Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Kromogen in situ hybridisering SS et værktøj til HPV-relateret hoved-og hals kræftdiagnose

doi: 10.3791/59422 Published: June 14, 2019

Summary

Human papillomavirus (HPV) RNA kromogen in situ hybridisering anses for at være en af guld standarderne for aktiv human papillomavirus infektion påvisning inden tumorer. Det giver mulighed for visualisering af HPV E6-E7 mRNA udtryk med lokalisering og semikvantitativ evaluering af dets signal.

Abstract

Human papillomavirus (HPV) infektion er en stor risikofaktor for en subtype af orofaryngeal planocellulært karcinom (OPSCC), som har tendens til at være forbundet med et bedre resultat end alkohol-og tobaksrelateret OPSCC. Kromogen in situ-hybridisering (CISH) af HPV-viral RNA kan tillade semikvantitativ evaluering af virale udskrifter af de onkogene proteiner E6 og E7 og en in situ-visualisering med en god rumlig opløsning. Denne teknik gør det muligt at diagnosticere en aktiv infektion med visualisering af HPV transskription i de svulst HPV-inficerede celler. En fordel ved denne teknik er undgåelse af kontaminering fra nonneoplastiske HPV-inficerede celler støder op til tumoren. Samlet, dens gode diagnose forestillinger har det anset for at være den gyldne standard for aktiv HPV-infektion identifikation. Siden E6 og E7 viral protein interaktion med celle proteiner pRb og P53 er obligatorisk for celletransformation, er HPV-RNA CISH funktionelt relevant og afspejler akut aktiv onkogenic HPV-infektion. Denne teknik er også klinisk relevant, da "lav" eller "høj" HPV-transkription niveauer hjalp identifikationen af to prognose grupper blandt HPV-relaterede P16-positive hoved-og halscancer patienter. Her præsenterer vi protokollen for manuel HPV-RNA CISH udført på formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) dias med et kit fra producenten. I stedet for kromogen åbenbaring kan RNA in situ-hybridisering også udføres med fluorescerende Åbenbaring (RNA FISH). Det kan også kombineres med konventionel immun farvning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HPV-RNA er et effektivt værktøj til påvisning af aktiv HPV-infektion, som kan vise sig at være afgørende for godartede eller maligne læsioner på forskellige steder såsom orofarynx eller livmoderhalsen. Påvisning af en aktiv HPV-infektion kan understøtte diagnosen af en HPV-induceret læsion og dermed påvirke dens behandling og prognose.

HPV er den hyppigste seksuelt overførte infektion, og mere end 100 virale genotyper er beskrevet1. Skematisk, lavrisiko genotyper såsom genotype 6 og 11 er kendt for at fremkalde kønsvorter, recidiverende luftvejs papillomatose og andre godartede læsioner, hvorimod højrisiko-genotyper såsom genotyper 16 og 18 er ansvarlige for de fleste livmoderhalskræft og anal kræft og spille en rolle i HNSCC oncogenesis i variable proportioner, som tegnede sig for regionale epidemiologiske data2.

Der findes flere værktøjer til påvisning af HPV-infektion. Da en højrisiko-HPV-infektion fører til ekspression af virale onkogeniske proteiner E6 og E73, er påvisning af E6 og E7 udskrifter bredt betragtet som guldstandarden for aktiv HPV-infektion identifikation4. HPV-RNA CISH kan udføres på FFPE-prøver, som ganske enkelt er fremstillet af patienter, der lider af forskellige HPV-relaterede sygdomme. Dens ydeevne er blevet evalueret i plade intraepitelial neoplasi i livmoderhalsen, anus, og vagina, og i invasive pladecellekarcinom i livmoderhalsen, anus, og den øvre aerofordøjelses kanalen5: det opnår en følsomhed på over 98% blandt HPV-DNA-polymerasekæde reaktion (PCR)-positive tilfælde. Dette er lidt bedre end P16 immun farvning (93%) og HPV-DNA in situ-hybridisering (DNA ISH: 97%), som er mere almindeligt anvendt. I en anden kohorte af 57 patienter med planocellulært karcinom (SCC) som følge af hoved-og nakkeregionen, genital regionen, huden og urinvejene, sammenlignet med HPV-DNA ISH, opnåede HPV RNA CISH bedre følsomhed (100% versus 88%) og specificitet (87% versus 74%)6.

P16 immunofarvning er en indirekte markør, der afspejler forstyrrelser i cellecyklussen, som kan være forårsaget (men ikke udelukkende) af HPV-infektion4,7. Denne omkostningseffektive test besidder en god følsomhed og en negativ prædiktiv værdi og anbefales som en surrogatmarkør for højrisiko-HPV-infektion i oropharynx cancer (OPC) af College of American patologer (CAP) og af Union for international Kræftkontrol (UICC)8.

Selvom dette papir udelukkende fokuserer på påvisning af HPV i HNSCC, er HPV-RNA klinisk relevant i forskellige andre tilstande, der involverer HPV-infektion. For eksempel, denne teknik kan forbedre nøjagtigheden af diagnosen af lav-grade planocelløse intraepiteliale læsioner i livmoderhalsen (LSIL, tidligere kendt som Cervical intraepitelial neoplasi, grad 1 [CIN1]) for morfologisk tvetydige tilfælde9. Hvad angår orofaryngeal SCC, gør HPV-RNA CISH det muligt at identificere HPV-relateret SCC, mærket som forskellig fra HPV-relateret orofaryngeal SCC i den nylige ottende udgave af TNM-klassifikationen af hoved-og hals kræft (i Unionen for international Cancer Kontrol [UICC])10. Da HPV-relaterede SCC udviser en bedre prognose med længere overlevelse og forbedret strålebehandling og kemoterapi følsomhed end HPV-relateret SCC11,12,13, kan påvisning af HPV-infektion påvirke patienthåndtering14,15. Desuden kan HPV-RNA CISH anvendes til diagnosticering af HPV-relateret multiphenotypisk sinonasalt karcinom med et højere signal end HPV-DNA CISH16. Flere multivariat analyser tyder på, at påvisning af E6 og E7 udskrifter er korreleret med en bedre prognose i orofaryngeale SCC samlet7,15,17,18 og i under gruppe af P16-positive orofaryngeale SCC19,20.

Her præsenterer vi protokollen for manuel HPV-RNA, der udføres på FFPE-slides med et sæt, der er fremstillet af producenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen følger etiske retningslinjer og blev godkendt af det etiske udvalg (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. klargøring af materialerne

  1. Klargøring af 1x vaskebuffer
    1. Forbered 3 L 1x vask buffer ved at tilføje 2,94 L destilleret vand og en flaske (60 mL) vaskebuffer (50x) (Se tabellen over materialer) til en stor carboy. Bland godt.
      Bemærk: 1x-vaskebufferen kan tilberedes før tid og opbevares ved stuetemperatur i op til 1 måned.
  2. Fremstilling af modfarvnings reagenser
    1. Forbered 50% hematoxylin.
      1. I en stinkhætte tilsættes 100 mL af Gills hematoxylinlegemer i (Se tabellen over materialer) til 100 ml destilleret vand i en farvnings skål.
        Bemærk: 50% hematoxylinlegemer farvnings opløsning kan genbruges i op til 1 uge.
    2. Forbered 0,02% (w/v) ammoniak vand (bluing reagens).
    3. I stinkhætten tilsættes 1,43 mL 1 N ammoniumhydroxid til 250 mL destilleret vand i et gradueret cylinder eller en anden beholder. Forsegl cylinderen med paraffin folie. Bland dens indhold godt for 3x – 5x.
      Bemærk: ved kvantitativ bestemmelse er det afgørende at anvende ammoniumhydroxid. Reagenserne kan forberedes før tid. Sørg for, at alle containere er dækket.
  3. Klargøring af 1x Målsøgnings reagens
    1. I et stort bægerglas tilsættes 70 mL 10x Målsøgnings reagens (Se tabellen over materialer) til 630 ml destilleret vand.
    2. Anbring bægerglasset på en varmeplade med en magnetomrører. Dæk den med aluminiumsfolie.
    3. Indholdet koges ved 100 °C i 10 – 15 minutter.
      Bemærk: Lad det ikke koge i mere end 30 min.
  4. Ækvilibrering af reagens
    1. Sørg for, at hybridiserings ovnen er tændt og ved 40 °C. Læg vådt befugtning papir i bunden af bakken.
      Bemærk: en hybridiserings ovn (Se tabellen over materialer) er nødvendig for trin 3,4 til 4,2.
    2. Fjern forstærknings reagenserne (AMP1 – AMP6, se tabellen over materialer) fra køleskabet og opbevar dem ved stuetemperatur, mindst 30 minutter før det relevante inkubations trin.
    3. Før hver brug opvarmes Månens og/eller kontrol sonden i mindst 10 min ved 40 °C i ovnen eller i et vandbad eller en inkubator.

2. vedhæftningsstyrke og afparaffinisation i stinkhætten

Bemærk: Start protokollen med 3 – 5 μm-tykke histologiske prøver monteret på ikke-farvede slides.

  1. For at øge vedhæftningen skal du bage slidene ved 60 °C i 1 time eller ved 40 °C natten over i en ovn.
  2. Oplad slide holderen med ufarvede histologiske slides. Fordyb glide stativet i 5 min i frisk xylen indeholdt i en farvnings skål, med lejlighedsvis agitation. gentages med frisk xylen.
  3. Fordyb glide stativet i 3 min i frisk 100% ethanol, der er indeholdt i en farvnings skål, med konstant omrøring. Gentag med frisk 100% ethanol.
  4. Lad lysbillederne tørre i 2 minutter ved stuetemperatur.
    Bemærk: genbrug ikke deparaffinisering reagenser til dehydrering af lysbilleder efter analysen.

3. vævs forbehandling

Bemærk: disse trin følger anbefalingerne i "standard forbehandlingen" i henhold til producentens anvisninger for prøver fra hoved og hals. Timingen af afsnit 3,1 og 3,2 skal muligvis justeres afhængigt af det manipulerede væv.

  1. Blokade af peroxidaseaktivitet
    1. Tilsæt 4 – 6 dråber hydrogenperoxid (Se tabellen over materialer) til hver slide og inkube dem i 10 minutter ved stuetemperatur.
    2. Vask slidene 2x i 2 min i destilleret vand ved stuetemperatur.
  2. Brud på RNA/vævs grænser
    1. Med en klo, fjerne aluminiumsfolie fra den kogende 1x mål hentning reagens (TTR1x) fra punkt 1,3 og stop omrøring. Sænk glide stativet langsomt og meget forsigtigt i 15 min. dæk bægerglasset igen med aluminiumsfolie.
      Bemærk: Simmering skal fortsætte i dette trin.
      Forsigtig: Brug kloen til at manipulere aluminiumsfolie og glide stativet for at undgå forbrændinger. Sørg for at bære passende personlige værnemidler, såsom handsker og en lab frakke.
    2. Med klo, straks overføre den varme slide rack til et destilleret vandbad og vaske det i 2 min.
      Bemærk: Sørg for, at prøverne ikke afkøles i TTR1x.
    3. Vask slidene i frisk 100% ethanol i 2 min.
    4. Lad slidene tørre ved stuetemperatur i 2 min.
  3. Barriere skabelse
    1. Med en hydrofobe barriere pen (Se tabellen over materialer), tegne en barriere omkring prøven. Lad det tørre ud på mindst 5 min.
      Bemærk: Tillad, at barrieren virkelig tørrer ud. Hvis det slides under proceduren, så tøv ikke med at trække det igen. Undgå at røre ved vævet med pennen. Protokollen kan sættes på pause natten over her.
  4. Nedbrydning af proteasehæmmere
    1. Anbring diasene på glide stativet og tilsæt ~ 4 dråber protease plus pr. prøve (Se tabellen over materialer).
    2. Dæk Fugtighedskontrol bakken med et låg, og sæt den i hybridiserings ovnen i 30 min ved 40 °C.
      Bemærk: for at undgå fordampning skal dreje knappen drejes helt til Låsepositionen.
    3. Fjern bakken fra ovnen, og fjern glide stativet.
    4. Ét dias ad gangen, Fjern hurtigt eventuel overskydende væske, og Anbring sliden i en rutsjebane, der er nedsænket i en farvnings skål fyldt med destilleret vand.
    5. Vask slidene 2x i 2 min i destilleret vand ved stuetemperatur. Agitere konstant.

4. udførelse af analysen

Bemærk: Lad ikke sektioner tørre ud mellem inkubations trinene.

  1. Hybridisering af HPV-proben
    Bemærk: Sørg for, at sonden er forvarmet til at opløse enhver nedbør før brug. Til dette trin, i stedet for HPV-sonde, kan peptidyl-prolyl isomerase B (PPIB) for positiv kontrol eller dihydrodipicolinatreduktase (dapb) for negativ kontrol (Se tabellen over materialer) også anvendes.
    1. Tryk på og/eller svip diasene for at fjerne overskydende væske, og anbring dem i glide stativet. Der tilsættes ~ 4 dråber HPV-sonde for at dække hver sektion fuldstændigt.
    2. Dæk bakken med et låg, og sæt den i ovnen i 2 timer ved 40 °c.
      Bemærk: for at undgå fordampning skal du sørge for, at turn Nob drejes helt til Låsepositionen.
    3. Fjern bakken fra ovnen, og fjern glide stativet.
    4. Et dias ad gangen, hurtigt fjerne eventuelle overskydende væske og placere diaset i en slide rack nedsænket i en farvnings skål fyldt med 1x vask buffer.
    5. Vask diasene i 1x vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur med konstant agitation. Gentag dette med frisk 1x vask buffer.
  2. Hybridisering af AMP1, AMP2, AMP3 og AMP4
    Bemærk: disse trin omfatter hybridisering i hybridiserings ovnen og AMP1 – AMP4 fra det købte Kit (Se tabellen over materialer).
    1. Tryk på og/eller svip for at fjerne overskydende væske fra diasene, og anbring dem i slide stativet. Tilsæt ~ 4 dråber AMP1 til helt at dække hvert afsnit.
    2. Dæk bakken med et låg, og sæt den i ovnen i 30 min ved 40 °c.
    3. Fjern bakken fra ovnen, og fjern glide stativet.
    4. Et dias ad gangen, hurtigt fjerne eventuelle overskydende væske og placere diaset i en slide rack nedsænket i en farvnings skål fyldt med 1x vask buffer.
    5. Vask diasene i 1x vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur med konstant agitation. Gentag dette med frisk 1x vask buffer.
    6. Gentag trin 4.2.1 – 4.2.5, men brug ~ 4 dråber AMP2 i stedet for AMP1 og inkubeter i 15 min ved 40 °c. Vask slidene 2x i 2 min, begge gange i frisk vask buffer.
    7. Gentag trin 4.2.1 – 4.2.5, men brug ~ 4 dråber AMP3 i stedet for AMP1 og inkubeter i 30 min ved 40 °c. Vask slidene 2x i 2 min, begge gange i frisk vask buffer.
    8. Gentag trin 4.2.1 – 4.2.5, men brug ~ 4 dråber AMP4 i stedet for AMP1 og inkubeter i 15 min ved 40 °c. Vask slidene 2x i 2 min, begge gange i frisk vask buffer.
  3. Hybridisering af AMP5 og AMP6
    Bemærk: disse trin omfatter ikke hybridisering i ovnen, men hybridisering ved stuetemperatur. AMP5 og AMP6 kommer fra det indkøbte Kit (Se tabellen over materialer).
    1. Tryk på og/eller svip diasene for at fjerne overskydende væske, og anbring dem i glide stativet. Tilsæt ~ 4 dråber AMP5 til helt at dække hvert afsnit.
    2. Dæk bakken med et låg, og inkube i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Et dias ad gangen, hurtigt fjerne eventuelle overskydende væske og placere den i en slide rack nedsænket i en farvnings skål fyldt med 1x vask buffer.
    4. Vask diasene i 1x vaskebuffer i 2 minutter ved stuetemperatur med konstant agitation. Gentag dette med frisk 1x vask buffer.
    5. Gentag trin 4.3.1 – 4.3.4, men brug ~ 4 dråber AMP6 i stedet for AMP5 og inkuperer i 15 minutter ved stuetemperatur. Vask slidene 2x i 2 min, begge gange i frisk vask buffer.

5. signal detektering med 3, 3 '-diaminobenzidin

Forsigtig: Diaminobenzidin (DAB) er giftigt. Følg passende forholdsregler og sikkerhedsretningslinjer ved bortskaffelse og håndtering af dette kemikalie.

  1. Bland lige store mængder af DAB-A og DAB-B (Se tabellen over materialer) i en passende størrelse rør ved at dispensere det samme antal dråber af hver opløsning. Der fremstiller ~ 120 μL DAB-substrat pr. afsnit (~ 2 dråber af hver reagens/i alt 4). Bland det godt for 3x – 5x.
  2. Tag hvert enkelt dias, én ad gangen, fra glide stativet, og tryk på og/eller svip for at fjerne den overskydende væske, før du placerer den i slide stativet.
  3. Pipette ~ 120 μL DAB på hver vævs sektion. Sørg for, at sektionerne er dækket, og inkuperer i 10 minutter ved stuetemperatur.
  4. Kassér den resterende DAB i henhold til lokal regulering, og Indsæt diaset i en slide rist under vand i en farvnings skål fyldt med ledningsvandet.

6. modfarvnings-

  1. Flyt glide stativet til en farvnings skål indeholdende 50% hematoxylinlegemer farvnings opløsning lad det hvile i 30 s ved stuetemperatur. Bemærk, at diasene bliver lilla.
  2. Overfør straks glide stativet tilbage til en farvnings skål, der indeholder postevand, og vask diasene 3x – 5x ved at flytte risten op og ned.
  3. Fortsæt med at gentage vaske trinnet med frisk vand fra hanen, indtil slidene er klare, mens sektionerne forbliver lilla.
  4. Udskift vandhanen i farvnings skålen med 0,02% ammoniak vand. Bevæg rack op og ned 2x-3x. Bemærk, at vævs sektionen skal blive blå.
  5. Udskift ammoniak vandet med vand fra hanen. Vask diasene 3x – 5x.

7. dehydrering

  1. Flyt glide stativet til en farvnings skål, der indeholder 70% ethanol i stinkhætten, og lad det hvile i 2 minutter med lejlighedsvis agitation.
  2. Flyt glide stativet til den første farvnings skål, der indeholder 100% ethanol, og lad det hvile i 2 minutter med lejlighedsvis agitation.
  3. Flyt glide stativet til en anden farvnings skål, der indeholder 100% ethanol, og lad det hvile i 2 minutter med lejlighedsvis agitation.
  4. Flyt glide stativet til en farvnings skål, der indeholder xylen, og lad det hvile i 5 minutter med lejlighedsvis agitation.

8. Skub montering

  1. Fjern diasene fra glide stativet, og læg dem fladt med de sektioner, der vender opad i stinkhætten.
  2. Monter ét dias ad gangen ved at tilføje 1 dråbe et xylen-baseret monterings medium til hvert lysbillede og forsigtigt placere en 24 mm x 50 mm dækglas over sektionen. Undgå at fælde luftbobler.
  3. Luft-tør slidene i ≥ 5 min.

9. evaluering af prøverne

  1. Undersøg vævs afsnittene under et standard skygge felt mikroskop ved 20x – 40x forstørrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som beskrevet her, i hoved og hals planocelløse celle kræft, en sag kan betragtes som positiv i nærværelse af brun punktiform farvning i cytoplasma eller i kerner af tumorceller. I de fleste undersøgelser betragtes signalet som enten "positivt" eller "ikke påvist"14. Metoder til semi kvantificering af signalet er blevet rapporteret, men mangler standardisering mellem holdene. For eksempel, i nogle undersøgelser, blev signalerne scoret som 1 + med 1 – 3 prikker per tumor celle, 2 + med 4 – 9 prikker per tumor celle, eller 3 + med 10 prikker eller mere pr tumor celle6; i post hoc-analyser blev kun 2 + og 3 +-signaler, som var lettere at fortolke, taget i betragtning. I en anden undersøgelse, blev resultaterne opdelt i to scores: RNA CISH "høj" og RNA CISH "lav". RNA CISH "høj" score blev defineret af mere end 50% af farvede kræftceller, eller ved farvning, der dækker mere end 80% af celleoverfladen (kerne og cytoplasma) i mindst 30% af kræftcellerne, som observeret med en 20x mål (figur 1)21.

Med hensyn til positive kontroller skal PPIB-signalet være synligt som punktat prikker i cellekerner ved 20x – 40x forstørrelse. Som for negative kontrol dias, en prik til hver 10 celler viser baggrund DAB farvning per 20x mikroskopet felt er acceptabelt.

Figure 1
Figur 1: eksempler på "Low" og "High" RNA CISH farvning. (A og B) RNA cish "lav" score farvning i orofaryngeale plade celle karcinomer. Farvning observeres i under 50% af tumorcellerne og dækker mindre end 80% af cellens overflade. (C og D) RNA cish "høj" score farvning i orofaryngeale planocellulære karcinomer. Farvning observeres i mere end 50% af tumorcellerne, og i dette tilfælde overstiger farvnings overfladen 80% i mere end 30% af tumorcellerne. Dette tal er blevet ændret fra Augustin et al.21venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HPV-RNA, der udføres med et indkøbt kit, er et effektivt værktøj til påvisning af virale udskrifter, og det indikerer aktiv HPV-infektion. Udføres manuelt, trinene i protokollen er generelt let at følge, og den købte kit er praktisk. Denne teknik gør det muligt farvning af 19 histologiske prøver plus en kontrol slide på én gang, og analysen varer omkring 8 h. Det er vigtigt ikke at lade prøverne tørre ud mellem trin, medmindre andet er nævnt. Præbehandlings betingelsen skal muligvis justeres afhængigt af det manipulerede væv.

HPV E6-E7 mRNA-ekspressions signal detekteres med en præcis rumopløsning, hvilket udelukker enhver kontaminering fra HPV-inficerede nonneoplastiske celler, der støder op til tumoren. Påvisning af HPV E6 og E7 RNA er funktionelt relevant, da disse udskrifter er nødvendige for HPV-induceret celletransformation gennem deres interaktion med cellulære P53 og pRb-proteiner4. Derfor kan HPV-RNA CISH i præancerøse læsioner af livmoderhalsen hjælpe med at diskriminere intraepiteliale læsioner af lav kvalitet (LSIL) fra højkvalitets intraepiteliale læsioner (HSIL) i overensstemmelse med signalets lokalisering: i de fleste tilfælde af LSIL, rigelige mængder diffustfarvede kerner mærkes i hele epitel tykkelsen, hvilket indikerer en produktiv fase. HSIL udviser enten rigelige, diffustfarvede cellekerner i det overfladiske lag, sameksisterende med stærke nukleare og cytoplasmatiske signal signaler i det nedre lag (i læsioner tidligere kendt som CIN2) eller stærk nuklear farvning med cytoplasmatiske prikker i hele epitel tykkelsen, hvilket indikerer den transformative fase af HPV-infektionen (i læsioner, der tidligere var kendt som CIN3)22.

Selv om der endnu ikke findes nogen standard anbefaling for den semikvantitative evaluering af signalet, beretter nogle forfattere om klinisk relevans, da den semikvantitative evaluering af HPV E6 og E7-udskrifter har gjort det muligt at identificere to prognostiske grupper blandt HPV-relaterede HNSCC-patienter21. Det er blevet postuleret, at påvisning af HPV-DNA uden E6 og E7 udskrifter eller med kun lave niveauer af E6 og E7 udskrifter ville være funktionelt irrelevant, og at sådanne patienter bør samles med HPV-negative cancerpatienter21, 23. det er

Med hensyn til begrænsninger i denne procedure, er det postuleret, at nogle få uspecifikke kryds hybridiseringer kan ske i nogle tilfælde, som en hypotese af Dreyer et al.23 RNA cish kan ikke være egnet til forskelsbehandling mellem E6/E7 RNA-udskrifter og viral DNA, da protokollen indeholder et varmebehandlings trin på 100 °C, som mistænkes for at give mulighed for viral DNA-denaturering23. Dette understøttes af observation af to typer af signaler i positive tilfælde, nemlig stærk farvning primært lokaliseret i tumor cellekerner, samt et fint granulært signal i cytoplasma. Da den sonde, der anvendes i denne protokol, specifikt binder HPV-genotype 16 og 18, som er involveret i et stort flertal af HPV-relaterede HNSCC4, kan lejlighedsvis HPV-associerede tilfælde blive overset af RNA cish, enten på grund af visse HPV-genotyper, der ikke er i sonden eller på grund af mutationer eller sletninger af primer-bindingssteder. Endelig kræver denne metode dyre reagenser og udstyr og er ikke let tilgængelig i rutinemæssig praksis.

For hver prøve, i alt tre sektioner er nødvendige: en til at udføre HPV-assay, en for den positive kontrol, og en for den negative kontrol. Da RNA er et skrøbeligt molekyle og kan forværres over tid i FFPE-prøver, skal kvaliteten af afskrifterne kontrolleres for hver prøve ved hjælp af positive kontrolprobes såsom PPIB, DNA-instrueret RNA polymerase II-underenhed RPB1 (Polr2a) eller polyubiquitin-C (UBC) , som er menneskelige husholdning gener. Desuden, når der er en semikvantitativ tilgang, skal signalet være normaliseret til husholdning gen kontrol sonde21. Den anbefalede positive kontrol for hvert væv kan findes i producentens vejledning. En nylig undersøgelse bekræfter imidlertid, at mRNA-ekspression kan undersøgt kraftigt både i prospektive og retrospektive prøver, der viser sammenlignelige mRNA-niveauer mellem prøver fra 2004 og 2008. Dette er til fordel for den relative integritet af mRNA over tid24. Den anbefalede negative kontrol sonde, der bruges til at undgå uspecifik farvning, er bakteriernes gen-kodning for DAPB.

Her beskrives kromogen in situ-hybridisering af HPV-RNA som udført manuelt. Denne teknik kan også udføres med fluorescerende mærkning og/eller kombineret med konventionel immun farvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: bestyrelser, seminarer: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche

Acknowledgments

Forfatterne takker afdelingen for patologi i Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel og Gisèle Legall); den histologiske platform PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark til sprog redigering; Alexandra Elbakyan for hendes bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5, (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24, (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21, (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15, (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41, (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142, (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42, (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363, (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73, (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28, (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36, (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27, (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21, (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126, (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9, (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462, (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. (2017).
Kromogen in situ hybridisering SS et værktøj til HPV-relateret hoved-og hals kræftdiagnose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter