Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Induserbart, celle Type-spesifikk uttrykk i Arabidopsis thaliana gjennom LhGR-mediert Trans-aktivisering

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59394
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1, 3, 3, 1, 2
1Department of Developmental Physiology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 2Department of Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 3Department of Stem Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi generering og søknad av en sette av transgene Arabidopsis thaliana linjer muliggjør induserbart, vev-spesifikke uttrykk i de tre viktigste meristems, skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium.

Abstract

Induserbart, vev-spesifikke uttrykk er en viktig og kraftig verktøy for å studere spatio-temporale dynamikken i genetisk forstyrrelsene. Kombinerer fleksibel og effektiv GreenGate kloning systemet med velprøvde og benchmarked LhGR system (her kalt GR-LhG4) for induserbart uttrykket, har vi generert et sett av transgene Arabidopsis linjer som kan kjøre uttrykk for en effektor kassett i en rekke spesifikke celletyper i de tre hoved plante meristems. Dette valgte vi tidligere utviklet GR-LhG4 systemet basert på en chimeric transkripsjon faktor og en beslektet type pOp promoter sikre stram kontroll over et bredt spekter av uttrykk. I tillegg for å visualisere uttrykk domenet der syntetiske transkripsjon faktoren er aktiv, er en ER lokalisert mTurquoise2 fluorescerende reporter under kontroll pOp4 eller pOp6 kodet i driveren linjer. Her beskriver vi nødvendig for å generere en driver eller effektor linje og demonstrere hvordan celle type spesifikke uttrykk kan indusert og fulgte i skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium av Arabidopsis. Ved hjelp av flere eller alle linjer, kontekst spesifikk effekten av uttrykke en eller flere faktorer (effektor) under kontroll syntetiske pOp kan vurderes raskt, for eksempel i F1 planter en mellomting mellom en effektor og flere driveren linjer. Denne tilnærmingen er eksemplifisert ved ektopisk uttrykk for VND7, en NAC transkripsjon faktor kan indusere ektopisk videregående cellen vegg avsettelse i en celle autonom måte.

Introduction

En stor begrensning i biologi i postgenomic tid er å dechiffrere rollen sammenheng spesifikke for en bestemt faktor eller genetisk forstyrrelsene. Konstituerende genetisk forstyrrelser som tap-av-funksjon og gevinst-av-funksjon tilnærminger ofte bare tillate end-point analyse av livslang tilpasning prosesser, obfuscating skillet mellom primær og sekundær effekter. I tillegg kan sammenheng bestemte funksjoner, maskert eller utvannet av storskala effekter i fjerne vev eller andre faser av utviklingen. Videre, i ekstreme tilfeller, dødelighet kan utelukke noen mekanistisk innsikt. For å omgå disse problemene, kan en ideal, analysere effekten av akutt genetisk forstyrrelsene i en bestemt kontekst som en bestemt celle type på en gang-løst måte. For å oppnå dette, er genetisk verktøy for induserbart, celle type-spesifikk uttrykk nødvendig1. Hvis du vil gi en ressurs for rask vurdering av spatiotemporal dynamikken i et svar på en gitt effektor, har vi kombinert enkel kloning levert av GreenGate system2 med bevist effekten av GR-LhG4 systemet3, 4,5,6. Vi har generert et sett med linjer uttrykke chimeric transkripsjon faktoren LhG4 smeltet ligand binding domenet av rotte corticoid reseptor (GR)7 under kontroll av godt karakterisert celle type bestemte arrangørene8. I hvile forhold, fortsatt transkripsjon faktor utenfor kjernen, GR domenet er bundet av cytosolic HSP90. Med tillegg av syntetiske ligand deksametason (Dex), kjernefysiske translokasjon er indusert og LhG4 vil formidle transkripsjon av uttrykket kassetter under kontroll av en beslektet syntetiske type pOp promoter, som en mTurquoise2 reporter inkludert i driveren linjene visualisere uttrykk domenet etter innledningen.  Dermed driveren linjene teknisk inneholder også en effektor kassett. Krysset av driveren linjer med en linje som bærer en effektor kassett med, for eksempel en genet av interesse under kontroll samme type pOp dermed lar rask vurdering av akutt eller langsiktige konsekvensene av effektor uttrykk i en rekke celletyper.

Her gir vi en protokoll som beskriver prosedyrene generere driveren og effektor linjene og demonstrere hvordan celle type spesifikke uttrykk kan indusert og fulgte i skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium av Arabidopsis. For å illustrere dyktighet og spesifisitet av denne tilnærmingen, vi utnytter den velkjente transkripsjon faktoren VND7 som kan kjøre vedvev-lignende videregående cellen vegg thickenings ectopically9. Behandle F1 fra et kryss mellom pSCR10,11 driver linjen og pOp6:VND7 effektor linje fører til dannelse av ektopisk vedvev som celler i stivelse skjede celler av Arabidopsis stem.

For å lette generasjonen av store DNA samlinger kreves for å konstruere driveren og effektor uttrykk plasmider, brukte vi den rask og effektiv GreenGate kloning metode2. GreenGate kloning er basert på type II S begrensning enzymer som Eco31I eller dens isoschizomer Bsajeg2. Disse enzymene kuttet nedstrøms asymmetrisk anerkjennelse områdene produsere overheng med varierende base sammensetning. Ved å innlemme Eco31I /Bsajeg begrensning nettsteder i oligonucleotides og tildele bestemte overheng sekvenser til DNA elementer, modulære kloning er oppnådd, tilrettelegge generering av store samlinger. I GreenGate rammen faller DNA moduler i kategorier A-F basert på overheng sekvens som fungerer som kort og er samlet i den rekkefølgen. Derfor bør primerne utviklet for å forsterke din ønsket produkt være i henhold til den valgte modul2 (figur 1A). Hvis det er en intern Eco31I /Bsajeg området og rekkefølgen er ikke kompatibel med GreenGate oppføringen og destinasjon moduler, kan du fortsette uten mutagenizing, men med lavere effektivitet. Også bruke nettstedet-rettet mutagenese fjerne Eco31I /Bsajeg begrensning nettsteder ta vare ikke for å endre aminosyrer i genet produkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vektorer og moduler kan fås fra non-profit depotet, Addgene (https://www.addgene.org).

1. kloning bruker GreenGate

  1. Design primere med overheng oppført i tabell 1, erstatte 'NNNN' med modulen spesifikk adapter sekvenser nedenfor: fremover: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + bestemt sekvens 3´, omvendt: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + revers bemanning av bestemt sekvens 3´. Legg understreket baser for å sikre at vedlikehold av lesing rammen.
    Modulen overheng:
    Merk: I standard GreenGate rammen, seks moduler, A-F, settes sammen med en plante transformasjon vektor ryggrad i ett uttrykk plasmider (figur 1 c). Vanligvis vil A modulen havn promoter sekvenser, en B-modul en N-terminal kode eller "dummy" sekvens6, en C-modul en CD, en D-modulen en C-terminalen kode eller dummy, en E-modulen en terminator, og en F-modul kassetteninn motstand for valg av transgene planter. Adapter for kopling med andre ferdigbygde moduler er tilgjengelige for bruk i stedet for den F modul2.
  2. PCR forsterkning
    1. Forsterke sekvensen av interesse med designet primerne av polymerasekjedereaksjons (PCR) ifølge standardprotokoller.
    2. Skille PCR produktet på en agarose gel. Avgiftsdirektoratet og kolonne rense riktig fragmentet bruker en kommersiell kit (se Tabell for materiale) ifølge instruksjonene fra produsenten.
  3. Oppføringen modul opprettelse
    1. Separat fordøye modul vektoren og PCR fragmentet (trinn 1.2.) (Figur 1 A, B) med Eco31I/Bsajeg bruker 100-500 ng DNA (vektor eller Fragment), 3 µL 10 x fordøyelsen buffer og 5-10 U Eco31I i et rør og bringe volumet til 30 µL med ddH2O.
    2. Bland forsiktig av pipettering opp og ned og Nedspinning kort på 1000 x g. Ruge på 37 ° C på varme blokk 15 min (eller etter tid anbefaling av innkjøpte begrensning enzym).
    3. Etter fordøyelsen, rense kolonne hvert utvalg bruker en kommersiell kit (se Tabell for materiale) og kvantifisere innhentet DNA ved å bestemme optisk densitet ved 260 nm (OD260) bruker et spektrofotometer.
    4. Mix 30-100 ng fordøyd innsetting og 10-50 ng fordøyd vektoren av pipettering opp og ned flere ganger og ruge med 1 µL T4 Ligase (5 U/µL og 3 µL 10 x T4 ligation buffer i et totalt volum på 30 µL ved romtemperatur 1t (etter anbefaling av T4 ligase leverandøren) (se Tabell for materiale).
      Merk: Beregne ønsket molar forholdet oppføring modul: destinasjon vektoren (f.eks 3:1) for hemorroider avhengig av konsentrasjon og lengden på oppføringen modul skivene.
    5. For å øke effektiviteten av transformasjon, Deaktiver varme T4-ligase av rugende reaksjonen på 65 ° C for 20 min.
    6. Bruk ligation produktet å transformere kompetent E. coli celler i henhold til standard lab protokoller og spre bakterier på agar plater supplert med ampicillin (100 µg/mL)
    7. Inkuber platen med bakterier på 37 ° C for overnatting.
    8. Skjermen for kolonier med modulen aktuelle innførselen av kolonien PCR primere 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3) og 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3) og PCR standardvilkår.
      Merk: Denne primer kombinasjonen er gyldig oppføring moduler som primerne binder seg til oppføringen vektor ryggraden.
    9. Velg enkelt kolonier plasmider isolering. Bruk 2 mL LB flytende kultur med ampicillin (100 µg/mL) og ruge over natten i en 37 ° C shaker.
    10. Isolere plasmider fra overnatting flytende kulturen med en mini Prep Kit eller ønsket utvinning protokollen (se Tabell for materiale).
    11. For å identifisere plasmider med riktig innsatsen, utføre begrensning enzym analyse, for eksempel ved å velge to enzymer som kuttet unikt i din sette inn ved å blande 200 ng av plasmider, 2 µL 10 x fordøyelsen buffer, 5-10 U av valgt begrensning enzymer og ddH2 O til 20 µL.
    12. Sekvens valgte plasmider primere 86A1 og 86A2 (se trinn 1.3.9.).
  4. Målet modul opprettelse:
    Merk: Målet plasmider bruke ønsket destinasjon modul pGGZ001, pGGZ002 eller pGGZ0032 (figur 1 c).
    1. I et rør Legg og bland 50-150 ng tom destinasjon vektor (pGGZ003, for eksempel), 50-300 ng av hver fylte oppføring modul, 2 µL 10 x fordøyelsen buffer bufferen, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I og dH2O til et totalt volum på 20 µl.
      Merk: Beregne ønsket molar forholdet oppføring modul: destinasjon vektoren (f.eks 3:1) for hemorroider avhengig av konsentrasjon og lengden på oppføringen modul skivene.
    2. Bland og utføre GreenGate reaksjon2 bruker en PCR thermocycler vekslende 30 ganger mellom 37 ° C for 5 min og 16 ° C i 2 minutter, etterfulgt av ett trinn 5 min på 50 ° C og 5 min på 80 ° C.
    3. For å øke effektiviteten, Legg 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) og 1,5 µL 10 mM ATP til reaksjon og Inkuber 1t i romtemperatur, etterfulgt av varme-inaktivering av T4 DNA Ligase ved 65 ° C i 20 min.
    4. Bruk ligation reaksjonen å transformere kompetent E. coli og spre bakterier på agar plater med passende selektiv agent spectinomycin (50 µg/mL).
    5. Inkuber transformert E. coli på tallerkenen på 37 ° C for overnatting.
    6. For å bekrefte transformasjon, nytt strek hver valgte enkelt koloniene på spectinomycin (50 µg/mL) og ampicillin (100 µg/mL) som inneholder plater, henholdsvis. Bruk bare kolonier som vokser på spectinomycin men ikke på ampicillin plater.
    7. Inkuber E. coli koloniene overnatting på 37 ° C.
    8. Velg enkelt kolonier plasmider isolering. Bruk 2 mL LB flytende kultur med spectinomycin (50 µg/mL) og ruge over natten på en 37 ° C shaker.
    9. Isolere tilsvarende plasmider med en mini Prep Kit (se Tabell for materiale).
    10. Sjekk av begrensning enzym analyse (se 1.3.12.) og sekvens valgt positiv konstruksjoner med primere 88C 3 (5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3), 88C 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3). Hvis innsatsen ikke være fullt sekvensielt med disse veiledningene, utforme interne primere for sekvenser.
      Merk: Å identifisere kloner med riktig antall pOp gjenta sekvenser (se diskusjon), den primere pOp6 (pOp6_F, 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3, og pOp6_R, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3) som binder i den kort sagt flankert sekvenser kan brukes for PCR forsterkning og påfølgende gel geleelektroforese for å diskriminere etter størrelse.
  5. Mellomliggende supermodule opprettelsen
    1. Kombinere to uavhengige sett med oppføringen moduler, som kreves for å generere GR-LhG4 sjåfør linjene med integrert reporter-effektor kassett, første bygge to mellomliggende plasmider, kalt supermodules2, før du monterer det siste uttrykket plasmider i pGGZ001 eller pGGZ003.
    2. Husk å legge til F-H adapter på slutten av den første supermodule og H-en adapter i begynnelsen av den andre supermodule (de fungere som forbindelser mellom to konstruksjoner) som beskrevet2.
      Merk: Bare pGGN000 mellomliggende modulen bærer motstand kassetten. Vil generere uttrykk plasmider, utføre GreenGate reaksjon med destinasjon vektoren og pGGN000 og pGGM000 middels supermodules. Alternativt, bland destinasjon vektor, pGGN000 mellomliggende supermodule og de resterende enkelt modulene utføre GreenGate reaksjon2. Sistnevnte er mindre effektiv enn tidligere, men kan være raskere.
    3. Hvis du vil opprette en pGGM000/pGGN000 supermodule, bland 1,5 µL (100-300 ng/µL) for hver oppføring modulene med 1 µL (30 ng/µL) tom mellomliggende vektor (pGGM000 eller pGGN000), 2 µL 10 x fordøyelsen buffer, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) , og 5-10 U Eco31I i et totalvolum på 20 µL.
      Merk: Beregne ønsket molar forholdet oppføring modul: destinasjon vektoren (f.eks 3:1) for hemorroider avhengig av konsentrasjon og lengden på oppføringen modul skivene
    4. Bland og utføre GreenGate reaksjonen som i trinn 1.4.2
    5. For å øke effektivitet, Legg 1 µL T4 Ligase og 1,5 µL ATP (10 mM), og Inkuber 1t i romtemperatur, etterfulgt av varme-inaktivering ved 65 ° C i 20 min.
    6. Bruk 10 µL av hemorroider reaksjonen vil gjøre kompetent E. coli og strek på plater som inneholder kanamycin (50 µg/mL).
    7. Utføre overnatting inkubering av den transformerte E. coli på tallerkenen på 37 ° C.
    8. Nytt strek hver valgte enkelt koloniene på kanamycin (50 µg/mL) og ampicillin (100 µg/mL) inneholder plater, henholdsvis.
    9. Utføre overnatting inkubasjon E. coli koloniene på tallerkenen på 37 ° C.
    10. Velg enkelt kolonier som vokser bare kanamycin men ikke på ampicillin plasmider isolering. Bruk 2 mL LB flytende kultur med kanamycin (50 µg/mL) og ruge over natten i en 37 ° C shaker.
    11. Isolere tilsvarende plasmider ved hjelp av en mini prep kit (se Tabell for materiale).
    12. Sjekk plasmider av begrensning enzym analyse (se 1.3.12.) og Bekreft sekvensering primere 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) og 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) annealing til pGGM000/pGGN000 ryggraden. Hvis innsatsen ikke være fullt sekvensielt med disse veiledningene, utforme interne primere for sekvenser.
      Merk: Hvis kloning i pGGM000 eller pGGN000 vektorer er mislykket, en mulig løsning er å fordøye den pGGM000 eller pGGN000 med Eco31I, kjører på en gel og rense fra gel pGGM000 eller pGGN000 ryggraden (ca 2000 bp) fragmentet uten den ccdB kassett (ca 1400 bp). Deretter gå som normalt med ligation reaksjonen.
  6. Transformere en A. tumefaciens pSOUP+ belastning (f.eks ASE), som pSa opprinnelsen til replikering (ori A. tum.) i destinasjon vektorer krever hjelper plasmider pSOUP12. Strek ut bakterier på LB plater som inneholder chloramphenicol (34 µg/mL), kanamycin (50 µg/mL), spectinomycin (50 µg/mL) og tetracycline (12.5 µg/mL). Inkuber transformert A. tumefaciens på platen i en 28 ° C inkubator for to til tre dager.

2. generasjon Arabidopsis transgene planter

  1. Transformasjonen av Arabidopsis thaliana.
    Merk: Transformere A. thaliana planter etter Zhang et al., 200613.
  2. Utvalg av transgene linjer.
    1. Transformert planter, og velg Bruk utvalg ordningen brukes GABI-Kat14 for motstand mot sulfadiazine15.
    2. Velg i generasjon T2, som viser forholdet 3:1 segregering i motstand markøren for å velge stabil linjer med en mulig enkel integrering hendelse. Overføre disse linjene til T3 generasjon og velg planter homozygous for motstand genet. Eventuelt utføre en sørlige Blot analyse eller en standard kvantitative sanntid PCR (SA-qPCR)16 å velge enkelt innsetting linjer.

3. induksjon av trans-aktivisering Arabidopsis driveren linjer

  1. Rot
    1. Teste reporter uttrykk i A. thaliana driveren linjer genereres gjennom trinn 1 og 2, sterilisere frø som beskrevet nedenfor.
      1. Legge til 0,5-1.0 mL 70% etanol + 0,01% ikke-ioniske vaskemiddel til ca 100 frø (20 mg) i en 1,5 ml reaksjon rør og Inverter røret et par ganger. Nedspinning 1000 x g for 15 s og leveringstanken nedbryting.
      2. Legge til 0,5-1.0 mL av absolutt etanol. Invertere røret flere ganger, Nedspinning for 1000 x g for 15 s og Forkast nedbryting.
      3. Legge til 0,5-1.0 mL absolutt etanol og Inverter tube t et par ganger, deretter spinne ned 1000 x g for 15 s og Forkast nedbryting.
      4. Tillate frø tørke i panseret. Hvis frø skal være lagdelt i rør videre til trinn 3.1.1.6.
      5. Legge til 0,5-1.0 mL sterilt vann og Inverter røret et par ganger. Nedspinning 1000 x g for 15 s og Forkast nedbryting.
      6. Legge til 0,5-1.0 mL sterilt vann og Inverter røret flere ganger. Nedspinning 1000 x g for 15 s og Forkast nedbryting.
      7. Legge til 0,5-1.0 mL sterilt vann.
    2. Forberede halv-styrke Murashige og Skoog middels, pH 5.8 og legge 0,9% plante agar og 1% sukrose. Når autoklavering lagt deksametason (Dex), oppløst i DMSO til en siste konsentrasjon av 10-30 µM til induksjon plater og en lik mengde DMSO til kontroll plater, henholdsvis.
    3. Sette frø for rot bildebehandling på plater og stratify dem for 48 timer i mørket og kalde (4 ° C).
    4. Sette plater i vertikal posisjon i en plante inkubator (lang dag (16/8 h), 22 ° C, luftfuktighet, 65%) og dyrke dem i fem dager.
    5. Fem dager etter spiring (dag), bilde seedlings bruker AC confocal mikroskopi for laserskanning.
  2. Stammen
    1. Sterilisere frø som beskrevet i 2.1.1. og sette frø på ½ MS, 0,9% plante agar og 1% sukrose plater. Stratify 48 h i mørket og kalde (4 ° C).
    2. Seks til sju dager etter spiring, overføre seedlings jord, hver plante i en enkelt pott (lang dag (16/8 h), 22 ° C, luftfuktighet, 65%).
    3. Indusere trans-aktivisering i stammer vanning Dex eller uekte løsning eller dipping plantene i Dex eller falske løsninger, henholdsvis.
    4. Vanning, bruke en 25 µM Dex løsning i vann utarbeidet fra et lager av 25 mM Dex oppløst i etanol. Vann hver 2-3 dager før tiden for induksjon.
    5. For dipping, forberede en 1 liters kanne, 750 mL vann som inneholder 0.02% silwet L-77 med 25 µM Dex eller tilsvarende mengde DMSO for Dex og narr behandling, henholdsvis. Dypp enkelt planter for 30 i innledningen eller i uekte løsningen. Gjenta hver 2-3 dager før tiden for imaging.
      Merk: Etter dipping, planter bør opprettholdes ved høy luftfuktighet i én time.
  3. Skyte apikal Meristem (SAM)
    1. Sterilisere frø som beskrevet i 2.1.1. Forberede plater med ½ MS, 0,9% plante agar og 1% sukrose medium og sette frø på platene. Lagre platene i to dager i mørket og kaldt for lagdeling.
    2. Sette plater i vertikal posisjon i en plante inkubator. Seks til sju dager etter spiring, overføre seedlings til jord, hver plante i en enkelt pott (lang dag (16/8 h), 22 ° C, luftfuktighet, 65%).
    3. Når stammen er rundt 1 cm lang (25-30 dag), spray sitter SAM med 10-50 µM Dex i H20 iført en ansiktsmaske. Induksjon og bildebehandling ved senere stadier av utvikling, indusere SAMs lengre stammer eller siden skudd.
      Merk: SAMs kan også være forårsaket av paintbrushing Dex-løsning for å hindre spray dråper. Bruk en maske når Dex brukes ved sprøyting.
    4. 24-48 h etter induksjon, dissekere SAMs og Fortsett til bildebehandling (se 4.3).
      Merk: Bare un indusert planter ble brukt for overføringen for å redusere sannsynligheten for å slå av genet. Planter i T2/T3 ble brukt for bildebehandling.

4. imaging reporter uttrykk i Arabidopsis driver linjer.

  1. Rot
    1. Overføre seedlings fra plate 10 µg/mL propidium iodide (PI) løsninger og mot stain dem i 5 min.
    2. Plasser røttene i mikroskop imaging kammer (1-og vev kultur kammer cover glass II, se Tabellen for materiale) og image dem ved hjelp av en AC confocal laserskanning mikroskop med en 63 x vann nedsenking mål (se Tabell for materiale).
    3. For å visualisere PI fluorescens, bruk en eksitasjon bølgelengden til 488 nm og samle utslipp mellom 590 og 660 nm. Til mTurquoise2 fluorescens bruke 458 nm eksitasjon og samle utslipp mellom 460 og 615 nm.
  2. Stammen
    1. Utføre vannrett hånd kuttet deler av anlegget stammer med et barberblad, excising et segment av ca 3 cm. fastsette stammen med fingeren på motsatt side av delen å kutte. Utføre flere fine kutt sekvensielt, men Merk at bare deler fra en tilsvarende stilling i stammen skal sammenlignes.
    2. Etter hvert snitt, fordype barberblad i en Petriskål som inneholder vann fra springen og samle delene stammen. Stain deler på dette punktet eller direkte montere på objektglass.
    3. For flekker, forberede en 1 mL av 250 µg/mL av PI løsning av vann i en liten Petriskål (se Tabell for materiale). Fordype delene i 5 minutter og skyll i vann. Overføre dem til objektglass med fine tang eller en fin maling pensel. Ta vare å ikke presse prøvene med dekkglassvæske.
    4. Bilde prøver ved å bruke en AC confocal laserskanning mikroskop med en 25 x dipping vann nedsenking linse (se Tabell for materiale). Bruk 561 nm laserlys å opphisse PI fluorescens og samler fra 570 til 620 nm. Bruk 405 nm å opphisse mTurquoise2 fluorophore effektor kodet av sjåføren linje konstruksjoner og samler utslipp fra 425 til 475 nm.
  3. Skyte apikal Meristem
    1. Skjær stammen 2 cm nedenfor skyte spissen med tang. Holde stammen i den ene hånden og bruke fine pinsett fjerne blomsterknopper og store primordia. Hvis du vil fjerne unge primordia, fikse SAM stående i en Petriskål inneholder 3% agarose. Bruk en kikkert og tang for å fjerne unge primordia nær SAM. Alternativt bruke en injeksjon kanyle (se Tabell for materiale) å kutte disse primordia.
    2. Stain dissekert SAM i en 250 µg/mL PI løsning for 5-10 min. utføre flekker enten direkte ved pipettering noen dråper flekker løsning på forberedt SAM eller overføre prøven til et rør fylt med flekker løsning. Holde SAM fullstendig neddykket under farging prosedyren.
    3. Plasser farget SAM i en liten Petriskål (se Tabell for materiale) med 3% agarose medium og dekke SAM med ddH2O.
    4. Bildet dissekert SAMs ved hjelp av en AC confocal laserskanning mikroskop utstyrt med en 25 x dipping vann nedsenking linse (se Tabell for materiale).
    5. Bruk 561 nm laserlys å opphisse PI fluorescens og samler fra 570 til 620 nm. Bruk 405 nm å opphisse mTurquoise2 fluorophore og samle utslipp fra 425 til 475 nm.
      Registrere bildestakker spenner over 50 µm i z-retningen trinnet størrelse på 0,5 µm.
      Merk: SAM imaging som beskrevet her krever en oppreist AC confocal laser skanning mikroskop og en linse (her, vann dipping linsen) med lange arbeidsavstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generasjon av driveren og effektor linjer gjennom GreenGate kloning

GreenGate kloning systemet er basert på GoldenGate kloning og bruk type IIS begrensning endonuclease Bsajeg eller sin isoschizomer øko31I. Som enzymet produserer overheng fjernt fra nettstedet sitt asymmetrisk anerkjennelse, base sammensetningen av overheng kan fritt danner valgt, som er grunnlaget modularitet av systemet. Hvert PCR-generert element, for eksempel en promoter sekvens, CDer eller terminator, settes først inn i en angitt oppføring vektor med matchende overheng produsert av begrensning digest generere en modul. Etter subcloning brukes en rekke samsvarende moduler, vanligvis seks, for GreenGate ligation reaksjon resulterer i montering av Konstruer i en binær anlegget destinasjon vektor.

Driveren linjer, moduler som inneholder DNA-sekvenser av vev-spesifikke promoter (pTS), GR-LHG4 transkripsjon faktoren, pOp6 selskapet og mTurquoise2 reporteren sammensmeltet med en N-terminal signal peptid og en C-terminalen ER oppbevaring signal var smeltet inkludert terminatorer og forskjellige kort moduler og en modul for transgene utvalg som beskrevet tidligere 2,8 (figur 2). Effektor linjer ble bygget med pOp6 arrangøren og en effektor kassett, for eksempel bestående av en genet av interesse og terminator samt en modul koding en motstand genet for transgene plante utvalg (figur 2).

Induksjon av driveren og visualisering av reporteren fluorescens

Induksjon med Dex fører til celle type spesifikke mTurquoise2 uttrykk i roten endodermis (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, figur 3A), phloem prekursorer og cambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Finne 3B), og stamceller i skyte apikal meristem (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, Figur 3 c).

Trans-aktivering av VND7 i stivelse skjede cellene i cambium

Som en test for trans-aktivisering generert vi en effektor linjekoding videregående cellen vegg master transkripsjon faktoren VND7 smeltet VP16 aktivisering domenet, som har vist å indusere videregående celle veggen formasjonen celle selvstendig når misexpressed 8,9,19,20.

Etter 5 dager med en enkelt behandling med 15 µM Dex eller DMSO for den indusert eller uekte plantene henholdsvis var stilk deler forberedt på visualisering av ektopisk lignification i stivelse skjede. Propidium Iodide viser i stammen sterk affinitet til lignified vev. Stivelse skjede cellene i indusert prøver av Dex, men ikke i de falske viste et sterkt signal om PI kanalen og noen celler viser den typiske reticulate fortykkelse av cellen vegg i vedvev celler (Figur 4).

Figure 1
Figur 1. GreenGate kloning prinsippet. A) Type IIS begrensning endonucleases, som Bsajeg /Eco31I, gjenkjenner ikke-palindromic sekvenser (rød) og kuttet asymmetrisk i en bestemt avstand uavhengig av sekvensen (blå). Eco31I gjenkjenner 'GGTCTC', kutt fra den andre nukleotid nedstrøms av webområdet anerkjennelse og skaper en fire base 5' overheng. B) GreenGate kloning systemet er basert på et modulært system med seks forskjellige oppføring vektorer pGGA000-pGGF000. Disse vektorer inneholder en Ampicillin motstand kassett (AmpR) og en ccdB kassett flankert av bestemte adaptere for hver oppføring vektor (f.eks pGGA000 oppføring vektor) og 'GGTCTC' Eco31I anerkjennelse nettsteder. Eco31I fordøyelsen av pGGA000 utgivelser ccdB og skaper pGGA000-spesifikke fire nukleotid overheng (mørk blå). Insert1 forsterkes primere skjuler 'GGTCTC' og pGGA000 bestemte adaptere og etter fordøyelsen samskrevet i pGGA000. Samme prosedyre følges med andre moduler. C) den siste GreenGate reaksjonen kombinerer Eco31I fordøyelsen destinasjon vektor pGGZ001 og seks oppføring vektorer pGGA000-pGGF000 og den samtidige ligation av alle moduler i destinasjon vektoren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Oversikt over Dex-induserbart LhGR/pOp-systemet med sjåfør og effektor. i driveren linjer, vev-spesifikke arrangører (pTS) kontrollere uttrykket av syntetiske transkripsjon faktor LhG4, som er translationally smeltet ligand binding domenet av rotte glukokortikoid reseptor (GR) og dermed hindrer, i fravær av Dex, kjernefysisk translokasjon. Effektor linjen havner kassetteninn transcriptional drevet av et pOp element og en TATA boks med en minimal 35S promoter. Krysset med en driver linje og Dex induksjon, binder GR-LhG4 til type pOp elementene i reporter kassetten og for de i modulen effektor inducing transkripsjon av mTurquoise2 og effektor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Indusert driveren linjer root, stammen og SAM. A) Dex-indusert driveren linje pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (spirer i 50 µM Dex) i rot og narr behandling. FUGLESKREMSEL selskapet (pSCR) formidler uttrykk i endodermis, cortex/endodermis første (CEI) og quiescent center (QC). Cellene er mot beiset med propidium iodide (PI). Skalere barer = 20 µm. B) Dex-indusert driveren linje pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (dyppet i en 50 µM Dex løsning og visualisert etter 3 dager) i i stammen og narr behandling. SMXL5 selskapet (pSMXL5) formidler uttrykk i cambium stilk cellen domene og phloem forløpere. Cellene er mot beiset med propidium iodide (PI). Skalere barer = 100 µm. C) Dex-indusert driveren linje pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µM, 48t) i SAM. CLAVATA3 selskapet (pCLV3) formidler uttrykk i stamcelleforskningen domenet. Bilder i bunnen viser XZ- og YZ tverrsnitt, Dex-indusert og narr behandlet, henholdsvis. Cellene er mot beiset med propidium iodide (PI). Skalere barer = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Ektopisk lignification i stivelse skjede av stammen. A) ektopisk lignification er sett fem dager etter Dex induksjon av driveren linjen pSCR >> VND7-VP16 i stammen. FUGLESKREMSEL selskapet (pSCR) formidler uttrykk i stivelse skjede cellene i stammen. Venstre bildet viser fletting av PI kanal og lys feltet høyre bilde viser bare PI kanal. B) kontrollen uekte viser ingen signal i stivelse skjede cellene. Cellene er mot beiset med propidium iodide (PI). Skalere barer = 100 µm. PI fluorescens er USANN-farget i grønt mens chloroplast auto fluorescens er rød i alle bilder. Hvit pilspisser Velg stivelse skjede celler. Venstre bildet viser fletting av PI kanal og lys feltet høyre bilde viser bare PI kanal.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Modul 5' overheng vanligvis brukes til 3 overheng
A ACCT arrangøren AACA
B AACA N-terminal tag GGCT
C GGCT Koding sekvens TCAG
D TCAG C-terminalen tag CTGC
E CTGC Terminator ACTA
F ACTA motstand kassett GTAT

Tabell 1: Overheng brukt primer design

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi nødvendig for å generere og bruke en allsidig og omfattende verktøykasse for induserbart, celle type bestemt trans-aktivisering. Krysset linjer bærer effektor kassetter under kontroll pOp med driveren linjer kan studere mis uttrykk effektene i F1 generasjon, slik at rask vurdering av genetisk forstyrrelsene i en rekke celletyper. Alternativt effektor konstruksjonene kan brukes til å transformere driveren linjer eller ved å tilpasse kloning strategi, fører og effektor konstruere kan også kombineres på en T-DNA. Programmer for dette systemet varierer fra romlig og timelig kontrollert mis uttrykk studier domene-spesifikke sammenleggbare eller genet redigering og celle-type spesifikke complementation.

Ingen av prosedyrene som er beskrevet her bør utgjør en utfordring til labs utstyrt for generelle molekylærbiologi teknikker. LhG4 uttrykk systemet har blitt grundig testet og sikrer ikke-leaky og tuneable uttrykk som kan bli drevet til høy nivåer8, selv om vi forsiktig at dynamikkområdet induser konsentrasjon bør fastsettes empirisk for hver driver og effektor linje kombinasjon kombinere dette velprøvde systemet med modulære GreenGate kloning tilbyr en rask og enkel måte å induserbart uttrykk i en celle type som en bestemt promoter er tilgjengelig. Vi merket at rekombinasjon hendelser kan oppstå under forsterkning av plasmider som inneholder gjentatte sekvenser av type pOp arrangøren. Dette fører ofte har færre gjentakelser av OP-rekkefølge, som kan bli vurdert av PCR. Siste konstruksjoner bør alltid bekreftes av sekvensering Escherichia coli og Agrobacterium tumefaciens. Men ble sporadisk rekombinasjon hendelsene bare oppdaget i E. coli.

Begrense bruk av denne teknikken er dermed tid til å generere transgene planter.  Det er av avgjørende betydning å teste for genet stanse, starte i T2 generasjon og bare beholde stabil linjer. For å minimere sjansen for å stanse, anbefaler vi å samle frø bare skjemaet ikke-indusert planter.

Teknikken er beskrevet her er gratis til andre trans-aktivisering systemer21,22, som gir en omfattende ressurs og kombinerer vev spesifisitet induserbart uttrykk. En mulig fremtidig utvikling av denne metoden er inkorporering av flere celle type-spesifikk arrangører å kjøre GR-LhG4, for eksempel i vev utenfor de viktigste meristems. Angående effektor er en spennende mulig utvidelse tilpasning av høyeffektive genet redigeringsverktøy å tillate celle type-spesifikk banker outs23.

Driveren linjene beskrevet i Schürholz et al. 20188 er tilgjengelig fra NASC (http://arabidopsis.info/), DNA-konstruksjoner beskrevet i Lampropoulos et al., 20132 og Schürholz et al., 20188 er tilgjengelig fra Addgene (https://www.addgene.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Arbeid i våre laboratorier støttes av tysk Research Foundation (DFG) tilskudd WO 1660/6-1 (til S.W.) og GR 2104/4-1 (til TG) og SFB1101 (til TG og J.U.L) og en europeisk forskningsråd consolidator gir (PLANTSTEMS 647148) til TG  S.W. støttes gjennom Emmy Noether fellesskap av DFG gjennom Grant WO 1660/2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.1
ATP Sigma-Aldrich A9187
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Column purification Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imaging Sarstedt AG & Co. KG 1-well tissue culture chamber, on cover glass II
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4903
DMSO Fisher Scientific, UK D139-1
Eco31I Thermo Fisher Scientific FD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) Sterican, Braun
Kanamycin Carl Roth GmbH + Co. KG T832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv Leica, Wetzlar, Germany
MS medium Duchefa, Haarlem, Netherlands M0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objective Nikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 627102
Petri dish 60/150 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 628102
Petri dish 120/120/17 Greiner Bio-One GmbH, Germany 688102
Plant agar Duchefa, Haarlem, Netherlands P1001
Plasmid extraction Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170
Razorblade Classic, Wilkinson Sword GmbH 7005115E
Reaction tubes Sarstedt AG & Co. KG 72.690.001
Silwet L-77 Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
Spectinomycin AppliChem GmbH 3834.001
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000c
Sucrose Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Sulfadiazine Sigma-Aldrich S6387
Tetracycline AppliChem GmbH 2228.0025
T4 Ligase 5 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0011
T4 Ligase 30 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).

Tags

Genetikk problemet 146 induserbart uttrykk trans-aktivisering formidler-reporter studier uttrykk kontroll MIS uttrykk funksjonelle genetikk
Induserbart, celle Type-spesifikk uttrykk i <em>Arabidopsis thaliana</em> gjennom LhGR-mediert <em>Trans</em>-aktivisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

López-Salmerón, V.,… More

López-Salmerón, V., Schürholz, A. K., Li, Z., Schlamp, T., Wenzl, C., Lohmann, J. U., Greb, T., Wolf, S. Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation. J. Vis. Exp. (146), e59394, doi:10.3791/59394 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter