Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مراكز استجواب جيرمنال أوتوريكتيفي الفردية بواسطة فوتواكتيفيشن في نموذج تشيميريك مختلط من المناعة الذاتية

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59397
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University

Summary

ويصف هذا البروتوكول توليد التركيبات نخاع العظام مورين مختلطة مع عفوية مراكز جيرمنال المناعة الذاتية، وفي أوتوريكتيفي التي تحمل لمفاوية مراسل فوتواكتيفاتابل البروتينات فلورية خضراء (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل). وهذا يوفر القدرة على ربط موقع الهاتف الخلوي في الأنسجة مع التحليلات الجزيئية ووظيفية المتلقين للمعلومات.

Abstract

أمراض المناعة الذاتية الحالي عبئا صحية كبيرة. أسئلة أساسية تتعلق بالتنمية والتقدم لأمراض المناعة الذاتية لا تزال دون إجابة. شرط واحد للتقدم في فهمنا للآليات المرض الكامنة وديناميات الخلوية هو اقتران دقيقة من موقع ميكرواناتوميكال لمجموعات فرعية الخلية مع التحليلات الجزيئية أو وظيفية المتلقين للمعلومات؛ هدفا تقليديا يصعب تحقيقه. تمكين وضع fluorophores البيولوجية فوتواكتيفاتابل مستقرة واندماجها في سلالات مراسل مؤخرا وسم ميكرواناتوميكال دقيقة وتتبع من المجموعات الخلوية في نماذج مورين. هنا، نحن تصف كيفية القدرة على تحليل الخلايا اللمفية أوتوريكتيفي من مراكز جيرمنال واحد قد تساعد على تقديم رؤى جديدة في المناعة الذاتية، باستخدام المزيج من طراز تشيميريك الرواية من المناعة الذاتية مع مراسل فوتواكتيفاتابل كمثال . علينا أن نظهر مختلطة إجراء لتوليد التركيبات مع أوتوريكتيفي عفوية جيرمنال المراكز المأهولة لمفاوية تحمل مراسل بروتين فلوري أخضر فوتواكتيفاتابل. استخدام استراتيجيات التوسيم في الحية، يمكن تصور واحد مراكز جيرمنال في الأنسجة اللمفاوية اكسبلانتيد وعلى فوتواكتيفاتيد المكونات الخلوية قبل يومين-فوتون مجهرية. لمفاوية فوتواكتيفاتيد من مراكز جيرمنال واحد يمكن تحليلها ثم أو فرز تدفق سيتوميتريكالي، كخلايا مفردة أو بكميات كبيرة، ويمكن أن يتعرضوا للتحاليل الجزيئية ووظيفية المتلقين للمعلومات الإضافية. مباشرة يمكن تطبيق هذا النهج على تقديم أفكار متجددة في مجال المناعة الذاتية، ولكن قد تجد الإجراء الخاص بتوليد التركيبات نخاع العظام والإجراء فوتواكتيفيشن بالإضافة إلى ذلك تطبيق واسع في الدراسات المتعلقة بالأمراض المعدية و ورم الانبثاث.

Introduction

حدوث أمراض المناعة الذاتية قد ارتفعت بسرعة في العقود الماضية، وبخاصة في المجتمعات الغربية. واليوم، أمراض المناعة الذاتية في صفوف الثالث على قائمة الأسباب الأكثر شيوعاً للإصابة بالأمراض ومعدلات الوفيات في العالم الغربي1. أسئلة أساسية تتعلق بالتنمية والتقدم لأمراض المناعة الذاتية لا تزال دون إجابة. شرط واحد للتقدم في فهمنا للآليات المرض الكامنة وديناميات الخلوية هو اقتران دقيقة من موقع ميكرواناتوميكال لمجموعات فرعية الخلية مع التحليلات الجزيئية أو وظيفية المتلقين للمعلومات. في العقد الماضي، قد مكن تطوير عدد من مستقرة fluorophores البيولوجي فوتوكونفيرتيبلي، أو فوتواكتيفاتابل، أو فوتوسويتشابل واندماجها في سلالات مراسل وسم ميكرواناتوميكال دقيقة وتتبع الخلوي مجموعات فرعية في نماذج مورين.

كايد، بروتين فلوري فوتوكونفيرتيبلي التي تنشأ من المرجان ستوني، يخضع فوتوكونفيرسيون لا رجعة فيه من الأسفار الخضراء للأسفار الأحمر عند التعرض ل الضوء فوق البنفسجي أو الأشعة فوق البنفسجية2. في البداية يعملون على اتباع السلوك الديناميكي للخلايا الفردية في تطوير أورجانوتيبيك الدماغ شرائح3، جيل كايد خبط في الماوس يسمح فيما بعد رصد الحركة الخلوية الحية في، والنظام تم تطبيقها على تحليلات الخلايا المناعية الهجرة من وإلى العقد الليمفاوية4. وكان هذا النهج المكرر في وقت لاحق مع مراسل من الجيل الثاني5. مراسل مماثلة هو ديندرا6، التي استخدمت مؤخرا لتعقب الانبثاث العقدة الليمفاوية في فيفو7.

وكان البروتين فوتواكتيفاتابل الأولى وضعت أخضر فلورسنت بروتين (بروتينات فلورية خضراء) هندسيا مع طفرة نقطة واحدة (T203H)، مما أدى إلى امتصاص منخفضة جداً في منطقة الطول الموجي من 450 إلى 550 نيوتن متر8. بعد فوتواكتيفيشن بالضوء فوق البنفسجي، يبدل هذا البروتين فوتواكتيفاتابل أخضر نيون (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) استيعاب الحد الأقصى من 400 ~ إلى ~ 500 نانومتر، تسفر عن كثافة 100-fold تقريبية زيادة عندما متحمس مع طول موجه 488 نانومتر. يسمح توليد الفئران المعدلة وراثيا التي أعرب جميع الخلايا المكونة للدم السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، للمرة الأولى، تحليلات متعمقة لتحديد الخلية بفي مناطق الضوء والظلام تشريحيا محددة من مركز جيرمنال9.

حين فوتواكتيفيشن تحويل الذي لا رجعة فيه من دولة غير الفلورية إلى دولة فلورسنت، وفوتوكونفيرسيون انتقال ذهابا من طول موجي واحد إلى آخر، البروتينات فوتوسويتشابل قادرون على رحلات مكوكية بين كلا الشرطين10 . كان تسخير هذه الصفة الأخيرة مؤخرا لهندسة التحكم الضوئية ل نشاط البروتين11.

استخدام المراسل السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، ونحن مؤخرا تتميز مبدع الخلية بواحد مراكز جيرمنال في نموذج رواية للمناعة الذاتية مثل الذئبة عفوية12. يستند هذا النموذج إلى التركيبات المختلطة مع نخاع العظام جزء 1 إيواء أوتوريكتيفي خلية بمستقبﻻت طريقة الكبس مع خصوصية لمجمعات ريبونوكلير بالبروتين (564Igi،من13،14) جنبا إلى جنب مع نخاع العظام 2 أجزاء من أي المطلوب المانحة. في حوالي 6 أسابيع بعد إعادة تشكيل، تتحقق شروط التماثل الساكن في أوتوريكتيفي العفوية التي جيرمنال المراكز موجودة في الطحال والعقد اللمفاوية الجلدية. جدير بالذكر أن مركز جيرمنال السكان بخليه حصرا تقريبا (~ 95 ٪) تتألف من الخلايا المشتقة من حجرة غير 564Igi، وأصبحت هذه الخلايا المستمدة من النوع المتوحش ب أوتوريكتيفي. ولذلك، يسمح النموذج نهج 'التوصيل والتشغيل' إلى تحليلات لمركز جيرمنال أوتوريكتيفي ب الخلايا باستخدام مختلف المتسلسلات وطرق الرافضة والصحفيين. هنا، يمكننا وصف الإجراء لتوليد التركيبات المختلطة مع مراكز جيرمنال أوتوريكتيفي عفوية يسكنها لمفاوية تحمل المراسل السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. استخدام استراتيجيات التوسيم في الحية، يمكن تصور واحد مراكز جيرمنال في الأنسجة اللمفاوية اكسبلانتيد وفوتواكتيفاتيد المكونات الخلوية استخدام مجهر اثنين-فوتون. لمفاوية فوتواكتيفاتيد من مراكز جيرمنال واحدة يمكن فيما بعد تحليلها بواسطة التدفق الخلوي أو فرز حسب فلوروتشرومي تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) وتعرض للتحاليل الجزيئية ووظيفية المتلقين للمعلومات الإضافية. القدرة على تحليل الخلايا اللمفية أوتوريكتيفي من مراكز جيرمنال واحدة مباشرة يمكن تطبيقها على تقديم أفكار متجددة في مجال المناعة الذاتية، ولكن التقنيات والنهج الموصوفة بالإضافة إلى ذلك قد تجد التطبيقات ذات الصلة في دراسات الأمراض المعدية والورم الانبثاث.

Protocol

استخدام الحيوانات جميع تتفق مع المبادئ التوجيهية "الجماعة الأوروبية" ووافقت مديرية البحوث الحيوانية الدانمركية (2017-15-0201-01348).

1-تربية الماوس العامة وإعداد المخازن المؤقتة وأدوات

  1. الماوس البيت خطوط حرة ظروف (منتدى جنوب المحيط الهادئ) الممرض محددة، مع الرصد الدوري للحالة الصحية وفقا للمبادئ التوجيهية الموحدة.
  2. اختياري: التحقق من عدم وجود مراكز جيرمنال عفوية في الفئران السذاجة نظراً لعدم رصد الإصابات العارض. هذا يمكن أن يتم أما عن طريق مجهر الفلورة (وجود هياكل مركز جيرمنال) أو التدفق الخلوي (تواتر خلايا مركز جيرمنال ب) كما هو موضح سابقا12.
    ملاحظة: أما الإناث أو الذكور يمكن استخدامها. عموما، أنها مثالية للجنس تطابق الجهات المانحة والمتلقية، عدم تطابق نوع الجنس يمكن أن يؤدي نظرياً إلى اللوريكتيفيتي نحو الذكور Y-المستضد الإناث المستفيدين/الجهات المانحة15.
  3. استخدام المستلمين CD45.1 (B6. سخل-بتبرك بيبكب/BoyJ) في حوالي 6-10 أسابيع من العمر. استخدام 564Igi (B6. كجيغtm1 تيك (Igh564)إيجكtm1 تيك (Igk564)/J) والسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) المانحين في 6-12 أسبوعا عمر.
  4. تعقيم الأدوات الجراحية (مقص الغرامة مباشرة والملقط دومون #5 و #7) قبل التعقيم لهم وفقا للمبادئ التوجيهية للتعقيم الروتينية.
  5. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت نخاع العظم (بي أم) التي تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 2% مصل بقرى الجنين (FBS)، وحمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) على درجة الحموضة 7.4. لإعداد المخزن المؤقت BM، قم بإضافة 10 مل من إبطال الحرارة (1 ساعة في حمام مائي 56 درجة مئوية لإلغاء تنشيط المتممة) FBS و 1.25 مل حل يدتا 400 مم (تعديل على درجة الحموضة 7.4) إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4 ومزيج جيد. قم بتصفية المخزن المؤقت باستخدام قارورة فلتر 0.2 ميكرون.
  6. إعداد 10 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل المخزن المؤقت (155 ملم NH4Cl, 12 ملم ناكو3، يدتا 0.1 ملم) بتمييع 1 مل أسهم 10 x إلى 10 مل حجم الإجمالي مع الكاشف الصف المياه. إعداد 50 مل من برنامج تلفزيوني مع 5 مم يدتا، درجة الحموضة 7.4.

2-إنشاء التركيبات المختلطة نخاع العظام

  1. تشعيع المتلقين (يوم 0)
    1. ضع المستلمين نخاع العظم CD45.1 في وعاء تشعيع مناسب ويتهددها مع 1,100 راد في إيرادياتور جاما.
      ملاحظة: يمكن استخدام مصادر الإشعاع البديلة. بغض النظر عن المصدر، قد الجرعة/التوقيت الأمثل تسفر عن تأثير ميلوابلاتيفي القصوى مع تلف الأنسجة الجانبية الحد الأدنى للحيوانات.
    2. مكان على المضادات الحيوية المياه متواصلة ad (1 ملغ من سولفاديازين و 0.2 مغ من مياه الشرب ميثوبريم/mL).
  2. استخراج العظام (1 يوم)
    1. تخدير الجهات المانحة نخاع العظم 564Igi بتدفق مستمر من 4% إيسوفلوراني في الهواء، و euthanize بخلع عنق الرحم. رذاذ أسفل الجهات المانحة مع الإيثانول ووضعها على منصات الجراحية المعقمة في هود التدفق. الشروع في العمل على المحافظة على ظروف معقمة، استخدام المخازن المؤقتة العقيمة والمعدات.
    2. لاستخراج عظم الفخذ والساق، أولاً إجراء شق حول الكاحل وتمتد صعودا وصولاً إلى الورك استخدام مقص غرامة على التوالي. استخدام ملقط ثقيلة أو الإبهام والأصابع الفهرس، سحب الجلد أعلى وإيقاف الساق نحو الجسم. وبالمثل سحب الجلد إلى أسفل والخروج القدم.
    3. موسيقى البوب من مفاصل الركبة والكاحل بالاستيلاء على الساق في الفخذ وسحب القدم قوة. المضي قدما لكسر في الكاحل مشتركة وسحب القدم اتجاه الجسم مع الاحتفاظ بالساق، وبالتالي تجريد الأوتار والعضلات خارج الساق.
    4. كسر في الركبة مشتركة للإفراج عن الساق، وكذلك سحب هذا نحو الجسم أثناء الضغط على لعظم الفخذ، وبالتالي تجريد الأوتار والعضلات قبالة عظم الفخذ. إجراء شق في الورك وقطع الأوتار، ثم سحب عظم الفخذ من مأخذ الورك. كرر الخطوات 2.2.2 – 2.2.4 للجانب كونترالاتيرال.
    5. تنظيف العظام بعناية عن طريق فرك لهم مع منشفة ورقية خشنة من أجل إزالة جميع العضلات والنسيج الضام المتبقية. ثم شطف لهم في المخزن المؤقت BM المثلج قبل أخيرا نقلها إلى المخزن BM الباردة الطازجة على الجليد باستخدام زوج من الملقط دومون #7. كرر الخطوة 2، 2 للمانحين السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل.
      ملاحظة: يختلف عدد خلايا نخاع العظم من متبرع واحد وفقا للجنس والعمر. مقياس عدد الجهات المانحة وفقا لنسب نخاع العظام الإدخال المطلوب والأرقام والعدد المطلوب من المستلمين. إذا كانت الجهات المانحة النادرة، يمكن أن تكون أطرافه الجبهة مضمنة لاستخراج نخاع العظام. هذا عادة ما تؤدي 1/3 إضافية إلى نصف الخلايا التي تم الحصول عليها من أطرافه هند. عادة، في أي مكان من 50 مليون من الخلايا يمكن استرداد كل المانحين، حسب العمر والجنس، والخلفية، وعما إذا كانت مدرجة إلا هند أو هند وأطرافه الجبهة.
  3. استخراج خلايا نخاع العظام
    1. إعداد قذائف الهاون قبل الشطف في المخزن المؤقت BM المثلج. واستنزاف المخزن المؤقت شطف تستخدم وحدة تحكم ماصة كهربائية مع ماصة مصلية 10 مل إضافة 10 مل مخزن BM المثلج الطازجة.
    2. نقل العظام من المانحين 564Igi باستخدام زوج من الملقط دومون #7 قذائف الهاون واستخدام المدقة لسحق وطحن العظام للإفراج عن نخاع العظام. نضح استخراج نخاع العظام مع ماصة 10 مل مصلية ويمر عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل على الجليد.
    3. إضافة 10 مل إضافية من المخزن BM المثلج الطازجة إلى قذائف الهاون، وكرر لضمان الانتعاش الكامل من الخلايا. إزالة المواد العظام من قذائف الهاون مع منشفة ورقية وتجاهل على نحو ملائم، وشطف هاون بعناية مع الإيثانول 70 في المائة، تليها BM المخزن المؤقت. كرر الخطوة 2، 3 لمجموعة المانحين نخاع العظام السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل.
  4. عد الخلايا نخاع العظام
    1. استخدام ميكروبيبيتي، مكان معالجة تجميعية تحتوي على 40 ميكروليتر ربك تحلل المخزن المؤقت على قطعة من البلاستيك البارافين الفيلم. عكس أنبوب نخاع العظم 564Igi عدة مرات وإخراج 10 ميليلتر الكوة باستخدام ميكروبيبيتي. مزجها مع ميليلتر 40 من ربك تحلل إسقاط المخزن المؤقت.
    2. بعد ذلك إضافة 50 ميليلتر من تريبان الأزرق (0.4 في المائة في المحلول) إلى الانخفاض. مباشرة تحميل 10 ميليلتر من المزيج الناتج في هيموسيتوميتير بوركير-تورك والعد تحت المجهر. حساب عدد الخلايا كل مل، باستخدام 10 × معامل إضعاف إجمالي. تأكيد بقاء الخلية الملائمة > 90%. كرر الخطوة 2، 4 للمجموعة المانحة نخاع العظام السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل.
  5. إعداد تعليق المانحين
    1. استناداً إلى التهم التي تم الحصول عليها في الخطوة 2، 4 والعدد المطلوب من المستلمين، حساب حجم المانحة نخاع العظم من كل مجموعة من المجموعات المانحة اثنين لتكون مختلطة في أنبوب المزيج المانحين.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لإنشاء مجموعة واحدة من 564Igi:PA 1:2 المختلطة-التركيبات بروتينات فلورية خضراء مع المستلمين CD45.1 6: كل مستلم يتطلب 20 × 106 المانحة مجموع الخلايا، 564Igi جزء 1 و 2 أجزاء السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. وهكذا، وهذا يتطلب 6 x 1/3 × 20 × 106 = 40 × 106 564Igi المانحة الخلايا و 6 x 2/3 × 20 × 106 = 80 × 106 السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء المانحة الخلايا.
    2. مزيج من المبالغ المناسبة من النخاع المانحة السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، و 564lgi في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي خليط نخاع العظام في 200 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق باستخدام دلو دوار يتأرجح.
    3. صب المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت BM المثلج في كثافة 1 × 108 خلايا كل مل. نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي بريكوليد 1.5 مل على الجليد.
  6. إعادة تشكيل المستلمين نخاع العظام مع الجهات المانحة نخاع العظام
    1. تخدير المستلمين باستخدام تعريفية مع تدفق مستمر من 4% إيسوفلوراني في الهواء، متبوعاً بالصيانة في 3.75 في المائة. تحقق من الطائرة كافية للتخدير بغياب منعكس تو-قرصه.
    2. عناية نفض الغبار على أنبوب يحتوي على مزيج نخاع العظام لضمان استثارة كافية من خلايا نخاع العظام، ثم ميليلتر aspirate 200 من مزيج نخاع العظام (~ 20 × 106 خلايا)، في 0.3 مل، قياس 30 حقنه الأنسولين.
    3. مكان المستلم على جانبها، تمتد برفق الجلد أعلى وأسفل العين قليلاً 'بوب العين بها'، وإدراج غيض المحاقن بلطف تقريبا بزاوية 30 درجة إلى الجزء الأمامي محجر العين، مع الحرص على تجنب العين والأنسجة المحيطة بها. عندما تشعر غيض الإبرة للمس عظم يؤكد تجويف العين، تتراجع قليلاً (~0.5 ملم) وحقن نخاع العظام المانحة استخدام الضغط المستمر ببطء.
      ملاحظة: هناك يجب أن يكون لا نزيف، لا تسرب السوائل ولا إلى انتفاخ ضئيل للغاية من العين عند الحقن.
    4. العودة الماوس إلى القفص بالماء متواصلة للمضادات الحيوية والتحقق من الاسترداد الفوري من الإجراء. كرر الخطوة 2، 6 لكل مستلم.
      ملاحظة: يمكن استخدام حقن الوريد الذيل بدلاً من حقن ريتروربيتال مع نتائج مماثلة، ولكن في أيدينا أنها أبطأ بكثير، التي قد تكون مصدر قلق عند العمل مع مجموعات كبيرة من المستلمين. وينبغي تجنب استرداد حيوانات فظاعتها مباشرة على الأسرة الصغيرة القطر كما أنها تشكل خطرا الطموح والخنق
  7. إزالة المياه المضادات الحيوية (14 يوما)
    1. إزالة الماء المضادات الحيوية من cage(s) واستبدالها بمياه الشرب العذبة العادية.

3-التحقق من إعادة تشكيل ناجحة والتحقق من درجة مناسبة من تشيميريسم (الأسبوع 6)

  1. ريتروربيتال نزيف من التركيبات وعناصر التحكم
    1. إعداد أنابيب جمع الدم بوسمها 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي وفقا لأرقام علامة الإذن المتلقية وإضافة 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 مم يدتا.
      ملاحظة: تشمل الضوابط المناسبة للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، و CD45.1 و CD45.2 9 11 (إيديوتيبي). وهذا يمكن القيام به بما في ذلك 1 السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء + الماوس والماوس CD45.1 1، 1 B6 الماوس والماوس 564Igi 1.
    2. تخدير الفئران والتحقق من الطائرة كافية للتخدير كما في الخطوة 2.6.1. مكان الوهم على جانبها، تمتد برفق الجلد أعلى وأسفل العين قليلاً 'بوب العين بها'.
    3. برفق إدراج أنبوب شعري هيبارينيزيد (60 ميليلتر حجم داخلي) ملفوفة بوبيت تقريبا بزاوية 40 درجة في الجزء الأمامي محجر العين، مع الحرص على تجنب الأضرار بالعين والأنسجة المحيطة. بلطف تويست/تدوير الأنبوب حتى يبدأ في ملء مع الدم.
    4. تسمح الدم سلبية ملء الأنبوب بعمل شعري، حتى كامل تماما تقريبا، ثم سحب الأنبوب ووضعه في أنبوب جمع المسمى قبل المقابلة، بينما في نفس الوقت مباشرة تخفيف قبضة حول السماح للعين بالعين تسوية العودة إلى الموقف. نزيف يجب أن يتوقف فورا.
    5. ضمان أن الأنبوبة الشعرية وقد أفرغت في أنبوب جمع وتخلص منه في حاوية الأدوات الحادة. إغلاق الأنبوب وعكس ثلاث مرات لضمان خلط كاملة مع برنامج تلفزيوني/يدتا.
    6. العودة الماوس إلى القفص والتحقق من الاسترداد الفوري من الإجراء. كرر الخطوة 3، 1 لكل الماوس التجريبية وعناصر التحكم المناسبة.
      ملاحظة: أخذ الحيطة والحذر عند استخدام ثقب الوريد اللهاة بهذا الأسلوب قد تشكل خطرا أكبر للإصابة العارض في المستلمين المشع قبل هذه يتم تشكيلها تماما. وعلاوة على ذلك، في تجربتنا، نجد أن حجم الدم التي تم جمعها، وكمية الدم المفقودة بسبب النزيف أكثر تقلباً. كل من هذه الاعتبارات هامة، التركيبات نخاع العظام حساسة في مرحلة إعادة تشكيل، قبل انجرافتيد نخاع العظام جديدة تماما وقد استأنف هيماتوبويسيس المستويات العادية.
  2. تنقية الدم المحيطية وحيدات النوى الخلية (ببمك)
    1. بعد انتهاء جمع الدم، بإيجاز (10 ق) الطرد المركزي هذه الأنابيب على سرعة منخفضة (< 200 x ز) جمع المخفف استقر الدم في الجزء السفلي من الأنابيب.
    2. ملء حقنه 10 مل مع اللمفاويات فصل المتوسطة ونعلق إبرة 18 جرام. أدخل الإبرة إلى الجزء السفلي من الأنبوب الأول وأونديرلايير عينة الدم مع 1 مل من اللمفاويات فصل المتوسطة. بعناية سحب الإبرة والقضاء عليه مع منشفة ورقية لمنع التلوث عبر العينة التالي.
    3. المضي قدما من خلال جميع العينات، ثم الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة على 800 x ز، في درجة حرارة الغرفة، في أجهزة الطرد مركزي في دلو يتأرجح، مع الفرامل تعيين إلى منخفض/إيقاف تشغيل.
    4. إعداد مجموعة من المقابل المسمى 1.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على 1 مل من كل المثلج العازلة BM.
    5. عقب الطرد المركزي، لكل عينة، أدخل الطبقة العليا (البلازما) مع ميكروبيبيتي 200 ميليلتر ونضح طبقة الخلايا وحيدات النوى (الشركات متعددة الجنسيات) فقط فوق الواجهة. نقل الخلايا إلى الأنبوبة المسماة في المقابل يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت BM. إغلاق الغطاء وعكس إلى المزيج. تجاهل الأنبوبة المحتوية على المتوسطة فصل اللمفاويات.
    6. المضي قدما من خلال جميع العينات وثم الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية في دوار دلو يتأرجح. نضح وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من المثلج BM العازلة. العينات جاهزة الآن لتلوين الأجسام المضادة وتحليل تدفق سيتوميتريك.
  3. تلوين لتقييم تدفق سيتوميتريك
    ملاحظة: اقترح الفريق: CD45.1-فيتك، B220-بيركب-Cy5.5، 9 د 11-A568، CD45.2--آسيا والمحيط الهادئ. تم الكشف عن عدم تنشيط السلطة الفلسطينية التجارة والنقل في قناة اللون البرتقالي (أو ما يعادلها) المحيط الهادئ. مطلوب لا صبغة الجدوى كما فصل اللمفاويات يتخلص من الخلايا الميتة.
    1. استخدام ميكروبيبيتي، إضافة 100 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة وكذلك لكل عينة الوهم والتحكم، لوحة 96-جيدا.
    2. لعينات مراقبة غير السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء 3، تجمع ميليلتر 100 المتبقية لكل عينة (إجمالي 300 ميليلتر). إضافة 50 ميليلتر من هذه المواد لمراقبة أونستينيد وآبار مراقبة الملون واحدة. بالإضافة إلى ذلك للسيطرة على السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء الملطخة بمفرده إضافة 50 ميليلتر من أونستينيد السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء عينة.
    3. لكل بئر، إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت (أونستينيد)، واحد جسم (ضوابط التعويض الملطخة بمفرده، باستثناء مراقبة تعويض السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء) أو مزيج الأجسام المضادة (عينات). تبني على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    4. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار من المخزن المؤقت. إضافة 200 ميليلتر BM المخزن المؤقت لكل بئر والطرد المركزي مرة أخرى يغسل. ونفض الغبار خارج المخزن المؤقت ريسوسبيند الخلايا في كل بئر في 200 ميليلتر BM المخزن المؤقت. العينات جاهزة الآن للتحليل المتعلق تدفق سيتوميتير (الشكل 1).
      ملاحظة: يمكن تحليل الاستجابات مركز جيرمنال في التركيبات في أي نقطة من 6 أسابيع فصاعدا.

4. في الحية وسم من الجيوب الأنفية المنطقة الهامشية/اختلال للمساعدة في تحديد المراكز جيرمنال واحد

ملاحظة: هذا البروتوكول هو أداءهم لقاطع/العرقوب (العقدة الليمفاوية المابضيه) والحقن في الوريد (رابعا، الطحال)، ولكن يمكن أن تختلف وفقا للموقع المستهدف.

  1. حقن قاطع الثنائي لتسمية العقدة الليمفاوية المابضيه
    1. تخدير الفئران كما هو الحال في الخطوة 2.6.1.
    2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، تمييع 2 ميليلتر من جسم CD169 الماوس لمكافحة الفئران المسمى PE في 18 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. ضع قطرات اثنين من 10 ميليلتر من كل من الخليط على قطعة من البلاستيك البارافين الفيلم. نضح كل قطره باستخدام حقنه الأنسولين 0.3 مل بإبرة قياس 30.
    3. حقن ميليلتر 10 من العلامات مزيج أما قاطع (أدخل مع الإبرة بزاوية 5-10 درجة مئوية في الجزء المركزي من قاطع، الدانية بدءاً من أصابع القدم، وأدخل الإبرة في منتصف الطريق تقريبا نحو الكعب) أو في العرقوب (أدخل مع الإبرة في 5- 10 ° زاوية فقط فوق الكعب وإدراج حول في منتصف الطريق على طول على طول المحور العرقوب في الاتجاه نحو الركبة). تعود الفئران إلى اقفاصها وانتظر حوالي 15 دقيقة قبل الشروع في الخطوة 5.
  2. حقن الوريد لوسم الطحال
    1. تخدير الفئران كما هو الحال في نقطة 2.6.1.
    2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، تمييع 10 ميليلتر من جسم CD169 الماوس لمكافحة الفئران المسمى PE في 90 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. نضح الخليط مع حقنه الأنسولين 0.3 مل.
    3. أداء ريتروربيتال رابعا الحقن حسب الخطوة 2.6. تعود الفئران إلى اقفاصها وانتظر حوالي 15 دقيقة قبل الشروع في الخطوة 5.
      ملاحظة: كبديل إيسوفلوراني، حقن مخدر مثل يمكن استخدام مزيج الكيتامين/إكسيلازيني؛ ومع ذلك، يؤدي ذلك عادة إلى أوقات الانتعاش أبطأ. منذ اللمفاوي عموما تتأثر حركة العضلات الهيكلية، من المتوقع أن يؤدي إلى بطء صرف الوقت.

5-اكسبلانتينج الطحال والغدد الليمفاوية وإعداد فوتواكتيفيشن

  1. إعداد دائرة التصوير وفوتواكتيفيشن على الوجهين
    1. إزالة المكبس من حقنه 20 مل والعودة-تحميل أنه مع الشحوم فراغ عن طريق إدراج فوهة أنبوب الشفط الشحوم في ذلك. ثم إزالة المكبس من حقنه 5 مل واستخدام محقنة 20 مل للتحميل مرة أخرى أنها مع الشحوم فراغ.
    2. استخدام المحاقن فراغ-الشحوم 5 مل تحميل إعداد تصوير وغرفة فوتواكتيفيشن بوضع ساترة مربعة على سطح مستو والتتبع على طول حواف ساترة مع فراغ الشحوم (حوالي 1-2 مم من الحواف).
      ملاحظة: الحرص على تجنب التلوث الشحوم الفراغ من جميع الأسطح التي تتلامس في وقت لاحق مع عدسة المجهر، كما يمكن أن تلوث ميكرودروبليتس من فراغ الشحوم مستحلب في الماء الغمر العدسة.
    3. تملأ قاعة الشحوم فراغ في كشف الغطاء مع المخزن المؤقت BM المثلج ومكان على سطح مستو باردة.
  2. حصاد العقد الليمفاوية والطحال
    1. Euthanize الحية في المسمى تشيميريك الماوس ليتم تحليلها وفقا لخطوة 2.2.1. رذاذ أسفل الذبيحة مع الإيثانول 70%.
    2. للوصول إلى العقدة الليمفاوية المابضيه، استخدام مقص مستقيم غرامة جعل شق في الجلد أسفل الحفرة الركبة، وتمديد الخفض صعودا على طول السطر أوتار تقريبا حتى الورك. استخدام دومون #5 أو #7 الملقط، سحب كل من اللوحات تعرض للجلد إلى الخارج، تعريض الأنسجة في الحفرة المابضيه (الشكل 2A).
    3. استخدام زوج من الملقط دومون #5، أدخل الحفرة المابضيه الآنسي فقط إلى هذا السياق المابضيه بعناية وتشريح فتح الدهون بإدراج وفتح وإغلاق الملقط على طول محور الساق، بغية الكشف عن العقدة الليمفاوية المابضيه الكامنة.
    4. البوب العقدة الليمفاوية الخروج من الحفرة واسطة معسر في عضلة الفخذ من الجانب الأمامي الدانية للركبة باستخدام الإبهام والسبابة (الشكل 2). الاستيلاء على العقدة الليمفاوية من الأسفل مع الملقط تحريرها من الأنسجة المحيطة (الشكل 2)، وثم وضعه في الدائرة فراغ الشحوم بإعدادها في الخطوة 5، 1.
    5. كرر الخطوات 5.2.2 – 5.2.4 للجانب كونترالاتيرال. الغدد الليمفاوية متعددة يمكن تركيبها في دائرة واحدة إذا رغبت في ذلك.
    6. وأخيراً أغلق الدائرة بوضع ساترة ثانية على رأس ريم فراغ الشحوم والضغط بلطف إلى أسفل، مع الحرص على قذف جميع فقاعات الهواء.
      ملاحظة: بعض من المخزن المؤقت قد دفعت بها كذلك، ولكن ينبغي أن تشكل الشحوم فراغ ختم ضيق، منع تسرب السوائل (الشكل 2D). العقد اللمفاوية الآن في غرفة تصوير على الوجهين.
    7. للوصول إلى الطحال، باستخدام زوج من مقص مستقيم غرامة جعل شق من خلال جدار البطن في الجانب الأيسر من الماوس، الأقرب إلى الخط الأمامي الآنسي، فقط أدناه القفص الصدري، وتمتد من جميع أنحاء الجسم إلى الخط الابطي الخلفي. ينبغي أن يكون غيض الطحال مرئية (الشكل 3A).
    8. سحب الطحال مع زوج من الملقط دومون #7 وقطع الالتصاقات على الجانب السفلي الإفراج عنها. استخدام زوج مقص مستقيم غرامة لقص ~ 2 مم سميكة، مستعرضة، شرائح.
    9. ضع الشريحة في الدائرة فراغ الشحوم بإعدادها في الخطوة 5، 1. شرائح الطحال متعددة يمكن تركيبها في دائرة واحدة إذا رغبت في ذلك.
    10. وأخيراً أغلق الدائرة بوضع ساترة ثانية على رأس ريم فراغ الشحوم والضغط بلطف إلى أسفل، مع الحرص على قذف جميع فقاعات الهواء. إبقاء جميع الدوائر التصوير على الجليد في جميع الأوقات، فيما عدا أثناء التصوير وفوتواكتيفيشن.
      ملاحظة: بعض من المخزن المؤقت قد دفعت بها كذلك، ولكن ينبغي أن تشكل الشحوم فراغ ختم ضيق، منع تسرب السوائل. شرائح الطحال الآن في غرفة تصوير على الوجهين (الشكل 3B).

6-فوتواكتيفيشن

  1. تحديد مراكز جيرمنال واحد
    ملاحظة: هذا البروتوكول هو وصف للطحال، ولكن هو مماثل تماما للعقد اللمفاوية.
    1. المكان قاعة التصوير على المسرح المجهر. استخدام ماصة نقل بلاستيك 3.5 مل، ضع قطره ماء المقطر على رأس ساترة العلوي وانخفاض الهدف حتى نقطة الاتصال. التركيز على رأس الأنسجة باستخدام الضوء المنقولة.
    2. قم بالتبديل إلى وضع الظلام والإثارة اثنين-فوتون، وضبط الليزر إلى 940 نانومتر.
      ملاحظة: مع مجموعات التصفية المناسب، هذا الطول الموجي تراخيص الإثارة والكشف عن الجيل الثاني التوافقيات في الهياكل التي تحتوي على الكولاجين المرتبطة بالسفن الرئيسية والعناصر الهيكلية، فضلا عن CD169-PE حقن في الخطوة 4-2، التي ويحدد منطقة هامشية. ومع ذلك، لا 940 نانومتر الإثارة لا فوتواكتيفاتي السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل.
    3. تعريب فرادى المناطق اللب الأبيض (المحاط تلطيخ CD169-PE) قرب سطح الأنسجة، وتحديد غمد بيريارتيريولار اللمفاوية (الزملاء، منطقة الخلية T) بتوليد التوافقيات الثانية المرتبطة arteriole المركزية. في منطقة بين الزملاء ومنطقة هامشية، ابحث عن وجود درجة عالية من أوتوفلوريسسينت، تنشيط الضامة تينجيبلي الجسم (إشارة قوية أوتوفلوريسسينت في جميع القنوات، وظهور مثل النقطة مع vacuoles الظلام) (الشكل 4 أ).
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، بسبب اتجاه غير مرغوب فيه للأنسجة، يمكن أن يكون انعكاس قاعة التصوير والتصوير يمكن أن يؤديها من الاتجاه الآخر.
    4. استناداً إلى السمات المميزة التي تم تحديدها في الخطوة 6.1.3.، رسم منطقة الاهتمام تحديد منطقة واحدة في وسط جيرمنال. إعداد Z-كومة من حوالي 100-150 ميكرومتر العمق، بدءاً من سطح النسيج، واستخدام حجم خطوة ~ 3 ميكرومتر.
    5. قم بالتبديل إلى 830 الطول الموجي الإثارة نانومتر. إيقاف تشغيل أو تعتيم جميع القنوات لمنع د إلى الكشف عن (الليزر السلطة والأسفار الإخراج عادة أعلى كثيرا في هذا الطول الموجي)، وثم 'صورة' المكدس.
      ملاحظة: إعدادات معينة، مثل الليزر بكسل والسلطة يسكن الوقت، تعتمد على العمق في الأنسجة والأنسجة محددة تستخدم نظام التصوير. وقد كل التطبيق الأمثل لنظام التصوير المحددة المستخدمة. وفي حين أنه من الضروري للحصول على كفاءة فوتواكتيفيشن في جميع أنحاء المكدس، ينبغي الحرص لا إلى د الخلايا.
    6. قم بالتبديل مرة أخرى إلى 940 الطول الموجي الإثارة نانومتر وفتح القنوات. المسح الضوئي من خلال المكدس لتأكيد كفاءة فوتواكتيفيشن في جميع أنحاء (الشكل 4 باء) وغياب د (منتشر، يحدها من خلية غير إشارة السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، البقع الداكنة أو درجة عالية أوتوفلوريسسينسي في منطقة فوتواكتيفاتيد).
    7. انتقل إلى فوتواكتيفاتي جميع الأنسجة ذات الصلة في قاعة التصوير، ثم إعادته على الفور الجليد حتى مزيد من المعالجة. المضي قدما في فوتواكتيفيشن دوائر التصوير إضافية.
      ملاحظة: اكسبلانتينج النسيج والتركيب وخاصة فوتواكتيفيشن العمليات تستغرق وقتاً طويلاً، ولكن ينبغي أن تقتصر فترة الدوران الإجمالي على 4-6 ساعات، لمنع انخفاضا كبيرا في بقاء الخلية.

7-استعادة وتحليل الخلايا فوتواكتيفاتيد

  1. استخراج الخلايا الليمفاوية من الغدد الليمفاوية والطحال
    1. لكل عينة فوتواكتيفاتيد، وإعداد أنبوب ميكروسينتريفوجي تبعاً لذلك مسمى 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر من المخزن المؤقت BM على الجليد. وتشمل عينات من عنصر تحكم غير السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء وعدم تنشيط ماوس السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. يمكن أن يتحقق هذا بإدراج عنصر تحكم واحد B6 والسلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء واحدة التحكم الماوس.
    2. بعناية إزالة بكشف الغطاء العلوي من قاعة التصوير، مع الحرص على الحفاظ على موقف العينات (إذا كانت عينات متعددة موجودة في دائرة واحدة)، ومكان كل عينة في أنبوب العينة الخاصة به.
    3. استخدام الخالطون مدقة، الضغط الأنسجة وتطور المدقة في أنبوب للإفراج عن الخلايا الليمفاوية. استخدام ميكروبيبيتي، نضح وتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 الطازجة والمبردة مسبقاً. لعينات العقدة الليمفاوية، قم بالتخطي إلى الخطوة 7.1.5.
    4. لعينات الطحال، الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في دوار دلو يتأرجح. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من ربك تحلل المخزن المؤقت. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إضافة 800 ميليلتر من المثلج BM العازلة والمضي قدما إلى الخطوة 7.1.5.
    5. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في دوار دلو يتأرجح. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 200 ميليلتر من المثلج BM العازلة. العينات جاهزة الآن لتلطيخ لتدفق سيتوميتريك التقييم والفرز، وإذا رغبت في ذلك.
  2. تلوين لتقييم تدفق سيتوميتريك
    ملاحظة: اقترح الفريق: CD169-PE، B220-بيركب-Cy5.5، 9 د 11-A647، CD38-بي-Cy7، ويمكن حلها صلاحية صبغ افلور-780، الأزرق GL7 والمحيط الهادئ. تم الكشف عن عدم تنشيط السلطة الفلسطينية التجارة والنقل في قناة اللون البرتقالي (أو ما يعادلها) المحيط الهادئ. تم الكشف عن فوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل في قناة التجارة والنقل. يمكن استبعاد أي الضامة المنقي المشترك (الذي قد أو ربما لم يكن المجراة في المسمى مع CD169-PE) تلطيخ مع CD169 PE واستخدام ذلك كبوابة تفريغ.
    1. استخدام ميكروبيبيتي، إضافة 100 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة وكذلك لكل عينة الوهم والتحكم، في لوحة 96-جيدا.
    2. لعينات مراقبة B6، إضافة 50 ميليلتر من هذه المواد لمراقبة أونستاينيد وآبار مراقبة الملون واحدة. لمراقبة عدم تفعيلها الملطخة بمفرده السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل بالإضافة إلى ذلك إضافة 50 ميكروليتر من عينة السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل أونستينيد عدم تفعيلها. لمراقبة الملطخة بمفرده السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء المنشط، تجمع المواد المتبقية لجميع العينات التي فوتواكتيفاتيد.
    3. لكل بئر، إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت (أونستينيد ويتحكم في تعويض السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل)، واحد جسم (ضوابط التعويض الملطخة بمفرده) أو مزيج الأجسام المضادة (عينات فوتواكتيفاتيد). تبني على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    4. الطرد المركزي في 200 x ز 5 دقائق عند 4 درجة مئوية. نفض الغبار من المخزن المؤقت. إضافة 200 ميليلتر BM المخزن المؤقت لكل بئر والطرد المركزي مرة أخرى يغسل. ونفض الغبار خارج المخزن المؤقت ريسوسبيند الخلايا في كل بئر في 200 ميليلتر BM المخزن المؤقت. العينات جاهزة الآن لتحليل تدفق سيتوميتير أو أرز (النتائج الممثلة في الشكل 5).

Representative Results

جيل التركيبات المختلطة نخاع العظام

هذا البروتوكول يحقق قوة التركيبات نخاع العظام المختلطة مع تشيميريسم شبه كاملة في حجرة الخلية بكما هو مبين في النتيجة الممثل في الشكل 1 (للأهمية الإحصائية الرجاء الرجوع إلى 12). الأرقام الموحدة بخليه يكشف سيروتيبينج في 6 أسابيع بعد إعادة تشكيل (الشكل 1A)، مع تردد منخفض من 9 11 (إيديوتيبي) الخلايا ب تعميم الإيجابية المستمدة من حجرة 564Igi (الشكل 1B). داخل بوابة مجموع اللمفاويات، هناك تردد منخفض من الخلايا المشتقة من المستلم المتبقية، ~ 6% CD45.1 (Q1)، مما يشير إلى درجة عموما من تشيميريسم ~ 94% (الشكل 1). الحجرة داخل الجهة المانحة (CD45.1-، س 4 + س 3) نسبة 564Igi (Q4) للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل (Q3) هو حوالي 23% إلى 77%. وهذا انخفاضا طفيفا مما يفسر الإدخال نسبة 33 في المائة إلى 66 في المائة بالتحديد السلبية الثقيلة من الخلايا ب المستمدة من حجرة 564Igi 12. كما يظهر في الشكل 1، وهناك تشيميريسم كاملة تقريبا في حجرة الخلية ب (99.9% CD45.1-) وهيمنة السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء المشتقة من نخاع العظم خلايا ب (Q3)، الذي نتيجة لتحديد الخلايا ب المستمدة من 564Igi السلبية الثقيلة.

الحصاد من الأنسجة وتجهيزها وتدفق سيتوميتريك التقييم

الشكل 2 و الشكل 3 إثبات إجراءات ونتائج اكسبلانتينج طازجة معزولة الليمفاوية والطحال شرائح. ويعرض الشكل 4 نتيجة ممثل لوضع العلامات في الحية وفوتواكتيفيشن من منطقة واحدة في الوسط جيرمنال في شريحة طحال اكسبلانتيد. كما يمكن رؤية العلامات في المجراة مع CD169-PE لديها (الشكل 4A)، المسمى قوة منطقة هامشية (الأحمر، أشارت إلى جانب "MZ"). إشارة التوافقيات الثاني الظاهر في العناصر الهيكلية التي تحتوي على الكولاجين والسفن الرئيسية (الأزرق)، بما في ذلك أرتيريولي المركزية من غمد بيريارتيريولار اللمفاوية (الزملاء). عالية أوتوفلوريسسينت، تنشيط تينجيبلي الجسم الضامة المرتبطة بنشاط مركز جيرمنال (رؤوس). أخذت معا، يسمح تحديد منطقة هامشية، والزملاء والضامة تينجيبلي الجسم، تحديد منطقة فائدة التي يرجح أن تحتوي على مركز جيرمنال واحد. منطقة الاهتمام فوتواكتيفاتيد كما هو موضح في الشكل 4 باء. كما هو موضح، فوتواكتيفيشن هو ميكرواناتوميكالي الدقيقة9، تسفر عن منطقة محددة من التنشيط. النتائج المعروضة بالإضافة إلى ذلك بمثابة تأكيد لكثافة عالية من السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء + لمفاوية في التركيبات المعاد تشكيلها ووجود مراكز جيرمنال عفوية. تدفق المصب سيتوميتريك التقييم كذلك تؤكد أرقام حجرة سيتمتعون بالخليه (الشكل 5) ومركز جيرمنال عفوية سكان (الشكل 5E) ووجود مجموعة فرعية من مركز جيرمنال ب الخلايا التي تم فوتواكتيفاتيد (الرقم 5F).

وهكذا، هذا البروتوكول يقدم وسيلة قوية لجيل التركيبات نخاع العظام المختلطة مع أوتورياكتيفي عفوية مراكز جيرمنال، التي تتكون أساسا من البرية من نوع الخلايا ب المشتقة تحمل مراسل فوتواكتيفاتابل. وهذا يسمح بدوره لتحليل المتلقين للمعلومات من مراكز جيرمنال الفردية (نظرة عامة رسومية في الشكل 6).

Figure 1
رقم 1: تدفق التقييم سيتوميتريك لدرجة تشيميريسم في الدم 564Igi (CD45.1-، السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-): السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل (CD45.1-، والسلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء +) مختلطة التركيبات في دكت المشع CD45.1 المتلقين (CD45.1 +، السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-)، 6 أسابيع بعد إعادة تشكيل- عرض النابضة للخلايا B220 + B، وبوابات مسبقاً في الخلايا الليمفاوية القميص الأرض A). سوبجيت ب) من الأرض أ، عرض 9 11 + (إيديوتيبي) التردد داخل الخلية بالسكان. ج) الأرض من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل مقابل CD45.1، بوابات مسبقاً في الخلايا الليمفاوية القميص. د) الأرض من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل مقابل CD45.1 في سوبجيت بخليه من الأرض أ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الداخلي للحصاد وتصاعد المابضيه الليمفاوية للتصوير وفوتواكتيفيشن- A) شق هو تحت الركبة ومدد تصل إلى الورك، وهي سحب الحواف للجانبين، من أجل فضح الحفرة المابضيه (رأس السهم). فتح ب) فاتباد السطحية وهي العقدة الليمفاوية المابضيه المكشوفة (رأس السهم). يتم استرداد ج) العقدة الليمفاوية المابضيه من الحفرة. د) الإجراء يتكرر للجانب كونترالاتيرال وكلا العقدتين تقام في قاعة ساترة/فراغ-الشحوم الوجهين مليئة BM المخزن المؤقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: إجراءات جمع وتركيب الطحال للتصوير وفوتواكتيفيشن. ) هو شق في الخط الأمامي الآنسي أسفل القفص الصدري والموسعة حول الجسم على الخط الابطي الخلفي، والحواف يتم سحبه لفضح غيض الطحال (رأس السهم). تراجع ب) الطحال واقتطعت، وقطع إلى شرائح رقيقة (1-2 مم)، التي تقام في قاعة ساترة/فراغ-الشحوم الوجهين مليئة BM المخزن المؤقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
4 الرقم: فوتواكتيفيشن. A) اثنين-فوتون صورة مجهرية مركز جيرمنال في الطحال قبل فوتواكتيفيشن. وسم في المجراة مع مكافحة--CD169--PE أنجز قبل موسم الحصاد الطحال لتسمية المنطقة الهامشية (الأحمر، أشارت إلى جانب "MZ"). إشارة التوافقيات الثاني هو الظاهر في الهياكل التي تحتوي على الكولاجين المرتبطة بإهاب والسفن الرئيسية (أزرق). تحديد رؤوس الأسهم العالية أوتوفلوريسسينت، تنشيط الضامة تينجيبلي الهيئة المرتبطة بنشاط مركز جيرمنال. وكان إجراء تصوير 940 نانومتر الإثارة. يشير إلى شريط مقياس في الركن الأيمن العلوي) 200 ميكرومتر. بأما ألف، ولكن بعد فوتواكتيفيشن على 830 نانومتر. خلايا فوتواكتيفاتيد هي الآن مرئية (الأخضر) في منطقة محددة من الفائدة يحدها منطقة هامشية ويشمل الضامة تينجيبلي الهيئة التي سبق تحديدها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
5 الرقم: تدفق سيتوميتريك تحليل خلايا مركز جيرمنال ب فوتواكتيفاتيد- A) الأرض للأمام مقابل بوابة الجانب مبعثر واللمفاويات. ب) الأرض من منطقة المبعثر إلى الأمام كدالة للارتفاع المبعثر إلى الأمام داخل الخلايا اللمفاوية، والناتجة عن القميص بوابة. ج) صلاحية صبغ الأرض الإقصاء داخل القميص، والناتجة عن الخلايا الحية بوابة. جاتينج د) خلايا B220 + B. جاتينج ه) مركز جيرمنال ب الخلايا، وحددت كخلايا CD38lo GL7hi داخل بوابة B220 +. جاتينج و) من الخلايا فوتواكتيفاتيد ضمن السكان خلية ب GC، حددت كمجموعة فرعية من المشترك معربا عن عدم تنشيط الخلايا وفوتواكتيفاتيد السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: نظرة عامة رسومية للبروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

عدد كبير من نماذج مورين من المناعة الذاتية متاحة، والكثير منها يقدم مع مراكز جيرمنال عفوية16. ومع ذلك، العديد من النماذج المتاحة المرفأ الخلفيات الوراثية المعقدة أو الطفرات في المنظمين وسط انتشار الخلايا اللمفاوية أو التنشيط، مما يجعلها ضعيفة تلائم إينتيركروسينج مع خطوط مراسل والدراسات المتعلقة بالسلوك العادي اللمفاويات في المناعة الذاتية، على التوالي. النموذج الحالي، على العكس من ذلك، يسمح نهج 'التوصيل والتشغيل' إلى تحليلات متعمقة للخلايا المستمدة من النوع المتوحش مركز جيرمنال ب أوتوريكتيفي استخدام أي مزيج المرجوة المتسلسلات وطرق الرافضة والصحفيين، في هذه القضية التي يمثلها فوتواكتيفاتابل التجارة والنقل. استخدام استراتيجيات التوسيم في الحية، يمكن تصور واحد مراكز جيرمنال في الأنسجة اللمفاوية اكسبلانتيد وفوتواكتيفاتيد المكونات الخلوية استخدام مجهر اثنين-فوتون. ثم يمكن لمفاوية فوتواكتيفاتيد من مراكز جيرمنال واحد سيتوميتريكالي تدفق فرزها أو تحليلها، كخلايا مفردة أو بكميات كبيرة. قد تتعرض هذه الخلايا فيما بعد للتحاليل الجزيئية والوظيفية المتلقين للمعلومات الإضافية لتقديم أفكار متجددة في مجال المناعة الذاتية.

وهناك بعض الخطوات الحاسمة للأداء الناجح لهذا الإجراء. كما يتبين من نتائج تمثيلية، التشعيع (1,100 راد) والجهات المانحة نخاع العظم إعادة تشكيل بنجاح استبدال حجرة نخاع العظام المتلقية الغلة تشيميريسم شبه كاملة في حجرة الخلية ب. هذا نقطة هامة، كما سيجعل الخلايا ب المستمدة من المستلم المتبقية مجموعة فرعية من السكان مركز جيرمنال 'الظلام'. بغض النظر عن المصدر المستخدمة التشعيع، الجرعة/توقيت تشعيع له ليكون الأمثل تسفر عن تأثير ميلوابلاتيفي القصوى مع تلف الأنسجة الجانبية الحد الأدنى للحيوانات. لإعادة تشكيل، قد وجد بروتوكول سحق العظام وإعادة تشكيل مع 20 مليون مجموع المانحين الخلايا تحقق درجة عالية من إعادة تشكيل قوة. يضمن إمكانية عالية للجهة المانحة نخاع العامل العقيمة والباردة على الجليد لاستخراج نخاع العظام. للوصول إلى الجهة المانحة المطلوب نسب نخاع العظام، من الضروري الحذر الشديد عند عد مختبرين للخلايا، لعد نفسها وعند أخذ العينة الفرعية لنخاع العظام للعد. خلط وشارك التكوير الكوسا المانحين، بدلاً من سينتريفوجينج وريسوسبيندينج بشكل منفصل وثم خلط، يعمل لمنع أي انحراف في نسب المانحة بعد عد الخلايا.

توليد الوهم نخاع العظام المختلطة من البروتوكول يمكن أن تقف وحدها، وأنه يمكن توليد التركيبات مع مراكز جيرمنال أوتوريكتيفي مع أي مراسل المرجوة، أو التحوير، أو المغلوب. غير حد واحد لهذه الحاجة إلى الاستعانة بالجهات المانحة هيستوكومباتيبلي. سلالة 564Igi على خلفية كونجينيك C57Bl/6J، ونتيجة لذلك، ينبغي أن يكون الجهة أو الجهات المانحة الأخرى والمستفيدين خلفية كونجينيك حاء-2b (أو بدلاً من ذلك، ينبغي أن باككروسيد سلالة 564Igi إلى الضغط المطلوب والنمط الظاهري المناعة الذاتية يتم التحقق على خلفية جديدة). الإجراء تشعيع يميل لصالح بيئة توليروجينيك17، وقد يسمح بعدم التطابق في بعض المستضدات histocompatibility طفيفة. إلا أن هذا الجانب ينبغي دقة النظر، لا سيما إذا خلط الذكور والإناث الجهات المانحة و/أو المستفيدين، نظراً لاحتمال مفاعليه الإناث مع المستضدات Y مقيدة بذكر.

وبالمثل، الجانب فوتواكتيفيشن البروتوكول يمكن أن تقف وحدها، ويمكن استخدامها في العديد من السياقات المختلفة. ومع ذلك، المراسل السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل الوحيدة المتاحة حاليا مع مروج جامعة كولومبيا البريطانية، ونشطة في جميع الخلايا النسب المكونة للدم، ولكن ليس في الخلايا اللحمية. كما ذكر في المقدمة، فوتواكتيفاتابل، فوتوسويتشابل أو فوتوكونفيرتيبلي مراسل سلالات أخرى متوفرة، ويمكن الاستعاضة عن السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، مع التعديل المناسب للظروف التجريبية.

من المهم تجنب فوتواكتيفيشن غير مقصود من المناطق غير المرغوب فيها، بالاحتفاظ بالليزر فوق 900 نانومتر عند التصوير، وهذا الطول الموجي وسوف لا فوتواكتيفاتي السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل. فوتواكتيفيشن نفسها، إعدادات معينة، مثل الليزر بكسل والسلطة الوقت يسكن، سيعتمد على العمق في الأنسجة والأنسجة محددة تستخدم نظام التصوير، وكل التطبيق الأمثل لنظام التصوير المحددة المستخدمة. ينبغي أن يكون الحرص عدم د الخلايا، إلا أنها في الوقت نفسه ضرورية للحصول على كفاءة فوتواكتيفيشن في جميع أنحاء المكدس، من أجل الحصول على تمثيل كاف لتنشيط الخلايا لتحليلات المتلقين للمعلومات. مركز جيرمنال ب الخلايا عموما تشكل في أي مكان من 0.5% ~ 2% من خلايا الطحال أو الجلدية العقدة الليمفاوية ب، وكما يتبين من نتائج الممثل (الشكل 5)، فوتواكتيفاتيد واحدة في الوسط جيرمنال ب الخلايا قد جعل ~ 1 في المائة من مجموع عدد السكان الحالي في شريحة مفردة طحال. ولذلك، فرز عدد كبير من الخلايا أو التحليل الناجح يتطلب تجهيز عدد كبير من الأحداث.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

دغن سراج الدين هو زميل لوندبيكفوندين وزميل مؤسسة كارلسبرغ الموقر. وأيد هذا العمل بالإضافة إلى ذلك في الجزء على "منحة نف الطب الحيوي" (دغن سراج الدين).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody, 9D11-A568 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend 110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) Biolegend 144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) Biolegend 142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 Biolegend 102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Biolegend 103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized Fisher Scientific 211766
Cell strainer, 70 µm Falcon 352350
Conical tubes, 50 mL Falcon 352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm Thermo Fisher Scientific 22X22-1
EDTA Merck 1,084,180,250
Ethanol, 70% VWR 8301.360
Fetal bovine serum Life Technologies 10270106
Flow cytometer, FACS Canto II BD Biosciences 338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP BD Biosciences - Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning VWR DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk VWR 630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet. Orion Pharma 9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) Cedarlane CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) Sarstedt 72.690.550
Microscope, Two-photon Prairie Technologies (now Bruker) - Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml VWR 410-0110
NaHCO3 Merck 1063290500
Needle, 18 gauge BD Medical 304622
NH4Cl VWR 87,769,290
PBS Sigma d8537
Pestle homogenizer VWR 47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm VWR 410-0122
Pipette, Serological, 10 ml VWR 612-3700
Pipette, transfer, plastic Sarstedt 861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M) Bemis PM996
Plate, 96-well Falcon 353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps FST - Fine Science Tools 91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps FST - Fine Science Tools 91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight FST - Fine Science Tools 91460-11
Syringe, 10 mL Terumo SS-10ES1
Syringe, 20 mL Terumo SS-20ES1
Syringe, 5 mL Terumo SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc BD Medical 324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml MSD Animal health 431577
Trypan blue solution, 0.4% VWR K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher Scientific 65-0865-14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing. International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  3. Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede. Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).
  4. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  5. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  6. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  7. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  10. Habuchi, S., et al. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).
  11. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).
  12. Degn, S. E., et al. Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers. Cell. 170 (5), 913-926 (2017).
  13. Berland, R., et al. Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice. Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).
  14. Chatterjee, P., et al. Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner. European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).
  15. Toubai, T., et al. Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells. Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).
  16. Luzina, I. G., et al. Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice. Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).
  17. Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529 (2014).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 146، فوتواكتيفيشن، فوتواكتيفاتابل أخضر نيون البروتين (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل)، المناعة الذاتية، والطحال، والعقدة الليمفاوية، الماوس، explant، الوهم نخاع العظام المختلطة، مجهرية اثنين-فوتون
مراكز استجواب جيرمنال أوتوريكتيفي الفردية بواسطة فوتواكتيفيشن في نموذج تشيميريك مختلط من المناعة الذاتية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, … More

Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, S. E. Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity. J. Vis. Exp. (146), e59397, doi:10.3791/59397 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter