Summary
ここでは、我々 は生成を記述して形質転換シロイヌナズナのセットのアプリケーション線 3 主な分裂、茎頂や根の頂端分裂組織形成層で有効にする、組織固有の誘導式です。
Abstract
誘導、組織固有の式は遺伝的摂動の時空間的ダイナミクスを研究するための重要かつ強力なツールです。エフェクターの式をドライブすることができます形質転換シロイヌナズナ行セットを生成しているクローン作成実績とベンチマークを行った LhGR システム (ここでは GR LhG4 と呼ばれる) 誘導式の柔軟かつ効率的な GreenGate 組み合わせることで、3 つの主要な植物の分裂で特定の細胞型の範囲でのカセット。このため、我々 はキメラ転写因子と表現のレベルの広い範囲にわたってタイトなコントロールを確保する同種pOp 型プロモーターに基づいて開発済みの GR LhG4 システムを選んだ。さらに、合成転写因子がアクティブ式ドメインを視覚化するpOp4 または pOp6プロモーターの制御下で ER ローカライズ mTurquoise2 蛍光レポーターはドライバーの行でエンコードされます。ここでは、ドライバーまたはエフェクター ラインを生成し、細胞型特異的発現の誘導および茎頂、根の頂端分裂組織とシロイヌナズナのひこばえに続いてできる方法を示すに必要な手順について述べる。使用するには、いくつかまたはすべてのドライバー ライン、1 つのコンテキスト特定効果かポップ合成プロモーターの制御下で複数の要因 (エフェクター) を 1 つのエフェクターと複数間のクロスの F1 植物で急速に、たとえば評価できます。ドライバーの行。このアプローチは、VND7、細胞自律的に異所性の二次細胞壁形成を誘導することができる NAC 転写因子の異所性発現によって例証されます。
Introduction
ポストゲノム時代における生物学の主要な制限は、特定の要因や遺伝的摂動のコンテキストの特定の役割を解読することです。関数の損失と利得の機能のアプローチなど遺伝的摂動構成では、プライマリとセカンダリの効果の違いを難読化、生涯適応プロセスのエンドポイント解析頻繁のみ許可します。さらに、コンテキストの特定の機能をマスクまたは遠い組織または開発の他の段階で大規模な効果によって希釈できます。また、極端な場合、致死することができます任意の機械論的な洞察力を妨げるもの。理想的には、これらの問題を回避するために、時間分解の方法で特定のセル型などの特定のコンテキスト内で急性の遺伝的摂動の効果を分析 1 つ。そのためには、誘導、細胞型特異的発現の遺伝学的ツール、必要な1です。与えられたエフェクターへの応答の時空間ダイナミクスの迅速な評価のため、リソースを提供するために我々 は定める GreenGate システム2 GR LhG4 システム3,の実証済みの有効性とクローン作成の容易さを結合した4,5,6。我々 は、LhG4 はよく特徴付けられる細胞の種類特定のプロモーター8の制御の下でラットのコルチコイド受容体 (GR)7のリガンド結合ドメインに融合キメラ転写因子を表現する行のセットを生成しています。GR ドメインは細胞質 HSP90 に拘束条件を安静時の転写因子の核外ままです。合成リガンド デキサメタゾン (Dex) の追加により、核移行が誘導される LhG4 は式カセット mTurquoise2 記者などの同種合成pOp 型プロモーターの制御下での転写を仲介して誘導後定義式のドメインを視覚化するドライバーの行に含まれます。 したがって、ドライバーの行技術的にまた含まれているエフェクタ カセット。したがって、たとえば、同じpOp 型プロモーターの制御下で興味の遺伝子とエフェクター カセットを運ぶライン ドライバーの行のセットの交差により、エフェクター表現の急性または長期的な結果を迅速に評価幅広い種類の細胞。
ここで、ドライバーとエフェクターの行を生成し、細胞型特異的発現が誘導し、茎頂や根の頂端分裂組織の形成に続いて方法を示して必要な手順を記述したプロトコルを提供します。シロイヌナズナ。力とこの方法の特異性を説明するためによく知られているトランスクリプション要因 VND7 異所萌出へ木部二次細胞壁肥厚を運転することができる利用9。シロイヌナズナの細胞幹デンプン鞘内異所性木部細胞の形成につながるpSCR10,11ドライバー ラインとpOp6:VND7エフェクター ライン間のクロスから F1 を治療します。
ドライバーとエフェクターの発現プラスミドを構築するために必要な大規模な DNA アセンブリの生成を容易にするには、方法2のクローン作成の迅速かつ効率的な GreenGate を使用しました。GreenGate クローニングは2エコ31I やその isoschizomer Bsaなどタイプ II 制限酵素に基づいています。これらの酵素はカット基本組成を変化させてオーバー ハングを生産、不斉認識サイトの下流。エコ31I を組み込むことによって/Bsa私制限サイト オリゴヌクレオチドと DNA 要素に特定の突出部分シーケンスの割り当て、モジュラー クローン作成を実現、大規模なアセンブリの生成を促進します。GreenGate フレームワークで DNA モジュールはアダプターとして機能し、その順序で組み立てられて A ~ F オーバー ハング シーケンスに基づいてカテゴリに分類されます。したがって、ご希望の商品を増幅するプライマーは選択したモジュール2 (図 1 a) に従ってする必要があります。内部エコ31I/Bsa私はサイトとシーケンスは GreenGate エントリと宛先モジュールと互換性がない、mutagenizing、なく低い効率を進むことが。また、サイト指示された突然変異誘発を使用してエコ31I を削除する/Bsa私遺伝子産物中のアミノ酸を変更するように注意して、制限のサイト。
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Protocol
ベクトルおよびモジュールは、非営利のリポジトリでは、Addgene (https://www.addgene.org) から入手できます。
1. GreenGate を使用してクローニング
- 表1 オーバー ハングを使用して設計プライマー、モジュール型固有のアダプター シーケンス 'NNNN' に置き換える以下: 前方: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 特定のシーケンス 3´ を逆に: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + リバース特定のシーケンス 3´ の補数。リーディング ・ フレームの維持下線付きの拠点を追加します。
モジュールのオーバー ハング:
注: 既定の GreenGate フレームワーク、六つのモジュールで A ~ F 工場変換ベクター バックボーンを持つ 1 つの発現プラスミド (図 1) にまとめます。通常、A モジュールがハーバーのプロモータ配列 B のモジュールを N 末端タグまたは「ダミー」シーケンス6、C モジュール、CD D モジュール C 末端タグ、ダミー、電子モジュール ターミネータ、および F モジュールの形質転換の選択に抵抗カセット植物。その他の組立単位との結合にアダプターが F モジュール2の代わりに使用できます。 - PCR の拡大
- ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) によると、標準的なプロトコルによって設計されたプライマーの興味のシーケンスを増幅します。
- Agarose のゲルの PCR の製品を分離します。消費税と列はコマーシャルを使用して正しいフラグメントを浄化キットの製造元の指示に従って (材料の表を参照してください)。
- モジュールのエントリを作成
- 別にダイジェスト モジュール ベクトルと PCR のフラグメント (ステップ 1.2.)(図 1 A, B)エコ31I/Bsaと私は管内の DNA (ベクトルまたはフラグメント)、消化バッファー x 3 μ 10 と 5-10 Uエコ31I 100 500 ng を使用して、ddH2O. 30 μ L にボリュームをもたらす
- 優しく上下にピペッティングとスピン ・ ダウン 1,000 x gで簡単にミックス。熱ブロック 15 分 (または購入制限の酵素の時間勧告に従い) 37 ° C で孵化させなさい。
- 消化力の後の列は商業キット (材料の表を参照) と 260 の光学濃度を決定することによって得られた DNA の定量化に使用する各サンプルを浄化する nm (OD260) 分光光度計を使用しています。
- ミックス 30-100 ng を上下に数回ピペッティングによる挿入および 10-50 ng 消化ベクトルを消化し、1 μ L と T4 リガーゼ (5 U/μ L、および (次勧告 1 時間室温で 30 μ L の総ボリュームで T4 結紮バッファー x 3 μ 10 を孵化T4 リガーゼ サプライヤー) の (材料の表を参照してください)。
注: は、濃度とエントリ モジュール挿入の長さに応じて結紮の目的モル比エントリ モジュール: デスティネーション ベクトル (例えば、3:1) を計算します。 - 変換の効率を高めるため、熱は 20 分の 65 ° C で反応の孵化によって T4 リガーゼを不活性化します。
- 標準的な実験室のプロトコルおよびアンピシリン (100 μ g/mL) を添加した寒天版の細菌の普及に従って細胞の有能なエシェリヒア属大腸菌を変形する結紮製品使用
- 37 ° C で細菌とプレート間一晩インキュベートします。
- コロニー PCR プライマー 86A1 (3 '5'-GTTGTGTGGAATTGTGAGC) と86A2 (3 '5'-GTTTTCCCAGTCACGACG-) 標準 PCR の状態を使用して目的のエントリ モジュールとコロニーのための画面。
注: プライマー バインド エントリ ベクトルのバックボーンとして、このプライマーの組み合わせはエントリのすべてのモジュールに対して有効です。 - プラスミドの分離のためのシングル コロニーを選択します。アンピシリン (100 μ g/mL) を添加した 2 mL LB 液体培養を使用し、37 ° C シェーカーで一晩インキュベートします。
- 小型準備キットまたは目的の抽出と一晩かけて液体培養から分離プラスミッド プロトコル (材料の表を参照してください)。
- 正しい挿入プラスミドを識別するために 200 ng のプラスミドを 2 μ L 10 x の 5-10 U 消化バッファーの選択の制限の酵素と ddH2 を混合することによってあなたの挿入で一意にカット 2 つの酵素を選択してたとえば、制限酵素分析を実行します。20 μ L O。
- (1.3.9 の手順を参照してください)。 プライマー 86A1と86A2を使用して選択したプラスミドをシーケンスします。
- 宛先モジュールを作る:
注: 送信先のプラスミッドのため目的モジュール pGGZ001、pGGZ002 または pGGZ0032 (図 1) を使用します。- 管内を追加し、50-150 ng 空キャスト先のベクトルを混ぜる (pGGZ003、たとえば)、それぞれの 50-300 ng いっぱいエントリ モジュール、2 μ L 10 消化バッファー x、1.5 μ 10 mM ATP、1 μ L T4 リガーゼ (30 U/μ L)、5-10 U μ Lエコ31I と dH2O の総量を20 μ l。
注: は、濃度とエントリ モジュール挿入の長さに応じて結紮のため目的のモル比のエントリ モジュール: デスティネーション ベクトル (例えば 3:1) を計算します。 - ミックスし、GreenGate 反応2 30 回 37 ° C 5 分、2 分、5 分 50 ° c、80 ° C で 5 分の 1 つの手順で続いてのための 16 ° C の間で交互 PCR たちを使用してを実行
- 1 μ L を追加、効率を高めるため T4 リガーゼ (30 U/μ L)、1.5 μ L 反応に 10 mM ATP、T4 DNA リガーゼの 20 分の 65 ° c の熱不活性に続いて、室温で 1 時間インキュベートします。
- 有能なエシェリヒア属大腸菌を変換し、適切な選択エージェント スペクチノマイシン (50 μ g/mL) を添加した寒天に細菌を広げる ligation の反作用を使用します。
- 37 ° C でプレートに変換されたエシェリヒア属大腸菌間一晩インキュベートします。
- 変換の確認、再からデルスト リーク各プレートをそれぞれ含むスペクチノマイシン (50 μ G/ml) とアンピシリン (100 μ g/mL) に選択した単一のコロニー。アンピシリン プレートではなくスペクチノマイシンの成長のコロニーのみを使用します。
- 37 ° C で一晩大腸菌コロニーを孵化させなさい
- プラスミドの分離のための単一のコロニーを選択します。スペクチノマイシン (50 μ g/mL) を添加した 2 mL LB 液体培養を使用し、37 ° C シェーカーで一晩インキュベートします。
- 小型準備キットに対応するプラスミドの分離 (材料の表を参照してください)。
- 制限酵素解析による確認 (1.3.12 を参照してください). シーケンス選択プライマー 88 3 (3 '5'-ACCTCTCGGGCTTCTGG-)、 88 4 (3 '5'-CCTTTTTACGGTTCCTG) を使用して肯定的な構成要素とします。挿入は完全にこれらのプライマーとシーケンスことはできない場合は、シーケンスの内部のプライマーを設計します。
注: 識別するクローンポップ繰り返しシーケンス (ディスカッションを参照) の正しい数を持つ、プライマー pOp6 (pOp6_F、3 '5'-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA;、 pOp6_R、3 '5'-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT) に結合する、短いシーケンスを側面はサイズによって差別する pcr、電気泳動後のゲルを使用することができます。
- 管内を追加し、50-150 ng 空キャスト先のベクトルを混ぜる (pGGZ003、たとえば)、それぞれの 50-300 ng いっぱいエントリ モジュール、2 μ L 10 消化バッファー x、1.5 μ 10 mM ATP、1 μ L T4 リガーゼ (30 U/μ L)、5-10 U μ Lエコ31I と dH2O の総量を20 μ l。
- 中間 supermodule の作成
- エントリ モジュールの行を生成する、GR LhG4 ドライバーと統合記者エフェクター カセット最初ビルド 2 中間プラスミドと呼ばれる supermodules2、最終的な式をアセンブルする前に必要な 2 つの独立したセットを結合するにはプラスミド pGGZ001 または pGGZ003。
- 必ず最初の supermodule と説明2として (それらは 2 つの構造間の接続となる) 2 番目の supermodule の初めに H A アダプターの末尾 F H アダプターに追加してください。
注: pGGN000 の中間モジュールだけ耐性カセットを運ぶ。発現プラスミドを生成するには、キャスト先のベクトルと pGGN000 と pGGM000 の中間 supermodules GreenGate 反応を実行します。また、キャスト先のベクトル、pGGN000 中間 supermodule と GreenGate 反応2を実行する残りの単一モジュールを混在させます。後者の方法は前者より効率が悪いが高速化することができます。 - PGGM000/pGGN000 supermodule を作成するには、1 μ L (30 ng/μ L) 空中間のベクター (pGGM000 または pGGN000)、2 μ L の 10 倍消化バッファー、1.5 μ 10 mM ATP、1 μ L と 1.5 μ L (100-300 ng/μ L) の各エントリ モジュールを混ぜる T4 リガーゼ (30 U/μ L)、と 5-10 Uエコ31I 20 μ L の総ボリュームで。
注: 計算目的モル比エントリ モジュール: デスティネーション ベクトル (例えば、3:1) 濃度とエントリ モジュール挿入の長さに応じて結紮 - ミックスし、ステップ 1.4.2 のように GreenGate 反応を実行
- 効率を高めるためには、1 μ L を追加 T4 リガーゼと 1.5 μ L ATP (10 mM) し、20 分の 65 ° C で熱不活化に続いて、室温で 1 時間インキュベートします。
- Ligation の反作用の 10 μ L を使用して有能なエシェリヒア属大腸菌およびカナマイシン (50 μ G/ml) を含んでいる版に連勝。
- 37 ° C でプレートに変換されたエシェリヒア属大腸菌一夜培養を実行します。
- 再連勝 (50 μ g/mL) カナマイシン、アンピシリン (100 μ g/mL) の選択した単一コロニーの各プレートをそれぞれ含みます。
- 37 ° C でプレートにエシェリヒア属大腸菌のコロニーの一晩インキュベートを実行します。
- 成長カナマイシン、アンピシリン プラスミドの分離ではなく単一のコロニーを選択します。カナマイシン (50 μ g/mL) を添加した 2 mL LB 液体培養を使用し、37 ° C シェーカーで一晩インキュベートします。
- 分離小型準備を使用して対応するプラスミド キット (材料の表を参照してください)。
- 制限酵素分析によるプラスミッドをチェック (1.3.12 を参照してください)。プライマー 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) と87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) pGGM000/pGGN000 バックボーンに熱処理を使用してシーケンスによって確認してください。挿入は完全にこれらのプライマーとシーケンスことはできない場合は、シーケンスの内部のプライマーを設計します。
注: pGGM000 または pGGN000 のベクトルへのクローニングに成功した場合 1 つの可能な解決策、pGGM000 またはエコ31I で pGGN000 を消化し、ゲルでランなし pGGM000 または pGGN000 のバックボーン (約 2000 bp) フラグメントをゲルから浄化、ccdBカセット (約 1400 bp)。それから通常 ligation の反作用と進みます。
- デスティネーション ベクトルの複製 (博多織 A. tum。) pSa 原点ヘルパー プラスミド pSOUP12の存在は必要として、 A. 根頭がんしゅ病菌pSOUP+ひずみ (例えば ASE) を変換します。クロラムフェニ コール (34 μ G/ml)、カナマイシン (50 μ G/ml)、スペクチノマイシン (50 μ G/ml)、テトラサイクリン (12.5 μ g/mL) を含んでいる LB の版に細菌を連勝。2 〜 3 日間の 28 ° C の定温器でプレートに変換されたA. 根頭がんしゅ病菌を孵化させなさい。
2. シロイヌナズナ形質転換植物の世代
- シロイヌナズナの変換です。
注: は、シロイヌナズナ植物によると張ら、2006年13を変換します。 - トランスジェニックは行の選択。
- 変換後の植物を選択するには、スルファジアジン銀15への抵抗にガビ キャット14で使用される選択方式を使用します。
- 可能な単一の統合イベントで安定したラインを選択するには、世代 T2, 抵抗性マーカーの 3:1 の分離比を示すを選択します。T3 世代にこれらの行を反映し、植物の抵抗性遺伝子のホモ接合体を選択します。また、南しみ分析または標準的な量的なリアルタイム PCR (SA qPCR)16単一挿入行を選択を実行します。
3.シロイヌナズナドライバー ライン トランス活性化の誘導
- ルート
- 手順 1 と 2、以下に示すように種子を滅菌を介して生成されたシロイヌナズナドライバー行記者の式をテストします。
- 追加 0.5 〜 1.0 mL の 70% エタノール + 0.01% 非イオン性洗剤 1.5 ml の反応管・反転チューブ約 100 種 (20 mg) を数回します。1000 x g は 15 の s、上清を吸引でスピンダウンします。
- 追加 0.5 〜 1.0 mL の無水エタノール。数回チューブを反転、1,000 x g 15 s と破棄上清のスピン ・ ダウン。
- 追加 0.5 〜 1.0 mL の無水エタノールと反転管 t に数回後、15 s と破棄上清の 1,000 x gでスピンダウンします。
- 乾燥フード内側に種子を許可します。種子管内は層化しようとしている場合は、3.1.1.6 の手順に進みます。
- 追加 0.5 〜 1.0 mL の滅菌水反転チューブを数回します。15 s と破棄上清の 1,000 x gでスピンダウンします。
- 追加 0.5 〜 1.0 mL の滅菌水反転チューブ数回。15 s と破棄上清の 1,000 x gでスピンダウンします。
- 追加 0.5 〜 1.0 mL の滅菌水。
- 半分強さ培地、培、培地の pH 5.8 を準備し、0.9% 工場寒天培地と 1% ショ糖を追加します。オートクレーブは、デキサメタゾン (Dex) を追加後に、溶解した DMSO、誘導板に 10-30 μ M と DMSO の制御板に同量の最終的な集中にそれぞれ。
- プレートにルート イメージングのための種を置いて、暗闇と寒さ (4 ° C) で 48 時間のそれらを分類します。
- 植物インキュベーター (長い一日 (16/8 h)、22 ° C、湿度 65%) で垂直位置に板を置く5 日間のためにそれらを育てます。
- 発芽 (dag) 後 5 日間は、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いた苗をイメージします。
- 手順 1 と 2、以下に示すように種子を滅菌を介して生成されたシロイヌナズナドライバー行記者の式をテストします。
- 幹
- 2.1.1 のように種子を殺菌します。½ MS、0.9% 工場寒天培地と 1% ショ糖板に種子を置きます。暗闇と寒さ (4 ° C) で 48 h の分類します。
- 発芽後 6 〜 7 日では、単一の鍋 (長い一日 (16/8 h)、22 ° C、湿度 65%) で各植物を土に苗を転送します。
- Dex やモックのソリューションと水遣り、Dex やモックのソリューションで植物をそれぞれ浸漬茎のトランス活性化を誘導します。
- 水まきのため 25 μ M Dex 水溶液の Dex がエタノールに溶解した 25 の mM の在庫から調製した水を使用します。誘導の目的の時間まで 2-3 日毎に水します。
- 浸漬について, 1 L ビーカー、Dex とモックの治療のためそれぞれ 0.02% silwet L-77 Dex や DMSO の相当額の 25 μ m を含む水の 750 mL を準備します。30 の単一の植物を浸し s 誘導またはモックのソリューション。画像の目的の時間まで 2-3 日毎に繰り返します。
メモ: 以下の浸漬、植物を 1 時間維持に湿度の高い必要がありますされます。
- シュート頂分裂組織 (SAM)
- 2.1.1 のように種子を殺菌します。½ MS、0.9% 工場寒天 1 %sucrose 培地と板を準備し、板に種子を置きます。闇と成層の寒さの中、2 日間のプレートを格納します。
- 植物インキュベーターで垂直にプレートを入れます。発芽後 6 〜 7 日は、土、単一の鍋 (長い一日 (16/8 h)、22 ° C、湿度 65%) で各工場に苗を転送します。
- 茎は約 1 cm 長く (25-30 dag)、花房サム 10-50 μ m スプレー Dex H20 顔のマスクを身に着けています。誘導および開発の後の段階で、長い茎の側面シュート SAMs を誘発します。
注: Sam ことができます paintbrushing による噴霧粒子を防ぐために Dex ソリューション。噴霧して Dex を適用する場合、マスクを使用しないでください。 - 誘導後、24-48 h SAMs を解剖し、イメージングに進みます (4.3 を参照)。
注: のみ非誘導植物伝播の遺伝子サイレンシングの確率を減らすために使用されました。T2 ・ T3 の植物は、画像に使用されました。
4.シロイヌナズナドライバー行記者式の画像。
- ルート
- プレートから 10 μ G/ml propidium ヨウ化 (PI) ソリューションに苗を転送し、カウンター 5 分、それらを染色します。
- 商工会議所をイメージング顕微鏡に根を置き (カバー ガラス II、1 ウェル培養室は、材料表を参照)、水浸対物レンズ × 63 顕微鏡共焦点レーザーを使用してそれらをイメージ (材料の表を参照してください)。
- PI 蛍光を視覚化、590 と 660 nm 間 488 nm と収集の発光の励起波長を使用します。MTurquoise2 蛍光 458 nm 励起を使用し、460 と 615 nm の発光を収集します。
- 幹
- かみそりの刃で植物の茎の部分を切って水平手を実行をカットする目的の部分の反対側に指で幹を修正、セグメントの約 3 cm の常套します。いくつかの細かいカットを順番に実行しますが、茎の同じような位置からのセクションのみを比較する必要があることに注意してください。
- 各カット後水道水の入ったシャーレに黒人の茎切片を収集します。この時点でのセクションを染色や顕微鏡スライドに直接マウントします。
- 染色、250 μ g/mL の小さなシャーレの水の PI 溶液の 1 mL を準備 (材料の表を参照してください)。5 分間のセクションを浸すし、水でそれらをすすいでください。微細鉗子で顕微鏡のスライドや細かいペイント ブラシに転送します。サンプルは、coverslip を絞ることを注意してください。
- 共焦点走査型レーザー顕微鏡 25 x の水浸漬レンズを浸漬を使用したサンプルの画像 (材料の表を参照してください)。使用 561 nm のレーザー光に PI 蛍光励起、620 570 から集める nm。ドライバーによってエンコードされた mTurquoise2 fluorophore エフェクターを刺激する使用 405 nm ラインの構造と 425 から 475 へ排出量の収集 nm。
- メリステム
- 鉗子でシュート先端の下 2 cm の茎をカットします。片手で茎を保持し、花のつぼみと大原基を削除する微細鉗子を使用します。若い原基を削除するには、3% の agarose を含むペトリ皿に直立位置で SAM を解決します。両眼と鉗子を使用して、SAM に近い若い原基を削除します。また、注入カニューレを使用 (材料の表を参照) これらの原基を遮断します。
- 5 ~ 10 分染色染色準備のサムの上に液を数滴をピペットで直接いずれか実行 250 μ g/mL PI ソリューションで切り裂かれたサムを染色または染色液で満たされたチューブにサンプルを転送します。維持 SAM は、染色手順中に完全に水没。
- 小さいペトリ皿にステンド グラスの SAM の場所 (材料の表を参照してください) 3% の agarose 媒体とカバー SAM ddH2o.
- 画像解剖共焦点レーザー顕微鏡水浸漬レンズを浸漬 x 25 装備サムス (材料の表を参照してください)。
- 使用 561 nm のレーザー光に PI 蛍光励起、620 570 から集める nm。475 への 425 から、mTurquoise2 の fluorophore と収集の放出を刺激する使用 405 nm nm。
0.5 μ m のステップ サイズの z 方向に 50 μ m にまたがる画像のスタックを記録します。
注: SAM イメージングここで説明が必要走査顕微鏡と (ここでは、レンズを浸漬水) レンズ長作動距離を持つ直立した共焦点レーザー。
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Representative Results
GreenGate クローニングを介してドライバーとエフェクターの行の世代
クローニング システム GreenGate、GoldenGate のクローニングとBsaタイプ IIS の制限の endonuclease の使用に基づいて私またはその isoschizomerエコ31I。その不斉認識のサイトでオーバー ハングの基本組成から遠い酵素生成張り出しが自由にすることができます選択すると、基礎となるシステムのモジュールを形成します。PCR 生成した要素、たとえば、プロモーター、CD、または終端文字、各最初、モジュールを生成する制限のダイジェストのプロデュースのオーバー ハングに一致する指定されたエントリ ベクトルに挿入されます。Subcloning 後、一致するモジュール、通常六つの数、バイナリー デスティネーション ベクトルの構成要素のアセンブリの結果 GreenGate ligation の反作用のために使用されます。
ドライバーの線、組織固有のプロモーター (pTS)、GR LHG4 転写因子、 pOp6プロモーター、mTurquoise2 レポーターの dna 塩基配列を含んでいるモジュールは、N 末端のシグナルペプチドに融合し、C 末端 ER の保持信号以前2,8 (図 2) を説明するように、遺伝子組換え選択モジュールとさまざまなアダプタ モジュール ターミネータを融合しました。エフェクターが建設され、 pOp6プロモーターとエフェクター カセット、たとえば形質転換植物の選択 (図 2) の抵抗性遺伝子をエンコード モジュールと同様、興味およびターミネーターの遺伝子から成る。
ドライバーの行とのレポーター蛍光可視化誘導
Dex と誘導ルート内皮の細胞型特定 mTurquoise2 発現につながる (pSCR>> SP mTurquoise2 HDEL、図 3 a)、師部前駆体とひこばえ (pSMXL5>> SP mTurquoise2 HDEL 17、 図 3B) と茎頂で幹細胞 (pCLV3>> SP mTurquoise2 HDEL 18図 3)。
穂木のデンプン鞘細胞における VND7 のトランス活性化
トランス活性化のテストケースとして二次細胞壁マスター転写因子 VND7 融合 VP16 活性化ドメインは、自律的に二次細胞壁形成を誘導するために示されているエンコード エフェクターの行を生成します。misexpressed 8,9,19,20。
誘導の Dex や DMSO の 15 μ M またはモックの植物のいずれかで 1 つの治療の 5 日後, 茎切片はデンプン鞘における異所性木質化の可視化のために準備されました。木の組織に幹の強い親和性で Propidium ヨウ化を示しています。デンプン鞘細胞誘導デックス、試料が PI チャネルと細胞の強力な信号を示したモックではなく木部細胞 (図 4) で細胞壁の典型的な網状の肥厚を示します。
図 1。原則をクローニング GreenGate。A) 種類 IIS の制限エンドヌクレアーゼ、 Bsaのような私/エコ31I、非回文シーケンス (赤) を認識し、シーケンス (青) とは無関係に定義された距離の非対称カットします。エコ31I 'GGTCTC' を認識し、認識サイトの 2 番目ヌクレオチド下流からのカット、4 つ基本 5' 突出部分を作成します。システムのクローン作成 B) GreenGate は、六つの異なるエントリ ベクトルの pGGA000 pGGF000 とモジュラー システムに基づいています。これらのベクトルはアンピシリン耐性カセット (AmpR) を含み、 ccdBカセット並ぶ各エントリ ベクトル (例えば pGGA000 エントリ ベクトル) と 'GGTCTC'エコ31I 認識のための特定のアダプターのサイト。PGGA000 のエコ31I 消化は、 ccdBを解放し、pGGA000 固有の 4 塩基オーバー ハング (紺) を作成します。Insert1 は、'GGTCTC' と pGGA000 の特定のアダプターをかくまっているプライマーと pGGA000 に消化後に増幅されています。同じプロシージャの後に、他のモジュールが続きます。C) 最終 GreenGate 反応は、先のベクトル pGGZ001 と六つの入力ベクトルの pGGA000 pGGF000 のエコ31I 消化とキャスト先のベクトルにすべてのモジュールの同時結紮を兼ね備えています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。ドライバーとエフェクターの線で Dex 誘導 LhGR/pOp システムの概要です。ドライバーの行に組織特異的発現プロモーター (pTS) 制御ラット グルココルチコイド受容体 (GR) のリガンド結合ドメインに融合並進とそれによって防止、デックスの不在で合成転写因子 LhG4、式核移行。エフェクター ラインは、ポップの要素と最小限35Sプロモーターと TATA ボックスによって駆動される転写カセットを隠し持っています。ドライバーの行と Dex 誘導時に交差、GR LhG4 バインド記者カセットでポップ型の要素に、これらエフェクター モジュールの mTurquoise2 とエフェクターの転写を誘導します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。根、茎、およびサムの誘導ドライバー ライン。A) ドライバーの誘導ラインpSCR >>SP mTurquoise2 HDEL (50 μ M で発芽させた Dex) ルートとモックの治療。かかしプロモーター (pSCR) は、内皮、皮質/内皮初期における式 (CEI) および静止センター (QC) を仲介します。細胞は propidium ヨウ化 (PI) カウンター ステンド グラスです。スケール バー = 20 μ m. B) ドライバーの誘導ラインpSMXL5 >>SP mTurquoise2 HDEL (50 μ M Dex 溶液浸漬して 3 日後の可視化) の幹とモックの治療。SMXL5プロモーター (pSMXL5) は、ひこばえ幹細胞ドメインおよび師部前駆体における発現を仲介します。細胞は propidium ヨウ化 (PI) カウンター ステンド グラスです。スケール バー = 100 μ m. C) ドライバーの誘導ラインpCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 μ M、48 h) SAM で。CLAVATA3プロモーター (pCLV3) は、幹細胞ドメインにおける発現を仲介します。下の写真は、XZ と YZ 断面、誘導、模擬治療それぞれを表示します。細胞は propidium ヨウ化 (PI) カウンター ステンド グラスです。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。茎のデンプン鞘における異所性木質化の。A) 異所性木質化はドライバーのラインの Dex 誘導後 5 日間見られるpSCR >> VND7 VP16茎。かかしプロモーター (pSCR) は、茎でデンプン鞘細胞における発現を仲介します。左の画像は、PI チャネルと明視野、右図のみ PI チャネルの結合を示しています。B) モック コントロールはデンプン鞘細胞に信号を示しています。細胞は propidium ヨウ化 (PI) カウンター ステンド グラスです。スケール バー = 100 μ m。 PI 蛍光は偽色葉緑体中のグリーンの自己蛍光はすべてのイメージの赤。白い矢印は、デンプン鞘細胞をポイントします。左の画像は、PI チャネルと明視野、右図のみ PI チャネルの結合を示しています。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| モジュール | 5' 突出部分 | 通常のを使用 | 3' 突出部分 |
| A | ACCT | プロモーター | AACA |
| B | AACA | N 末端タグ | GGCT |
| C | GGCT | コーディング シーケンス | TCAG |
| D | TCAG | C 末端タグ | CTGC |
| E | CTGC | ターミネーター | ACTA |
| F | ACTA | 抵抗カセット | GTAT |
プライマー デザインのために使用される表 1: オーバー ハング
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Discussion
ここでは、生成および誘導型、セル型特定トランスの汎用性と包括的なツールキットを適用に必要な手順を述べる-活性化。ドライバーの行とポップのプロモーターの制御下でエフェクター カセットを運ぶラインを渡る F1 世代、幅広い種類の細胞で遺伝的摂動の迅速な評価を有効にすることで誤表現効果を勉強できます。また、エフェクターの構造は、ドライバーの行に変換する使用ことができます。 または、クローンの戦略、ドライバー、エフェクターを適応させることによって構築組み合わせることもできます 1 つの T-DNA に。アプリケーションからこのシステムの範囲の時空間制御ドメイン固有ノックダウンまたは遺伝子編集と細胞型特定の補完に誤表現学部。
ここで説明する手順のいずれもは、一般的な分子生物学の技術のための装備のラボへの挑戦を提起するべき。LhG4 式システム徹底的にテストされており、高に駆動することができます非水漏れやパワーバルブ式レベル8、されますが、我々 はインデューサ濃度のダイナミック レンジは、各ドライバーの経験的確定すべき注意モジュラー GreenGate クローニングとこの実証済みのシステムを組み合わせるエフェクター ラインの組み合わせが特定のプロモーターが提供されている任意のセル型で発現する迅速かつ簡単な方法を提供しています。我々 に気づいたその組換えpOp 型プロモーターの反復配列を含むプラスミドの増幅中にイベントが発生します。これらはしばしば PCR によって評価される OP シーケンスの少ない繰り返しを持っていることに起因します。最終構造は、大腸菌とアグロバクテリウムのシーケンスによって常に確認すべき。ただし、時折再結合イベントはエシェリヒア属大腸菌にのみ検出されました。
遺伝子組換え植物を生成する時間は、この技術のアプリケーションを制限すること。 遺伝子サイレンシング、T2 世代で起動テストしてだけ安定したラインを維持するために非常に重要です。サイレンシングのチャンスを最小限に抑える、種子だけフォーム非誘発植物採取をお勧めします。
ここで説明する手法は、包括的なリソースを提供し、発現の組織特異性を組み合わせた、無料トランス活性化システム21,22で。このメソッドの可能な未来の開発ドライブ GR LhG4、たとえば外メインの分裂組織により細胞型特異的発現プロモーターの混入であります。エフェクター、エキサイティングな可能な拡張編集を可能にする携帯型固有ノック アウト23ツール高効率遺伝子の適応です。
Schürholz ら 20188に記載されているドライバーの行 NASC (http://arabidopsis.info/) から利用できる DNA 構造説明で Lampropoulos ら、2013年2や Schürholz ら、2018年8 Addgene (https://www.addgene.org/) から入手できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 の研究室での仕事はドイツ研究振興協会 (DFG) によってサポートされている助成金ヲ 1660/6-1 (南西) におよび GR 2104/4-1 (T.G.) と (TG および J.U.L) に SFB1101 と欧州研究評議会によってコンソリ データ付与 (PLANTSTEMS 647148) T.G. 南西は DFG を通じて助成を 1660/2 エミー賞ネーター的な団体を通してサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
