Summary
Dit protocol introduceert een standaard laboratoriumprocedure voor diagnostische tests van Lyssavirus antigenen in vleermuizen in Taiwan.
Abstract
Virussen binnen het geslacht Lyssavirus zijn zoönotische pathogenen, en ten minste zeven Lyssavirus soorten worden geassocieerd met menselijke gevallen. Omdat vleermuizen natuurlijke reservoirs zijn van de meeste lyssavirussen, is een Lyssavirus surveillanceprogramma van vleermuizen uitgevoerd in Taiwan sinds 2008 om de ecologie van deze virussen in vleermuizen te begrijpen. In dit programma, niet-gouvernementele bat Conservation organisaties en lokale dierenziekte controlecentra samengewerkt om dode vleermuizen of vleermuizen sterven van zwakte of ziekte te verzamelen. Hersenweefsels van vleermuizen werden verkregen via obductie en onderworpen aan directe fluorescerende antilichaam test (vet) en omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) voor detectie van Lyssavirus-antigenen en nucleïnezuren. Voor het vet worden ten minste twee verschillende rabiës diagnose conjugaten aanbevolen. Voor de RT-PCR worden twee verzamelingen van primers (JW12/N165-146, N113F/N304R) gebruikt om een partiële sequentie van het Lyssavirus nucleoproteïne-gen te versterken. Dit surveillanceprogramma bewaakt lyssavirussen en andere zoönoseverwekkers in vleermuizen. Taiwan bat Lyssavirus is te vinden in twee gevallen van de Japanse dwergvleermuis (Pipistrellus abramus) in 2016 – 2017. Deze bevindingen moeten het publiek, gezondheidswerkers en wetenschappers informeren over de potentiële Risico's van contact met vleermuizen en andere dieren in het wild.
Introduction
Virussen binnen het geslacht Lyssavirus zijn zoönotische pathogenen. Er zijn ten minste zeven Lyssavirus soorten in verband met menselijke gevallen1. In aanvulling op de 16 soorten in dit geslacht1,2,3, Taiwan bat Lyssavirus (twblv)4 en kotalahti bat Lyssavirus5 zijn onlangs geïdentificeerd in vleermuizen, maar hun taxonomische statussen nog te worden bepaald.
Vleermuizen zijn de natuurlijke hosts van de meeste lyssavirussen, met uitzondering van mokola Lyssavirus en Ikoma Lyssavirus, die nog niet zijn geïdentificeerd in een vleermuizen1,2,3,6. De informatie over lyssavirussen in Aziatische vleermuizen is nog steeds beperkt. Twee niet-gekenmerkte lyssavirussen in Aziatische vleermuizen (een in India en de andere in Thailand)7,8 zijn gemeld. Een menselijke rabiës geval geassocieerd met een vleermuis beet in China werd gemeld in 2002, maar de diagnose werd alleen gemaakt door klinische observatie9. In Centraal-Azië, Aravan Lyssavirus werd geïdentificeerd in de kleine muizen-eared bat (Myotis blythi) in kirgizië in 1991, en Khujand Lyssavirus werd geïdentificeerd in de klop knuppel (Myotis mystacinus) in Tadzjikistan in 200110. In Zuid-Azië werd Gannoruwa bat Lyssavirus geïdentificeerd in de Indische Flying Fox (Pteropus Medius) in Sri Lanka in 20153. In Zuidoost-Azië vertoonden verschillende serologische studies over vleermuizen in de Filipijnen, Thailand, Bangladesh, Cambodja en Vietnam een variabele seroprevalentie van11,12,13,14, 15. Hoewel Irkolyssavirus werd geïdentificeerd in de grote buis-nosed bat (Murina leucogaster) in de provincie Jilin, China in 201216, blijven de exacte soorten en locaties van lyssavirussen in Oost-Aziatische vleermuis populaties onbekend.
Om de aanwezigheid van Lyssavirus in de Taiwanese vleermuis populaties te beoordelen, werd een surveillanceprogramma met zowel direct FAT als RT-PCR geïnitieerd. Taiwan bat Lyssavirus werd geïdentificeerd in twee gevallen van de Japanse dwergvleermuis (Pipistrellus abramus)4 in 2016 – 2017. In dit artikel wordt een standaardwerk procedure voor laboratoria geïntroduceerd voor het toezicht op de BBT-populatie in Taiwan door Lyssavirus. Het stroomschema van de bat Lyssavirus diagnose in ons laboratorium is weergegeven in Figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. veiligheidsmaatregelen bij het hanteren van lyssavirussen
- Zorg ervoor dat alle laboratoriummedewerkers die de BBT-specimens hanteren, pre-exposure-rabiës profylaxe krijgen17. Bewaak de niveaus van antilichamen tegen rabiës van de werknemers vooraf en bekijk ze elke 6 maanden17opnieuw. Follow-up rabiësvaccinatie is vereist voor degenen wier antilichaam niveaus lager zijn dan 0,5 IE/mL17.
- Afhankelijk van de bioveiligheidsvoorschriften van het land waar het laboratorium zich bevindt, moet u ervoor zorgen dat de volgende procedures worden uitgevoerd in geschikte laboratoria voor bioveiligheidsniveau (bv. BSL-2 laboratoria in Taiwan en BSL-3 laboratoria in Australië), en dat werknemers zijn momenteel gekwalificeerd en dragen passende persoonlijke beschermingsmiddelen18.
Opmerking: rabiësvaccinatie biedt weinig tot geen bescherming tegen lyssavirussen die behoren tot phylogroepen II en III18. De werknemers moeten ervan op de hoogte worden gesteld dat er in vleermuizen19 verschillende zoönoseverwekkers zijn geïdentificeerd en dat monsters moeten worden verwerkt onder geschikte laboratoriumomstandigheden op bioveiligheidsniveau met adequate persoonlijke beschermingsmiddelen.
2. monsterverzameling
- Gebruik gevonden zwakke of zieke vleermuizen of karkassen.
Opmerking: zwakke of zieke vleermuizen worden geleverd aan de bat Conservation Society van Taipei voor veterinaire zorg of onderzoek, terwijl karkassen rechtstreeks aan het onderzoeksinstituut voor diergezondheid worden voorgelegd. In dit surveillanceprogramma zijn geen gezonde vleermuizen geëerd. - Laat een vleermuis ecoloog vleermuissoorten identificeren door middel van morfologische kenmerken20.
- Voer DNA barcoding van de vleermuissoorten wanneer Lyssavirus positief wordt gediagnosticeerd, met behulp van eerder gepubliceerde procedures21.
- Dien een inlichtingenblad in van elk BBT-karkas (verzamelplaats, soorten, klinische verschijnselen, enz.).
3. obductie van vleermuis specimens
- Materialen voorbereiden.
- Maak een schoon dissectie bord en plaats een steriel absorberend pad voor obductie.
- Bereid Verzamel buisjes voor het verzamelen van vleermuis organen.
- Bereid Wegwerp pincet en scalpels voor obductie. Verander tools tussen de obductie van elke vleermuis. Bereid katoen ballen bevochtigd met 70% ethanol voor het reinigen van pincet en scalpels tijdens het bemonsteren.
- Maak twee Microscoop-dia's voor het vet. Verzamel verse specimens en fixeer ze in formaline oplossing voor histopathologisch onderzoek.
- Onderzoek alle uitwendige openingen voor obductie. Fotografeer de externe kenmerken van de vleermuis, met name het hoofd, de oren en de vleugels, voor soorten differentiatie.
- Verzamel een oraal wattenstaafje monster. Plaats de vleermuis in ventrale ligigheid op het bord en bevestig de knuppel met een pincet. Snijd de huid langs de middenlijn van de snuituil met een scalpel en trek de huid aan de zijkanten. Snijd de schedel langs de middenlijn van de snuituil met een scalpel en open hem met een pincet om het hersenweefsel bloot te leggen.
- Verwijder het hersenweefsel van de schedel en plaats het op een steriele tong depressor, en maak indruk uitstrijkjes van het hersenweefsel (zie stap 4,2). Verzamel een klein stukje vers hersenweefsel en repareer het in formaline voor histopathologisch onderzoek. Het overgebleven hersenweefsel in een buis voor nucleïnezuur extractie bevatten.
- Reinig pincet en scalpel met katoenen ballen bevochtigd met 70% ethanol om achtergebleven weefsels te verwijderen tussen de specimen collectie.
- Plaats de vleermuis op het bord in dorsale ligpositie en bevestig deze op het bord met naalden aan beide zijden van de oksel en Tail hiel.
- Verdoe de huid langs de middellijn van het lichaam van onderkaak naar anus. Til de huid en de onderliggende spierweefsels op en scheid ze met een pincet. Verzamel de speekselklieren, die in de buurt van de mandibulaire bot.
- Til het borstbeen lichtjes op met een pincet en snijd het borstbeen en de buikwand langs de middenlijn met een scalpel. Snijd de sleutelbeenderen met een scalpel. Bevestig de linker-en rechter rib-kooien aan het bord met naalden om de thoracische holte te openen.
- Noteer de bruto laesies en de mate van postmortemwisseling.
- Verwijder de viscerale weefsels (d.w.z. hart, longen, lever, nieren, darmen) van het karkas met behulp van een pincet en een scalpel. Verzamel de viscerale specimens als dat nodig is voor toekomstig onderzoek.
Opmerking: verzameling van dubbele voorbeelden wordt aanbevolen. Men moet worden verzameld voor moleculaire diagnostiek, en de andere moet worden bevroren bij-80 ° c met of zonder virale transportmedium voor virale cultuur22.
4. direct fluorescerende antilichaam test (vet)
- Maak indruk uitstrijkjes van het hersenweefsel voor het vet. Voer het vet uit zoals eerder beschreven18,23 met de volgende wijzigingen.
- Scheid het hersenweefsel voorzichtig van het verbonden zenuwweefsel met een pincet en breng het hersenweefsel over naar een steriele tong depressor. Snijd de dwarsdoorsnede van de hersenen, met inbegrip van de hersenstam en cerebellum18,23. Maak indruk uitstrijkjes van het hersenweefsel door het snijoppervlak van het hersenweefsel lichtjes aan te raken en druk op de schuif op het lens weefsel om overtollig weefsel te verwijderen.
- Bevestig de dia's met aceton bij-20 °C gedurende 30 min. droog de geteste dia's en de positieve en negatieve controles vóór het vlekken met conjugaat.
- Het gebruik van elk van de twee in de handel verkrijgbare FITC-geconjugeerde anti-rabiës antilichamen voor kleuring Lyssavirus antigen wordt ten zeerste aanbevolen23. Bepaal de werkconcentratie van het handels conjugaat vóór de eerste kleuring. Laat de verdunde conjugaten door een spuit filter van 0,45 μM op de glijbanen vallen en inbroed de glaasjes bij 37 °C gedurende 30 minuten in een natte kamer.
- Giet de overtollige conjugaat uit de glijbanen en was na incubatie de glaasjes met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Laat een kleine hoeveelheid van 10% glycerol vallen op de dia's en dek af met afdekplaatjes.
- Bekijk de dia's met een fluorescerende Microscoop.
5. nucleïnezuur extractie
- Voeg het juiste volume MEM-10 toe (minimaal essentieel medium aangevuld met 10% foetaal runderserum) aan het hersenweefsel (10% w/v).
- Homogenaat het hersenweefsel met een 5 mm stalen kraal in een homogenisatieinstrument en centrifugeer bij 825 x g gedurende 10 minuten.
- Extract het nucleïnezuur, waarvan het eindvolume 50 μL is, binnen 200 μL van het supernatant met behulp van de in de handel verkrijgbare totale nucleïnezuur extractie Kit met instrument.
6. RT-PCR en fylogenetische analyse
Opmerking: verschillende primer sets zijn gepubliceerd om alle bekende lyssavirussen of specifieke lyssavirussen te detecteren. Het hier beschreven protocol is een voorbeeld dat ons laboratorium gebruikt en mogelijk niet voldoet aan alle experimentele behoeften. Selecteer geschikte primers volgens de behoeften van het laboratorium.
- Bereid het One-Step RT-PCR-reagens als volgt: Voeg 5 μL geëxtraheerd nucleïnezuur toe aan het reactiemengsel met 2,5 μL van een 10x-reactiebuffer, 0,5 μL voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM van elk), 4 μL 1,25 mM dNTP, 0,3 μL RNase-remmer (40 U/μL) , 0,3 μL van reverse transcriptase (10 e/μL), 0,4 μL van DNA-polymerase (5 U/μL) en 11,5 μL DEPC-behandeld water.
Opmerking: de in dit Protocol gebruikte primer is JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') en N165-146 (5 '-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3 ')24. Wijzig de bereiding van reagentia en fiets condities volgens de gebruikte primer sets. - Voer de fiets uit onder de volgende omstandigheden: incubatie bij 42 °C gedurende 40 min; initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 10 min; 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 sec. en 72 °C gedurende 30 sec.; en tot slot, verdere uitbreiding bij 72 °C gedurende 10 minuten.
- Gebruik een andere of meer primer sets om de diagnostische gevoeligheid te verhogen.
- Gebruik N113F (5 '-gtaggatgctatatggg-3 ') en N304R (5 '-ttgacgaagatcttgctcat-3 ')25,26 om het One-Step RT-PCR-reagens als volgt voor te bereiden: Voeg 5 μl geëxtraheerd nucleïnezuur toe aan een reactiemengsel met 5 μl 10x-buffer, 5 μl voor-en achteruit primers (4 μM van elk), 5 μL van 1,25 mM dNTP, 0,5 μL RNase-remmer (40 e/μL), 0,2 μL reverse-transcriptase (10 e/μL), 1 μL van DNA-polymerase (5 U/μL) en 23,3 μL DEPC-behandeld water.
- Voer de fiets uit onder de volgende omstandigheden: incubatie bij 42 °C gedurende 40 min; initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten; 35 cycli van 95 °C gedurende 1 min, 55 °C gedurende 1 minuut en 20 sec. en 72 °C gedurende 1 minuut; en tot slot, verdere uitbreiding bij 72 °C gedurende 10 minuten.
Opmerking: afhankelijk van de laboratorium behoeften, kiest u geschikte primers voor diagnose. N113F is oorspronkelijk ontworpen voor rabiësvirus versterking, maar het werkt mogelijk niet goed voor andere lyssavirussen. De set van N113F en N304R werkt goed voor rabiësvirus (Taiwan Ferret Badger variant) en Taiwan bat Lyssavirus. Het zal gemakkelijker zijn om hele nucleoproteïne sequenties te verkrijgen door gebruik te maken van de set JW12 en N304R primers als het Lyssavirus wordt versterkt door beide bovenstaande primer sets.
- Analyseer het PCR-product op 2% agarose-gel elektroforese en visualiseer door UV-licht verlichting.
- Volgorde van het PCR-product door commerciële sequencing-service.
- Voer de sequentie in of upload deze naar de webpagina van de nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Selecteer de database "anderen (nr etc.)" en voer het organisme in als Lyssavirus. Selecteer het MegaBlast algoritme en voer de BLAST uit.
7. virus isolatie
Opmerking: Voer virusisolatie uit wanneer 1) het vet of 2) de RT-PCR duidt positiviteit aan.
- Homogeniseren het hersen preparaat in een 10% (w/v) suspensie in MEM-10. Centrifugeer bij 825 x g gedurende 10 min.
- Inoculeren 200 μL supernatant met een suspensie van 3 x 106 MNA (muis neuroblastoma) cellen in 1 ml mem-10 voor 1 uur bij 37 °c met 1% co2. Breng de hersenen homogenaat-celsuspensie over in een kolf van 25 cm2 en voeg 6 ml mem-10 toe.
- Cultiveer 1 mL van de hersenen homogenaat-celsuspensie in een 4 goed Teflon gecoate glazen glijbaan met 6 mm diameter op hetzelfde moment.
- Na 3 – 4 dagen incubatie bij 37 °C met 1% CO2, Fixeer de cellen op de 4 well slide met 100% aceton (v/v).
- Beits de glaasjes met twee FITC-geconjugeerde anti-rabiës antilichamen na stappen 4.4 – 4.7. De cellen zijn geïnfecteerd wanneer de intracytoplasmische insluitsels worden onderzocht. Noteer het percentage geïnfecteerde cellen.
- Voer trypsinoisatie en subcultuur van de geënt celcultuur uit wanneer de dia's als negatief worden gekleurd:
- Verwijder het medium en spoel de kolf af met 5 mL PBS.
- Voeg 1 mL trypsine toe aan de kolf en sla de bodem van de kolf stevig vast.
- Voeg 6 mL MEM-10 toe en hervat de cellen.
- Zet de celsuspensie in een nieuwe weefsel kolf (6 mL) en op een 4 well Slide (1 mL).
- Herhaal stap 7.4 – 7.6 tot 100% infectiviteit is bereikt.
- Verzamel de supernatant na 24 h van incubatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van 2014 tot mei 2017 werden 332 BBT-karkassen uit 13 soorten verzameld voor surveillance. Twee geteste positieve. In de eerste bat geval, de hersen impressie getest negatief met behulp van het vet met een van de commerciële FITC-geconjugeerde anti-rabiës antilichamen (Figuur 2), terwijl de RT-PCRs met gebruikmaking van elk van de twee primer sets (JW12/N165-146, N113F/N304R) leverde positieve resultaten (Figuur 3). Een 428 BP-sequentie van ampliconlengte voor temp (versterkt met N113F/N304R en met het partiële nucleoproteïne-gen) werd verkregen. De volgorde werd onderworpen aan BLAST opvragen door de GenBank database. Het resultaat toonde aan dat de sequentie vergelijkbaar was met lyssavirussen met een identiteit van minder dan 79% (Figuur 4), ter ondersteuning van de identiteit van de gedetecteerde lyssavirussen.
Later werden twee lyssavirussen met succes geïsoleerd uit deze twee hersenen, en de virussen werden bevestigd door FAT (Figuur 5) en sequencing. De geïdentificeerde Lyssavirus werd aangeduid als Taiwan bat Lyssavirus (TWBLV) op basis van de sequentieanalyse4. In het tweede geval waren de resultaten van de vetten die de twee commerciële FITC-geconjugeerde anti rabiës antilichamen in dienst hadden, inconsistent, zoals beschreven voor het eerste geval.
Figuur 1: bat Lyssavirus diagnose stroomschema.
Stroomdiagram met de huidige proces-en diagnosemethoden die ons laboratorium nu gebruikt. Virus isolatie moet worden uitgevoerd wanneer de directe fluorescentie antilichaam test of de omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie positief is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: direct vet met twee commerciële FITC-geconjugeerde anti-rabiës antilichamen van hele hersen compressie van een TWBLV-geïnfecteerde vleermuis die inconsistente resultaten oplevert.
Case nummer: 2016-2300: (A) het vet met reagens A (5x verdunning), waarmee appel groene positieve signalen worden aangetoond. B) het vet met reagens B, dat een negatief resultaat vertoont (verdunning 20x). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: producten van RT-PCRs met twee primer sets.
De primer set gebruikt in de Lanes 1 tot 3 was JW12/N165-146, en de verwachte product grootte was 111 baseparen. De primer set gebruikt in rijstroken 4 tot 6 was N113F/N304R, en de verwachte product grootte was 521 baseparen. Beide tests van het monster (wegen 1 en 4) waren positief. M = 100 BP DNA-ladder; rijbanen 1 en 4 = getest monster; rijbanen 2 en 5 = positieve controles; Lanes 3 en 6 = negatieve controles. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: BLAST resultaat van N113F/N304R product van TWBLV geïnfecteerde bat.
BLAST resultaten toonde aan dat de zaak was het meest vergelijkbaar met de Lyssavirus, maar de identiteit met de Lyssavirus in de database was slechts 79%. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: vergelijking van Lyssavirus antigeen distributie van virusisolatie van TWBLV met twee met FITC geconjugeerde anti rabiës conjugaten.
De 10% bat-hersen emulsie (twblv Infected) werd geënt in muis neuroblastoom cellen voor virusisolatie. De vetten werden uitgevoerd op de tiende passage en gekleurd met twee FITC-geconjugeerde anti-rabiës antilichamen. Antigeen distributie van muis neuroblastoom cellen met twee rabiës conjugaten toonde significante verschillen. A) het vet met reagens A (5x verdunning). B) het vet met reagens B (5x verdunning). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze laboratoriumstandaard operating procedure (SOP) biedt een serieel proces voor het testen van BBT-monsters voor de aanwezigheid van Lyssavirus-antigenen in Taiwan. De belangrijkste stappen zijn de tewerkstelling van vet en RT-PCR. Ook de selectie van geschikte monsters en een geslaagde isolatie van het virus zijn belangrijk. Bovendien, sommige problemen is uitgevoerd tijdens de controle van bat lyssavirussen. Het grote verschil was de doeldieren. Aanvankelijk (2008 – 2009), de doeldieren van bat Lyssavirus toezicht waren levende vleermuizen, die werden gevangen in Kinmen eiland in Taiwan vervolgens getest voor Lyssavirus na euthanasie. De meeste gevangen vleermuizen waren gezond en onwaarschijnlijk om Lyssavirus te dragen, en deze benadering van controle was niet humaan. Daarom werden in het derde jaar alleen dode of stervende vleermuizen verzameld en werd het toezichtsgebied van regionaal naar nationaal uitgebreid. Na acht jaar van continue monitoring, de eerste bat Lyssavirus geval werd uiteindelijk ontdekt in Taiwan.
Hoewel vet de meest gebruikte methode is voor de diagnose van rabiës en aanbevolen door OIE en WHO18, hebben weinig studies inconsistente resultaten aangetoond wanneer verschillende conjugaten werden gebruikt in het vet5,27. Soortgelijke inconsistente resultaten verscheen ook in TWBLV-geïnfecteerde gevallen. In de met TWBLV geïnfecteerde MNA-cellen vertoonden de resultaten van vet significante verschillen in 2 conjugaten (Figuur 5). Een van de FITC-geconjugeerde anti-rabiës antilichamen reageerden niet goed, zelfs niet bij hogere concentraties. Vanwege de variatie van Lyssavirus antigeen in de monsters en de variatie van het antilichaam avidity en affiniteit van antilichamen in de conjugaten, wordt aanbevolen dat twee verschillende conjugaten worden gebruikt in vet om vals negatieve resultaten in Lyssavirus te voorkomen diagnose23,28,29.
RT-PCR kan een bevestigende diagnose geven voor inconsistente resultaten van vet. Vanwege de hoge genetische diversiteit van Lyssavirus wordt het aanbevolen om meer dan één primer in RT-PCR te gebruiken om de nauwkeurigheid van Lyssavirus screening29,30te verhogen. Een primer set ontworpen uit sterk gecondengeerde nucleoproteïne genen is de meest gebruikte set in Lyssavirus detectie29. RT-PCR kan ook worden gebruikt voor diagnose in darm samples wanneer vet niet kan worden uitgevoerd31,32. Om te voorkomen dat valse negativiteit voorkomt dat de ontdekking van een roman Lyssavirus, meer hulpmiddelen worden aanbevolen voor detectie. Twee roman lyssavirussen4, Taiwan bat Lyssavirus, werden geïdentificeerd tijdens deze enquête met de SOP.
Daarnaast werd een zeer diverse TWBLV-stam en een nieuwe soort Lyssavirus gevonden in vleermuizen in Taiwan in 2018 (niet-gepubliceerde gegevens). De bevindingen bewees dat de tewerkstelling van zowel het vet als de RT-PCR om lyssavirussen in vleermuizen te detecteren nuttig is. Enkele beperkingen van de RT-PCR primer set die in deze SOP worden gebruikt, dienen te worden genoteerd. In de primer set van N113F/N304R, werd N113F oorspronkelijk ontworpen voor rabiësvirus versterking, maar het werkt mogelijk niet goed voor andere lyssavirussen. Verschillende primers voor Lyssavirus detectie zijn gepubliceerd door andere onderzoekers29,30 en kan worden gekozen volgens laboratorium behoeften.
Dit artikel is een stap-voor-stap Inleiding tot bat Lyssavirus surveillance in Taiwan. Het is te hopen dat deze SOP nuttig zal zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in bat Lyssavirus surveillance zijn. Naarmate meer onderzoekers enquêtes van vleermuizen uitvoeren, zullen er in de toekomst meer lyssavirussen worden geïdentificeerd. Deze SOP bewaakt niet alleen lyssavirussen, maar ook andere zoönoses agenten in vleermuizen. Dergelijke bevindingen kunnen het publiek, gezondheidswerkers en wetenschappers informeren over de mogelijke Risico's van contact met vleermuizen en andere dieren in het wild. Het zal ook helpen bij het vergroten van het begrip van de evolutie en de oorsprong van het Lyssavirus en leiden tot aanzienlijke vooruitgang in wetenschappelijk onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er worden geen belangenconflicten gedeclareerd.
Acknowledgments
We danken tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai en ya-LAN Li voor hun hulp tijdens deze studie. Deze studie werd gesteund door Grant No. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) van het Bureau voor dier-en Plantenziekte inspectie en quarantaine, Raad van landbouw, uitvoerende yuan, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
- Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al.
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al.
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al.
- Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al.
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
- World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O.
- Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
