Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Afhører individuelle Autoreactive Kimcentrene af Photoactivation i en blandet kimære Model af autoimmunitet

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59397
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University

Summary

Denne protokol beskriver generation af blandet murine knoglemarv kimærer med spontane autoimmune Kimcentre, i hvilke autoreactive lymfocytter bære en photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (PA-NGL) reporter. Dette giver mulighed for at samkøre cellular placering i væv med downstream molekylære og funktionelle analyser.

Abstract

Autoimmune sygdomme udgør en betydelig sundhedsbyrde. Grundlæggende spørgsmål vedrørende udvikling og progression af autoimmun sygdom forblive ubesvarede. En forudsætning for fremskridt i vores forståelse af de underliggende sygdomsmekanismer og cellulære dynamics er den præcise kobling af microanatomical placeringen af celle subsets med downstream molekylære eller funktionelle analyser; et mål, der traditionelt har været vanskeligt at opnå. Udviklingen af stabile photoactivatable biologiske fluorophores og deres integration i reporter stammer har for nylig aktiveret præcise microanatomical mærkning og sporing af cellulære delmængder i murine modeller. Her, beskriver vi hvordan evnen til at analysere autoreactive lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan bidrage til at give ny indsigt i autoimmunitet, ved hjælp af en kombination af en roman kimære model af autoimmunitet med en photoactivatable journalist som eksempel . Vi demonstrere en procedure til at generere blandet kimærer med spontane autoreactive Kimcentre befolket af lymfocytter bærer en photoactivatable grøn fluorescerende proteiner reporter. Brug in vivo mærkning strategier, kan enkelt Kimcentre visualiseres i eksplanterede lymfoide væv og deres cellebestanddele photoactivated af to-foton mikroskopi. Photoactivated lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan derefter analyseres eller sorteret flow cytometrically, som enkelt celler eller i bulk, og kan blive udsat for yderligere downstream molekylære og funktionelle analyser. Denne tilgang kan direkte anvendes til at give fornyet indsigt inden for autoimmunitet, men proceduren for generering af knoglemarven kimærer og photoactivation procedure kan desuden finde bred anvendelse i undersøgelser af smitsomme sygdomme og tumor metastaser.

Introduction

Forekomsten af autoimmune sygdom er steget hurtigt i de seneste årtier, især i de vestlige samfund. Dag, autoimmun sygdom rangerer tredje på listen over mest udbredte årsager til sygelighed og dødelighed i den vestlige verden1. Grundlæggende spørgsmål vedrørende udvikling og progression af autoimmun sygdom forblive ubesvarede. En forudsætning for fremskridt i vores forståelse af de underliggende sygdomsmekanismer og cellulære dynamics er den præcise kobling af celle subsets med downstream molekylære eller funktionelle analyser microanatomical placering. I det seneste årti har har udviklingen af et antal af stabile photoconvertible, photoactivatable eller photoswitchable biologiske fluorophores og deres integration i reporter stammer aktiveret den præcise microanatomical mærkning og sporing af cellulære delgrupper i murine modeller.

Kaede, en photoconvertible fluorescerende proteiner med oprindelse fra en stony koral, gennemgår irreversibel photoconversion fra grønne fluorescens til røde fluorescens ved udsættelse for violet eller ultraviolet lys2. I første omgang ansat til at følge den dynamiske opførsel af individuelle celler i at udvikle organotypic hjerne skiver3, blev generation af en Kaede knock-i mus efterfølgende tilladt overvågning cellulær bevægelse in vivo, og systemet anvendt til analyser af immun celle migration til og fra lymfeknuder4. Denne tilgang blev efterfølgende raffineret med en anden generation reporter5. En lignende reporter er Dendra6, som for nylig blev brugt til at spore lymfeknude metastaser i vivo7.

Den første photoactivatable protein udviklet var en grøn fluorescerende proteiner (NGL) konstrueret med et enkelt punkt mutation (T203H), fører til en meget lav absorbans i regionen bølgelængde fra 450-550 nm8. Efter photoactivation af ultraviolet lys, denne photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (PA-NGL) skifter absorption maximum fra ~ 400 til ~ 500 nm, giver et omtrentlige 100-fold intensiteten stiger, når ophidset med en bølgelængde på 488 nm. Generation af Transgene mus, hvor alle hæmatopoietisk celler express PA-normal god landbrugspraksis tilladt for første gang dybtgående analyser af B-celle udvalg i anatomisk defineret lyse og mørke zoner af germinal center9.

Photoactivation er en irreversibel omdannelse fra en ikke-fluorescerende stat til en fluorescerende tilstand, og photoconversion er en en-vejs overgang fra én bølgelængde til en anden, er photoswitchable proteiner købedygtig shuttle mellem begge betingelser10 . Denne sidstnævnte kapacitet blev for nylig udnyttes til at ingeniør optisk kontrol af protein aktivitet11.

Udnytte PA-normal god landbrugspraksis reporter, præget vi for nylig B celle repertoirer af enkelt Kimcentre i en roman model af spontan lupus-lignende autoimmunitet12. Denne model er baseret på blandede kimærer med 1 del knoglemarv husly en autoreactive B-celle receptoren knock-i med specificitet for ribonuclear-protein komplekser (564Igi13,14) kombineret med 2 dele knoglemarv fra alle ønskede donor. På ca 6 uger post rekonstitution, er homeostatiske betingelser opnået, hvilke spontane autoreactive Kimcentre er til stede i milten og de kutane lymfeknuder. Især, den germinal center B-celle population er næsten udelukkende (~ 95%) sammensat af celler, der stammer fra ikke-564Igi rum, og disse wild-type-afledte B-celler er blevet autoreactive. Derfor, modellen tillader 'plug-and-play' tilgang til analyser af autoreactive germinal center B-celler ved hjælp af forskellige transgener, knock-outs og journalister. Her, beskrive vi proceduren for at skabe blandede kimærer med spontane autoreactive Kimcentre befolket af lymfocytter transporterer PA-normal god landbrugspraksis reporter. Brug in vivo mærkning strategier, kan enkelt Kimcentre visualiseres i eksplanterede lymfoide væv og deres cellebestanddele photoactivated ved hjælp af en to-foton mikroskop. Photoactivated lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan efterfølgende analyseret ved flowcytometri eller sorteret efter fluorokrom-aktiveret celle sortering (FACS) og underkastes supplerende downstream molekylære og funktionelle analyser. Evnen til at analysere autoreactive lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan direkte anvendes til at give fornyet indsigt inden for autoimmunitet, men de teknikker og metoder beskrevet kan desuden finde relevante applikationer i undersøgelser af smitsomme sygdomme og tumor metastaser.

Protocol

Alle brug af dyr i overensstemmelse med retningslinjerne for EU og blev godkendt af den danske dyr forskning Inspectorate (2017-15-0201-01348).

1. generelle mus dyrehold og forberedelse af buffere og værktøjer

  1. Husmus linjer under specifikke patogen gratis (SPF) betingelser, med periodisk overvågning af sundhedstilstanden ifølge standard retningslinjer.
  2. Valgfrit: Kontrollér fravær af spontan Kimcentre i naive mus på grund af ikke-overvågede utilsigtet infektioner. Dette kan gøres enten ved immunfluorescens mikroskopi (tilstedeværelse af germinal center strukturer) eller flow flowcytometri (hyppigheden af germinal center B celler) som tidligere beskrevet12.
    Bemærk: Enten hunner eller hanner kan bruges. Generelt, er det ideelt at sex match donorer og modtagere, som en uoverensstemmelse af sex kan teoretisk set føre til alloreactivity mod det mandlige Y-antigen af kvindelige modtagere/donorer15.
  3. Brug CD45.1 modtagere (B6. SJL -Ptprcen Pepcb/BoyJ) på omkring 6-10 uger gammel. Brug 564Igi (B6. Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/j) og PA-normal god landbrugspraksis (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) donorer på 6-12 ugens i alder.
  4. Sterilisere de kirurgiske værktøjer (lige fine saks og Dumont pincet #5 og #7) ved autoklavering dem ifølge rutinemæssig sterilisation retningslinjer.
  5. Forberede 500 mL af knoglemarven (BM) buffer indeholdende fosfatbufferet saltopløsning (PBS), 2% føtal bovin Serum (FBS), 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) ved pH 7,4. For at forberede BM buffer, der tilsættes 10 mL af varme-inaktiverede (1 time i en 56 ° C vandbad til at inaktivere supplement) FBS og 1,25 mL af en 400 mM EDTA-oploesning (indstillet til pH 7,4) til 500 mL PBS, pH 7,4 og bland godt. Filtrer bufferen ved hjælp af en 0,2 µm sugekolbe.
  6. Forberede 10 mL af røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer (155 mM NH4af Cl, 12 mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA) ved fortynding af 1 mL af en 10 x bestand til 10 mL af samlede volumen med vand af reagens. Forberede 50 mL PBS med 5 mM EDTA, pH 7,4.

2. etablering af blandede knoglemarv kimærer

  1. Bestråling af modtagere (dag 0)
    1. Anbring CD45.1 knoglemarv modtagere i en passende bestråling beholder og bestråle med 1.100 Rad i en gamma-irradiator.
      Bemærk: Alternative bestråling kilder kan bruges. Dosis/timing har uanset kilden, skal optimeres for at giver maksimal myeloablative effekt med minimal sikkerhedsstillelse vævsskader til dyrene.
    2. Sted på antibiotikum vand ad libitum (1 mg af sulfadiazin og 0,2 mg trimethoprim/mL drikkevand).
  2. Udvinding af knogler (dag 1)
    1. Bedøver 564Igi knoglemarvsdonorer ved kontinuerlig flow af 4% isofluran i luften, og aflive af cervikal dislokation. Sprøjte ned donorer med ethanol og placere dem på steril kirurgiske puder i flow hætte. Fortsætte med at arbejde, opretholde sterile forhold, brug af sterile buffere og udstyr.
    2. For at udtrække lårben og skinneben, først gøre et snit omkring anklen og udvide opad hele vejen til hofte bruge lige fine sakse. Brug en heavy-duty pincet eller tommelfinger og indeks fingre, trække huden op og ned af benet mod kroppen. Ligeledes trække huden ned og ned til foden.
    3. Pop ud i knæ og ankel samlinger af sensationsprægede benet i hoften og trække foden kraftigt. Gå videre til at bryde anklen fælles og trække foden mod kroppen mens du holder tibia, dermed stripping sener og muskler fra skinnebenet.
    4. Bryde knæet fælles at frigive skinnebenet, og ligeledes trække dette mod kroppen mens du holder lårbenet, derved stripping sener og muskler fra lårbenet. Gøre et snit på hofteled og skær sener, derefter trække lårbenet fra hip-stikket. Gentag trin 2.2.2 – 2.2.4 for de kontralaterale side.
    5. Ren knoglerne forsigtigt ved at gnide dem med et groft stykke køkkenrulle for at fjerne alle resterende muskler og bindevæv. Skyl dem derefter i iskoldt BM buffer før endelig overføre dem til frisk kold BM buffer på is ved hjælp af et par af Dumont #7 pincet. Gentag trin 2.2 for PA-normal god landbrugspraksis donorer.
      Bemærk: Antallet af knoglemarv celler fra en enkelt donor varierer efter køn og alder. Skala antallet af donorer efter ønskede input knoglemarv nøgletal og numre og det ønskede antal modtagere. Hvis donorer er knappe, kan forlemmerne medtages til knoglemarven udvinding. Dette giver typisk en ekstra 1/3 til ½ af celler fra hind benene. Typisk, hvor som helst fra 50-200 millioner celler kan inddrives per donor, afhængigt af alder, køn, baggrund og om kun hind eller både hind og forlemmerne er inkluderet.
  3. Knoglemarven celle udvinding
    1. Forbered mørtel ved skylning i iskold BM buffer. Dræn skyl buffer og bruge en elektrisk pipette controller med 10 mL serologisk pipette tilføjes 10 mL frisk iskold BM buffer.
    2. Overføre knoglerne fra 564Igi donorer til mørtel ved hjælp af et par af Dumont #7 pincet og bruge pistil at knuse og findele knogler for at frigive knoglemarven. Aspirér knoglemarv ekstrakt med 10 mL serologisk pipette og passerer det gennem en 70 µm celle si i en 50 mL tube på is.
    3. Tilføje en ekstra 10 mL frisk iskold BM buffer til mørtel og Gentag for at sikre fuldstændig genopretning af celler. Fjerne knoglemateriale fra mørtel med en køkkenrulle, kassere korrekt, og skyl mørtel omhyggeligt med 70% ethanol, efterfulgt af BM buffer. Gentag trin 2.3 for gruppen PA-normal god landbrugspraksis knoglemarv donor.
  4. Tælle knoglemarv celler
    1. Med en mikropipette, placere et slipværktøj, som indeholder 40 µL af RBC lysisbuffer på et stykke plastic paraffin film. Invertere 564Igi knoglemarv rør et par gange og tegne en 10 µL alikvot ved hjælp af en mikropipette. Bland det med de 40 µL af RBC lysis buffer drop.
    2. Efterfølgende tilføje 50 µL af Trypan blå (0,4% i vandig opløsning) til drop. Straks indlæse 10 µL af den resulterende blanding i en Burker-Türk hemocytometer og Grev under mikroskop. Beregne antallet af celler pr. mL, ved hjælp af 10 x samlede fortyndingsfaktoren. Bekræfte passende cellernes levedygtighed > 90%. Gentag trin 2.4 for gruppen PA-normal god landbrugspraksis knoglemarv donor.
  5. Forberede donor suspensioner
    1. Baseret på tæller fremstillet i trin 2.4 og det ønskede antal modtagere, beregne mængden af donor knoglemarv fra hver af to donor grupperne skal blandes i donor mix rør.
      Bemærk: For eksempel, for at nedsætte en gruppe af 1:2 blandede 564Igi:PA-normal god landbrugspraksis kimærer med 6 CD45.1 modtagere: hver modtager kræver 20 x 106 donor celler alt, 1 del 564Igi og 2 dele PA-normal god landbrugspraksis. Således, dette kræver 6 x 1/3 x 20 x 106 = 40 x 106 564Igi donor celler og 6 x 2/3 x 20 x 106 = 80 x 106 PA-normal god landbrugspraksis donor celler.
    2. Bland de passende beløb af PA-normal god landbrugspraksis og 564lgi donor marv i en 50 mL konisk slange. Der centrifugeres knoglemarv blandingen på 200 x g og 4 ° C i 10 minutter ved hjælp af en swingende spand rotor.
    3. Den dekanteres og resuspend celler i iskold BM buffer med en tæthed på 1 x 108 celler pr. mL. Overførsel til en forkølede 1,5 mL microcentrifuge tube på is.
  6. Retablere knoglemarv modtagere med donor knoglemarv
    1. Bedøver modtagere ved hjælp af induktion med kontinuerlig flow af 4% isofluran i luft, efterfulgt af vedligeholdelse på 3,75%. Kontrollere passende fly af anæstesi ved fravær af tå-knivspids refleks.
    2. Svirp omhyggeligt det rør, som indeholder knoglemarven mix for at sikre tilstrækkelig ophvirvling af knoglemarv celler, så aspirat 200 µL af knoglemarven mix (~ 20 x 106 celler), i en 0,3 mL, 30 gauge insulin sprøjte.
    3. Placere modtageren på sin side, forsigtigt strække huden over og under øjet til lidt pop øje ud, og Isæt forsigtigt spidsen af sprøjten ca på en vinkel på 30° ind i fronten af øjenhulen, at tage sig for at undgå øjet og det omgivende væv. Når spidsen af nålen er følte at røre knoglen understreger øjenhulen, trække lidt (~0.5 mm) og langsomt injicere donor knoglemarven ved hjælp af konstant pres.
      Bemærk: Der skal være ingen blødning, ingen lækage af væske og ikke til meget mindre udbuling af øjne ved injektion.
    4. Returnere musen til bur med ad libitum antibiotika vand og kontrollere øjeblikkelig tilbagesøgning fra proceduren. Gentag trin 2.6 for hver modtager.
      Bemærk: Hale-vene injektion kan bruges i stedet for retroorbital injektion med lignende resultater, men i vores hænder det er betydeligt langsommere, som kan være et problem, når du arbejder med store grupper af modtagere. Inddrivelse af bedøvet dyr direkte på små diameter sengetøj bør undgås, da det udgør en risiko for aspiration og kvælning
  7. Fjernelse af antibiotika vand (dag 14)
    1. Fjerne den antibiotiske vand fra cage(s) og erstatte med frisk regelmæssig drikkevand.

3. kontrol vellykket rekonstitution og kontrollere passende grad af kimærisme (uge 6)

  1. Retroorbital blødning af kimærer og kontrol
    1. Forberede blod indsamling rør ved mærkning 1,5 mL microcentrifuge rør efter modtagerens øre tag numre og tilføje 50 µL af PBS, som indeholder 5 mM EDTA.
      Bemærk: Omfatte passende kontrol for PA-normal god landbrugspraksis, CD45.1 og CD45.2 og 9 d 11 (idiotype). Dette kan gøres ved at medtage 1 PA-normal god landbrugspraksis + mus, 1 CD45.1 mus, 1 B6 musen og 1 564Igi.
    2. Bedøver mus og kontrollere passende fly af anæstesi som i trin 2.6.1. Placer Kimæren på sin side, forsigtigt strække huden over og under øjet til lidt pop øje ud.
    3. Forsigtigt indsætte en BoPET-indpakkede heparinized kapillarrør (60 µL indre volumen) ca på en 40° vinkel i forreste del af øjet socket, pasning til at undgå at beskadige øjet og det omgivende væv. Forsigtigt twist/rotere røret indtil det begynder at fyldes med blod.
    4. Tillade blodet at passivt fylde røret af kapillaritet, indtil næsten helt fyldt, og derefter trække røret og læg det i den tilsvarende forud mærket collection tube, samtidig med at de straks afslappende greb omkring øjet til at tillade øjet til at bosætte sig tilbage på plads. Blødning bør stoppe øjeblikkeligt.
    5. Sikre at den kapillarrør har tømt i collection tube og smide det i en skarpe container. Luk røret og invertere tre gange for at sikre fuldstændig opblanding med PBS/EDTA.
    6. Returnere musen til buret og kontrollere øjeblikkelig tilbagesøgning fra proceduren. Gentag trin 3.1 for hver eksperimentelle mus og de passende kontrol.
      Bemærk: Være forsigtig, når du bruger submandibulære vene punktering, da denne metode kan udgøre en større risiko for utilsigtet infektion i bestrålede modtagere, før de er fuldt ud fremstillet. Derudover er vores erfaring finder vi at mængden af blod indsamlet og mængden af blod tabt på grund af overdreven blødning er mere variabel. Begge af disse overvejelser er vigtige, som knoglemarven kimærer er følsomme i fasen rekonstitution før den nye knoglemarv er fuldt aflægger og bloddannelsen har genoptaget normale niveauer.
  2. Perifert blod mononukleære celler (PBMC) rensning
    1. Efter afslutningen af blod samling, kortvarigt (10 s) centrifugeres rør ved lav hastighed (< 200 x g) til at indsamle den fortyndede stabiliseret blod i bunden af rørene.
    2. Fyld en 10 mL sprøjte med lymfocyt adskillelse medium og vedhæfte en 18 G nåle. Indsætte nålen til bunden af den første rør og underlayer blodprøve med 1 mL af lymfocyt adskillelse medium. Forsigtigt trække nålen og tørre det med et stykke køkkenrulle til at undgå krydskontaminering af den næste prøve.
    3. Fortsæt gennem alle prøverne, derefter centrifugeres i 25 minutter på 800 x g, ved stuetemperatur i en svinge spanden centrifuge, med bremserne indstillet til lav/off.
    4. Udarbejde et sæt af tilsvarende mærket 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende 1 mL iskold BM buffer hver.
    5. Efter centrifugering, i hver prøve, indtaster den øverste (plasma) lag med en 200 µL mikropipette og Opsug mononukleære (MNC) cellelag lige over grænsefladen. Overfør celler til tilsvarende mærket røret indeholder 1 mL af BM buffer. Luk låget og vend for at blande. Kassér lymfocyt adskillelse medium-holdige tube.
    6. Fortsæt gennem alle prøverne og derefter centrifugeres ved 200 x g i 5 min, 4 ° C i en swingende spand rotor. Opsug og supernatanten fjernes, og resuspenderes i 200 µL af iskold BM buffer. Prøverne er nu klar til antistoffarvning og flow cytometric analyse.
  3. Farvning for flow cytometric evaluering
    Bemærk: Foreslog panel: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Ikke-aktiverede PA-NGL opdages i Stillehavet Orange (eller tilsvarende) kanal. Ingen levedygtighed farvestof er påkrævet som lymfocyt adskillelse slipper af døde celler.
    1. Med en mikropipette, tilføje 100 µL af cellesuspension pr. brønd for hver chimera og kontrol prøve til en 96-brønd plade.
    2. For de 3 ikke-PA-NGL kontrolprøver pool de resterende 100 µL af hver prøve (300 µL samlede). Tilsæt 50 µL af dette materiale for unstained kontrol og enkelt farvede kontrolhullerne. For PA-normal god landbrugspraksis single-farvede kontrol Derudover tilføje 50 µL af unstained PA-normal god landbrugspraksis prøve.
    3. Til hver brønd, Tilsæt 100 µL af buffer (unstained), single antistof (single-farvede kompensation kontrolelementer, undtagen PA-normal god landbrugspraksis kompensation kontrol) eller antistof mix (prøver). Ruger på isen i 20 minutter.
    4. På 200 x g der centrifugeres i 5 minutter ved 4 ° C. Svirp ud bufferen. Tilføje 200 µL af BM buffer til hver brønd og centrifugeres igen for at vaske. Svirp ud bufferen og resuspend celler i hver brønd i 200 µL af BM buffer. Prøverne er nu klar til analyse på et flow Flowcytometret (figur 1).
      Bemærk: Germinal center svar i kimærer kan analyseres på ethvert tidspunkt fra 6 uger frem.

4. In vivo mærkning af den marginale zone/subcapsular sinus til at støtte identifikation af enkelt Kimcentre

Bemærk: Denne protokol er påvist for footpad/hock (popliteal lymfeknude) og intravenøs (i.v., milt) injektioner, men kan varieres efter mål-webstedet.

  1. Bilaterale footpad injektion i popliteale lymfeknude mærkning
    1. Bedøver mus som i trin 2.6.1.
    2. I en 1,5 mL microcentrifuge tube, fortyndes 2 µL af PE-mærket rotte anti-mus CD169 antistof i 18 µL af PBS, pH 7,4. Placer to dråber af 10 µL af blandingen på et stykke plastic paraffin film. Opsug hver dråbe med en 0,3 mL insulin sprøjte med en 30 gauge kanyle.
    3. Injicér 10 µL af mærkning mix i enten footpad (Angiv med nålen i en 5-10° vinkel i den centrale del af footpad, proksimale fra begyndelsen af tæerne, og indsætte nålen ca halvvejs mod hælen) eller hock (Angiv med nålen på en 5 - 10 ° vinkel lige over hælen og indsætte om halvvejs af dens længde langs aksen af achillessenen i retning mod knæet). Returnere mus til deres bure og vent ca 15 minutter før man går videre med trin 5.
  2. Intravenøs injektion for milt mærkning
    1. Bedøver mus som i punkt 2.6.1.
    2. I en 1,5 mL microcentrifuge tube, fortyndet 10 µL af PE-mærket rotte anti-mus CD169 antistof i 90 µL af PBS. Opsug blandingen med en 0,3 mL insulin sprøjte.
    3. Udføre retroorbital i.v. injektion pr. trin 2.6. Returnere mus til deres bure og vent ca 15 minutter før man går videre med trin 5.
      Bemærk: som et alternativ til isofluran, indsprøjtning bedøvende såsom ketamin/xylazin mix kan anvendes; men dette typisk fører til langsommere inddrivelse gange. Da lymfedrænage er generelt påvirket af skeletmuskulatur bevægelse, forventes dette at føre til langsommere dræning tid.

5. explanting milt og lymfeknuder og forberede photoactivation

  1. Forberede et dobbeltsidet imaging og photoactivation kammer
    1. Fjern stemplet fra en 20 mL sprøjte og back-belastning det med vakuum fedt ved at indsætte dysen af et rør af vakuum fedt i det. Derefter fjerne stemplet fra en 5 mL sprøjte og bruge 20 mL sprøjte til back-belastning det med vakuum fedt.
    2. Bruge vakuum-fedt indlæst 5 mL sprøjte til at forberede en billeddannelse og photoactivation kammer ved at placere en firkantet coverslip på en flad overflade og spore langs kanten af coverslip med vakuum fedt (omkring 1-2 mm i fra kanterne).
      Bemærk: sørge for at undgå vakuum fedt forurening af alle overflader, der efterfølgende kommer i kontakt med mikroskop linse, som microdroplets af vakuum fedt emulgeret i fordybelse vand kan forurene linsen.
    3. Fylde cover-slip vakuum fedt kammer med iskold BM buffer og placere på en kold flad overflade.
  2. Høst lymfeknuder og milt
    1. Aflive den in vivo mærket kimære musen skal analyseres som pr trin 2.2.1. Sprøjte ned slagtekroppen med 70% ethanol.
    2. Hen til adgang den popliteal lymfeknude, bruge lige fine saks til at gøre et snit i huden, lige under knæet pit og udvide cut opad langs linjen forstrækning næsten indtil hofteleddet. Ved hjælp af Dumont #5 og #7 trække pincet, hver af de udsatte flapper af hud og udad, at eksponere væv i knæhaselymfeknuderne fossa (figur 2A).
    3. Ved hjælp af et par af Dumont #5 pincet, omhyggeligt indtaste den knæhaselymfeknuderne fossa bare mediale til popliteal vene og dissekere åbne fedt ved at indsætte og åbne og lukke pincet langs aksen af benet, for at afsløre de underliggende popliteal lymfeknude.
    4. Pop lymfeknude ud af fossa ved at klemme quadriceps musklen fra forsiden proksimalt for knæet med tommel- og pegefinger (figur 2B). Grab lymfeknude nedefra med pincet til at befri det fra det omkringliggende væv (figur 2 c) og derefter placere den i vakuum fedt salen forberedt i trin 5.1.
    5. Gentag trin 5.2.2 – 5.2.4 for de kontralaterale side. Flere lymfeknuder kan monteres i et enkelt kammer, hvis det ønskes.
    6. Endelig lukke kammeret ved at placere en anden coverslip på toppen af vakuum fedt rand og trykke forsigtigt ned, tager sig for at presse alle luftbobler.
      Bemærk: Nogle af bufferen kan skubbes så godt, men det vakuum fedt bør danne en tæt forsegling, at forhindre udsivning af væske (figur 2D). Lymfeknuder er nu i en dobbelt-sidet billeddiagnostiske afdeling.
    7. For at få adgang til milten, ved hjælp af et par lige fine saks lave et snit gennem bugvæggen på venstre side af musen, proksimalt for den forreste mediale linje, lige under brystkassen og udvide det rundt i kroppen til den bageste aksillær linje. Spidsen af milten bør være synlige (figur 3A).
    8. Træk milten med et par af Dumont #7 pincet og skære sammenvoksninger på undersiden til at frigive den. Brug par lige fine saks til at skære ~ 2 mm tyk, tværsnits, skiver.
    9. Placere skive i vakuum fedt salen forberedt i trin 5.1. Flere milt udsnit kan monteres i et enkelt kammer, hvis det ønskes.
    10. Endelig lukke kammeret ved at placere en anden coverslip på toppen af vakuum fedt rand og trykke forsigtigt ned, tager sig for at presse alle luftbobler. Holde alle billeddiagnostiske afdelinger på is på alle tidspunkter, undtagen for under billedbehandling og photoactivation.
      Bemærk: Nogle af bufferen kan skubbes så godt, men det vakuum fedt bør danne en tæt forsegling, at forhindre udsivning af væske. Milt skiver er nu i et dobbelt-sidet imaging kammer (figur 3B).

6. Photoactivation

  1. At identificere enkelt Kimcentre
    Bemærk: Denne protokol er beskrevet for milten, men svarer helt til lymfeknuderne.
    1. Placer den billeddiagnostiske afdeling på stadiet mikroskop. Bruger en 3,5 mL plastik overførsel pipette, placere en dråbe destilleret vand på toppen af den øverste coverslip og sænke målet indtil kontaktpunkt. Fokusere på toppen af væv ved hjælp af den gennemlysning.
    2. Skift til mørke tilstand og to-foton excitation, og tune laser til 940 nm.
      Bemærk: Med de passende filter sæt, denne bølgelængde tillader excitation og påvisning af anden generation af harmoniske i kollagen-holdige strukturer forbundet med større fartøjer og strukturelle elementer, samt CD169-PE injiceres i trin 4.2, som identificerer den marginale zone. Men, 940 nm excitation gør ikke photoactivate PA-normal god landbrugspraksis.
    3. Lokalisere enkelte hvid-papirmasse områder (afgrænset af CD169-PE farvning) nær overfladen af vævet, og identificere periarteriolar lymfoide kappe (PALS, T-celle zone) af den anden harmoniske generation forbundet med den centrale arteriole. I zonen mellem PALS og den marginale zone, kigge efter tilstedeværelsen af stærkt autofluorescent, aktiveres tingible-body makrofager (stærk autofluorescent signal i alle kanaler, blob-lignende udseende med mørke vacuoles) (figur 4A).
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, på grund af uønskede orientering af væv, den billeddiagnostiske afdeling kan vendes og imaging kan udføres fra anden retningen.
    4. Baseret på kendetegnende identificerede i trin 6.1.3., tegne en region af interesse at finde en enkelt germinale centrum. Oprette en Z-stak af omkring 100-150 µm dybde, startende fra overfladen af vævet, og ved hjælp af et trin størrelse af ~ 3 µm.
    5. Skifte til 830 nm excitation bølgelængde. Slukke eller dæmpe alle kanaler for at undgå solskader detektorer (som laser power og output Fluorescens er typisk dramatisk højere ved denne bølgelængde), og derefter 'billede' stakken.
      Bemærk: Specifikke indstillinger, såsom laser power og pixel hviletid, afhænger dybden i væv, de specifikke væv bruges og imaging systemet. Hvert program har til at være optimeret til det specifikke imaging system anvendes. Det er vigtigt at få effektive photoactivation i hele stakken, bør pleje tages ikke til solskader cellerne.
    6. Skifte tilbage til 940 nm excitation bølgelængde og genåbne kanaler. Scanne gennem stakken bekræfte effektive photoactivation i hele (figur 4B) og fravær af solskader (diffuse, celle-afgrænset PA-normal god landbrugspraksis signal, mørke pletter eller høj grad autofluorescence i photoactivated område).
    7. Fortsæt til photoactivate alle relevante væv i den billeddiagnostiske afdeling, derefter straks returnere det til is indtil videre forarbejdning. Fortsætte med photoactivation for ekstra billeddiagnostiske afdelinger.
      Bemærk: Væv explanting, montering og særligt photoactivation er tidskrævende processer, men total turn-around tid bør begrænses til 4-6 timer, for at forhindre et dramatisk fald i cellernes levedygtighed.

7. inddrivelse og analyse af photoactivated celler

  1. Udvinding af lymfocytter fra lymfeknuder og milt
    1. For hver photoactivated prøve, forberede en tilsvarende mærket 1,5 mL microcentrifuge tube indeholder 500 µL af BM buffer på is. Omfatte prøver fra en ikke-PA-NGL kontrol og en ikke-aktiveret PA-normal god landbrugspraksis mus. Dette kan opnås ved at inkludere en B6 kontrol og en PA-normal god landbrugspraksis kontrol mus.
    2. Fjern forsigtigt den øverste dække slip fra imaging kammeret, idet man fastholder holdning af prøverne (hvis flere prøver er til stede i et enkelt kammer), og placere hver prøve i dets respektive prøveglas.
    3. Med en pistil homogeniseringsapparat, klemme vævet og twist pistil i røret at frigive lymfocytter. Med en mikropipette, Opsug den lysate og filtreres gennem et 70 µm celle si i en frisk, pre afkølede 1,5 mL microcentrifuge tube. For lymfeknude prøver, spring til trin 7.1.5.
    4. Milt prøver, der centrifugeres ved 200 x g i 5 min. ved 4 ° C i en swingende spand rotor. Supernatanten og resuspenderes i 200 µL af RBC lysisbuffer. Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur, og derefter tilføje 800 µL af iskold BM buffer og gå videre til trin 7.1.5.
    5. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min. ved 4 ° C i en swingende spand rotor. Supernatanten og resuspend i 200 µL af iskold BM buffer. Prøverne er nu klar til farvning for flow cytometric evaluering og sortering, hvis det ønskes.
  2. Farvning for flow cytometric evaluering
    Bemærk: Foreslog panel: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, Fixable levedygtighed farvestoffet Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Ikke-aktiverede PA-NGL opdages i Stillehavet Orange (eller tilsvarende) kanal. Photoactivated PA-normal god landbrugspraksis er opdaget i normal god landbrugspraksis kanal. Enhver Co renset makrofager, (som måske eller måske ikke har været in vivo mærket med CD169-PE) kan udelukkes ved farvning med CD169-PE og bruge dette som en dump gate.
    1. Med en mikropipette, tilføje 100 µL af cellesuspension pr. brønd for hver chimera og kontrol prøve, i en 96-brønd plade.
    2. For kontrolprøver B6 tilsættes 50 µL af dette materiale for unstained kontrol og enkelt farvede kontrolhullerne. For ikke-aktiveret PA-normal god landbrugspraksis single-farvede kontrol Derudover tilføje 50 µL af unstained ikke-aktiveret PA-normal god landbrugspraksis prøve. De aktiverede PA-normal god landbrugspraksis single-farvede kontrol, pool det resterende materiale til alle photoactivated prøver.
    3. Til hver godt, Tilsæt 100 µL af buffer (unstained og PA-normal god landbrugspraksis kompensation styrer), single antistof (single-farvede kompensation kontrol) eller antistof mix (photoactivated prøver). Ruger på isen i 20 minutter.
    4. Der centrifugeres ved 200 x g 5 minutter ved 4 ° C. Svirp ud bufferen. Tilføje 200 µL af BM buffer til hver brønd og centrifugeres igen for at vaske. Svirp ud bufferen og resuspend celler i hver brønd i 200 µL af BM buffer. Prøverne er nu klar til analyse på et flow forskellige eller sidesorteringen (repræsentative resultater i figur 5).

Representative Results

Generation af blandet knoglemarv kimærer

Denne protokol opnår håndfast blandede knoglemarv kimærer med en næsten fuldstændig kimærisme i B-celle rum som vist i det repræsentative resultatet i figur 1 (for Statistisk signifikans henvises til 12). Serotyping afslører normaliseret B celle numrene på 6 uger post rekonstitution (figur 1A), med en lav frekvens af 9 d 11 (idiotype) positive cirkulerende B-celler fra 564Igi rum (figur 1B). Inden for den samlede lymfocytter gate, der er en lav frekvens af resterende modtageren-afledte celler, ~ 6% CD45.1 (Q1), der angiver en samlede grad af kimærisme ~ 94% (figur 1 c). Inden for donoren segment (CD45.1-, Q4 + Q3) forholdet mellem 564Igi (Q4) til PA-normal god landbrugspraksis (Q3) er omkring 23% til 77%. Dette afledt lidt lavere end input 33 til 66% forholdet forklares af den tunge negative markering af B-celler fra 564Igi rum 12. Som det ses i figur 1 d, der er næsten komplet kimærisme i B-celle rum (99,9% CD45.1-) og dominans af PA-normal god landbrugspraksis knoglemarv-afledte B celler (Q3), som er en konsekvens af den tunge negative udvalg af 564Igi-afledte B-celler.

Høst af væv, behandling og flow cytometric evaluering

Figur 2 og figur 3 viser procedurer for og resultaterne af explanting frisk isoleret lymfeknuder og milt skiver. Figur 4 præsenterer et repræsentativt resultat for in vivo mærkning og photoactivation af en enkelt germinal center område i en eksplanterede milt skive. Som det ses (figur 4A), in vivo mærkning med CD169-PE har håndfast mærket den marginale zone (rød, angivet med "MZ"). Den anden harmoniske signal er tilsyneladende i kollagen-holdige strukturelementer og større fartøjer (blå), herunder den centrale arteriole af periarteriolar lymfoide kappe (PALS). Meget autofluorescent, aktiveres tingible-body makrofager er forbundet med germinal center aktivitet (pilespidser). Identifikation af den marginale zone, PALS og tingible-body makrofager, tilsammen giver mulighed for identifikation af en region af interesse, som sandsynligvis indeholder en enkelt germinal center. Det pågældende område, er photoactivated som illustreret i figur 4B. Som det fremgår, er photoactivation microanatomically præcis9, giver et afgrænset område af aktivering. Præsenteres resultaterne desuden tjene som bekræftelse af en høj tæthed af PA-normal god landbrugspraksis + lymfocytter i rekonstitueret kimærer og tilstedeværelsen af spontan Kimcentre. Downstream flow cytometric evaluering yderligere bekræfter normaliseret B celle rum tal (fig. 5 d), en spontan germinal center befolkning (figur 5E) og tilstedeværelsen af et undersæt af germinal center B celler, som har været photoactivated (figur 5F).

Således, denne protokol præsenterer en robust metode til generering af blandet knoglemarv kimærer med spontane autoreactive Kimcentre, der overvejende består af vildtype afledte B celler transporterer en photoactivatable reporter. Dette giver til gengæld mulighed for downstream analyser af individuelle Kimcentre (grafisk oversigt i figur 6).

Figure 1
Figur 1: Flow cytometric evaluering af graden af kimærisme i blodet af 564Igi (CD45.1-, PA - normal god landbrugspraksis-): PA-normal god landbrugspraksis (CD45.1-, PA-normal god landbrugspraksis +) blandet kimærer i lethally bestrålede CD45.1 modtagere (CD45.1 +, PA - normal god landbrugspraksis-), 6 uger post rekonstitution. A) Plot viser gating B220 + B-celler, pre låge på singlet lymfocytter. B) Subgate fra plot A, viser 9 d 11 + (idiotype) frekvens i B-celle population. C) Plot af PA-normal god landbrugspraksis versus CD45.1, pre låge på singlet lymfocytter. D) Plot af PA-NGL versus CD45.1 i B-celle subgate fra plot A. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Procedure for høstning og montering popliteal lymfeknuder til billedbehandling og photoactivation. A) et snit er lavet under knæet og udvidet op til hofteleddet, og kanterne er trukket tilbage til siderne, for at afsløre den knæhaselymfeknuderne fossa (pilespids). B) den overliggende fatpad er åbnet og den popliteal lymfeknude er udsatte (pilespids). C) i popliteale lymfeknude er hentet fra fossa. D) proceduren gentages for de kontralaterale side og begge noder er monteret i et dobbelt-sidet coverslip/vakuum-fedt kammer fyldt med BM buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Procedure til høst og montering milt til billedbehandling og photoactivation. En) et snit er lavet på den forreste mediale linje lige under brystkassen og udvidet rundt i kroppen til den bageste aksillær linje, og kanterne er trukket tilbage for at eksponere spidsen af milten (pilespids). B) milten er tilbagetrukket og skåret ud og skæres i skiver, tynde (1-2 mm), som er monteret i et dobbelt-sidet coverslip/vakuum-fedt kammer fyldt med BM buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Photoactivation. A) to-foton Mikrograf af en germinale centrum i milten før photoactivation. In vivo mærkning med anti-CD169-PE blev udført før høst af milten at mærke den marginale zone (rød, angivet med "MZ"). De anden harmoniske signal er tilsyneladende i kollagen-holdige strukturer forbundet med integument og større fartøjer (blå). Pilespidser identificere højt autofluorescent, aktiveres tingible-body makrofager forbundet med germinal center aktivitet. Imaging blev udført på 940 nm excitation. Skalalinjen i øverste venstre hjørne angiver 200 µm. B) med hensyn til A, men efter photoactivation på 830 nm. Photoactivated celler er nu synlig (grøn) i et afgrænset område af interesse, der afgrænses af den marginale zone, og som omfatter de tidligere identificerede tingible-body makrofager. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Flow cytometric analyse af photoactivated germinal center B celler. A) Plot af fremad versus side scatter og lymfocyt gate. B) Plot af forward scatter område som en funktion af forward scatter højde i lymfocyt gate, og deraf følgende singlet gate. C) levedygtighed farvestof udstødelse plot inden for singlet gate, og deraf følgende levende celle gate. D) Gating B220 + B-celler. E) Gating germinal center B celler, identificeret som CD38lo GL7hi celler inden for indgangen B220 +. F) Gating af photoactivated celler i befolkningens GC B celle, identificeret som delmængden af celler, der samtidig udtrykker ingen-aktiveret og photoactivated PA-normal god landbrugspraksis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: grafisk oversigt over protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Et stort antal murine modeller af autoimmunitet er tilgængelige, hvoraf mange er til stede med spontane Kimcentre16. Men mange af de tilgængelige modeller harbor komplekse genetiske baggrunde eller mutationer i centrale regulatorer af lymfocyt spredning eller aktivering, gør dem dårligt egnet til intercrossing med journalisten linjer og studier af normale lymfocyt adfærd i autoimmunitet, henholdsvis. Den nuværende model, tværtimod tillader 'plug-and-play' tilgang til dybdegående analyser af autoreactive wild-type-afledte germinal center B celler ved hjælp af enhver ønsket kombination af transgener, knock-outs og journalister, i det foreliggende tilfælde repræsenteret af photoactivatable normal god landbrugspraksis. Brug in vivo mærkning strategier, kan enkelt Kimcentre visualiseres i eksplanterede lymfoide væv og deres cellebestanddele photoactivated ved hjælp af en to-foton mikroskop. Photoactivated lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan derefter blive analyseret eller sorterede flow cytometrically, som enkelt celler eller i bulk. Disse celler kan efterfølgende blive udsat for yderligere downstream molekylære og funktionelle analyser at give fornyet indsigt inden for autoimmunitet.

Der er nogle vigtige trin til vellykket præstation af denne procedure. Som det fremgår af de repræsentative resultater, bestråling (1.100 Rad) og donor knoglemarv rekonstituering med succes erstatte den modtagende knoglemarv rum giver næsten fuldstændig kimærisme i B-celle rum. Dette er et vigtigt punkt, som resterende modtageren-afledte B celler ville gøre et undersæt af befolkningens germinal center 'mørk'. Uanset kilden til bestråling, har dosis/timing af bestråling skal optimeres for at giver maksimal myeloablative effekt med minimal sikkerhedsstillelse vævsskader til dyrene. Til rekonstitution, er knogle-crush protokol og rekonstituering med 20 millioner samlede donor celler blevet fundet at håndfast give høj rekonstitution grader. Arbejder steril og kold/på is til knoglemarven udvinding sikrer høj rentabilitet af donor marv. For at nå den ønskede donor knoglemarv nøgletal, er det nødvendigt at udvise stor omhu ved optælling delprøver af celler, både for at tælle sig selv, og når du tager ud delprøve af knoglemarv til optælling. Blanding og co pelleringsmidler donor courgetter, i stedet for centrifugering og resuspending separat og derefter blande, tjener til at forhindre enhver skævhed i donor nøgletal efter celle optællingen.

Blandet knoglemarv chimera generation af protokollen kan stå alene, og det giver generation af kimærer med autoreactive Kimcentre ønskede reporter, transgene og knock-out. Dog er en begrænsning til dette behovet for at bruge histocompatible donorer. 564Igi stamme er på en C57Bl/6J congenic baggrund, og som en konsekvens af andre donor(s) og modtagerne skal have en H-2b congenic baggrund (eller alternativt, 564Igi stammen bør være backcrossed til den ønskede stamme og autoimmune fænotype kontrolleret på den nye baggrund). Proceduren for bestråling tendens til at favorisere en tolerogenic miljø17, og uoverensstemmelser i nogle mindre histocompatibility antigener kan tolereres. Dog, dette aspekt bør grundigt overvejes, især hvis blanding mandlige og kvindelige donorer og/eller modtagerne, på grund af potentialet for kvindelige reaktivitet med mand-begrænset Y-antigener.

På samme måde, photoactivation aspekt i protokollen kan stå alene, og kan bruges i mange forskellige sammenhænge. PA-normal god landbrugspraksis reporter er imidlertid i øjeblikket kun tilgængelig med UBC promotor, der er aktive i alle hæmatopoietisk slægt celler, men ikke i stromale celler. Som nævnt i indledningen, andre photoactivatable, photoswitchable eller photoconvertible reporter stammer er tilgængelige, og PA-normal god landbrugspraksis, kan erstattes med passende justering af forsøgsbetingelser.

Det er vigtigt at undgå utilsigtet photoactivation af uønskede områder, ved at fastholde laser godt over 900 nm når imaging, som denne bølgelængde vil ikke photoactivate PA-normal god landbrugspraksis. For photoactivation, sig selv, specifikke indstillinger, såsom laser power og pixel hviletid, vil afhænge af dybden i vævet, den specifikke væv bruges og billedbehandling system, og hver applikation har til at være optimeret til det specifikke imaging system anvendes. Pleje skal tages ikke til solskader cellerne, men det er samtidig vigtigt at få effektive photoactivation i hele stakken, for at få en tilstrækkelig repræsentation aktiveret celleområde downstream analyser. Germinal center B celler generelt udgør overalt fra 0,5% til ~ 2% af milt eller kutan lymfeknude B celler, og som kan ses fra de repræsentative resultater (figur 5), photoactivated enkelt germinal center B celler kan fyldes op ~ 1% af samlet bestand, der findes i en enkelt milt skive. Vellykket analyse eller sortering af et betydeligt antal celler kræver derfor, behandling af en lang række begivenheder.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

SE Degn er en Lundbeckfonden fyr og en Carlsberg Foundation fornem fyr. Dette arbejde var delvis desuden støttet af en NNF biomedicinsk Grant (SE Degn).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody, 9D11-A568 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend 110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) Biolegend 144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) Biolegend 142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 Biolegend 102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Biolegend 103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized Fisher Scientific 211766
Cell strainer, 70 µm Falcon 352350
Conical tubes, 50 mL Falcon 352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm Thermo Fisher Scientific 22X22-1
EDTA Merck 1,084,180,250
Ethanol, 70% VWR 8301.360
Fetal bovine serum Life Technologies 10270106
Flow cytometer, FACS Canto II BD Biosciences 338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP BD Biosciences - Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning VWR DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk VWR 630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet. Orion Pharma 9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) Cedarlane CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) Sarstedt 72.690.550
Microscope, Two-photon Prairie Technologies (now Bruker) - Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml VWR 410-0110
NaHCO3 Merck 1063290500
Needle, 18 gauge BD Medical 304622
NH4Cl VWR 87,769,290
PBS Sigma d8537
Pestle homogenizer VWR 47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm VWR 410-0122
Pipette, Serological, 10 ml VWR 612-3700
Pipette, transfer, plastic Sarstedt 861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M) Bemis PM996
Plate, 96-well Falcon 353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps FST - Fine Science Tools 91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps FST - Fine Science Tools 91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight FST - Fine Science Tools 91460-11
Syringe, 10 mL Terumo SS-10ES1
Syringe, 20 mL Terumo SS-20ES1
Syringe, 5 mL Terumo SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc BD Medical 324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml MSD Animal health 431577
Trypan blue solution, 0.4% VWR K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher Scientific 65-0865-14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing. International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  3. Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede. Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).
  4. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  5. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  6. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  7. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  10. Habuchi, S., et al. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).
  11. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).
  12. Degn, S. E., et al. Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers. Cell. 170 (5), 913-926 (2017).
  13. Berland, R., et al. Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice. Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).
  14. Chatterjee, P., et al. Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner. European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).
  15. Toubai, T., et al. Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells. Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).
  16. Luzina, I. G., et al. Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice. Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).
  17. Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529 (2014).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 146 Photoactivation photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (PA-NGL) autoimmunitet milt lymfeknude mus eksplantat blandet knoglemarv chimera to-foton mikroskopi
Afhører individuelle Autoreactive Kimcentrene af Photoactivation i en blandet kimære Model af autoimmunitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, … More

Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, S. E. Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity. J. Vis. Exp. (146), e59397, doi:10.3791/59397 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter