Summary
该协议引入了标准实验室操作程序，用于在台湾蝙蝠中诊断病毒抗原。
Abstract
莱萨病毒属内的病毒是人畜共患的病原体，至少有七种莱沙病毒与人类病例有关。由于蝙蝠是大多数利沙病毒的天然宿主，自2008年以来，台湾一直在对蝙蝠进行感染病毒监测，以了解这些病毒在蝙蝠中的生态。在这个计划中，非政府的蝙蝠保护组织和当地动物疾病控制中心合作收集死于虚弱或疾病的蝙蝠。蝙蝠的脑组织通过尸检获得，并直接进行荧光抗体测试（FAT）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），以检测利沙病毒抗原和核酸。对于 FAT，建议至少两种不同的狂犬病诊断联结。对于RT-PCR，使用两组引源（JW12/N165-146，N113F/N304R）来扩增裂源病毒核蛋白基因的部分序列。这个监测程序监测蝙蝠中的莱沙病毒和其他人畜人病。2016-2017年，台湾蝙蝠赖萨病毒在两例日本皮司特鲁斯（Pipistrellus abramus）病例中被发现。这些发现应该让公众、卫生专业人员和科学家了解接触蝙蝠和其他野生动物的潜在风险。
Introduction
莱萨病毒属内的病毒是人畜的病原体。至少有7种与人类病例1有关的莱沙病毒。除了该属的1、2、3、台湾蝙蝠利沙病毒（TWBLV）4和科塔拉赫蒂蝙蝠利沙病毒5最近已在蝙蝠身上鉴定的16个物种外，其分类状况尚未确定。
蝙蝠是大多数溶血病毒的天然宿主，除了莫科拉利萨病毒和伊科马利萨病毒，这些尚未在任何蝙蝠1，2，3，6中被识别。亚洲蝙蝠中有关感染病毒的信息仍然有限。据报道，亚洲蝙蝠（一种在印度，另一种在泰国）有2种未定性的莱萨病毒。2002年，中国报告发生了一起与蝙蝠咬伤有关的人类狂犬病病例，但诊断结果仅通过临床观察9。在中亚，1991年在吉尔吉斯斯坦较小的鼠耳蝙蝠（Myotisblythi）中发现了阿拉万利萨病毒，2001年在塔吉克斯坦的胡须蝙蝠（Myotismystacinus）中发现了胡扬德利萨病毒。在南亚，甘诺鲁瓦蝙蝠利萨病毒在2015年3月在斯里兰卡的印度飞狐（Pteropusmedius）中被鉴定。在东南亚，对菲律宾、泰国、孟加拉国、柬埔寨和越南蝙蝠的几项血清学研究表明，11、12、13、14、 15.虽然2012年中国吉林省大管鼻蝙蝠（Murinaleucogaster）中发现了伊尔库特流沙病毒，但东亚蝙蝠种群中流沙病毒的确切种类和位置仍不得而知。
为了评估台湾蝙蝠种群中是否存在感染病毒，启动了一项同时采用直接FAT和RT-PCR的监测计划。2016-2017年，在两例日本皮皮斯特勒（Pipistrellus abramus）4例中发现了台湾蝙蝠赖萨病毒。本文介绍了台湾蝙蝠种群的感染病毒监测实验室标准操作程序。图1显示了我们实验室中蝙蝠流沙病毒诊断的流程图。
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Protocol
1. 处理莱沙病毒时的安全注意事项
- 确保所有处理蝙蝠标本的实验室工作人员接受接触前狂犬病预防17。事先监测工人的狂犬病抗体水平，每6个月重新检查一次。抗体水平低于0.5 IU/mL17的，需进行后续狂犬病疫苗接种。
- 根据实验室所在国家/地区的生物安全法规，确保在适当的生物安全级别实验室（例如台湾的 BSL-2 实验室和澳大利亚 BSL-3 实验室）执行以下程序，并确保工人目前合格，并穿着适当的个人防护设备18。
注：狂犬病疫苗接种对属于植物群II和III18的利沙病毒几乎没有保护。工人必须被告知，在蝙蝠19中已发现几种人畜共生病原体，并应在适当的生物安全水平实验室条件下使用适当的个人防护设备处理样品。
2. 样本收集
- 使用发现虚弱或生病的蝙蝠或尸体。
注：弱蝙蝠或病蝙蝠被送至台北蝙蝠保护协会进行兽医护理或研究，而尸体则直接提交动物健康研究所。在这个监视计划中，没有健康的蝙蝠被安乐死。 - 有蝙蝠生态学家通过形态特征20识别蝙蝠物种。
- 使用先前公布的程序21，在诊断利沙病毒阳性时对蝙蝠物种进行DNA条形码。
- 提交每个蝙蝠尸体的信息表（收集地点、物种、临床体征等）。
3. 蝙蝠标本的尸检
- 准备材料。
- 准备一个干净的解剖板，并放置一个无菌吸收垫进行尸检。
- 准备收集管收集蝙蝠器官。
- 准备一次性钳子和手术刀进行尸检。在每只蝙蝠的尸检之间更换工具。在取样过程中，用70%乙醇制备棉球，用于清洁钳子和手术刀。
- 为 FAT 准备两张显微镜幻灯片。收集新鲜标本，并将其固定在形式溶液中，用于组织病理学检查。
- 在尸体解剖前检查所有外部孔。拍摄蝙蝠的外部特征，尤其是头部、耳朵和翅膀，以便进行物种分化。
- 收集口服拭子样本。将蝙蝠放在棋盘上的腹腔，用钳子固定蝙蝠的头部。用手术刀沿着卡瓦里中间线切割皮肤，并将皮肤拉到侧边。用手术刀沿着卡瓦里河的中线切开头骨，用钳子打开它，露出脑组织。
- 从头骨中取出脑组织，将其放在无菌的舌头压压器上，并从脑组织中留下涂片（参见步骤 4.2）。收集一小块新鲜的脑组织，并固定在正式组织病理学检查。将剩余的脑组织包含在用于核酸提取的管中。
- 用70%乙醇润湿棉球清洁钳子和手术刀，去除标本收集之间的保留组织。
- 将球棒放在棋盘上，在背交道中固定，并在斧头和尾跟两侧用针将其固定在板上。
- 沿着身体中线将皮肤从下颌到主或下颌。提起并分离皮肤和底层肌肉组织。收集唾液腺，这是附近的骨骼。
- 用钳子稍微抬起胸骨，用手术刀沿着中线切开胸骨和腹壁。用手术刀切下锁骨。用针将左右肋骨保持架固定到板上，以打开胸腔。
- 记录严重病变和死后变化的程度。
- 使用钳子和手术刀从尸体中取出内脏组织（即心脏、肺、肝脏、肾脏、肠道）。根据需要收集内脏标本，以用于未来研究。
注：建议收集重复的示例。一个应收集分子诊断，另一个应冻结在-80°C与或不病毒传播介质病毒培养22。
4. 直接荧光抗体测试（FAT）
- 为 FAT 留下脑组织的印象涂片。执行 FAT 如前面描述的18，23与以下修改.
- 用钳子轻轻地将脑组织从连接的神经组织中分离出来，并将脑组织转移到无菌的舌头抑制器中。切割大脑的横截面，包括脑干和小脑18，23。轻轻触摸脑组织的切割表面，使脑组织的印记涂抹，然后按透镜组织上的幻灯片以去除多余的组织。
- 将丙酮在-20°C处固定30分钟。
- 使用两种市售的FITC结合抗狂犬病抗体，用于染色流沙病毒抗原，强烈建议23。在第一次染色之前确定商业偶联体的工作浓度。将稀释的偶联物通过 0.45 μM 注射器过滤器滴到滑片上，并在 37°C 下在湿室中孵育幻灯片 30 分钟。
- 从幻灯片中排空多余的偶联体，并在孵育后用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗幻灯片。
- 在幻灯片上放置少量 10% 甘油，并盖上盖玻片。
- 用荧光显微镜检查幻灯片。
5. 核酸提取
- 将适当的MEM-10（最低必需介质辅以10%胎儿牛血清）加入脑组织（10%无v）。
- 在均质器中用5毫米钢珠对质化脑组织，在825 x g下离心10分钟。
- 提取核酸，其最终体积为50μL，在200μL的上清液使用市售总核酸提取套件与仪器。
6. RT-PCR和植物遗传学分析
注： 已发布多个引录集，以检测所有已知的莱沙病毒或特定的莱沙病毒。此处描述的协议是我们实验室使用并可能不符合所有实验需求的示例。根据实验室需求选择合适的引漆。
- 准备一步式RT-PCR试剂如下：在反应混合物中加入5μL的提取核酸，含有2.5μL的10x反应缓冲液，0.5μL的正向和反向引物（每片10μM），4μL的1.25mM dNTP，0.3 μL的RNase抑制剂（40U/μL），0.3 μL 逆转录酶 （10 U/μL），0.4 μL DNA 聚合酶 （5 U/μL）， 和 11.5 μL 的 DEPC 处理水。
注：本协议中使用的引物集为 JW12 （5' -ATAACACCTAATAG-3'） 和 N165-146 （5'-GCAGGGTTATATATATATAtA-3'）24。根据使用的引漆集修改试剂的制备和循环条件。 - 在以下条件下进行循环：在42°C孵育40分钟;在94°C处初次变性10分钟;35个周期，94°C，30s，55°C30s，72°C30s;最后，在72°C下进一步延长10分钟。
- 使用另一个或多个引注集来增加诊断灵敏度。
- 使用 N113F （5'-GTAGATATATATGGG-3）和 N304R （5'-TTGAAGATATATTTTCTAT-3'）25、26制备一步式 RT-PCR 试剂，如下所示：在含有 5 μL 10x 缓冲液、5 μL 的的反应混合物中加入 5 μL 的提取核酸正向和反向引物（各4μM），5μL1.25 mM dNTP，0.5 μL的RNase抑制剂（40U/μL），0.2 μL的逆转录酶（10U/μL），1μL的DNA聚合酶（5 U/μL），以及23.3μL的DEPC处理水。
- 在以下条件下进行循环：在42°C孵育40分钟;在95°C处初始变性5分钟;35个周期为95°C1分钟，55°C为1分钟和20秒，72°C为1分钟;最后，在72°C下进一步延长10分钟。
注：根据实验室需求，选择合适的引信进行诊断。N113F最初是为狂犬病病毒扩增而设计的，但它对其他裂源病毒可能效果不好。N113F和N304R系列适用于狂犬病病毒（台湾雪铁龙变种）和台湾蝙蝠裂沙病毒。如果上述两组引体放大了莱沙病毒，则使用JW12和N304R引基剂组更容易获得整个核蛋白序列。
- 在 2% 胶质胶电泳分析 PCR 产品，并通过紫外线照明可视化。
- 按商业测序服务对PCR产品进行排序。
- 输入序列或将序列上载到核苷酸基本局部对齐搜索工具 （BLAST） 的网页。选择"其他（nr等）"数据库，并进入生物体作为莱萨病毒。选择 MegaBlast 算法并运行 BLAST。
7. 病毒隔离
注：当 1） FAT 或 2） RT-PCR 指示积极性时，执行病毒隔离。
- 在MEM-10中，在10%（w/v）悬浮液中使大脑标本均匀化。在 825 x g下离心 10 分钟。
- 在MEM-10的1 mL中，用悬浮3 x 106 MNA（小鼠神经母细胞瘤）悬浮3×10MNA（小鼠神经母细胞瘤）在37°C下1小时，用1%的CO2为1小时。将大脑均质细胞悬浮液转移到25cm2烧瓶，并加入6 mL的MEM-10。
- 在直径为 6 mm 的 4 孔特氟龙涂层玻璃幻灯片中培养 1 mL 的大脑均质细胞悬浮液。
- 在 37°C 孵育 3⁄4 天后，使用 1% CO2固定 4 口井上的细胞，使用 100% 丙酮 （v/v） 固定细胞。
- 按照步骤 4.4_4.7 将幻灯片与两个 FITC 结合的抗狂犬病抗体染色。当研究细胞内质内含物时，细胞被感染。记录受感染细胞的百分比。
- 当幻灯片被染色为负时，执行接种细胞培养的胰蛋白酶化和亚培养：
- 取出介质，用 5 mL 的 PBS 冲洗烧瓶。
- 将 1 mL 的胰蛋白酶添加到烧瓶中，并牢固地敲击烧瓶底部。
- 加入6 mL的MEM-10，然后重新悬浮细胞。
- 将细胞悬浮液放入新的组织瓶（6 mL）和4孔滑动（1 mL）上。
- 重复步骤 7.4_7.6，直到达到 100% 感染率。
- 在孵育24小时后收集上清液。
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Representative Results
从2014年至2017年5月，收集了来自13个物种的332只蝙蝠尸体进行监测。两个检测呈阳性。在第一个蝙蝠案例中，使用FAT与一种商用FITC结合的抗狂犬病抗体（图2）进行脑印象测试呈阴性，而使用两个引物集（JW12/N165-146，N113F/N304R）的RT-PCRs则产生了正结果 （图 3）。获得428 bp序列的扩增素（用N113F/N304R扩增，并含有部分核蛋白基因）。其序列由GenBank数据库进行BLAST查询。结果表明，该序列与身份小于79%的莱沙病毒相似（图4），支持检测到的莱沙病毒的特性。
后来，从这两个大脑中成功分离出两种利沙病毒，并通过FAT（图5）和测序确认了病毒。根据序列分析4，已鉴定的利沙病毒被指定为台湾蝙蝠莱沙病毒（TWBLV）。在第二种情况下，从第一例病例所述，使用两种商用FITC结合的抗狂犬病抗体的FAT获得的结果不一致。
图1：蝙蝠流毒病毒诊断流程图。
显示当前流程和诊断方法的流程图，显示我们实验室当前使用的流程和诊断方法。当直接荧光抗体测试或逆转录聚合酶链反应呈阳性时，应进行病毒分离。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：直接FAT与两个商业FITC结合的抗狂犬病抗体整个大脑压缩从TWBLV感染蝙蝠产生不一致的结果。
案例编号：2016-2300：（A） 带试剂 A 的 FAT（5 倍稀释），显示苹果绿色正信号。（B） 带试剂 B 的 FAT，显示负结果（20 倍稀释）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：采用两套底漆集的RT-PCRs产品。
通道 1 到 3 中使用的底漆集为 JW12/N165-146，预期产品尺寸为 111 个碱基对。通道 4 到 6 中使用的底漆集为 N113F /N304R，预期产品尺寸为 521 个碱基对。样品（通道1和4）的两个测试都呈阳性。M = 100 bp DNA阶梯;通道 1 和 4 = 测试样本;车道 2 和 5 = 正控制;车道 3 和 6 = 负控制。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：TWBLV感染蝙蝠N113F/N304R产物的BLAST结果。
BLAST结果显示，该病例与莱沙病毒最为相似，但数据库中与莱沙病毒的认同感仅为79%。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：TWBLV病毒分离的流源病毒抗原分布与两种FITC结合抗狂犬病偶联物的比较。
10%蝙蝠脑乳液（TWBLV感染）被接种到小鼠神经母细胞细胞中进行病毒分离。在10号通道进行了FAT，并沾染了两种FITC结合的抗狂犬病抗体。小鼠神经母细胞细胞与两种狂犬病结合物的抗原分布存在显著差异。（A） 带试剂 A 的 FAT（5 倍稀释）。（B） 带试剂 B 的 FAT（5 倍稀释）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该实验室标准操作程序 （SOP） 提供了一个串行程序，用于测试蝙蝠样本是否存在在台湾的利沙病毒抗原。关键步骤包括使用 FAT 和 RT-PCR。选择合适的样本和成功分离病毒也很重要。此外，在监测蝙蝠感染病毒期间进行了一些故障排除。主要区别是目标动物。最初（2008-2009年），蝙蝠利沙病毒监测的目标动物是活蝙蝠，它们被困在台湾金门岛，在安乐死后进行利沙病毒检测。大多数被困蝙蝠都健康，不太可能携带莱沙病毒，这种监测方法并不人道。因此，在第三年，只收集了死亡或垂死的蝙蝠，并将监测区域从区域扩大到国家。经过八年的连续监测，台湾终于发现首例蝙蝠流毒病例。
虽然FAT是狂犬病诊断应用最广泛的方法，由世界动物卫生组织和世卫组织18推荐，但很少有研究表明，当FAT5、27使用不同的结合物时，结果不一致。TWBLV感染病例中也出现类似的不一致结果。在TWBLV感染的MNA细胞中，FAT的结果显示2个结合物存在显著差异（图5）。FITC结合的抗狂犬病抗体之一反应不好，即使在浓度较高时也是如此。由于样品中流合物抗原的变化以及偶联中抗体的亲和力和亲和力的变化，建议在FAT中使用两种不同的结合物，以防止流解病毒的假阴性结果诊断23，28，29.
RT-PCR可以为FAT的不一致结果提供确认诊断。由于莱沙病毒的遗传多样性高，建议在RT-PCR中使用多套引源来提高莱沙病毒筛查的精度29，30。一套由高度保守的核蛋白基因设计的引物集是莱沙病毒检测中最常用的一套29。当FAT不能执行31，32时，RT-PCR也可用于普作为样品的诊断。为了避免防止发现新型莱沙病毒的虚假消极性，建议使用更多工具进行检测。在这次利用SOP进行的调查中，发现了两种新型的莱沙病毒4，台湾蝙蝠莱沙病毒。
此外，2018年在台湾的蝙蝠中发现了高度多样化的TWBLV菌株和一种新的莱沙病毒新物种（未公布的数据）。研究结果证明，使用FAT和RT-PCR来检测蝙蝠中的利沙病毒是有用的。应注意此 SOP 中使用的 RT-PCR 引漆集的一些限制。在N113F/N304R的引源集中，N113F最初是为狂犬病病毒扩增而设计的，但它对其他裂源病毒可能效果不好。其他研究人员已经出版了几种用于莱沙病毒检测的引种，可以根据实验室的需要来选择。
本文是对台湾蝙蝠感染病毒监测的逐步介绍。希望这个SOP将有助于研究人员谁有兴趣对蝙蝠感染病毒监测。随着更多的研究人员对蝙蝠进行调查，未来将发现更多的莱沙病毒。这种SOP不仅监测流沙病毒，还监测蝙蝠中的其他人畜共患剂。这些发现可以告知公众、卫生专业人员和科学家与蝙蝠和其他野生动物接触的潜在风险。它还将有助于增进对利沙病毒的进化和起源的了解，并导致科学研究取得实质性进展。
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Disclosures
不声明任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢李天成、林益腾、蔡嘉荣和李亚兰在研究期间给予的协助。这项研究得到了台湾行政院动植物卫生检验检疫局第107AS-8.7.1-BQ-B2（1）号赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
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