Summary
Genom detta protokoll införs ett standardförfarande för laboratorie drift för diagnostisk testning av lyssavirus antigener i fladdermöss i Taiwan.
Abstract
Virus inom släktet lyssavirus är zoonotiska patogener, och minst sju lyssavirus arter är förknippade med mänskliga fall. Eftersom fladdermöss är naturliga reservoarer av de flesta lyssaviruses, har ett lyssavirus övervakningsprogram för fladdermöss bedrivits i Taiwan sedan 2008 för att förstå ekologin hos dessa virus i fladdermöss. I detta program, icke-statliga bat bevarande organisationer och lokala djur centra sjukdom kontroll samarbetade för att samla in döda fladdermöss eller fladdermöss dör av svaghet eller sjukdom. Hjärnvävnader av fladdermöss erhölls genom obduktion och utsätts för direkt fluorescerande antikroppstest (fett) och omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR) för detektion av lyssavirus antigener och nukleinsyror. För FETTET rekommenderas minst två olika konjugat av rabies diagnos. För RT-PCR används två uppsättningar primrar (JW12/N165-146, N113F/N304R) för att förstärka en partiell sekvens av lyssavirus-nukleoproteingenen. Detta övervakningsprogram övervakar lyssaviruses och andra zoonotiska smittämnen i fladdermöss. Taiwan bat lyssavirus finns i två fall av den japanska pipistrelle (Pipistrellus abramus) i 2016 – 2017. Dessa fynd bör informera allmänheten, hälso-och sjukvårdspersonal och forskare om de potentiella riskerna med att kontakta fladdermöss och andra vilda djur.
Introduction
Virus inom släktet lyssavirus är zoonotiska patogener. Det finns minst sju lyssavirus arter i samband med Human fall1. Förutom de 16 arterna i släktet1,2,3, har Taiwan bat lyssavirus (twblv)4 och kotalahti bat lyssavirus5 nyligen identifierats i fladdermöss, men deras taxonomiska status har ännu inte bestämmas.
Fladdermöss är de flesta lyssaviruses naturliga värdar, med undantag av Mokola lyssavirus och ikoma lyssavirus, som ännu inte har identifierats i någon fladdermus1,2,3,6. Informationen på lyssaviruses i asiatiska fladdermöss är fortfarande begränsad. Två okarakteriserade lyssaviruses i asiatiska fladdermöss (en i Indien och den andra i Thailand)7,8 har rapporterats. En mänsklig rabies fall förbundet med en fladdermus bita i Porslinet var rapportera i 2002, utom diagnosen var gjord bara vid klinisk observation9. I Central Asien identifierades Aravan lyssavirus i den mindre mus-eared bat (Myotis sångare) i Kirgizistan 1991, och khujand lyssavirus identifierades i den med morrhår bat (Myotis mystacinus) i Tadzjikistan i 200110. I Sydasien identifierades Gannoruwa bat lyssavirus i den indiska flygande räven (Pteropus Medius) i sri Lanka 20153. I Sydostasien, flera serologiska studier på fladdermöss i Filippinerna, Thailand, Bangladesh, Kambodja och Vietnam visade variabel seroprevalens11,12,13,14, 15. Även om Irkut lyssavirus identifierades i det större röret-nosed bat (murina leucogaster) i Jilin-provinsen, kina i 201216, förblir den exakta arten och platserna för Lyssaviruses i östasiatiska fladdermuspopulationer okända.
För att bedöma närvaron av lyssavirus i taiwanesiska fladdermuspopulationer initierades ett övervakningsprogram som sysselsätter både direkt fett och RT-PCR. Taiwan bat lyssavirus identifierades i två fall av den japanska pipistrelle (Pipistrellus abramus)4 under 2016 – 2017. I denna artikel införs ett operativt laboratorieförfarande för lyssavirus övervakning av BAT-populationen i Taiwan. Flödesschema för BAT lyssavirus diagnos i vårt laboratorium presenteras i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. säkerhetsföreskrifter vid hantering av lyssaviruses
- Se till att alla laboratoriearbetare som hanterar bat-prover får pre-exponering för rabies profylax17. Kontrollera nivåerna av rabiesantikroppar hos arbetarna i förväg och ompröva dem var 6: de månad17. Uppföljning av rabiesvaccination krävs för dem vars antikroppsnivåer är lägre än 0,5 IE/mL17.
- Beroende på biosäkerhets föreskrifterna i det land där laboratoriet är beläget, se till att följande procedurer utförs i lämpliga laboratorier för biosäkerhetsnivå (t. ex. BSL-2-laboratorier i Taiwan och BSL-3-laboratorier i Australien), och att arbetstagarna är för närvarande kvalificerade och bär ordentlig personlig skyddsutrustning18.
Obs: rabies vaccinering skaffar litten till nej säkringen från lyssaviruses tillhörande phylogroups II och III18. Arbetstagarna måste informeras om att flera zoonotiska patogener har identifierats i fladdermöss19 och bör hantera prover under lämpliga laboratorieförhållanden på biosäkerhetsnivå med lämplig personlig skyddsutrustning.
2. provtagning
- Använd hittade svaga eller sjuka fladdermöss eller slaktkroppar.
Obs: svaga eller sjuka fladdermöss levereras till bat Conservation Society i Taipei för veterinärvård eller forskning, medan slaktkroppar lämnas in direkt till Animal Health Research Institute. Inga hälsosamma fladdermöss har euthanized i detta övervakningsprogram. - Ha en fladdermusekolog identifiera fladdermöss arter genom morfologiska egenskaper20.
- Utför DNA-streckkodning av fladdermusarten när lyssavirus positiva diagnostiseras med hjälp av tidigare publicerade procedurer21.
- Lämna in ett informationsblad för varje bat-kadaver (uppsamlingsplats, art, kliniska tecken osv.).
3. nekropsy av BAT-preparat
- Förbered material.
- Förbered en ren dissektion ombord och placera en steril absorberande pad för nekropsy.
- Förbered uppsamlings rören för uppsamling av BAT-organ.
- Förbered engångspincett och skalpeller för obduktion. Byta verktyg mellan varje bat ' s Necropsy. Förbered bomullstussar fuktade med 70% etanol för rengöring pincett och skalpeller under provtagning.
- Förbered två Mikroskop diabilder för FETTET. Samla in färska prover och fixera dem i formalin lösning för histopatologisk undersökning.
- Undersök alla yttre öppningar före nekropsy. Fotografera bat: s yttre funktioner, särskilt huvud, öron och vingar, för Art differentiering.
- Samla ett oralt pinnprov. Placera bat i ventrala vilo på brädet och fixa bat huvud med pincett. Skär huden längs mittlinjen av calvaria med en skalpell och dra huden till laterala sidor. Skär skallen längs mittlinjen av calvaria med en skalpell och öppna den med pincett att exponera hjärnvävnaden.
- Ta bort hjärnvävnaden från skallen och placera den på en steril tunga depressor, och göra avtryck smetar från hjärnvävnaden (se steg 4,2). Samla en liten bit av färsk hjärnvävnad och fixa det i formalin för histopatologisk undersökning. Innehåller den kvarvarande hjärnvävnaden i ett rör för nukleinsyrgasextraktion.
- Rengör pincett och skalpell med bomullstussar fuktad med 70% etanol för att avlägsna behållna vävnader mellan preparat samlingen.
- Placera bat på brädet i dorsala vilo och fixa det på brädet med nålar på båda sidor av armhålan och svans hälen.
- Incise huden längs mittlinjen av kroppen från underkäken till anus. Lyft och separera huden och underliggande muskelvävnad med pincett. Samla spottkörtlarna, som är nära mandibular benet.
- Lyft bröstbenet något med pincett, och skär bröstbenet och bukväggen längs mittlinjen med en skalpell. Skär nyckelbenen med en skalpell. Fäst vänster och höger revben burar till brädet med nålar för att öppna brösthålan.
- Registrera brutto lesioner och graden av post-mortem förändring.
- Ta bort visceral vävnader (dvs, hjärta, lungor, lever, njurar, tarmar) från slaktkroppen med hjälp av pincett och en skalpell. Samla in de visceral preparat som behövs för framtida forskning.
Observera: insamling av dubblettprover rekommenderas. Man bör samlas in för molekylär diagnos, och den andra bör frysas vid-80 ° c med eller utan viral transportmedium för viral Culture22.
4. direkt fluorescerande antikroppstest (fett)
- Gör intrycket smetar av hjärnvävnaden för FETTET. Utför fettet som tidigare beskrivits18,23 med följande modifieringar.
- Försiktigt separera hjärnvävnaden från den anslutna nerv vävnaden med pincett och överföra hjärnvävnaden till en steril tunga depressor. Skär tvärsnittet av hjärnan, inklusive hjärnstammen och lillhjärnan18,23. Gör intrycket smetar av hjärnvävnaden genom att lätt röra den skurna ytan av hjärnvävnaden, och tryck på bilden på linsen vävnad att ta bort överflödig vävnad.
- Fixera bilderna med aceton vid-20 ° c i 30 min. torka de testade glasen och de positiva och negativa kontrollerna innan färgning med konjugaten.
- Att använda var och en av de två kommersiellt tillgängliga FITC-konjugerade anti-rabies antikropparna för färgning lyssavirus antigen rekommenderas starkt23. Bestäm den arbetande koncentrationen av det kommersiella konjugaten före den första infärgning. Släpp de utspädda konjugaten genom ett spruta filter på 0,45 μM på glidbanorna och inkubera bilderna vid 37 ° c i 30 minuter i en våt kammare.
- Dränera överflödigt konjugat från diabilderna och tvätta glasen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) efter inkubering.
- Tappa en liten mängd 10% glycerol på glidbanorna och täck med täckglas.
- Undersök bilderna med ett fluorescerande Mikroskop.
5. nukleinsyrgasextraktion
- Tillsätt rätt volym av MEM-10 (minsta essentiella mediet kompletteras med 10% foster bovint serum) till hjärnvävnaden (10% w/v).
- Homogenifiera hjärnvävnaden med en 5 mm stål pärla i ett Homogenisatorer instrument och centrifugera vid 825 x g för 10 min.
- Extrahera nukleinsyran, vars slutliga volym är 50 μL, inom 200 μL av supernatanten med hjälp av det kommersiellt tillgängliga totala nukleinsyrgasextraktionsset med instrument.
6. RT-PCR och fylogenetisk analys
Obs: flera primer uppsättningar har publicerats för att upptäcka alla kända lyssaviruses eller specifika lyssaviruses. Det protokoll som beskrivs här är ett exempel som vårt laboratorium använder och kanske inte passar alla experimentella behov. Välj lämpliga primers enligt laboratorie behov.
- Bered en-stegs RT-PCR-reagens enligt följande: Tillsätt 5 μL av den extraherade nukleinsyran till reaktionsblandningen som innehåller 2,5 μL 10X reaktionsbuffert, 0,5 μL av fram-och bakprimrar (10 μM vardera), 4 μL 1,25 mM dNTP, 0,3 μL av RNase-hämmare (40 U/μL) , 0,3 μL omvänd transkriptas (10 U/μL), 0,4 μL DNA-polymeras (5 U/μL) och 11,5 μL DEPC-behandlat vatten.
Anmärkning: den primeruppsättning som används i detta protokoll är JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') och N165-146 (5 '-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3 ')24. Modifiera beredningen av reagenser och cykel förhållanden enligt de primer-satser som används. - Utför cyklingen under följande förhållanden: inkubering vid 42 ° c för 40 min; initial denaturering vid 94 ° c i 10 min; 35 cyklar av 94 ° c för 30 s, 55 ° c för 30 s och 72 ° c för 30 s; och slutligen, ytterligare förlängning vid 72 ° c för 10 min.
- Använd en annan eller flera primer-uppsättningar för att öka diagnostikkänsligheten.
- Använd N113F (5 '-gtaggatgctatatggg-3 ') och N304R (5 '-ttgacgaagatcttgctcat-3 ')25,26 för att förbereda en-stegs RT-PCR-reagens enligt följande: Tillsätt 5 μl extraherad nukleinsyra till en reaktionsblandning som innehåller 5 μl 10X buffert, 5 μl framåtriktade och omvända primrar (4 μM vardera), 5 μL 1,25 mM dNTP, 0,5 μL av RNase-hämmare (40 U/μL), 0,2 μL omvänt transkriptas (10 U/μL), 1 μL DNA-polymeras (5 U/μL) och 23,3 μL DEPC-behandlat vatten.
- Utför cyklingen under följande förhållanden: inkubering vid 42 ° c för 40 min; initial denaturering vid 95 ° c i 5 min; 35 cykler på 95 ° c i 1 min, 55 ° c i 1 min och 20 s, och 72 ° c i 1 min; och slutligen, ytterligare förlängning vid 72 ° c för 10 min.
Obs: beroende på laboratorie behov, Välj lämpliga primers för diagnos. N113F var ursprungligen avsedd för rabiesvirus förstärkning, men det kanske inte fungerar bra för andra lyssaviruses. Den uppsättning av N113F och N304R fungerar bra för rabiesvirus (Taiwan Ferret Badger variant) och Taiwan bat lyssavirus. Det blir lättare att få hela nukleoproteinsekvenser genom att använda uppsättningen av JW12 och N304R primers om lyssavirus förstärks av båda de ovan nämnda två primer-uppsättningarna.
- Analysera PCR-produkten på 2% aguppstod gel elektrofores och visualisera med UV-belysning.
- Sekvensera PCR-produkten efter kommersiell sekvenserings tjänst.
- Ange eller ladda upp sekvensen till webbsidan för nucleotide Basic Local Alignment search Tool (BLAST). Välj databasen "andra (nr etc.)" och ange organismen som lyssavirus. Välj den MegaBlast algoritm och kör BLAST.
7. virus isolering
Anmärkning: utför virusisolering när antingen 1) FETTET eller 2) RT-PCR indikerar positivitet.
- Homogenisera hjärnans prov i en 10% (w/v) suspension i MEM-10. Centrifugera vid 825 x g i 10 min.
- Inokulera 200 μL supernatanten med en suspension av 3 x 106 mna-celler (Mouse Neuroblastoma) i 1 ml MEM-10 för 1 h vid 37 ° c med 1% Co2. Överför hjärnan homogeniate-cellsuspensionen till en 25 cm2 kolv och tillsätt 6 ml MEM-10.
- Odla 1 mL av hjärnan homogenate-cellsuspension i en 4 väl teflonbelagd glas Slide med 6 mm diameter samtidigt.
- Efter 3 – 4 dagar av inkubering vid 37 ° c med 1% CO2, fixera cellerna på 4 väl glida med 100% aceton (v/v).
- Färga glasen med två FITC-konjugerade anti-rabiesantikroppar enligt steg 4.4 – 4.7. Cellerna är infekterade när intracytoplasmatisk inneslutningar undersöks. Registrera procentandelen infekterade celler.
- Utföra trypsinization och subkultur av den inokulerade cellkulturen när bilderna är färgade som negativa:
- Ta bort mediet och skölj kolven med 5 mL PBS.
- Tillsätt 1 mL trypsin till kolven och slå fast botten av kolven.
- Tillsätt 6 mL MEM-10 och Omsuspendera cellerna.
- Sätt cellsuspensionen i en ny vävnads kolv (6 mL) och på en 4 brunn Slide (1 mL).
- Upprepa steg 7.4 – 7.6 tills 100% smittsamhet uppnås.
- Samla supernatanten efter 24 h inkubation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Från 2014 till maj 2017 samlades 332 bat-slaktkroppar från 13 arter in för övervakning. Två testade positiva. I det första bat-fallet testade hjärnan intrycket negativt med hjälp av FETTET med en av de kommersiella FITC-konjugerade anti-rabiesantikropparna (figur 2), medan de RT-PCRS som använder var och en av de två PRIMERUPPSÄTTNINGARNA (JW12/N165-146, N113F/N304R) gav positiva resultat (figur 3). En 428 BP sekvens av amplikon (Amplified med N113F/N304R och innehåller den partiella nukleoproteingenen) erhölls. Dess sekvens utsattes för BLAST frågor av GenBank databasen. Resultatet visade att sekvensen liknade lyssaviruses med identiteter på mindre än 79% (figur 4), vilket stödde identiteterna hos de upptäckta lyssaviruses.
Senare, två lyssaviruses isolerades framgångsrikt från dessa två hjärnor, och virusen bekräftades av fett (figur 5) och sekvensering. Det identifierade lyssavirus utsågs till Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) baserat på sekvensanalys4. I det andra fallet var de resultat som erhållits från de fetter som var och en av de två kommersiella FITC-konjugerade anti-rabiesantikropparna oförenliga, såsom beskrivits i det första fallet.
Figur 1: BAT lyssavirus diagnos flödesschema.
Flödesschema som visar aktuell process och diagnostiska metoder som vårt laboratorium använde nu. Virus isolering bör utföras när antingen direkt fluorescerande antikropp test eller omvänd Transkription polymeras kedjereaktion är positiv. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: direkt fett med två kommersiella FITC-konjugerade anti-rabies antikroppar av hela hjärnan kompression från en TWBLV-infekterade bat ger inkonsekvent resultat.
Ärendenummer: 2016-2300: (A) FETTET med reagens A (5x utspädning), som demonstrerar äppelgröna positiva signaler. B) FETTET med reagens B, som uppvisar ett negativt resultat (20x utspädning). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: produkter från RT-PCRs som använder två primer-satser.
Primersetet som används i körfält 1 till 3 var JW12/N165-146, och den förväntade produktstorleken var 111 bas par. Primersetet som används i körfält 4 till 6 var N113F/N304R, och den förväntade produktstorleken var 521 bas par. Båda provningarna av provet (körfält 1 och 4) var positiva. M = 100 BP DNA-stege; körfält 1 och 4 = testat prov; körfält 2 och 5 = positiva kontroller; körfält 3 och 6 = negativa kontroller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: BLAST resultat av N113F/N304R produkt av TWBLV infekterade bat.
BLAST resultat visade att fallet var mest likt lyssavirus, men identiteten med lyssavirus i databasen var endast 79%. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: jämförelse av lyssavirus antigen distribution av virusisolering av TWBLV med två FITC-konjugerade antirabieskonjugat.
Den 10% bat Brain emulsion (twblv infekterade) inokulerades i mus neuroblastom celler för virusisolering. Fetterna utfördes vid den tionde passagen och färgas med två FITC-konjugerade anti-rabies antikroppar. Antigen distribution av mus neuroblastom celler med två rabieskonjugat visade signifikanta skillnader. (A) FETTET med reagens A (5x utspädning). B) FETTET med reagens B (5x utspädning). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta laboratorium standard arbetsförfarande (SOP) ger en seriell process för att testa bat prover för förekomst av lyssavirus antigener i Taiwan. De viktigaste stegen är anställning av FAT och RT-PCR. Urvalet av lämpliga prover och en lyckad isolering av viruset är också viktigt. Dessutom genomfördes en del felsökning under övervakning av BAT lyssaviruses. Den största skillnaden var måldjuren. Inledningsvis (2008 – 2009) var måldjur av BAT lyssavirus övervakning Live fladdermöss, som fångades i Kinmen Island i Taiwan sedan testas för lyssavirus efter dödshjälp. De flesta av de fångade fladdermöss var friska och osannolikt att bära lyssavirus, och denna strategi för övervakning var inte humant. Under det tredje året samlades därför endast döda eller döende fladdermöss in och utvidga övervakningsområdet från regionalt till nationellt. Efter åtta år av kontinuerlig övervakning upptäcktes det första bat lyssavirus-fallet i Taiwan.
Även om fett är den mest använda metoden för rabies diagnos och rekommenderas av OIE och WHO18, få studier har visat inkonsekvent resultat när olika konjugat användes i fettet5,27. Liknande inkonsekventa resultat dök också upp i TWBLV-infekterade fall. I de TWBLV-infekterade MNA-cellerna visade resultaten av FETTET signifikanta skillnader i 2 konjugat (figur 5). En av de FITC-konjugerade anti-rabies antikroppar reagerade inte bra, även vid högre koncentrationer. På grund av variationen av lyssavirus antigen i proverna och variationen av antikroppens aviditet och affinitet hos antikroppar i konjugatet rekommenderas att två olika konjugat används i fett för att förhindra falskt negativa resultat i lyssavirus diagnos23,28,29.
RT-PCR kan ge bekräftande diagnos för inkonsekventa resultat av fett. På grund av lyssavirus höga genetiska mångfald rekommenderas att mer än en primer-uppsättning i RT-PCR används för att öka noggrannheten hos lyssavirus screening29,30. En primer-uppsättning som utformats av mycket bevarade nukleoproteingener är den vanligast förekommande uppsättningen i lyssavirus Detection29. RT-PCR kan också användas för diagnos i förruttnelsebakteriernas prover när fett inte kan utföras31,32. För att undvika falsk negativitet som förhindrar upptäckten av en roman lyssavirus, rekommenderas fler verktyg för detektering. Två nya lyssaviruses4, Taiwan bat lyssavirus, identifierades under denna undersökning som sysselsätter SOP.
Dessutom hittades en mycket varierad TWBLV-stam och en roman nya arter av lyssavirus i fladdermöss i Taiwan 2018 (opublicerade data). Resultaten bevisade att anställning av både FETTET och RT-PCR för att upptäcka lyssaviruses i fladdermöss är användbart. Vissa begränsningar av den RT-PCR primer som används i denna SOP bör noteras. I primer uppsättning N113F/N304R, N113F var ursprungligen avsedd för rabiesvirus förstärkning, men det kanske inte fungerar bra för andra lyssaviruses. Flera primers för lyssavirus detektion har publicerats av andra forskare29,30 och kan väljas efter laboratorie behov.
Denna artikel är en steg-för-steg-introduktion till bat lyssavirus Surveillance i Taiwan. Förhoppningen är att denna SOP kommer att vara till hjälp för forskare som är intresserade av BAT lyssavirus övervakning. När fler forskare utför enkäter av fladdermöss kommer fler lyssaviruses att identifieras i framtiden. Denna SOP övervakar inte bara lyssaviruses utan även andra zoonoser agenter i fladdermöss. Sådana fynd kan informera allmänheten, hälso-och sjukvårdspersonal och forskare om de potentiella riskerna för kontakt med fladdermöss och andra vilda djur. Det kommer också att bidra till att öka förståelsen för lyssavirus utveckling och ursprung och leda till betydande framsteg inom vetenskaplig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Tien-Cheng Li, Yi-Tang lin, Chia-Jung Tsai, och ya-LAN Li för deras hjälp under denna studie. Denna studie stöddes av Grant No. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) från presidiet för djur-och växtskydds inspektion och karantän, jordbruksrådet, Executive Yuan, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
- Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al.
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al.
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al.
- Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al.
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
- World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O.
- Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
