Summary
Bu protokol Tayvan yarasalar lyssavirus antijenlerin tanısal test için standart bir laboratuvar işletim prosedürü tanıttı.
Abstract
Lyssavirus cinsinden virüsler zoonotik patojenlerdir ve en az yedi lyssavirüs türü insan vakalarıile ilişkilidir. Yarasalar çoğu lyssaviruses doğal rezervuarlar olduğundan, yarasaların bir lyssavirus izleme programı yarasalar bu virüslerin ekolojianlamak için 2008 yılından bu yana Tayvan'da yürütülmektedir. Bu programda, sivil toplum yarasa koruma örgütleri ve yerel hayvan hastalığı kontrol merkezleri ölü yarasalar veya yarasalar zayıflık veya hastalık tan ölen toplamak için işbirliği yaptı. Yarasaların beyin dokuları nekropsi yoluyla elde edildi ve lyssavirus antijenleri ve nükleik asitlerin saptanması için doğrudan floresan antikor testi (FAT) ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonuna (RT-PCR) tabi tutuldu. FAT için en az iki farklı kuduz tanı konjugatları önerilir. RT-PCR için lyssavirus nükleoprotein geninin kısmi dizisini yükseltmek için iki set astar (JW12/N165-146, N113F/N304R) kullanılır. Bu gözetim programı yarasalarda lyssaviruses ve diğer zoonotik ajanları izler. Tayvan yarasa lyssavirus 2016-2017 yılında Japon pipistrelle(Pipistrellus abramus)iki olguda bulunmuştur. Bu bulgular halk, sağlık profesyonelleri ve yarasalar ve diğer yaban hayatı temas potansiyel riskleri bilim adamları bilgilendirmek gerekir.
Introduction
Lyssavirus cinsinden virüsler zoonotik patojenlerdir. İnsan vakaları ile ilişkili en az yedi lyssavirus türü vardır1. Bu cins116 türek olarak,2,3, Tayvan yarasa lyssavirus (TWBLV)4 ve Kotalahti yarasa lyssavirus5 son zamanlarda yarasatespit edilmiştir, ancak taksonomik durumları henüz belirlenmelidir.
Yarasalar en lyssaviruses doğal konaklar, Mokola lyssavirus ve Ikoma lyssavirus hariç, henüz herhangi bir yarasa tespit edilmemiştir1,2,3,6. Asya yarasalarında lyssaviruses hakkında bilgi hala sınırlıdır. Asya yarasalar iki tanımsız lyssaviruses (Hindistan ve Taylanddiğer) 7,8 bildirilmiştir. Çin'de bir yarasa ısırığı ile ilişkili bir insan kuduz durumda 2002 yılında bildirilmiştir, ancak tanı sadece klinik gözlem9ile konulmuştu . Orta Asya'da, Aravan lyssavirus 1991 yılında Kırgızistan'da fare kulaklı yarasa(Myotis blythi)ve Khujand lyssavirus 2001 yılında Tacikistan'daki bıyıklıyarasada(Myotis mystacinus)tespit edilmiştir. Güney Asya'da, Gannoruwa yarasa lyssavirus Hint uçan tilki tespit edildi(Pteropus medius) Sri Lanka'da 20153. Güneydoğu Asya'da, Filipinler yarasalar üzerinde çeşitli serolojik çalışmalar, Tayland, Bangladeş, Kamboçya, ve Vietnam değişken seroprevalans11gösterdi,12,13,14, 15. yıl. Irkut lyssavirus jilin eyaleti, Çin 201216yılında büyük tüp burunlu yarasa(Murina leucogaster)tespit edilmiş olmasına rağmen, Doğu Asya yarasa popülasyonlarında lyssaviruses tam türleri ve yerleri bilinmemektedir.
Tayvanyarasa popülasyonlarında lyssavirus varlığını değerlendirmek için, hem doğrudan FAT hem de RT-PCR kullanan bir gözetim programı başlatıldı. Tayvan yarasa lyssavirus 2016-2017 yılında Japon pipistrelle(Pipistrellus abramus)4 iki olgutespit edilmiştir. Bu makalede, Tayvan yarasa nüfusunun lyssavirus gözetim için bir laboratuvar standart işletim prosedürü tanıtıldı. Laboratuvarımızda yarasa lyssavirus tanısının akış şeması Şekil1'de vettir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lyssavirüsleri kullanırken güvenlik önlemleri
- Yarasa numunelerini işleyen tüm laboratuvar çalışanlarının ön pozlama kuduz profilaksisi aldığından emin olun17. İşçilerin kuduz antikor düzeylerini önceden izleyin ve her 6 ayda bir yeniden inceleyin17. Antikor düzeyleri 0.5 IU/mL 17'nin üzerinde olanlariçinkuduz aşısının takibi gereklidir.
- Laboratuvarın bulunduğu ülkenin biyogüvenlik yönetmeliklerine bağlı olarak, aşağıdaki prosedürlerin uygun biyogüvenlik seviyesi laboratuvarlarında (örneğin, Tayvan'daki BSL-2 laboratuvarları ve Avustralya'daki BSL-3 laboratuvarları) ve işçiler şu anda nitelikli ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek18.
NOT: Kuduz aşısı, II ve III18gruplarına ait lyssavirüslere karşı çok az koruma sağlar. İşçiler, yarasa19'da çeşitli zoonotik patojenlerin tespit edildiği ve numuneleri uygun biyogüvenlik seviyesi laboratuvar koşullarında uygun kişisel koruyucu ekipmanla ele alması gerektiği konusunda bilgilendirilmelidir.
2. Örnek toplama
- Bulunan zayıf veya hasta yarasalar veya leşler kullanın.
NOT: Zayıf veya hasta yarasalar veteriner bakımı veya araştırması için Taipei Yarasa Koruma Derneği'ne teslim edilirken, karkaslar doğrudan Hayvan Sağlığı Araştırma Enstitüsü'ne teslim edilir. Bu gözetleme programında hiçbir sağlıklı yarasa ötenazi yapılmadı. - Bir yarasa ekolojist morfolojik özellikleri20 ile yarasa türlerini tanımlamak var.
- Lyssavirus pozitif tanısı konulduğunda yarasa türlerinin DNA barkodlamasını yapın, daha önce yayınlanmış prosedürler kullanılarak21.
- Her yarasa leşi (toplama sitesi, türler, klinik işaretler, vb) bir bilgi sayfası gönderin.
3. Yarasa örneklerinin nekropsisi
- Malzemeleri hazırlayın.
- Temiz bir diseksiyon tahtası hazırlayın ve nekropsi için steril bir emici ped yerleştirin.
- Yarasa organları toplamak için toplama tüpleri hazırlayın.
- Nekropsi için tek kullanımlık cımbız ve neşter hazırlayın. Her yarasanın nekropsisi arasında alet değiştirin. Örnekleme sırasında cımbız ve neşterlerin temizlenmesi için %70 etanol ile nemlendirilmiş pamuk topları hazırlayın.
- FAT için iki mikroskop slaytı hazırlayın. Histopatolojik inceleme için taze numuneleri toplayın ve formalin çözeltisinde düzeltin.
- Nekropsi öncesi tüm dış deifeleri inceleyin. Tür farklılaşması için yarasanın dış özelliklerini, özellikle baş, kulakve kanatları fotoğrafla.
- Oral bez örneği toplayın. Yarasayı ventral recumbency'ye tahtaya yerleştirin ve yarasanın kafasını cımbızla düzeltin. Bir neşter ile calvaria orta hattı boyunca deri kesin ve lateral yanlara deri çekin. Bir neşter ile calvaria orta hattı boyunca kafatası kesin ve beyin dokusu ortaya çıkarmak için cımbız ile açın.
- Beyin dokusunu kafatasından çıkarın ve steril bir dil depressörüne yerleştirin ve beyin dokusundan etki smear yapın (bkz. adım 4.2). Taze beyin dokusu küçük bir parça toplamak ve histopatolojik inceleme için formalin düzeltmek. Nükleik asit ekstraksiyonu için bir tüp kalan beyin dokusunu içerir.
- Numune toplama arasında tutulan dokuları temizlemek için %70 etanol ile nemlendirilmiş pamuk toplarla cımbız ve neşter temizleyin.
- Dorsal recumbency tahtaya yarasa yerleştirin ve aksilla ve kuyruk topuk her iki tarafında iğneler ile tahta üzerinde düzeltmek.
- Mandibuladan anüse kadar vücudun orta çizgisi boyunca deri eğim. Asansör ve cımbız ile cilt ve altta yatan kas dokuları ayırın. Mandibular kemiğe yakın tükürük bezleri, toplamak.
- Cımbızla göğüs kafesini hafifçe kaldırın ve orta hat boyunca göğüs kafesini ve karın duvarını neşterle kesin. Köprücük kemiğini neşterle kesin. Göğüs boşluğu açmak için iğneler ile tahtaya sol ve sağ göğüs kafesleri düzeltin.
- İğrenç lezyonları ve ölüm sonrası değişimin derecesini kaydedin.
- Viziyal dokuları (yani, kalp, akciğerler, karaciğer, böbrekler, bağırsak) cımbız ve neşter kullanarak karkas kaldırın. Gelecekteki araştırmalar için gerekli olan visseral örnekleri toplayın.
NOT: Yinelenen örneklerin toplanması önerilir. Biri moleküler tanı için toplanmalı, diğeri viral kültür için viral taşıma ortamı olan veya olmayan -80 °C'de dondurulmalıdır22.
4. Doğrudan floresan antikor testi (FAT)
- FAT için beyin dokusunun izlenimini edin. Fat'i daha önce açıklandığı gibi18,23'te aşağıdaki değişikliklerle gerçekleştirin.
- Beyin dokusunu cımbızla bağlı sinir dokusundan yavaşça ayırın ve beyin dokusunu steril bir dil depressörüne aktarın. Beyin sapı ve beyincik18,23dahil olmak üzere beynin kesit, kesin . Beyin dokusunun kesik yüzeyine hafifçe dokunarak beyin dokusunun izlenimini edin ve fazla dokuyu çıkarmak için lens dokusuna kaydırak tuşuna basın.
- 30 dk. Test edilmiş slaytları ve pozitif ve negatif kontrolleri eşleçle boyamadan önce -20 °C'de aseton ile düzeltin.
- Lyssavirus antijeni boyama için ticari olarak mevcut iki FITC konjuge anti-kuduz antikorlarının her birinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir23. İlk boyama dan önce ticari eşlegate çalışma konsantrasyonu belirleyin. Seyreltilmiş konjugatları 0,45 μM şırınga filtresinden slaytların üzerine bırakın ve kaydırakları 37 °C'de 30 dk boyunca ıslak bir oda içinde kuluçkaya yatırın.
- Slaytlardan fazla eşleç drenaj ve kuluçka sonrası fosfat tamponlu salin (PBS) ile slaytlar yıkayın.
- Slaytlar üzerinde% 10 gliserol küçük bir miktar bırakın ve kapak slaytlar ile kaplayın.
- Slaytları floresan mikroskopla inceleyin.
5. Nükleik asit ekstraksiyonu
- Beyin dokusuna (%10 w/v) MEM-10'un uygun hacmini (%10 fetal sığır serumu ile desteklenen minimum esansiyel ortam) ekleyin.
- 10 dk için 825 x g bir homogenizer alet ve santrifüj 5 mm çelik boncuk ile beyin dokusu homojenate.
- Son hacmi 50°L olan nükleik asidi, aletle ticari olarak kullanılabilen toplam nükleik asit çıkarma kitini kullanarak süpernatantın 200°L'sinde ayıklayın.
6. RT-PCR ve filogenetik analiz
NOT: Bilinen tüm lyssaviruses veya belirli lyssaviruses tespit etmek için çeşitli astar setleri yayınlanmıştır. Burada açıklanan protokol, laboratuvarımızın kullandığı ve tüm deneysel ihtiyaçlar için uygun olmadığı bir örnektir. Laboratuvar ihtiyaçlarına göre uygun astarları seçin.
- Tek adımlı RT-PCR reaktifini aşağıdaki gibi hazırlayın: 2,5 μL 10x reaksiyon arabelleği, 0,5 μL ileri ve ters astar (her biri 10 μM), 4 μL 1,25 mM dNTP, 0,3 μL RNase inhibitörü (40 U/μL) içeren reaksiyon karışımına 5 μL çıkarılmış nükleik asit ekleyin , 0.3 μL ters transkriptaz (10 U/μL), 0.4 μL DNA polimeraz (5 U/μL) ve 11.5 μL DEPC ile işlenmiş su.
NOT: Bu protokolde kullanılan astar seti JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') ve N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24' dir. Reaktiflerin ve bisiklet koşullarının hazırlanmasını kullanılan astar setlerine göre değiştirin. - Aşağıdaki koşullar altında bisiklet gerçekleştirin: 42 °C'de 40 dk için kuluçka; 10 dakika boyunca 94 °C'de ilk denatürasyon; 30 s için 94 °C, 30 s için 55 °C ve 30 s için 72 °C 35 döngüleri; ve son olarak, 10 dakika için 72 °C daha fazla uzatma.
- Tanısal duyarlılığı artırmak için başka veya daha fazla astar kümeleri kullanın.
- N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') ve N304R (5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3') 25,26'yı tek adımlı RT-PCR reaktifini aşağıdaki gibi hazırlamak için kullanın: 5 μL 10x tampon, 5 μL içeren bir reaksiyon karışımına 5 μL çıkarılan çekirdekasit ibaresini ekleyin ileri ve geri astarlar (her biri 4 μM), 5 μL 1,25 mM dNTP, 0,5 μL RNase inhibitörü (40 U/μL), 0,2 μL ters transkriptaz (10 U/μL), 1 μL DNA polimeraz (5 U/μL) ve 23,3 μL DEPC ile tedavi edilen su.
- Aşağıdaki koşullar altında bisiklet gerçekleştirin: 42 °C'de 40 dk için kuluçka; 5 dk için 95 °C'de ilk denatürasyon; 1 dk için 95 °C' nin 35, 1 dk ve 20 s'lik 55°C ve 1 dk için 72 °C; ve son olarak, 10 dakika için 72 °C daha fazla uzatma.
NOT: Laboratuvar ihtiyaçlarına bağlı olarak, tanı için uygun astarları seçin. N113F başlangıçta kuduz virüsü amplifikasyon için tasarlanmıştır, ancak diğer lyssaviruses için iyi çalışmayabilir. N113F ve N304R seti kuduz virüsü (Tayvan gelincik porsuğu varyantı) ve Tayvan yarasa lyssavirus için iyi çalışır. Lyssavirus yukarıdaki iki astar kümesinin her ikisi tarafından da yükseltilirse, JW12 ve N304R astarsetini kullanarak tüm nükleoprotein dizilerini elde etmek daha kolay olacaktır.
- PCR ürününü %2 agarose jel elektroforez üzerinde analiz edin ve UV ışık aydınlatması ile görselleştirin.
- PCR ürünlerini ticari sıralama hizmetine göre sırala.
- Sırayı Nucleottide Basic Local Hizalama Arama Aracı'nın (BLAST) web sayfasına girin veya yükleyin. "Diğerleri (nr vb)" veritabanını seçin ve organizmayı Lyssavirusolarak girin. MegaBlast algoritmasını seçin ve BLAST'ı çalıştırın.
7. Virüs yalıtımı
NOT: 1) FAT veya 2) RT-PCR pozitifliği gösterdiğinde virüs yalıtımı yapın.
- MEM-10'da beyin örneğini %10 (w/v) süspansiyonda homojenize edin. 10 dk için 825 x g santrifüj.
- 3 x 106 MNA (fare nöroblastomu) hücrelerinin 1 mL'si MEM-10'da %1 CO2ile 37 °C'de 200 μL süpernatant inoküle edin. Beyni homojen hücre süspansiyonuna 25 cm 2'lik bir şişeye aktarın ve 6 mL MEM-10 ekleyin.
- Aynı anda 6 mm çapında 4 kuyute Teflon kaplı cam kaydırakta beyin homojen hücre süspansiyonunun 1 mL'sini yetiştirin.
- 37 °C'de %1 CO2ile 3-4 günlük kuluçkadan sonra, 4 kuyudaki hücreleri %100 aseton (v/v) ile düzeltin.
- 4.4-4.7 adımlarını takiben slaytları iki FITC konjuge anti-kuduz antikoruile lekelendirin. İntrasitoplazmik inklüzmler incelendiğinde hücreler enfekte olur. Enfekte hücrelerin yüzdesini kaydedin.
- Slaytlar negatif olarak boyandığında aşılanmış hücre kültürünün tripsinizasyonunu ve alt kültürünü gerçekleştirin:
- Orta çıkarın ve 5 mL PBS ile şişeyi durula.
- Şişeye 1 mL tripsin ekleyin ve şişenin dibine sıkıca vurun.
- 6 mL MEM-10 ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonuna yeni bir doku şişesine (6 mL) ve 4 kuyu slaytına (1 mL) koyun.
- %100 enfekte olana kadar 7.4-7.6 adımlarını tekrarlayın.
- Kuluçka 24 saat sonra supernatant toplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2014-Mayıs 2017 tarihleri arasında 13 türden 332 yarasa leşi gözetim altında toplandı. İki test pozitif çıktı. İlk yarasa durumunda, beyin izlenimi, ticari FITC konjuge anti-kuduz antikorlarından biriyleFAT kullanılarak negatif test edildi (Şekil 2), iki astar kümesinin her birini kullanan RT-PCR'ler (JW12/N165-146, N113F/N304R) olumlu sonuçlar (Şekil 3). 428 bp amplicon dizisi (N113F/N304R ile güçlendirilmiş ve kısmi nükleoprotein geni içeren) elde edildi. Dizi, GenBank veritabanı tarafından BLAST sorgulamasına tabi tutuldu. Sonuç, dizinin tespit edilen lyssaviruses kimliklerini destekleyen %79'dandaha az (Şekil 4) kimlikli lyssaviruses'a benzediğini göstermiştir.
Daha sonra bu iki beyinden iki lyssavirüs başarıyla izole edildi ve virüsler FAT (Şekil 5) ve dizileme ile doğrulandı. Tanımlanan lyssavirus Tayvan yarasa lyssavirus olarak belirlenmiştir (TWBLV) dizi analizi dayalı4. İkinci durumda, iki ticari FITC konjuge anti-kuduz antikorları istihdam FATs elde edilen sonuçlar tutarsız, ilk durumda açıklandığı gibi.
Şekil 1: Yarasa lyssavirus tanı akış şeması.
Laboratuvarımızın şu anda kullandığı mevcut süreci ve tanı yöntemlerini gösteren akış şeması. Doğrudan floresan antikor testi veya ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu pozitif olduğunda virüs izolasyonu yapılmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir TWBLV enfekte yarasa tutarsız sonuçlar veren tüm beyin sıkıştırma iki ticari FITC konjuge anti-kuduz antikorları ile Doğrudan FAT.
Dava numarası: 2016-2300: (A) Reaktif A ile FAT (5x seyreltme), elma yeşili pozitif sinyalleri gösteren. (B) Reaktif B ile FAT, negatif bir sonuç gösteren (20x seyreltme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RT-PCR'lerin iki astar seti kullanan ürünleri.
1-3 şeritlerinde kullanılan astar seti JW12/N165-146 idi ve beklenen ürün boyutu 111 baz çiftiydi. 4-6 şeritte kullanılan astar seti N113F /N304R ve beklenen ürün boyutu 521 baz çifti idi. Numunenin her iki testi (şerit 1 ve 4) pozitifçıktı. M = 100 bp DNA merdiveni; şeritler 1 ve 4 = test edilen örnek; şeritler 2 ve 5 = pozitif kontroller; şeritler 3 ve 6 = negatif kontroller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: TWBLV enfekte yarasa N113F/N304R ürün BLAST sonucu.
BLAST sonuçları, vakanın lyssavirus'a en çok benzediğini, ancak veritabanında lyssavirüs olan kimliğin sadece %79 olduğunu gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: TWBLV'nin virüs izolasyonunun lyssavirus antijen dağılımının iki FITC konjuge anti-kuduz konjuge ile karşılaştırılması.
%10 yarasa beyin emülsiyonu (TWBLV enfekte) virüs izolasyonu için fare nöroblastom hücrelerine aşılandı. FAT'lar onuncu geçitte yapıldı ve iki FITC konjuge anti-kuduz antikoru ile lekelendi. Fare nöroblastom hücrelerinin iki kuduz konjulek ile antijen dağılımı önemli farklılıklar gösterdi. (A) Reaktif A (5x seyreltme) ile FAT. (B) Reaktif B (5x seyreltme) ile FAT. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu laboratuvar standart işletim prosedürü (SOP) Tayvan lyssavirus antijenlerin varlığı için yarasa örnekleri test etmek için bir seri süreç sağlar. Önemli adımlar arasında FAT ve RT-PCR istihdamı yer alıyor. Uygun örneklerin seçilmesi ve virüsün başarılı bir şekilde izole edilmesi de önemlidir. Ayrıca, yarasa lyssaviruses izlenmesi sırasında bazı sorun giderme yapılmıştır. En büyük fark hedef hayvanlardı. Başlangıçta (2008-2009), yarasa lyssavirus gözetim hedef hayvanlar tayvan Kinmen Adası'nda sıkışıp sonra ötanazi sonra lyssavirus için test edildi canlı yarasalar vardı. Kapana kısılmış yarasaların çoğu sağlıklıydı ve lyssavirus taşıma olasılığı düşüktü ve bu izleme yaklaşımı insancıl değildi. Bu nedenle, üçüncü yıl, sadece ölü ya da ölmekte olan yarasalar toplandı ve bölgesel ulusal gözetim alanı genişletmek. Sürekli izleme sekiz yıl sonra, ilk yarasa lyssavirus durumda nihayet Tayvan tespit edildi.
FAT kuduz tanısı için en yaygın olarak kullanılan yöntem olmasına rağmen ve OIE ve WHO18tarafından önerilen, farklı konjugatlar FAT5,27kullanıldığında tutarsız sonuçlar göstermiştir. Benzer tutarsız sonuçlar da TWBLV-enfekte olgularda ortaya çıktı. TWBLV enfekte MNA hücrelerinde, FAT sonuçları 2 konjugattaönemli farklılıklar göstermiştir (Şekil 5). FITC konjuge anti-kuduz antikorlarından biri yüksek konsantrasyonlarda bile iyi tepki vermedi. Örneklerde lyssavirus antijeninin değişimi ve konjugalerde antikor aviditesi ve afinitesinin değişimi nedeniyle, lyssavirüste yanlış negatif sonuçları önlemek için FAT'te iki farklı konjugağın kullanılması tavsiye edilir. tanı23,28,29.
RT-PCR, FAT'in tutarsız sonuçları için doğrulayıcı tanı sağlayabilir. Lyssavirus'un yüksek genetik çeşitliliği nedeniyle RT-PCR'de ayarlanan birden fazla astarın lyssavirus taramasının doğruluğunu artırmak için kullanılması tavsiye edilir29,30. Yüksek oranda korunmuş nükleoprotein genlerinden tasarlanmış bir astar seti lyssavirus algılama29'da en sık kullanılan kümedir. RT-PCR, 31,32. Yeni bir lyssavirus keşfini engelleyen yanlış olumsuzlukları önlemek için, daha fazla araç algılama için tavsiye edilir. İki roman lyssaviruses4, Tayvan yarasa lyssavirus, SOP istihdam bu anket sırasında tespit edilmiştir.
Ayrıca, 2018 yılında Tayvan'da yarasalarda çok çeşitli bir TWBLV türü ve yeni bir lyssavirus türü bulunmuştur (yayınlanmamış veriler). Bulgular, yarasalarda lyssavirüsleri tespit etmek için hem FAT hem de RT-PCR istihdamının yararlı olduğunu kanıtlamıştır. Bu SOP'da kullanılan RT-PCR astar setinin bazı sınırlamaları not edilmelidir. N113F/N304R astar setinde, N113F başlangıçta kuduz virüsü amplifikasyon için tasarlanmıştır, ancak diğer lyssaviruses için iyi çalışmayabilir. Lyssavirus tespiti için çeşitli astarlar diğer araştırmacılar tarafından yayınlanmıştır29,30 ve laboratuvar ihtiyaçlarına göre seçilebilir.
Bu makale, Tayvan yarasa lyssavirus gözetim için adım adım giriştir. Bu SOP yarasa lyssavirus gözetim ilgilenen araştırmacılar için yararlı olacağı umulmaktadır. Daha fazla araştırmacı yarasa araştırmaları yürüttükçe, gelecekte daha fazla lyssaviruse tespit edilecektir. Bu SOP sadece lyssaviruses değil, aynı zamanda yarasalar diğer zoonoses ajanları izler. Bu tür bulgular halk, sağlık profesyonelleri ve yarasalar ve diğer yaban hayatı ile temas potansiyel riskleri bilim adamları bilgilendirebilirsiniz. Ayrıca lyssavirus evrimi ve kökeni anlayışının artırılmasına yardımcı olacak ve bilimsel araştırmalarda önemli ilerleme yol açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması bildirilmemiştir.
Acknowledgments
Biz Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai ve Ya-Lan Li bu çalışma sırasında yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hayvan ve Bitki Sağlığı Teftiş ve Karantina Bürosu, Tarım Konseyi, Executive Yuan, Tayvan'dan 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) numaralı hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
- Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al.
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al.
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al.
- Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al.
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
- World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O.
- Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
