Medicine

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

Published: December 16, 2019 doi: 10.3791/59419

Lauren S. Sherman^1,2, Alexandra Condé-Green³, Yahaira Naaldijk¹, Edward S. Lee³, Pranela Rameshwar^1,2

¹Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, ²Rutgers School of Graduate Studies at New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, ³Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences

Summary

이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

Abstract

중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 지방 조직을 포함하여 다양한 성인 및 태아 조직으로부터 분리 될 수있는 다능성 세포의 집단입니다. 임상적으로 관련있는 세포 모형으로, 시험관에서 이 세포를 격리하고 확장하기 위하여 최적 방법이 필요합니다. 지방에서 파생된 MSP(ADSCs)를 분리하는 대부분의 방법은 지방 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제와 같은 가혹한 효소에 의존합니다. 그러나, 지방 조직을 분해 하 고 높은 ADSC 복구를 산출에 효과적, 이러한 효소는 비싼 고 ADSC에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다-임상 응용 프로그램에서 xenogeneic 구성 요소를 사용 하 여 위험을 포함 하 여. 이 프로토콜은 효소없이 신선한 리포아흡기 및 복부 성형술 샘플에서 ADSCs를 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 간략하게, 이 방법은 배양 형 배양 시스템에 선행된 어떤 벌크 조직의 기계적인 분리에 의존합니다. ADSC는 조직 밖으로 그리고 조직 배양 판으로 이동하는 것이 허용되며, 그 후 ADSCs는 여러 연구 및/또는 임상 적용을 위해 시험관 내에서 배양 및 확장될 수 있습니다.

Introduction

중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 지방 조직을 포함하여 다양한 성인 및 태아 조직에서 분리 될 수있는 다능성 성인 줄기 세포의 클래스입니다. 이들 세포는 시험관 내 모든 생식층의 세포로 분화하고, 동종 장벽을 교차시키고, 염증 부위를 교차시키고, 염증을 억제하는 그들의 가소성 으로 인한 기본적인 연구 및 임상 적용 모두에 대한 매력적인 세포 유형이다(Sherman, et al.^1). 지방 유래 MCS (ASCs)는 지방 조직이 일반적으로 일상적인 지방 흡입 및 복부 성형술 절차에 따라 조직을 폐기하는 것으로 간주되기 때문에, 수득의 용이성으로 인해 특히 매력적입니다. 그러나, 일단 수득되면, 견본은 일반적으로 가혹한 조건을 복종됩니다 – 효소 조건 또는 원심 분리 -^ASCs를격리하기 위하여^2,^3. 이 방법은 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계가 없는 경우 이식 방법을 사용하여 ASC를 분리하는 간단한 절차를 보여 줍니다.

ASC를 분리하는 가장 일반적인 방법은 지방 샘플을 세척하고, 콜라게나아제로 샘플을 효소적으로 소화하고, 샘플을 원심분리하고, ASC^4를배양하기 전에 마지막으로 적혈구를 분해하는 것으로 구성됩니다. ASC의 높은 수율을 격리하는 데 효율적이지만, xenogeneic 성분 (예를 들어, 콜라게나제와 효소 소화)의 사용은 미국 식품 의약국에 의해 "최소 조작"이상으로 간주되며, 클리닉^5,^6에서세포의 사용을 금지하는 면역 반응과 같은 위험을 초래할 수 있습니다. xenogeneic 분대의 리스크를 최소화하기 위하여는, 많은 단은 지방 조직을 소화하기 위하여 비 동물 유래, 제조된 효소를 건의했습니다. 그러나, 이들 효소는 여전히 가혹하고, 세포 표현형을 변경할 수 있다^7.

ASC를 격리하는 다른 방법은 고속 원심분리, 1,200 x g의높은 힘을 사용하여 ASC^8을격리하는 소용돌이를 포함합니다. 400 x g의 낮은 힘조차도 가능한 ASC^9을격리하기에 충분했습니다. 이 세포는 실행 가능한 세포의 다량을 생성하는 동안, 많은 프로토콜은 14 일⁸를 넘어 증식하는 데 실패했습니다. 또한, 기계적 절연은 효소 소화보다 회수된 세포를 적게 수율산출하지만, 계대 0^10에서지방 조직에 내인성 다른 세포에 비해 단리된 세포의 높은 비율은 ASC였다.

xenogeneic 분대의 비용 및 리스크와 더불어 더 적은 시간에 ASC의 더 순수하고 실행 가능한 인구의 격리는, 진료소에 번역을 위한 효소 소화를 점점 더 적게 호소합니다. 기계적 절연은 처음에는 유리한 접근법이지만, 사용되는 방법에 상당한 차이가 있고, 처리된 조직의 부피는 특수원심 단위의 크기로 제한되고, 작업자 의 일관성^2에의존할 수 있다.

효소 소화와 원심분리 모두 ASC의 높은 부피를 빠르게 산출하는 동안, 이 고립된 세포는 표현형 변화를 보여주고, 환자에게 돌아올 때 그들의 행동에 관하여 질문을^{산출합니다 2.} 이 프로토콜에 설명된 바와 같이, ASC 격리의 이식 기반 방법은, 따라서 일부 집단에 의해 채택되고, ASC는 고체 지방 조직^3,^11,^12의작은 조각에서 이동한다. 이러한 이동은 세포가 영양이 풍부한 매체에 그려지는 효과가 있는 것으로 보인다. 중간 식 세포의 다른 인구와 마찬가지로, ASCs는 플라스틱에 부착하고, 생존과 지방 조직에서 다른 세포 유형에서 자신의 격리를 허용, 사용되는 조직 배양 매체 (아래 구성 요소)에서 증식. 더 적은 세포가 처음에 복구되는 동안 - 수시로 취하는 > 1 주 세포가 조직 배양 격판덮개에 보일 때까지 - 이 조작되지 않은 ASC는 시험관에서 증식할 것이고, 임상적으로 관련있는 양에 세포의 확장을 허용하는^11,^12,^13.

Protocol

Lipoaspirate 및 복부 성형술 샘플의 사용은 러트 거스 대학의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다 - 뉴 어크 캠퍼스.

1. 조직배양배지의준비

ASC를 분리하기 전에 500 mL의 조직 배양 배지를 멸균하여 준비합니다. 배양 배지를 준비하려면, 높은 포도당과 2 mML-글루타민을 가진 덜베코의 최소한의 필수 배지(DMEM)에 10% 정의된 태아 송아지 혈청(FCS)과 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/100 mL)을 추가합니다. 매체는 최대 3 주 동안 4 °C에서 보관 할 수 있으며 항상 따뜻하게 사용해야합니다 (실온에서 37 °C 사이).
1. 다른 배지가 줄기 세포의 배양에 바람직한 경우, 대신 그 배지를 준비한다.

2. 지방 조직에서 ASC의 격리

리포아스해적 또는 복부 성형술 샘플을 얻습니다. IRB 승인 후, 다양한 수술 절차에 따라 조직을 폐기와 같은 샘플을 얻을. 외과 의사가 조직을 제거 한 혈관 중 실험실로 lipoaspirates를 수송; 수술실 시편 가방 또는 용기에 복부 성형술 샘플을 운반.
시료를 실온에서 최대 6시간 또는 4°C에서 즉시 처리하지 않을 경우 최대 24시간 동안 보관하십시오. 전술한 시간을 넘어 처리된 조직 샘플은 세포 수율이 감소할 가능성이 있다. 1x 멸균 인산염 완충 식염수를 첨가하여 복부 성형술 샘플을 촉촉하게 유지하십시오.
이 시점부터 무균 조건하에서 층류 후드의 모든 단계를 수행하십시오. 개인 보호를 위해 장갑을 착용하십시오. 10% 표백제, 70% 에탄올, 종이 타월을 근처에 보관하여 생물학적 유출을 신속하게 정리하십시오. 과잉 조직을 생물 의학 폐기물로 폐기합니다.
샘플을 1mm 조각으로 잘라내십시오. 복부 성형술 블록이 너무 커서 작업할 수 없는 경우, 다진 전에 블록에서 조직의 관리 가능한 크기를 잘라냅니다. 멸균 100mm 플레이트의 뚜껑에 복부 성형술 조직을 옮김을 옮김. 멸균 바늘을 사용하여 조직의 조각을 제자리에 고정하고 멸균 메스를 사용하여 벌크 조직을 자르거나 부드럽게 파쇄하여 조각을 잘라냅니다.
1. 이 단계는 일반적으로 lipoaspirates에 대 한 필요 하지 않습니다. 그러나, 큰 조직 덩어리가 lipoaspirate에서 관찰되는 경우에, 위와 같이 멸균 집게로 그 같은 덩어리를 제거하고 프로세스.
조직을 신선한 튜브로 옮기고 샘플을 5-6회 반전또는 흔들어 모든 층의 혼합을 보장합니다. 선택 사항: 리포아흡이 완전히 가라앉은 경우, 혼합하기 전에 오일 층을 제거하고 폐기하십시오.
2.5-5 mL의 조직을 100 mm 진공 가스 플라즈마 처리 조직 배양 판으로 옮김(표오브 머티리얼)으로옮니다. 신선한 원심분리기 튜브에 부어 시료의 부피를 측정합니다. 필요한 경우 멸균 주걱을 사용하여 조직 전달을 돕습니다.
플레이트에 동등한 부피의 조직 배양 배지를 추가합니다. 접시를 부드럽게 돌리면서 내용물과 섞습니다.
충분한 수의 세포가 플레이트의 기저부에서 보일 때까지 5%_CO2에서 37°C에서 파테를 배양한다. 시간이 지남에 따라 세포는 조직 내에서 플레이트 표면으로 이동하여 플라스틱에 부착됩니다. 그(것)들이 조직을 종료하는 때, 세포는 조직 조각의 주위에 작은 클러스터로 나타납니다.
매 24 시간마다 가능한 한 많은 액체를 제거하고 비슷한 양의 매체로 교체하십시오. 가능하면 티슈 조각을 제자리에 두십시오.
충분한 수의 세포가 플레이트에 기록되면 (>10 클러스터의 > 15-25 세포가 접시에 있음) 또는 7 일 후, 더 빨리, 조직의 나머지 조각을 모두 제거하십시오.
조직 배양 배지에서 ASC를 70% 합의에 도달할 때까지 또는 클러스터가 조밀해질 때까지 배양합니다(>5 조밀한 세포 군집, 각각 약 > 500 μm의 직경을 가진 세포군재)이 통과되어야 합니다.

3 ASC의 문화

부모 플레이트가 약 70% 동률에 도달하면 ASC를 통과합니다. ASC 문화의 합류를 피하기 위해 주의하십시오.
1x 인산완충식염수로 플레이트를 부드럽게 헹구고 부착 세포를 트립시니화합니다. 세포를 트립시니화하기 위해, 인산완충 식염수를 흡인하고 각 플레이트에 0.25% EDTA를 가진 트립신 1 mL을 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양한다. 5 분 후, 현미경 검사법에 의한 순도 를 확인하십시오. 세포가 여전히 부착되어 있는 경우, 세포를 추가로 5분 동안 인큐베이터로 되감습니다.
소량의 용지(총 트립신 부피의 약 25%)를 플레이트에 추가하여 트립신을 비활성화하고, 매체/트립신을 사용하여 플레이트의 베이스를 부드럽게 세척합니다. 플레이트를 세척하려면 플레이트를 약간 비스듬히 잡고 플레이트 상단에서 아래쪽으로 미디어/트립신을 부드럽게 파이펫하여 플레이트에서 매주 부착된 셀을 느슨하게 합니다. 세포는 1:3 비율로 재도금되거나 플레이트당 120,000-500,000셀의 밀도로 시드될 수 있다.
1. 세포 수에 기초하여 파종하는 경우, 플레이트에서 트립신/배지를 원추형 원심분리관으로 옮기고, 7분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 펠렛한다. 세포를 계산하기 위해, 혈세포 현탁액의 10 μL을 혈전계로 옮기고 그리드의 각 모서리에 있는 4 x 4 사분면에 존재하는 세포를 계산한다. 이러한 값을 함께 평균하고 값을 10^4로 곱하여 셀 번호를 계산합니다.
2. 세포를 파종하기 전에 플레이트에 미디어를 추가합니다. 셀을 드롭 방식으로 추가한 다음 플레이트를 소용돌이로 돌리면 플레이트 전체에 균일한 분포가 보장됩니다.
  참고: 3개의 대고 후에, 부착된 세포는 비대칭 및 스핀들 모양으로 나타나야 합니다. ASC 표현형 및 거동은 유세포분석및 분화 분석기를 사용하여 확인할 수 있다.
유세포분석및분화분석술을이용한ASC표현형및행동체의확인
1. 유세포분석
  1. 상기와 같이 세포를 수집하고 펠렛한다. 1x 인산완충식염수로 펠릿을 세척하고 제조업체가 권장하는 항체 볼륨으로 세포에 라벨을 붙입니다. 유세포분석, 일반적인 실험실 절차에 대한 자세한 프로토콜은 여기에서 찾을 수 있습니다^12,¹⁴^,¹⁵.
  2. ASC 표현형을 확인하기 위해 다음으로부터 표면 마커 패널을 선택한다: CD14, CD31, CD34, CD45 및 CD106에 대한 음수; CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 및 CD105^16,^17,^18,^19에대해 긍정적입니다. CD36의 존재와 CD106의 부재는 골수 유래 MCS^20에서ASC를 분별합니다.
2. 분화 검사: MSC 분화 키트를 사용하여 다중 라인 차별화를 확인합니다. 키트는 여러 제조업체에서 지광, 골생성 및 콘드로겐성 분화 능력을 확인하기 위해 사용할 수 있습니다. 키트 제공 매체를 3주 동안 또는 형태학적 분별이 관찰될 때까지 제조업체의 프로토콜에 따라 3~4일마다 변경합니다.
여러 대통로에 대한 세포를 배양하는 단계; 필요한 구절의 수는 응용 프로그램에 따라 달라집니다. 각 계심에서, 전술한 세포 표면 마커를 사용하여 MSC 세포 형태및 표현형을 확인하고, 다중 라인 분화 능력이 손실되지 않았는지 확인한다. 확장 잠재력은 기증자 간에 다르지만 대부분의 샘플은 최대 6-9 개의 대구로 확장 될 수 있습니다.
세포를 냉동 보존하고 향후 사용을 위해 액체 질소에 보관하십시오.

4 ASC의 냉동 보존

동결 솔루션 A와 B의 10 mL를 준비합니다.
1. 동결 용액 A의 경우, 높은 포도당DMEM에 20% FCS를 추가하십시오.
2. 동결 용액 B의 경우, 20% FCS와 20% 디메틸 설파이드(DMSO)를 높은 포도당DMEM에 추가합니다.
펠렛 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 5분 동안 동결액 A의 소량으로 세포를 재중단하고 3.3.1단계에서와 같이 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트한다.
500,000-1,000,000 셀/mL의 최종 세포 농도에 도달하기 위해 세포가 다시 중단될 최종 부피를 계산합니다. 동결 용액 A를 사용하여 최종 부피의 50%에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 최종 세포 농도에 도달하기 위해 튜브를 교반하면서 동결 액 B의 동일한 부피를 천천히 추가하십시오.
즉시 1-2 mL 극저온에서 세포를 동결. -80°C에 놓인 냉동 용기 나 냉동 용기에 저온 을 동결시켜 온도를 1 °C / 분으로 줄입니다. 제어 된 동결 (동결 용기의 경우 하룻밤)에 따라 세포를 액체 질소로 옮겨 장기간 보관하십시오.

Representative Results

여기에 상세한 방법을 사용하여, ASC는 성공적으로 지질 및 복부 성형술 샘플에서 분리되었다(그림 1). 3개의 대지나 후, 단리된 세포는 효소 소화를 따르는 ASC와 유사한 MSC 형태(비대칭, 스핀들 형상) 및 표현형을 갖는다는 것을 발견하였다(도2). 우리 그룹 및 다른 사람들로부터의 선행 연구는 이러한 ASC가 다른 수단에 의해 분리된 ASC를 포함하여 다른 MC와 같은 지방세포, 골세포 및 뉴런으로 분화하는 것으로 나타났다^11,^21.

대부분의 경우에, 조직 배양 격판덮개에 ASC 이동은 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 3-5 일 안에 구상될 수 있습니다. 그러나 경우에 따라 희소 한 세포만 7 일 후에 표시됩니다. 드문 경우에, 세포는 판에 마이그레이션되지 않으며/ 또는 세 번째 통로까지 증식하지 않을 것입니다. 이 결과는 일반적으로 조직 견본 처리에 있는 지연과 상관합니다.

그림 1: 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 의 ASC 격리의 회로도 표현. 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플은 일상적인 수술 후 조직을 폐기함에 따라 수득되었다. 복부 성형술 샘플은 파쇄되었고, 그 후 복부 성형술 또는 지방 흡입구 샘플은 조직 배양 배지에서 이식물로 도금되었습니다. ASC는 조직에서 영양이 풍부한 매체쪽으로 이동했습니다. 1주 후, 이식을 제거하고 다운스트림 실험 및/또는 임상 적용을 위해 ASC를 배양하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: MSC 형태및 표현형을 가진 고립된 ASC. 효소프리, 배전 방법에 의해 단리된 ASC는 통로 3에서 MSC 형태및 표현형을 갖습니다. (A)다른 MC와 마찬가지로, 이러한 ASCs는 배전 또는 효소 방법(예를 들어, 콜라게나아제)에 의해 분리되었는지 여부에 관계없이 비대칭, 스핀들 형상을 가진다. 효소 방법을 사용하여 단리된 ASC는 단리된 ASC를 이식하는 것과 비교하여 더 길고 좁은 형태를 산출; 후자는 골수 유래-MC와 같은 다른 효소 프리 격리 방법에서 파생된MCS와 유사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

ASC는 조직의 쉬운 접근 때문에 MSC의 매력적인 근원입니다. 임상 및 연구 응용 프로그램 모두에 대 한, 과학자 는 이러한 세포를 격리 하 고 배양 할 때 마음 기증자 가변성에 부담 해야 합니다. 아직 해명되지 않은 이유로, 다른 기증자의 MSC는 체외에서 증식하는 다른 능력을 보여, 이는 이후에 지방 이식 및 증식 용량에서 ASC의 마이그레이션에 영향을 미칠 것입니다. 이러한 효소가 없는 이식체로부터 분리된 ASC가 합류에 도달하는 데 걸리는 시간에 가변성을 관찰할 수 있지만, 시험관 내에서 증식하지 않는 시료는 드물었다.

기증자 가변성 을 넘어, 세포가 조직 밖으로 이동하거나 시험관 내에서 증식하는 실패의 가장 가능성이 높은 원인은 조직이 처리하기 전에 저장된 시간의 길이입니다. 시료가 처리 전에 >12 h에 대해 앉도록 허용되거나 수확과 가공 사이에 촉촉하게 유지되지 않았을 때, 가난한 이동 및 증식률이 관찰되었다. 자주 증식에 실패 한 유일한 샘플은 식염수 용액으로 촉촉하게 유지되지 않은 복부 성형술 샘플이었다 : 이러한 경우, 조직 블록의 중심에있는 조직은 종종 처리하기에 충분히 촉촉했지만, 때때로 폐기 할 필요가 있었다. 따라서 처리를 통해 수확의 시간에서 조직을 촉촉하게 유지하는 것이 중요합니다.

ASC가 1 주 마크에서 플레이트에서 관찰되지 않는 경우, 지방 이식은 조직 괴사가 발생하지 않도록 조직 배양 판에서 여전히 제거해야합니다. 때로는 쉽게 식별 할 수있는 세포가 너무 적지만, 그 소수의 세포는 배양 시스템 내에서 확장 할 수 있을 것입니다. 세포가 3 주에서 여전히 관찰되지 않으면 격리가 실패한 것으로 간주되어야합니다.

어떤 경우에는, 특히 복부 성형술의, 수술 분야 내의 한계로 인해 진정한 무균 샘플을 얻을 수 없습니다. 멸균 용기를 사용하여 조직을 수술실에서 층류 후드로 이송할 수 없는 경우, 조직의 외부 1cm를 제거하는 것은 일반적으로 미생물 오염을 방지하기에 충분하다. 복부 성형술 샘플이 피부에 부착된 경우, 피부는 지방 조직을 다듬기 전에 그 표면을 살균하기 위해 70 % 에탄올로 닦아 수 있습니다.

다진 과정에서 조직이 작고 미세한 조각으로 다듬어지는 것이 중요합니다. 이식이 너무 크면 ASC가 조직 밖으로 이동하고 플레이트위로 이동하는 표면적이 부족합니다. 또한, 조직이 괴사되지 않도록 조직이 필요 이상으로 플레이트에 더 이상 남아 있지 않는 것이 중요합니다.

이 방법의 한계는 조직 배양 과정 동안 ASC를 분리하는 효소(기재된 프로토콜, 트립신)의 사용이다. Accutase와 같은 다른 비동물 유래 효소는 동물 유래 제품에 대한 필요성을 제거하기 위해 대체 될 수 있지만, 이것은 조직 배양 비용을 증가시킬 것이다. 이러한 이유로, 많은 그룹이 그들의^{기질(22)으로부터}세포를 분리할 필요성을 최소화하면서 MSC 성장 잠재력을 증가시키기 위해 생물반응기 및 스캐폴드 계 시스템과 같은 비2차원 조직 배양 방법을 조사하고 있다.

ASC를 클리닉으로 옮길 때, 이식 격리 방법의 주요 제한은 많은 의료 센터가 부족한 좋은 제조 관행 (GMP) 수준의 조직 배양 시설에 의존하는 것입니다. 이러한 경우에, 임의의 자가 동봉된 상업적으로 이용 가능한 효소-또는 원심분리 기반 방법이 채택될 필요가 있을 것이다. 그러나 GMP 시설이 더 널리 보급됨에 따라 이러한 효과는 제한적일 것으로 예상됩니다. 한편, GMP 조직 배양 시설이 부족한 이러한 시설조차도 시험관내에서 ASC를 연구하기 위한 이식 방법을 사용할 수 있다: 조작이 적을수록 이들 세포는 생체내^{대응물(11)에}더 가깝다.

이 방법은 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계가 없는 경우 지방 조직(리포아흡기 및 복부 성형술)에서 ASC를 분리하는 간단한 방법을 제공합니다. ASC의 초기 수율은 다른 방법보다 낮지만, ASC는 시험관 내에서 증식되어 낮은 초기 수율의 효과를 최소화합니다. 과도하거나 강제적인 조작의 부족은 ASC가 특히 관련성이 있는 방식으로 고립하게 만드는데, 이는 관찰된 효과가 세포 자체 또는 격리 과정 중 세포의 조작때문인지 여부)가 적기 때문에 특히 관련성이 높습니다. ).

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다

Acknowledgments

저자는 아무런 인정이 없다

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
Falcon 3003 tissue culture plates	Corning	Corning
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	serum is batch tested to ensure it supports MSC growth
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049