Summary
Det här protokollet beskriver generationen av blandade murina benmärgen chimärer med spontana autoimmuna stilbildande centrum, i vilka autoreaktiva lymfocyter bär photoactivatable grönt fluorescerande protein (PA-GFP) reporter. Detta ger möjligheten att länka cellulära läge i vävnader med nedströms molekylära och funktionella analyser.
Abstract
Autoimmuna sjukdomar presentera en betydande hälsobörda. Grundläggande frågor om utveckling och progression av autoimmun sjukdom förblir obesvarade. Ett krav för framsteg i vår förståelse av de bakomliggande sjukdomsmekanismerna och cellulära dynamics är exakta kopplingen av microanatomical platsen för cell undergrupper med nedströms molekylär eller funktionella analyser; ett mål som har traditionellt varit svårt att uppnå. Utvecklingen av stabila photoactivatable biologiska fluorophores och deras integrering i reporter stammar har nyligen aktiverat exakt microanatomical märkning och spårning av cellulära delmängder i murina modeller. Här beskriver vi hur förmågan att analysera autoreaktiva lymfocyter från enda stilbildande centrum kan bidra till att ge nya insikter i autoimmunitet, med kombinationen av en roman chimära modell av autoimmunitet med en photoactivatable reporter som exempel . Vi visar ett förfarande för att generera blandat chimärer med spontana autoreaktiva stilbildande centrum befolkat av lymfocyter som transporterar photoactivatable grönt fluorescerande protein reporter. Använda i vivo märkning strategier, kan enda stilbildande centrum visualiseras i explanterad lymfvävnad och deras cellulära beståndsdelar photoactivated av 2-foton mikroskopi. Photoactivated lymfocyter från enda stilbildande centrum sedan kan analyseras eller sorterade flöde cytometrically, som enstaka celler eller i bulk, och kan bli föremål för ytterligare nedströms molekylära och funktionella analyser. Detta tillvägagångssätt kan direkt tillämpas för att ge förnyade insikter inom autoimmunitet, men förfarandet för att generera benmärgen chimärer och ljusaktivering förfarandet kan dessutom finner bred tillämpning i studier av smittsamma sjukdomar och tumören metastaser.
Introduction
Incidensen av autoimmun sjukdom har ökat snabbt under de senaste decennierna, särskilt i västerländska samhällen. Idag, autoimmun sjukdom rankas tredje på listan över vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet i västvärlden1. Grundläggande frågor om utveckling och progression av autoimmun sjukdom förblir obesvarade. Ett krav för framsteg i vår förståelse av de bakomliggande sjukdomsmekanismerna och cellulära dynamics är exakta kopplingen av microanatomical platsen för cell undergrupper med nedströms molekylär eller funktionella analyser. Det senaste decenniet har har utvecklingen av ett antal stabila photoconvertible, photoactivatable eller photoswitchable biologiska fluorophores och deras integrering i reporter stammar möjliggjort den exakta microanatomical märkning och spårning av cellular undergrupper i murina modeller.
Kaede, en photoconvertible fluorescerande protein med ursprung från en stenig korallrev, genomgår irreversibla photoconversion från grön fluorescens till röd fluorescens vid exponering för violett eller ultraviolett ljus2. Initialt sysselsatt att följa enskilda celler i utveckla organotypic hjärnan skivor3dynamiska beteende, tillämpades generering av en Kaede inpressning mus därefter tillåtet övervakning cellulära rörelse i vivo och systemet till analyser av immunceller migration till och från lymfkörtlar4. Detta tillvägagångssätt var därefter raffinerade med en andra generationens reporter5. En liknande reporter är Kalopsida6, som användes nyligen till att spåra lymfkörtel metastaser i vivo7.
Första photoactivatable proteinet utvecklat var ett grönt fluorescerande protein (GFP) konstruerad med en enda punkt mutation (T203H), leder till en mycket låg absorbans i våglängdsområdet från 450 till 550 nm8. Efter ljusaktivering av ultraviolett ljus, detta photoactivatable grönt fluorescerande protein (PA-GFP) växlar absorption maximala från ~ 400 till ~ 500 nm, vilket ger en ungefärlig 100-faldig intensitet ökar när glada med en våglängd av 488 nm. Generering av transgena möss där alla hematopoetiska celler uttrycker PA-GFP tillåtna, för första gången, djupgående analyser av B cellmarkeringen i anatomiskt definierade ljusa och mörka zoner av germinal center9.
Ljusaktivering är en irreversibel omvandling från ett icke-fluorescerande tillstånd till ett fluorescerande tillstånd, och photoconversion är en enkelriktad övergång från en våglängd till en annan, är photoswitchable proteiner kunna transferservice mellan båda villkoren10 . Denna sistnämnda kapacitet var nyligen utnyttjas för att ingenjör optisk kontroll av protein aktivitet11.
Utnyttja den PA-GFP reportern, kännetecknas vi nyligen B cell repertoarer av enda stilbildande centrum i romanen modell av spontana lupusliknande autoimmunitet12. Denna modell är baserad på blandade chimärer med 1 del benmärgen härbärgerat en autoreaktiva B-cells receptor inpressning med specificitet för ribonuclear-proteinkomplex (564Igi13,14) kombinerat med 2 delar benmärg från någon önskad givare. På cirka 6 veckor post beredning uppnås homeostatiska villkor i vilka spontana autoreaktiva stilbildande centrum är närvarande i mjälten och kutan lymfkörtlarna. Särskilt, germinal center B cell befolkningen är nästan uteslutande (~ 95%) består av celler som härrör från icke-564Igi facket, och dessa wild-type-härledda B-celler har blivit autoreaktiva. Modellen kan därför en 'plug-and-play' metod för analyser av autoreaktiva germinal center B-celler med olika transgener, knock-outs och reportrar. Här beskriver vi proceduren för att skapa blandade chimärer med spontana autoreaktiva stilbildande centrum befolkat av lymfocyter som transporterar PA-GFP reportern. Använda i vivo märkning strategier, kan enda stilbildande centrum visualiseras i explanterad lymfvävnad och deras cellulära beståndsdelar photoactivated med två-foton Mikroskop. Photoactivated lymfocyter från enda stilbildande centrum kan därefter analyseras med flödescytometri eller sorterade efter fluorokrom-aktiverad cell sortering (FACS) och utsätts för ytterligare nedströms molekylära och funktionella analyser. Förmågan att analysera autoreaktiva lymfocyter från enda stilbildande centrum kan direkt tillämpas för att ge förnyade insikter inom autoimmunitet, men de tekniker och metoder som beskrivs kan dessutom hitta relevanta applikationer i studier av infektionssjukdomar och tumören metastaser.
Protocol
All användning av djur överensstämde till Europeiska gemenskapens riktlinjer och godkändes av den danska djur forskning kontrollavdelningen (2017-15-0201-01348).
1. allmänna mus djurhållning och förberedelse av buffertar och verktyg
- Husmusen linjer villkor specifika patogen fri (SPF) med periodisk övervakning av hälsotillståndet enligt standardriktlinjer.
- Valfritt: kontrollera avsaknad av spontana stilbildande centrum i naiva möss på grund av icke-övervakade oavsiktlig infektioner. Detta kan göras antingen med hjälp av immunofluorescens mikroskopi (förekomst av germinal center strukturer) eller flödescytometri (frekvens av germinal center B-celler) som tidigare beskrivits12.
Obs: Antingen Honor eller hanar kan användas. Generellt, är det perfekt att sex match givare och mottagare, eftersom en obalans av kön kan teoretiskt leda till alloreaktivitet mot den manliga Y-antigenen av kvinnliga mottagare/givare15. - Använda CD45.1 mottagare (B6. SJL -Ptprcen Pepcb/BoyJ) vid cirka 6-10 veckors ålder. Använda 564Igi (B6. Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/j) och PA-GFP (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) givare vid 6-12 veckors ålder.
- Sterilisera Kirurgiska verktyg (raka fina sax och Dumont pincett #5 och #7) i autoklav dem enligt rutinmässig sterilisering riktlinjer.
- Förbereda 500 mL benmärg (BM) buffert som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 2% fetalt bovint Serum (FBS), 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) vid pH 7,4. För att förbereda BM buffert, tillsätt 10 mL av Värmeinaktiverade (1 timme i 56 ° C vattenbad att inaktivera ett komplement) FBS och 1,25 mL en 400 mM EDTA-lösning (justerat till pH 7,4) till 500 mL PBS, pH 7,4 och blanda väl. Filtrera det buffert som med ett 0,2 µm filterkolv.
- Förbereda 10 mL av röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) genom spädning av 1 mL av en 10 x 10 ml av totala volymen med reagens grade vatten. Förbereda 50 mL PBS med 5 mM EDTA, pH 7,4.
2. inrättandet av blandade benmärgen chimärer
- Bestrålning av mottagare (dag 0)
- Placera CD45.1 benmärg mottagarna i en lämplig bestrålning behållare och bestråla med 1.100 Rad i en gamma irradiator.
Obs: Alternativa bestrålning källor kan användas. Oavsett källa har dos/tidpunkten ska optimeras för att ge maximal myeloablativ effekt med minimal säkerheter vävnadsskada djuren. - Placera på antibiotika vatten ad lib (1 mg sulfadiazin och 0.2 mg trimetoprim/mL dricksvatten).
- Placera CD45.1 benmärg mottagarna i en lämplig bestrålning behållare och bestråla med 1.100 Rad i en gamma irradiator.
- Utvinning av ben (dag 1)
- Söva 564Igi benmärg givarna av kontinuerligt flöde av 4% isofluran i luften och eutanasi av cervikal Dislokation. Spraya ner givarna med etanol och placera dem på sterila kirurgiska kuddar i flödet huven. Fortsätt att arbeta att upprätthålla sterila förhållanden och använder sterila buffertar och utrustning.
- För att extrahera lårben och skenben, först gör ett snitt runt ankeln och utöka uppåt ända till höften med raka fina sax. Använder en kraftig tång eller tummen och pekfingret, dra huden upp och av benet mot kroppen. Likaså dra huden ner och av foten.
- Poppa ut knä och fotled lederna genom gripa tag i benet på höften och dra foten kraftfullt. Fortsätt att bryta fotleden gemensamma och dra foten mot kroppen medan du håller på att skenbenet, därmed strippar senor och muskler av skenbenet.
- Bryta knät gemensamma att släppa skenbenet, och likaså dra detta mot kroppen medan du håller på att lårbenet, därmed strippar senor och muskler av lårbenet. Gör ett snitt på höftleden och skär senor, sedan dra lårbenet ut från uttaget hip. Upprepa steg 2.2.2 – 2.2.4 för den kontralaterala sidan.
- Ren ben försiktigt genom att gnugga dem med en grov pappershandduk för att avlägsna alla återstående muskler och bindväv. Skölj dem i iskall BM buffert innan du slutligen överför dem till färskt kallt BM buffert på is med ett par Dumont #7 tången. Upprepa steg 2.2 för PA-GFP givarna.
Anmärkning: Antalet benmärgsceller från en enda donator varierar beroende på kön och ålder. Skala antalet givare enligt önskad ingång benmärgen nyckeltal och siffror och önskat antal mottagare. Om givarna är knappa, kan frambenen tas upp till benmärgen extraktion. Detta ger vanligtvis en ytterligare 1/3 till ½ av de celler som erhållits från bakbenen. Vanligen kan någonstans från 50-200 miljoner celler återvinnas per givare, beroende på ålder, kön, bakgrund och om bara hind eller både hind och frambenen ingår.
- Benmärgen cell utvinning
- Förbereda murbruk genom att skölja i iskall BM buffert. Dränera skölj bufferten och använda en elektrisk pipett handkontroll med 10 mL serologiska pipett 10 ml av färska iskall BM buffert.
- Överföra ben från 564Igi givare till mortel med hjälp av ett par Dumont #7 tången och Använd mortelstöten att krossa och Mala ben för att släppa benmärgen. Aspirera benmärg extraktet med pipett 10 mL serologiska och passera den genom en sil med 70 µm i cellen till en 50 mL tub på isen.
- Lägga till ett ytterligare 10 mL färsk iskall BM buffert i mortel och upprepa för att säkerställa fullständig återhämtning av celler. Ta bort benmaterial från mortel med en pappershandduk, kasseras enligt föreskrifter och skölj morteln noggrant med 70% etanol, följt av BM buffert. Upprepa steg 2.3 för gruppen PA-GFP benmärgen givaren.
- Räkna benmärgsceller
- Använd en mikropipett, placera en droplet-fil som innehåller 40 µL av RBC lyseringsbuffert på en bit plast paraffin film. Invertera 564Igi benmärg röret några gånger och ta ut en 10 µL alikvotens med hjälp av en mikropipett. Blanda det med de 40 µL av RBC lysis buffert droppe.
- Därefter Tillsätt 50 µL av Trypan blå (0,4% i vattenlösning) till droppa. Omedelbart ladda 10 µL av den resulterande blandningen i en Burker-Türk hemocytometer och antal under mikroskopet. Beräkna antalet celler per mL, med 10 x totala utspädningsfaktorn. Bekräfta adekvat cellviabilitet > 90%. Upprepa steg 2,4 för gruppen PA-GFP benmärgen givaren.
- Förbereda givare suspensioner
- Baserat på räkningarna erhålls i steg 2,4 och önskat antal mottagare, beräkna volymen av givarens benmärg från vardera av de två givare grupperna blandas i det givaren mix-röret.
Obs: till exempel för att inrätta en grupp av 1:2 blandade 564Igi:PA-GFP chimärer med 6 CD45.1 mottagare: varje mottagare kräver 20 x 106 givare celler totalt, 1 del 564Igi och 2 delar PA-GFP. Detta kräver alltså, 6 x 1/3 x 20 x 106 = 40 x 106 564Igi donatorcellerna och 6 x 2/3 x 20 x 106 = 80 x 106 PA-GFP givare celler. - Blanda de lämpliga mängder PA-GFP och 564lgi givare märg i en 50 mL konisk tub. Centrifugera benmärgen blandningen på 200 x g - och 4 ° C i 10 minuter med en svängig hink rotor.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna i iskall BM buffert på en densitet av 1 x 108 celler per mL. Överför till en förhandskyld 1,5 mL mikrocentrifug rör på is.
- Baserat på räkningarna erhålls i steg 2,4 och önskat antal mottagare, beräkna volymen av givarens benmärg från vardera av de två givare grupperna blandas i det givaren mix-röret.
- Beredning av benmärg mottagare med givarens benmärg
- Söva mottagare som använder induktion med kontinuerligt flöde av 4% isofluran i luft, följt av underhållsbehandling på 3,75%. Verifiera adekvat planet av anestesi genom avsaknad av tå-nypa reflex.
- Snärt noggrant röret som innehåller benmärg mix för att säkerställa adekvat resuspension av benmärgsceller, sedan aspirera benmärg mix (~ 20 x 106 celler), i en 0,3 mL 200 µL, 30 gauge insulinspruta.
- Placera mottagaren på sidan, försiktigt sträcka huden ovanför och nedanför ögat att något 'pop ögat ut', och försiktigt in spetsen på sprutan ca i 30° vinkel i framsidan av ögonhålan, för att undvika ögat och den omgivande vävnaden. När spetsen på nålen är kände att röra benet understryker ögonhålan, dra tillbaka något (~0.5 mm) och injicera långsamt benmärgen givaren med stadigt tryck.
Obs: Bör det finnas ingen blödning, inget läckage av vätska och nej till mycket mindre utbuktningen av ögat vid injektion. - Återgå musen till buren med ad libitum antibiotika vatten och kontrollera omedelbar återhämtning från förfarandet. Upprepa steg 2,6 för varje mottagare.
Obs: Svans-ven injektion kan användas i stället för retroorbital injektion med liknande resultat, i våra händer det dock betydligt långsammare, vilket kan vara ett bekymmer när du arbetar med stora grupper av mottagare. Återvinning av bedövat djur direkt på liten diameter sängkläder bör undvikas eftersom den utgör en risk för aspiration och kvävning
- Avlägsna antibiotika vatten (dag 14)
- Ta antibiotika vattnet från cage(s) och ersätta med regelbunden dricksvatten.
3. Kontrollera framgångsrik beredning och verifiera lämplig grad av chimärism (vecka 6)
-
Retroorbital blödning av chimärer och kontroller
- Förbereda blod insamling rör genom märkning 1,5 mL mikrocentrifugrör enligt mottagarens öra tagg nummer och lägga till 50 µL av PBS som innehåller 5 mM EDTA.
Obs: Inkludera lämpliga kontroller för PA-GFP, CD45.1 och CD45.2 och 9 d 11 (idiotypt). Detta kan göras genom inklusive 1 PA-GFP + mus, 1 CD45.1 mus, 1 B6 mus och 1 564Igi mus. - Söva möss och verifiera adekvat planet av anestesi som i steg 2.6.1. Placera chimera på sidan, försiktigt sträcka huden ovanför och nedanför ögat att något 'pop ögat ut'.
- Sätt försiktigt ett BoPET högerställd hepariniserad kapillärrör (60 µL inre volym) ungefär i 40° vinkel i framsidan av ögonhålan, noga med för att undvika att skada ögat och den omgivande vävnaden. Twist/rotera försiktigt röret tills den börjar fyllas med blod.
- Tillåter blodet att passivt Fyll röret av kapillärkraften, tills nästan helt full, och sedan dra tillbaka röret och placera den i motsvarande pre märkta samling röret, samtidigt som de omedelbart koppla greppet runt ögat att tillåta ögat att kvitta tillbaka i position. Blödning ska sluta omedelbart.
- Se till att kapillärröret har tömt in i samling röret och kasta den i en behållare. Nära röret och Invertera tre gånger för att säkerställa fullständig blandning med den PBS/EDTA.
- Återgå musen till buren och kontrollera omedelbar återhämtning från förfarandet. Upprepa steg 3.1 för varje experimentella mus och lämpliga kontroller.
Obs: Var försiktig när du använder submandibular vein punkteringen som denna metod kan innebära en större risk för oavsiktlig infektion hos bestrålade mottagare innan dessa är fullt färdigberedd. Dessutom i vår erfarenhet finner vi att volymen av blod samlas och mängden blod förloras på grund av kraftig blödning är mer variabel. Båda dessa överväganden är viktiga, eftersom de benmärgen chimärer är känsliga i beredning fas, innan den nya benmärgen är fullt rekonstituerades och blodbildning har återupptagit normala nivåer.
- Förbereda blod insamling rör genom märkning 1,5 mL mikrocentrifugrör enligt mottagarens öra tagg nummer och lägga till 50 µL av PBS som innehåller 5 mM EDTA.
-
Perifera mononukleära celler (PBMC) rening
- Efter slutförandet av blodinsamling, kort (10 s) Centrifugera rören vid låg hastighet (< 200 x g) att samla in de utspädda stabiliserad blod längst ned i rören.
- Fyll en 10 mL spruta med lymfocyter separation medium och bifoga en 18 G nål. Stick in nålen längst ned på första röret och underlayer blodprovet med 1 mL av lymfocyter separation medium. Försiktigt dra ut injektionsnålen och torka med en pappershandduk för att förhindra korskontaminering av nästa provet.
- Gå igenom alla prover och sedan Centrifugera i 25 minuter på 800 x g, vid rumstemperatur, i en svängande-hink centrifug, med bromsarna inställd på låg/off.
- Förbereda en uppsättning motsvarande märkta 1,5 mL mikrocentrifugrör innehållande 1 mL iskallt BM buffert varje.
- Efter centrifugering, för varje prov, ange övre (plasma) lagret med en 200 µL mikropipett och aspirera det mononukleära celllagrar (MNC) strax ovanför gränssnittet. Överföra cellerna till motsvarande märkta röret som innehåller 1 mL av BM buffert. Stäng locket och Invertera om du vill blanda. Kassera lymfocyter separation medium-innehållande röret.
- Gå igenom alla prover och sedan Centrifugera vid 200 x g i 5 min, 4 ° C i en svängande hink rotor. Aspirera och kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL iskall BM buffert. Proverna är nu redo för antikropp-färgning och flöde flödescytometrisk analys.
-
Färgning för flöde flödescytometrisk utvärdering
Obs: Föreslog panel: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Icke-aktiverat PA-GFP upptäcks i kanalen Pacific Orange (eller motsvarande). Ingen lönsamhet dye krävs eftersom lymfocyter avskiljandet tar bort döda celler.- Med hjälp av en mikropipett, tillsätt 100 µL cellsuspension per brunn för varje chimär och kontroll prov, till en plattan med 96 brunnar.
- För de 3 icke-PA-GFP kontrollprover, pool, de resterande 100 µL av varje prov (300 µL totalt). Tillsätt 50 µL av detta material för ofärgade kontroll och enda färgade kontrollbrunnarna. För PA-GFP singel-färgade kontroll dessutom Tillsätt 50 µL av ofärgade PA-GFP provet.
- I varje brunn, tillsätt 100 µL buffert (ofärgade), en antikropp (singel-färgade ersättning kontroller, förutom PA-GFP ersättning kontroll) eller antikropp mix (prov). Inkubera på is i 20 minuter.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 4 ° C. Häll ut bufferten. Tillsätt 200 µL BM buffert i varje brunn och centrifugera igen för att tvätta. Häll ut bufferten och resuspendera cellerna i varje brunn i 200 µL BM buffert. Proverna är nu redo för analys på en flödescytometer (figur 1).
Obs: Germinal center svaren i chimärer kan analyseras vid något tillfälle från 6 veckor och framåt.
4. In vivo märkning av den marginella zon/subkapsulär sinus att underlätta identifiering av enda stilbildande centrum
Obs: Protokolls demonstreras för footpad/hock (Poplietallymfknutor lymfkörtel) och intravenös (i.v., mjälte) injektioner, men kan varieras beroende på målwebbplatsen.
-
Bilaterala footpad injektion för Poplietallymfknutor lymfkörtel märkning
- Söva mössen som i steg 2.6.1.
- I ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, späd 2 µL av PE-märkt råtta antimus CD169 antikropp i 18 µL av PBS, pH 7,4. Placera två droppar av 10 µL varje blandningen på en bit plast paraffin film. Sug upp varje droppe med en spruta med 0,3 mL i insulin med en 30 gauge nål.
- Injicera den 10 µL märkning mix i antingen footpad (ange med nålen i 5-10° vinkel i den centrala delen av footpad, proximala från början av tårna, och för in nålen ungefär halvvägs mot hälen) eller hasen (ange med nålen på en 5 - 10 ° vinkel ovanför hälen och infoga om halvvägs av dess längd längs axeln av hälsenan i riktning mot knäet). Återgå möss till sina burar och vänta ca 15 minuter innan du fortsätter med steg 5.
-
Intravenös injektion för mjälte märkning
- Söva mössen som i punkt 2.6.1.
- I ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, späd 10 µL av PE-märkt råtta antimus CD169 antikropp i 90 µL av PBS. Aspirera blandningen med en 0,3 mL insulinspruta.
- Utföra retroorbital i.v. injektion enligt steg 2,6. Återgå möss till sina burar och vänta ca 15 minuter innan du fortsätter med steg 5.
Obs: som ett alternativ till isofluran, injektion narkos såsom Ketamin/xylazin mix kan användas; dock leder detta vanligtvis till långsammare återhämtning gånger. Eftersom lymfdränage är allmänt påverkad av skelettmuskulaturen rörelse, förväntas detta leda till långsammare dränering tid.
5. explanting mjälten och lymfkörtlarna och förbereda för ljusaktivering
-
Förbereda en dubbelsidig imaging och ljusaktivering kammare
- Ta bort kolven från en 20 mL spruta och tillbaka-ladda det med vakuum fett genom att sätta munstycket på en tub med vakuum fett i den. Sedan ta bort kolven från en 5 mL doseringsspruta och använder 20 mL spruta till baksidan-last det med vakuum fett.
- Använda vakuum-fett laddade 5 mL sprutan för att förbereda en avbildning och ljusaktivering kammaren genom att placera en fyrkantig täckglas på en plan yta och spåra längs kanterna av täckglaset med vakuum fett (ca 1-2 mm i från kanterna).
Obs: var noga med för att undvika vakuum fett kontaminering av alla ytor som senare kommer i kontakt med Mikroskop linsen, som microdroplets vakuum fett emulgerade i nedsänkning vattnet kan förorena linsen. - Fylla upp täckglas vakuum fett kammaren med iskall BM buffert och placera på en kall platta yta.
-
Skörda lymfkörtlar och mjälte
- Avliva den Invivo märkt chimär mus ska analyseras enligt steg 2.2.1. Spraya ner kadavret med 70% etanol.
- För att komma åt Poplietallymfknutor lymfkörteln, Använd raka fina sax göra ett snitt i huden precis nedanför knä gropen, och förlänga snittet uppåt längs hamstring-linjen nästan till höftleden. Använda Dumont #5 eller #7 tången, dra alla exponerade viftar av huden utåt, att utsätta vävnaden i Poplietallymfknutor fossa (figur 2A).
- Använder ett par Dumont #5 pincett, noggrant ange Poplietallymfknutor fossa bara mediala till Poplietallymfknutor ven och dissekera öppna fett genom att infoga och öppna och stänga tången längs axeln av benet, för att exponera underliggande Poplietallymfknutor lymfkörtel.
- Pop lymfkörteln av fossa genom att nypa i quadriceps-muskeln från framsidan proximala till knäet med hjälp av tummen och pekfingret (figur 2B). Greppa lymfkörteln underifrån med hjälp av tången att befria det från den omgivande vävnaden (figur 2 c) och sedan placera den i vakuum fett kammaren bereddes i steg 5.1.
- Upprepa steg 5.2.2, 5.2.4 för den kontralaterala sidan. Flera lymfkörtlar kan monteras i en enda kammare om så önskas.
- Slutligen Stäng kammaren genom att placera ett andra täckglas ovanpå vakuum fett fälgen och trycka försiktigt ner, ta hand för att pressa alla luftbubblor.
Obs: Några av bufferten kan tryckas ut också, men vakuum fettet bör bilda en tät förslutning, att förhindra läckage av vätska (figur 2D). Lymfkörtlarna är nu i en dubbelsidig imaging kammare. - För att komma åt mjälte, med ett par raka fina sax göra ett snitt genom bukväggen på vänster sida av musen, proximala till främre mediala linje, strax under bröstkorgen och utvidga det runt i kroppen till bakre axillär linje. Spetsen av mjälte bör vara synliga (figur 3A).
- Dra ut mjälten med ett par Dumont #7 tången och skär sammanväxningar på undersidan till frige den. Använd paret raka fina sax för att klippa ~ 2 mm tjock, tvärsnittsstudier, skivor.
- Placera en slice i vakuum fett kammaren bereddes i steg 5.1. Flera mjälte segment kan monteras i en enda kammare om så önskas.
- Slutligen Stäng kammaren genom att placera ett andra täckglas ovanpå vakuum fett fälgen och trycka försiktigt ner, ta hand för att pressa alla luftbubblor. Hålla alla tänkbar chambers på isen hela tiden, med undantag för under imaging och ljusaktivering.
Obs: Några av bufferten kan tryckas ut också, men vakuum fettet bör bilda en tät förslutning, att förhindra läckage av vätska. Mjälten skivor är nu i en dubbelsidig imaging kammare (figur 3B).
6. ljusaktivering
-
Att identifiera enstaka stilbildande centrum
Obs: Detta protokoll beskrivs för mjälte, men är helt analogt för lymfkörtlarna.- Placera imaging kammaren på Mikroskop scenen. Med 3,5 mL plast överföring pipett, placera en droppe destillerat vatten ovanpå det övre täckglaset och sänk målet tills kontaktpunkten. Fokusera på toppen av vävnaden med hjälp av genomlysning.
- Växla till mörka läge och två-photon excitation och justera lasern till 940 nm.
Obs: Med lämpliga filter set, denna våglängd tillåter excitation och upptäckt av andra generationen av övertoner i kollagen-innehållande strukturer associerade med stora kärl och strukturella element, liksom CD169-PE injiceras i steg 4,2, som identifierar den marginella zon. Dock inte 940 nm excitation inte photoactivate PA-GFP. - Lokalisera enskilda vit-massa områden (avgränsas av CD169-PE färgning) nära ytan av vävnad, och identifiera den periarteriolar lymfoida slidan (PALS, T cell zon) av understödjautvecklingen övertoner är associerad med den centrala arteriole. I zonen mellan PALS och den marginella zon, titta för förekomst av högt autofluorescent, aktiveras tingible-kroppen makrofager (stark autofluorescent signal i alla kanaler, blob-liknande utseende med mörkt vakuoler) (figur 4A).
Obs: Om nödvändigt, på grund av oönskade orientering av vävnad, imaging kammaren kan vändas och avbildning kan utföras från andra hållet. - Baserat på kännetecken som identifierades i steg 6.1.3., rita en region av intresse att identifiera en enda germinal center. Ställa in en Z-stack på runt 100-150 µm djup, start från ytan av vävnaden, och använder ett stegstorlek ~ 3 µm.
- Växla till 830 nm excitation våglängd. Stängs av eller dämpa alla kanaler för att förhindra photodamage detektorer (som laser power och utdata fluorescens är vanligtvis dramatiskt högre vid denna våglängd), och sedan 'bild' stacken.
Obs: Särskilda inställningar, till exempel laser power och pixel dröjtiden, beror på djupet i vävnaden, de specifika vävnad som används och bildsystem. Varje ansökan måste vara optimerad för det specifika imaging system som används. Det är viktigt att få effektiv ljusaktivering hela bunten, bör vara försiktig inte till åldrad hud cellerna. - Växla tillbaka till 940 nm excitation våglängd och öppna kanaler. Skanna igenom stacken att bekräfta effektiva ljusaktivering hela (figur 4B) och avsaknad av photodamage (diffusa, icke-cell-avgränsas PA-GFP signal, mörka fläckar eller hög grad autofluorescens i photoactivated område).
- Fortsätt till photoactivate alla relevanta vävnader i imaging kammaren, och sedan omedelbart returnera den till is tills vidare bearbetning. Fortsätt med ljusaktivering av ytterligare tänkbar kamrarna.
Obs: Vävnad explanting, montering och särskilt ljusaktivering är tidskrävande processer, men den totala turn-around tid bör begränsas till 4-6 timmar, att förhindra en dramatisk minskning av cellernas viabilitet.
7. återhämtning och analys av photoactivated celler
-
Utvinning av lymfocyter från lymfkörtlar och mjälte
- För varje photoactivated prov, förbereda ett med detta märkt 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 500 µL av BM buffert på is. Inkludera prover från en icke-PA-GFP-kontroll och en icke-aktiverade PA-GFP-mus. Detta kan åstadkommas genom en B6-kontroll och en PA-GFP kontroll mus.
- Ta försiktigt bort det övre täckglaset från imaging kammaren, noga med att bibehålla positionen för proverna (om flera prover förekommer i en enda kammare), och placera varje prov till dess respektive prov tube.
- Med hjälp av en mortel Homogenisatorer, pressa vävnaden och vrid mortelstöten i röret att släppa lymfocyterna. Med hjälp av en mikropipett, aspirera den lysate och filtrera genom en sil med 70 µm i cellen till ett färska, nedkylda 1,5 mL mikrocentrifug rör. För lymfkörtel prover, hoppa till steg 7.1.5.
- För mjälte prover, Centrifugera 200 x g under 5 minuter vid 4 ° C i en svängande hink rotor. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL RBC lyseringsbuffert. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur, sedan lägga till 800 µL av iskall BM buffert och fortsätt till steg 7.1.5.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter vid 4 ° C i en svängande hink rotor. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 200 µL iskall BM buffert. Proverna är nu redo för färgning för flöde flödescytometrisk utvärdering och sortering, om så önskas.
-
Färgning för flöde flödescytometrisk utvärdering
Obs: Föreslog panel: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, fastställbara livskraft Dye Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Icke-aktiverat PA-GFP upptäcks i kanalen Pacific Orange (eller motsvarande). Photoactivated PA-GFP upptäcks i GFP-kanal. Någon samtidig renat makrofager (som kanske eller kanske inte har varit i vivo märkt med CD169-PE) kan uteslutas genom färgning med CD169-PE och använda detta som en dump-grind.- Med hjälp av en mikropipett, tillsätt 100 µL cellsuspension per brunn för varje prov som chimera och kontroll, i en plattan med 96 brunnar.
- För de B6 kontrollproverna, tillsätt 50 μl av detta material för ofärgade kontroll och enda färgade kontrollbrunnarna. För den icke-aktiverade kontrollen för singel-färgas av PA-GFP dessutom Tillsätt 50 µL av ofärgade icke-aktiverade PA-GFP provet. För aktiverade PA-GFP singel-färgade kontroll, pool, det återstående materialet för alla photoactivated prover.
- Till varje brunn, tillsätt 100 µL buffert (ofärgade och PA-GFP ersättning kontroller), en antikropp (singel-färgade ersättning kontroller) eller antikropp mix (photoactivated prover). Inkubera på is i 20 minuter.
- Centrifugera vid 200 x g 5 minuter vid 4 ° C. Häll ut bufferten. Tillsätt 200 µL BM buffert i varje brunn och centrifugera igen för att tvätta. Häll ut bufferten och resuspendera cellerna i varje brunn i 200 µL BM buffert. Proverna är nu redo för analys på en flödescytometer eller sorterare (representativa resultat i figur 5).
Representative Results
Generation av blandade benmärgen chimärer
Protokolls uppnår kraftfullt blandade benmärgen chimärer med en nästan komplett chimärism i B cell facket som visas i det representativa resultatet i figur 1 (för statistisk signifikans hänvisas till 12). Serotyping avslöjar normaliserade B cell nummer på 6 veckor efter beredning (figur 1A), med en låg frekvens av 9 d 11 (idiotypt) positiva cirkulerande B-celler som härrör från 564Igi facket (figur 1B). Inom den totala lymfocyter porten, finns det en låg frekvens av återstående mottagare-derived celler, ~ 6% CD45.1 (Q1), vilket indikerar en övergripande graden av chimärism ~ 94% (figur 1 c). Inom givaren fack (CD45.1-, Q4 + Q3) förhållandet mellan 564Igi (Q4) till PA-GFP (Q3) är omkring 23% till 77%. Detta härrör något lägre än ingående baserat på 33% till 66% förklaras av det tunga negativa urvalet av B-celler från 564Igi fack 12. Som ses i figur 1 d, finns det praktiskt taget fullständig chimärism i B cell facket (99,9% CD45.1-) och dominans av PA-GFP benmärg-derived B-celler (Q3), som är en följd av det tunga negativa urvalet av 564Igi-derived B-celler.
Skörd av vävnader, bearbetning och flöde flödescytometrisk utvärdering
Figur 2 och figur 3 visar förfaranden för och resultaten av explanting isolerad nymalen lymfkörtlar och mjälte skivor. Figur 4 presenterar representativa resultat för Invivo märkning och ljusaktivering av en enda germinal center i ett explanterad mjälte segment. Som kan ses (figur 4A), i vivo märkning med CD169-PE har kraftfullt märkt den marginella zon (röd, indikeras av ”MZ”). Den andra övertoner signalen framgår i kollagen-innehållande strukturella element och stora kärl (blått), inklusive den centrala arteriole om periarteriolar lymfoida slida (PALS). Mycket autofluorescent, aktiveras tingible-kroppen makrofager är associerade med germinal center aktivitet (pilspetsar). Identifiering av den marginella zon, PALS och tingible-kroppen makrofager, sammantaget och tillåter identifiering av en region av intresse som sannolikt innehåller ett enda germinal center. Regionen av intresse är photoactivated som illustreras i figur 4B. Som visat, är ljusaktivering microanatomically exakt9, ger ett avgränsat område av aktivering. De presenterade resultaten dessutom fungera som bekräftelse av en hög täthet av PA-GFP + lymfocyter i ombildade chimärer och förekomsten av spontana stilbildande centrum. Underordnat flöde flödescytometrisk utvärdering ytterligare bekräftar normaliserade B cell fack nummer (figur 5 d), en spontan germinal center befolkningen (figur 5E) och förekomsten av en delmängd av germinal center B-celler som har varit photoactivated (figur 5F).
Således presenterar detta protokoll en robust metod för generering av blandade benmärgen chimärer med spontana autoreaktiva stilbildande centrum, som huvudsakligen består av vildtyp härledda B-celler som bär en photoactivatable reporter. Detta möjliggör i sin tur nedströms analyser av enskilda stilbildande centrum (grafisk översikt i figur 6).
Figur 1: Flow flödescytometrisk utvärdering av graden av chimärism med blod av 564Igi (CD45.1-, PA - GFP-): PA-GFP (CD45.1-, PA-GFP +) 6 veckor blandat chimärer i dödligt bestrålat CD45.1 mottagare (CD45.1 +, PA - GFP-), och bokför beredning. A) tomt visar gating B220 + B celler, pre gated på singlet lymfocyter. B) Subgate från tomt A, visar 9 d 11 + (idiotypt) frekvens inom B-cell befolkningen. C) rita av PA-GFP kontra CD45.1, pre gated på singlet lymfocyter. D) tomt av PA-GFP kontra CD45.1 i den B-cell subgate från tomt A. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Förfarande för skörd och montering Poplietallymfknutor lymfkörtlar för avbildning och ljusaktivering. A) ett snitt är gjort under knäet förlängas till höftleden och kanterna är tillbakadragen till sidorna, för att avslöja Poplietallymfknutor fossa (pilspets). B) den överliggande Fettvaddera öppnas och Poplietallymfknutor lymfkörteln är exponerade (pilspets). C) Poplietallymfknutor lymfkörteln är Hämtad från fossa. D) förfarandet upprepas för den kontralaterala sidan och båda noderna är monterade i en dubbelsidig täckglas/vakuum-fett kammare fylld med BM buffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förfarande för skörd och montering mjälte för avbildning och ljusaktivering. En) snitt är gjort vid främre mediala linjen precis nedanför bröstkorgen utvidgas runt kroppen till bakre axillär linje och kanterna dras för att exponera spetsen av mjälte (pilspets). B) mjälte är indragen och censurerade och skär i tunna (1-2 mm) skivor, som är monterade i en dubbelsidig täckglas/vakuum-fett kammare fylld med BM buffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Ljusaktivering. A) två-photon mikrograf en germinal Center i mjälten innan ljusaktivering. In vivo märkning med anti-CD169-PE utfördes innan skörd av mjälte att märka marginella zonen (röd, indikeras av ”MZ”). De andra övertoner signal är uppenbar i kollagen-innehållande strukturer som sammanhänger med skyddet och stora kärl (blå). Pilspetsar identifiera högt autofluorescent, aktiveras tingible-kroppen makrofager är associerad med germinal center verksamhet. Imaging utfördes på 940 nm excitation. Skalstapeln i det övre vänstra hörnet anger 200 µm. B) när det gäller A, men efter ljusaktivering på 830 nm. Photoactivated celler är nu synliga (grön) i ett definierat område av intresse som avgränsas av den marginella zon och som omfattar den tidigare identifierade tingible-kroppen makrofager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Flow flödescytometrisk analys av photoactivated germinal center B celler. A) tomt framåt kontra side scatter och lymfocyter gate. B) tomt framåt scatter område som en funktion av framåt scatter höjd inom lymfocyter gate och resulterande singlet gate. C) livskraft färga utslagning tomt inom singlet gate och resulterande levande cell gate. D) Gating B220 + B celler. E) Gating germinal center B celler, identifierats som CD38lo GL7hi celler inom B220 + grinden. F) Gating av photoactivated celler inom GC B cell befolkningen, identifierats som en delmängd av de celler som tillsammans uttrycker icke-aktiverat och photoactivated PA-GFP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: grafisk översikt över protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det finns ett stort antal murina modeller av autoimmunitet, varav många närvarande med spontana stilbildande centrum16. Men hysa många av de tillgängliga modellerna komplexa genetiska bakgrunder eller mutationer i centrala regulatorer av lymfocyter spridning eller aktivering, gör dem dåligt lämpade för intercrossing med reporter linjer och studier av normala lymfocyter beteende i autoimmunitet, respektive. Den nuvarande modellen, tvärtom gör en 'plug-and-play' strategi för fördjupade analyser av autoreaktiva wild-type-härledda germinal center B celler med valfri önskad kombination av transgener, knock-outs och reportrar, i förevarande fall företrädd av photoactivatable god Jordbrukarsed. Använda i vivo märkning strategier, kan enda stilbildande centrum visualiseras i explanterad lymfvävnad och deras cellulära beståndsdelar photoactivated med två-foton Mikroskop. Photoactivated lymfocyter från enda stilbildande centrum sedan kan analyseras eller sorterade flöde cytometrically, som enstaka celler eller i bulk. Dessa celler kan därefter genomgå ytterligare nedströms molekylära och funktionella analyser att ge förnyade insikter inom autoimmunitet.
Det finns några kritiska steg för framgångsrika resultat av proceduren. Som framgår av de representativa resultat, bestrålning (1.100 Rad) och givarens benmärg beredning framgångsrikt ersätta mottagarens benmärgen facket ger nästan komplett chimärism i B cell facket. Detta är en viktig punkt, som resterande mottagare-derived B-celler skulle göra en delmängd av befolkningens germinal center 'mörk'. Oavsett källa används för bestrålning har dos/tidpunkten för bestrålning ska optimeras för att ge maximal myeloablativ effekt med minimal säkerheter vävnadsskada djuren. För beredning har av ben-crush protokoll och beredning med 20 miljoner givarnas totala celler befunnits kraftfullt ge hög beredning grader. Arbeta sterilt och kalla på is för benmärg utvinning säkerställer hög bärkraft donatorns benmärg. För att nå önskad donatorns benmärg nyckeltal, är det viktigt att iaktta stor försiktighet när räknar alikvoter av cellerna, både för den inventering själv och när du tar ut delprov i benmärgen för inventering. Blandning och samtidig pelletering av givare Sallater, i stället för centrifugering och omblandning separat och sedan blanda, tjänar till att förhindra någon skev i givaren kvot för cell räkna.
Den blanda benmärgen chimera generationen av protokollet kan stå ensam, och det gör generation av chimärer med autoreaktiva stilbildande centrum med önskad reporter, transgenens eller knock-out. Dock är en begränsning till detta behovet av att använda histologiskt givare. 564Igi stammen är på C57Bl/6J congenic bakgrund, och följaktligen, den andra donor(s) och mottagare bör ha en H-2b congenic bakgrund (eller alternativt 564Igi stammen bör vara backcrossed till önskad stammen och de autoimmun fenotypen verifierad på den nya bakgrunden). Förfarandet för bestrålning tenderar att gynna en tolerogena miljö17, och avvikelser i vissa mindre histocompatibility antigen kan tolereras. Dock bör denna aspekt noggrant övervägas, särskilt om blanda manliga och kvinnliga givare eller mottagare, på grund av potentialen för kvinnliga reaktivitet med hane-begränsad Y-antigener.
Likaså den ljusaktivering aspekten av protokollet kan stå ensam, och kan användas i många olika sammanhang. PA-GFP reportern är dock för närvarande endast tillgänglig med de promoveras av UBC som är aktiv i alla hematopoetiska härstamning celler, men inte i stromaceller. Som nämnts i inledningen, andra photoactivatable, photoswitchable eller photoconvertible reporter stammar finns, och PA-GFP, kan ersättas med lämplig justering experimentella betingelser.
Det är viktigt att undvika oavsiktlig ljusaktivering av oönskade områden, genom att upprätthålla lasern väl över 900 nm när imaging, som denna våglängd kommer inte photoactivate PA-GFP. Specifika inställningar, till exempel laser power och pixel dröjtiden, kommer att bero på djupet i vävnaden, de specifika vävnad som används och bildsystem för ljusaktivering själv, och varje program har ska optimeras för specifika imaging system används. Försiktighet bör iakttas inte till åldrad hud cellerna, men det är samtidigt viktigt att få effektiv ljusaktivering hela stacken, för att få en tillräcklig representation av aktiverade celler för nedströms analyser. Germinal center B celler utgör vanligen någonstans från 0,5% till ~ 2% av mjälten eller kutan lymfkörtel B celler, och som kan ses från de representativa resultat (figur 5), photoactivated enda germinal center B celler kan göra upp ~ 1% av totalen population som finns i ett enda mjälte segment. Framgångsrika analys eller sortering av ett betydande antal celler kräver därför behandlar ett stort antal händelser.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
SE Degn är Lundbeckfonden Fellow och en Carlsberg Foundation framstående kollega. Detta arbete var delvis dessutom stöds av en nnm biomedicinsk Grant (SE Degn).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody, 9D11-A568 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255 | |
| Antibody, 9D11-A647 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031 | |
| Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
| Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) | Biolegend | 144613 | |
| Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) | Biolegend | 142403 | |
| Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 | Biolegend | 102717 | |
| Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
| Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized | Fisher Scientific | 211766 | |
| Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
| Conical tubes, 50 mL | Falcon | 352235 | |
| Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
| EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
| Ethanol, 70% | VWR | 8301.360 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
| Flow cytometer, FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
| Flow cytometer, LSRFortessa SORP | BD Biosciences | - | Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm) |
| Grease, high vacuum, Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
| Hemocytometer, Burker-Türk | VWR | 630-1544 | |
| Isoflurane, IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
| Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) | Cedarlane | CL5035 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) | Sarstedt | 72.690.550 | |
| Microscope, Two-photon | Prairie Technologies (now Bruker) | - | Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope |
| Mortar w. lip, unglazed, 75 ml | VWR | 410-0110 | |
| NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
| Needle, 18 gauge | BD Medical | 304622 | |
| NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
| PBS | Sigma | d8537 | |
| Pestle homogenizer | VWR | 47747-358 | |
| Pestle, unglazed, 175 mm | VWR | 410-0122 | |
| Pipette, Serological, 10 ml | VWR | 612-3700 | |
| Pipette, transfer, plastic | Sarstedt | 861,172,001 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm M) | Bemis | PM996 | |
| Plate, 96-well | Falcon | 353910 | |
| Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps | FST - Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps | FST - Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight | FST - Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
| Syringe, 20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
| Syringe, 5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
| Syringe, Insulin, 0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
| Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml | MSD Animal health | 431577 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | VWR | K940-100ML | |
| Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |
References
- Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing. International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede. Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Habuchi, S., et al. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).
- Degn, S. E., et al. Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers. Cell. 170 (5), 913-926 (2017).
- Berland, R., et al. Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice. Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).
- Chatterjee, P., et al. Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner. European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).
- Toubai, T., et al. Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells. Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).
- Luzina, I. G., et al. Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice. Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).
- Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529 (2014).
