Summary
Human papilloma virüsü (HPV) RNA kromojenik in situ hibridizasyon tümörlerde aktif insan papilloma virüsü Enfeksiyon algılama için altın standartlarından biri olarak kabul edilir. HPV E6-E7 mRNA ifadesinin lokalizasyonu ve sinyalinin seminiceliksel değerlendirilmesi ile görselleştirilmesini sağlar.
Abstract
Human papilloma virüsü (HPV) enfeksiyonu, alkol ve tütün ile ilgili opscc 'den daha iyi bir sonuç ile ilişkili olma eğilimindedir Orofaringeal skuayöz Hücre Karsinomu (opscc) bir alt türü için önemli bir risk faktörüdür. HPV viral RNA 'nın kromojenik in situ hibridizasyon (cish), Onkojenik proteinlerin E6 ve E7 viral transkriptlerinin yarı niceliksel değerlendirilmesi ve iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip bir in situ görselleştirme sağlar. Bu teknik, tümör HPV enfekte hücrelerde HPV transkripsiyon görselleştirme ile aktif bir enfeksiyon tanısı sağlar. Bu tekniğin bir avantajı, tümörle bitişik olmayan neoplastik HPV enfekte hücrelerden kontaminasyondan kaçınmak. Genel olarak, iyi tanı performansları aktif HPV enfeksiyon tanımlaması için altın standardı olarak kabul etmiştir. Hücre proteinleri ile E6 ve E7 viral protein etkileşiminin sorun ve p53 için zorunlu olduğu için, HPV RNA cısh işlevsel olarak ilgilidir ve aktif Onkojenik HPV enfeksiyonunu akut yansıtır. Bu teknik, "düşük" veya "yüksek" HPV transkripsiyon düzeylerinin HPV ile ilgili P16 pozitif baş ve boyun kanseri hastalarında iki prognoz grubunun tanımlanmasına yardımcı olduğu için klinik olarak da ilgilidir. Burada, üreticiden elde edilen bir kit ile formalin-fixed parafin-Embedded (FFPE) slaytlarında gerçekleştirilen manuel HPV RNA CıSS protokolünü sunuyoruz. Kromojenik vahiy yerine, RNA içinde situ hibridizasyon da floresan Vahiy (RNA balık) ile yapılabilir. Ayrıca konvansiyonel immünostasyon ile birlikte olabilir.
Introduction
HPV RNA CıSH, orofarenks veya uterus serviks gibi çeşitli konumlarda benign veya malign lezyonlarda önemli olabilecek aktif HPV enfeksiyonunun tespiti için güçlü bir araçtır. Aktif bir HPV enfeksiyonunun tespiti, HPV kaynaklı bir lezyonun tanısını destekleyebilir ve böylece tedavi ve prognozunu etkileyebilir.
HPV en sık cinsel yolla bulaşan enfeksiyondur ve 100 ' den fazla viral genotip1tanımlanmıştır. Şematik olarak, genotiplerde 6 ve 11 gibi düşük riskli genotipler, genital siğiller, tekrarlayan solunum papillomatozu ve diğer benign lezyonlara neden olduğu bilinmektedir, ancak en servikal kanserlerden 16 ve 18 genotip gibi yüksek riskli genotipler de sorumludur ve anal kanserler ve bölgesel epidemiyolojik veri2tarafından muhasebeleştirilir olarak değişken oranlarda hnscc onkogeninde rol oynar.
HPV enfeksiyonunun algılanması için çeşitli araçlar mevcuttur. Yüksek riskli HPV enfeksiyonu, E6 ve E73' ün viral Onkojenik proteinlerinin ifadesine yol açtıkları Için, E6 ve E7 transkriptlerinin tespiti, aktıf HPV enfeksiyon tanımlaması için altın standart olarak yaygın olarak görülebilir4. HPV RNA CıSH, çeşitli HıPV ile ilgili hastalıklardan muzdarip hastalarından oldukça kolay elde edilen FFPE örneklerinde gerçekleştirilebilir. Performansı, serviks, anüs ve vajinanın içinde Skuam intraepitelyal neoplazisinde ve serviks, anüs ve üst Aerodigestive yolu5' te invazif skuanöz hücre karsinomunda değerlendirildi:% 98 ' den fazla duyarlılık elde etti HPV DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) arasında-pozitif durumlarda. Bu biraz daha iyi P16 immünostat (93%) ve HPV DNA In situ hibridizasyon (DNA ISH: 97%), daha yaygın olarak kullanılır. 57, baş ve boyun bölgesinden kaynaklanan Skuam Hücre Karsinomu (SCC), HPV DNA ıSH ile karşılaştırıldığında genital bölge, cilt ve idrar yollarının başka bir kohort, HPV RNA CıSH daha iyi duyarlılık elde (100% karşı 88%) ve özgüllük (% 87 karşı 74%)6.
P16 immünostasyon HPV enfeksiyonu tarafından (ancak sadece) neden olabilir hücre döngüsü bozulması yansıtan dolaylı bir işaretidir4,7. Bu uygun maliyetli test iyi duyarlılık ve negatif tahmin değeri vardır ve orofarenks kanserinde yüksek riskli HPV enfeksiyonu bir vekil Marker olarak tavsiye edilir (OPC) tarafından Amerikan patologlar Koleji (CAP) ve Birliği tarafından Uluslararası Kanser kontrolü (UıCC)8.
Bu yazıda yalnızca HNSCC 'de HPV 'nin saptanmasına odaklanmasına karşın, HPV RNA CıSH, HPV enfeksiyonu içeren diğer çeşitli koşullarda klinik olarak ilgilidir. Örneğin, bu teknik, morfolojik olarak belirsiz vakalar için serviks (LSIL, önceden servikal intraepitelyal neoplazi, Grade 1 [CıN1] olarak bilinen) düşük dereceli skuayöz intraepitelyal lezyonların tanısı doğruluğunu artırabilir9. Orofaringeal SCC ile ilgili olarak, HPV RNA cısh HPV ilişkili SCC tanımlaması sağlar, HPV ilgisiz orofarengeal SCC TNM sınıflandırması baş ve boyun kanseri son sekizinci baskısında farklı olarak etiketli (Uluslararası Kanser Birliği Kontrol [UıCC])10. HPV ile ilgili SCC daha uzun hayatta kalma ve gelişmiş radyoterapi ve HPV ilgisiz SCC11,12,13daha kemoterapi hassasiyeti ile daha iyi bir prognoz sergilediği için, HPV enfeksiyonu tespiti hasta yönetimi14,15. Ayrıca HPV RNA CıSH, HPV ile ilgili multiphenotipfik sinonazal karsinoma tanısı için HPV DNA CıSH16' dan daha yüksek sinyalle kullanılabilir. Birden çok değişkenli analizler, E6 ve E7 transkriptlerinin algılanması, Orofaringeal SCC genel olarak7,15,17,18 ve en iyi prognoz ile ilişkilidir. P16-pozitif orofarengeal SCC19,20alt grubu.
Burada, üreticiden elde edilen bir kit ile FFPE slaytlarında gerçekleştirilen manuel HPV RNA CıSH protokolünü sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol etik kuralları takip eder ve Etik Komite (Comité-de-Protection-des-personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04) tarafından onaylanmıştır.
1. malzemelerin hazırlanması
-
1x yıkama tamponunun hazırlanması
- Hazırlamak 3 L 1x yıkama tampon ekleyerek 2,94 L distile su ve bir şişe (60 mL) yıkama tampon (50x) ( malzeme tablosunabakın) büyük bir carboy. İyi karıştırın.
Not: 1x yıkama tamponu önceden hazırlanabilir ve 1 aya kadar oda sıcaklığında saklanır.
- Hazırlamak 3 L 1x yıkama tampon ekleyerek 2,94 L distile su ve bir şişe (60 mL) yıkama tampon (50x) ( malzeme tablosunabakın) büyük bir carboy. İyi karıştırın.
-
Karşı boyama Reaktiflerin hazırlanması
- % 50 hematoxylin hazırlayın.
- Bir duman kaputu, eklemek 100 ml Gill 'in hematoksilen ı ( malzeme tablosunabakın) için 100 ml damıtılmış su bir boyama çanak.
Not: 50% hematoksinlin boyama çözeltisi 1 haftaya kadar yeniden kullanılabilir.
- Bir duman kaputu, eklemek 100 ml Gill 'in hematoksilen ı ( malzeme tablosunabakın) için 100 ml damıtılmış su bir boyama çanak.
- % 0,02 (w/v) amonyak suyu (bluing reaktif) hazırlayın.
- Duman kaputu, bir dereceli silindir veya başka bir kap içinde 250 mL distile su için 1 N amonyum hidroksit 1,43 mL ekleyin. Silindiri parafin filmi ile mühürleyin. İçeriğini 3x-5x için iyi karıştırın.
Not: tahlil quantitation Için, amonyum hidroksit kullanmak için önemlidir. Reaktifler zamanın öncesinde hazırlanabilir. Tüm konteynerlerin kapalı kalmasını sağlayın.
- % 50 hematoxylin hazırlayın.
-
1x hedef alma reaktörün hazırlanması
- Büyük bir Beaker, ekleyin 70 mL 10X hedef alma reakajının ( malzeme tablosunabakın) Için 630 ml distile su.
- Bir manyetik karıştırıcı ile bir ısıtma plakası üzerinde kabı yerleştirin. Alüminyum folyo ile kapak.
- 100 °C ' de 10 – 15 dakika boyunca içeriği kaynatın.
Not: 30 dakikadan fazla kaynatmaya izin vermeyin.
-
Reaktif Dengeleme
- Hibridizasyon fırın üzerinde ve 40 °c ' de olduğundan emin olun. Islak nemlendirme kağıdını tepsinin altına yerleştirin.
Not: 4,2 için 3,4 adımlar için gerekli olan bir hibridizasyon fırın ( malzeme tablosunabakın). - Amplifikasyon reaktiflerini çıkarın (AMP1 – AMP6, malzeme tablosunabakın) buzdolabından ve oda sıcaklığında tutmak, en az 30 dakika önce ilgili kuluçdak adım.
- Her kullanmadan önce, hedef ve/veya kontrol probları en az 10 dakika boyunca 40 °C ' de fırında veya su banyosundan veya kuluçkasında ısıtın.
- Hibridizasyon fırın üzerinde ve 40 °c ' de olduğundan emin olun. Islak nemlendirme kağıdını tepsinin altına yerleştirin.
2. duman kaputu içinde yapışma artırma ve deparafinizasyonda
Not: 3 – 5 μm kalınlığında histolojik örneklerle protokole başlayın ve lekelenmiş slaytlara monte edın.
- Yapışma geliştirmek için, 60 °C ' de 1 saat veya 40 °C ' de bir fırın içinde gece boyunca slaytlar pişirin.
- Slayt rafı lekelenmiş histolojik slaytlar ile şarj edin. Zaman zaman ajitasyon ile, bir boyama çanak bulunan taze Ksilin içinde 5 dk için slayt raf batırın. taze Ksilin ile tekrarlayın.
- Sürekli ajitasyon ile, bir boyama çanak içinde bulunan taze 100% etanol 3 dk için slayt raf batırın. Tekrar taze 100% etanol ile.
- Slaytlar oda sıcaklığında 2 dakika kuru edelim.
Not: tahlil işleminden sonra slaytların deparafinizasyonda reaktifini yeniden kullanmayın.
3. doku ön tedavisi
Not: Bu adımlar, baş ve boyun örnekleri için üreticinin talimatlarına göre "standart" ön tedavi önerisi izleyin. 3,1 ve 3,2 bölümlerin zamanlaması, işlenmiş dokuya bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
-
Peroksidaz aktivitesinin blokajı
- Her slayda 4 – 6 damla hidrojen peroksit ekleyin ( malzeme tablosunabakın) ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca onları inküyeyin.
- 2 dk için 2x slaytları oda sıcaklığında damıtılmış suda yıkayın.
-
RNA/doku sınırlarını kırma
- Bir pençe ile, 1,3 bölümünden alüminyum folyo kaynar 1x hedef alma reaktörden (TTR1x) çıkarın ve karıştırma durdurun. 15 dakika boyunca yavaşça ve çok dikkatli bir şekilde slayt rafa batırın. alüminyum folyo ile tekrar kap kapağı.
Not: Bu adımda devam etmek Simmering vardır.
DIKKAT: yanma yaralanmaları önlemek için böylece alüminyum folyo ve slayt raf işlemek için pençe kullanın. Eldiven ve laboratuvar ceket gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun. - Pençe ile, hemen bir damıtılmış su banyosu için sıcak slayt raf transferi ve 2 dakika yıkayın.
Not: örnekleri TTR1x soğutmak değil emin olun. - 2 dakika boyunca taze 100% etanol içinde slaytlar yıkayın.
- 2 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar kuru bırakın.
- Bir pençe ile, 1,3 bölümünden alüminyum folyo kaynar 1x hedef alma reaktörden (TTR1x) çıkarın ve karıştırma durdurun. 15 dakika boyunca yavaşça ve çok dikkatli bir şekilde slayt rafa batırın. alüminyum folyo ile tekrar kap kapağı.
-
Bariyer oluşturma
- Hidrofobik bariyer kalemiyle ( malzeme tablosunabakın), numunenin etrafında bir bariyer çizin. En az 5 dakika kurumasına izin verin.
Not: bariyerin gerçekten kurumasını bekleyin. Eğer prosedür sırasında dışarı giyerse, tekrar çizmek için çekinmeyin. Kalemle dokuya dokunmaktan kaçının. Protokol gece burada duraklatılmış olabilir.
- Hidrofobik bariyer kalemiyle ( malzeme tablosunabakın), numunenin etrafında bir bariyer çizin. En az 5 dakika kurumasına izin verin.
-
Proteaz sindirim
- Slaytları Slayt rafına yerleştirin ve numune başına ~ 4 damla protease Plus ekleyin ( malzeme tablosunabakın).
- Nem kontrol tepsisini kapak ile Kapla ve 40 °C ' de 30 dakika boyunca hybridizasyon fırınına takın.
Not: buharlaşma önlemek Için, Turn düğmesi tamamen kilit konumuna döndü emin olun. - Tepsiyi Fırından çıkarın ve slayt rafı çıkarın.
- Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak ve damıtılmış su ile dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf içine slayt yerleştirin.
- 2 dk için 2x slaytları oda sıcaklığında damıtılmış suda yıkayın. Sürekli agitate.
4. tahlil koşma
Not: kuluçta adımları arasında bölümlerin kurumasına izin vermeyin.
-
HPV prob hybridization
Not: kullanım öncesinde herhangi bir yağış çözülür problar prewarmed emin olun. Bu adım için, HPV probyerine, peptidyl-prolyl izomeraz B (ppıb) pozitif kontrol için veya dihiddrodipicolinate redüktaz (dapb) negatif kontrol için ( malzeme tablosunabakın) da kullanılabilir.- Fazla sıvıyı kaldırmak ve onları slayt rafa yerleştirmek için slaytlara dokunun ve/veya hafifçe vurun. Tamamen her bölümü kapsayacak şekilde HPV prob ~ 4 damla ekleyin.
- Tepsiyi kapak ile Kapla ve 40 °c' de 2 saat fırında takın.
Not: buharlaşma önlemek Için, Turn Nob tamamen kilit konumuna döndü emin olun. - Tepsiyi Fırından çıkarın ve slayt rafı çıkarın.
- Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı çıkarın ve 1 adet yıkama tampon ile dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf içine slayt yerleştirin.
- Sabit ajitasyon ile Oda sıcaklığında 2 dakika için 1x yıkama tampon içinde slaytlar yıkayın. Bu yeni 1x yıkama tampon ile tekrarlayın.
-
AMP1, AMP2, AMP3 ve AMP4 hybridization
Not: Bu adımlar hibridizasyon fırın ve AMP1 – AMP4 satın Kit ( malzeme tablosunabakın) hibridizasyon içerir.- Slaytlardan gelen aşırı sıvıyı kaldırmak ve slayt rafına yerleştirmek için dokunun ve/veya hafifçe vurun. Tamamen her bölümü kapsayacak şekilde AMP1 ~ 4 damla ekleyin.
- Tepsiyi kapak ile Kapla ve 40 °c' de 30 dakika boyunca fırında takın.
- Tepsiyi Fırından çıkarın ve slayt rafı çıkarın.
- Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı çıkarın ve 1 adet yıkama tampon ile dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf içine slayt yerleştirin.
- Sabit ajitasyon ile Oda sıcaklığında 2 dakika için 1x yıkama tampon içinde slaytlar yıkayın. Bu yeni 1x yıkama tampon ile tekrarlayın.
- 4.2.1-4.2.5 arasındaki adımları yineleyin, ancak AMP1 yerine AMP2 ~ 4 damla kullanın ve 40 °c ' de 15 dakika boyunca inküye yapın. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.
- 4.2.1-4.2.5 adımları yineleyin, ancak AMP1 yerine AMP3 ~ 4 damla kullanın ve 40 °c ' de 30 dakika boyunca inkübe edin. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.
- 4.2.1-4.2.5 arasındaki adımları yineleyin, ancak AMP1 yerine AMP4 ~ 4 damla kullanın ve 40 °c ' de 15 dakika boyunca inküye yapın. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.
-
AMP5 ve AMP6 hybridization
Not: Bu adımlar fırın içinde hibridizasyon içermez ama oda sıcaklığında hibridizasyon. AMP5 ve AMP6 satın alınan Kit ( malzeme tablosunabakın) gelir.- Fazla sıvıyı kaldırmak ve onları slayt rafa yerleştirmek için slaytlara dokunun ve/veya hafifçe vurun. Tamamen her bölümü kapsayacak şekilde AMP5 ~ 4 damla ekleyin.
- Tepsiyi kapak ile Kapla ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
- Bir defada bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak ve 1 adet yıkama tampon dolu bir boyama çanak içinde daldırma bir slayt raf yerleştirin.
- Sabit ajitasyon ile Oda sıcaklığında 2 dakika için 1x yıkama tampon içinde slaytlar yıkayın. Bu yeni 1x yıkama tampon ile tekrarlayın.
- Adımları tekrarlayın 4.3.1 – 4.3.4, ancak kullanın ~ 4 damla AMP6 yerine AMP5 ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye. 2 dk, her iki kez taze yıkama tamponu için 2x slaytlar yıkayın.
5.3, 3 '-diaminobenzidin ile sinyal algılama
DIKKAT: diaminobenzidin (DAB) zehirlidir. Bu kimyasalı elden çıkarmak ve ele aldığınızda uygun önlemler ve güvenlik kurallarını takip edin.
- DAB-A ve DAB-B ' y e eşit hacimleri karıştırın ( malzeme tablosunabakın), her bir çözümün aynı sayıda damlalarını dağıtarak uygun boyutta bir tüpte. Bölüm başına DAB substrat ~ 120 μL (her reakajın ~ 2 damla/toplam 4) olun. 3x-5x için iyi karıştırın.
- Her slayt, bir kerede, slayt raf ve dokunun ve/veya slayt rafa yerleştirmeden önce aşırı sıvı kaldırmak için Flick alın.
- Pipet ~ 120 her doku bölümü üzerine DAB μL. Bölümlerin kapalı olduğundan emin olun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inküye yapın.
- Kalan DAB ' i yerel yönetmeliğe göre atın ve slaytı musluk suyuyla dolu bir boyama çanağı içinde yer alan bir slayt rafa yerleştirin.
6. karşı boyama
- Slayt rafı,% 50 hematoksinlin boyama çözeltisi içeren bir boyama çanağına taşıyın, oda sıcaklığında 30 s için dinlensin. Slaytların mor olacağını unutmayın.
- Hemen slayt rafı musluk suyu içeren bir boyama çanak geri aktarın ve raf yukarı ve aşağı hareket ettirerek 3-5x slaytlar yıkayın.
- Bölümler mor kaldığı sırada, slaytlar açık olana kadar taze musluk suyu ile yıkama adımını tekrar tutun.
- % 0,02 Amonyak su ile boyama çanak musluk suyu değiştirin. Raf yukarı ve aşağı 2x – 3x taşıyın. Doku bölümünün maviye dönmeli olduğunu unutmayın.
- Amonyak suyunu musluk suyuyla değiştirin. Slaytlar 3x – 5x yıkayın.
7. dehidrasyon
- Slayt raf duman kaputu% 70 etanol içeren bir boyama çanak taşıyın ve zaman zaman ajitasyon ile 2 dakika dinlensin.
- Slayt raf% 100 etanol içeren bir ilk boyama çanak taşıyın ve ara sıra ajitasyon ile 2 dakika dinlensin.
- 100% etanol içeren ikinci bir boyama çanak için slayt raf hareket ve ara sıra ajitasyon ile 2 dakika dinlensin.
- Slayt raf ksile içeren bir boyama çanak taşıyın ve ara sıra ajitasyon ile 5 dakika dinlensin.
8. slayt montajı
- Slaytları Slayt rafından çıkarın ve onları, duman kaputunda yukarı bakan bölümlerle düz bir şekilde bırakın.
- Her slayda 1 damla ksile bazlı montaj ortamı ekleyerek bir defada bir slayt monte edin ve bölüm üzerinde 24 mm x 50 mm 'lik lamel magazini dikkatle yerleştiriniz. Herhangi bir hava kabarcıkları bindirme kaçının.
- Hava-kuru slaytlar ≥ 5 dk.
9. örnek değerlendirme
- 20X-40X büyütme standart aydınlık alan mikroskop altında doku bölümlerini inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklandığı gibi, baş ve boyun skuayöz hücre kanserinde, bir olgu sitoplazmada veya tümör hücrelerinin çekirdeklerinde kahverengi daktiform lekemesinde olumlu düşünülebilir. Çoğu çalışmada, sinyal "pozitif" veya "algılanmadı"14olarak kabul edilir. Sinyal semiquantification yöntemleri rapor edilmiştir ama takımlar arasındaki standardizasyon eksikliği. Örneğin, bazı çalışmalarda, sinyaller 1 + olarak 1 +-3 tümör hücresi başına nokta, 2 + ile 4 – 9 tümör hücresi başına nokta veya 3 + ile 10 nokta veya daha fazla tümör hücresi6; Post Hoc analizlerde, sadece 2 + ve 3 + sinyalleri, hangi yorumlamak daha kolay, dikkate alınmıştır. Başka bir çalışmada, sonuçlar iki puan bölünmüştür: RNA CıSK "yüksek" ve RNA CıSK "düşük". RNA CıSH "yüksek" puanı, lekelenmiş kanser hücrelerinin% 50 ' den fazla veya hücre yüzeyinin (çekirdek ve sitoplazma)% 80 ' den fazla%% 30 ' unda kanser hücrelerinin en az yüzde%% ' sini kapsayan bir 20 x objektif ile gözlenen (Şekil 1)21ile tanımlanmıştır.
Pozitif kontroller ile ilgili olarak, PPıB sinyali 20 x – 40X büyütmede hücre çekirdeğinin içinde deliner nokta olarak görünür olmalıdır. Negatif kontrol slaytlarına gelince, 20 x mikroskop alanı başına arka planda DAB boyama gösteren her 10 hücreye bir nokta kabul edilebilir.
Şekil 1: "düşük" ve "yüksek" RNA CıSK boyama örnekleri. (A ve B) RNA CıSH "düşük" Orofaringeal skuayöz hücre Karsinomlarında boyama puanı. Boya tümör hücrelerinin% 50 altında gözlenen ve hücre yüzeyinin% 80 daha az kapsar. (C ve D) RNA cish "High", Orofaringeal skuayöz hücreli karsinomlarda boyama puanı. Boya tümör hücrelerinin% 50 ' den fazla ve bu durumda, boya yüzeyi tümör hücrelerinin% 30 ' dan fazla% 80 aşıyor görülür. Bu rakam Augustin ve al.21değiştirildiBu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Satın alınan bir kit ile gerçekleştirilen HPV RNA CıSH, viral transkriptlerin tespiti için güçlü bir araçtır ve aktif HPV enfeksiyonu gösterir. El ile gerçekleştirilen, protokolün adımları genel olarak kolaylıkla takip edilir ve satın alınan Kit uygundur. Bu teknik, bir kerede 19 histolojik numune artı bir kontrol slayt boyama sağlar ve tahlil etrafında sürer 8 h. Aksi belirtilmediği sürece örnekleri adımları arasında kuru izin vermek için önemli değildir. Ön tedavi koşulu işlenmiş doku bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
HPV E6-E7 mRNA ifade sinyali, hassas bir uzamsal çözünürlüğe sahip olup, tümörün bitişiğindeki HPV-enfekte nonneoplastik hücrelerden herhangi bir kontaminasyon oluşmasını önler. HPV E6 ve E7 RNA 'nın algılanması, hücresel p53 ve pRb proteinleri4ile etkileşimi yoluyla HPV kaynaklı hücre dönüşümü için bu transkriptlerin gerekli olduğundan işlevsel olarak ilgilidir. Bu nedenle, uterus serviks prekanseröz lezyonlarda, HPV RNA CISH düşük dereceli intraepitelyal lezyonların (LSIL) yüksek dereceli intraepitelyal lezyonlardan (HSIL) sinyalin lokalizasyonuna göre ayrımcılık yapmanıza yardımcı olabilir: LSIL 'in çoğu durumda, bol miktarda diffüz lekeli çekirdekler epitel kalınlığı boyunca etiketlenmiş, üretken bir faz gösteren. HSIL, alt tabakada güçlü nükleer ve sitoplazmik noktalama sinyalleri (eskiden cıniki olarak bilinen lezyonlar) veya sitoplazmik noktalarla güçlü nükleer lekelenme ile birlikte, yüzeysel tabakada bol derecede diffüz lekeli hücre çekirdeklerini sergiler. epitelin kalınlığı boyunca, HPV enfeksiyonunun transformatif fazı (önceki adıyla CıND olarak bilinen lezyonlarda)22.
Sinyalin yarı niceliksel değerlendirilmesi için henüz standart bir öneri olmamasına rağmen, bazı yazarlar HPV E6 ve E7 transkriptlerinin seminiceliksel değerlendirilmesi iki prognostik teşhis izin verdi beri klinik alaka rapor HPV ile ilgili HNSCC hastaları arasında gruplar21. E6 ve E7 transkriptleri olmayan HPV DNA 'nın algılanması veya sadece düşük seviyeleri ile E6 ve E7 transkriptler işlevsel olarak ilgisiz olacağını ve bu tür hastaların HPV-negatif kanser hastaları21ile Havuzlanması gerektiğini öne olmuştur, 23 yaşında.
Bu prosedürün sınırlamaları ile ilgili olarak, bazı durumlarda bazı nonspesifik çapraz hybridizations, Dreyer ve ark.23 RNA cısh tarafından hipotez olabilir, E6/E7 RNA transkriptleri ve viral arasında ayrımcılık için uygun olmayabilir öne olduğunu DNA, protokol gibi virüs DNA denatürasyon için izin şüphelenilen bir 100 °C ısıl işlem adım içerir23. Bu, pozitif durumlarda iki tür sinyallerin gözlem tarafından desteklenmektedir, yani ağırlıklı olarak tümör hücre çekirdeğinde lokalize güçlü boyama, hem de sitoplazmada ince bir granül sinyal. Bu protokolde kullanılan prob, HPV ile ilgili hnscc4' ün büyük çoğunluğu içinde yer alan HPV genotipleri 16 ve 18 ' i özellikle bağlar, bazen HPV ilişkili durumlarda RNA CISC tarafından cevapsız olabilir, ya da belirli HPV genotip nedeniyle veya astar bağlayıcı sitelerin mutasyonlar veya silmeleri nedeniyle, prob dahil. Son olarak, bu yöntem pahalı reaktifler ve aygıtlar gerektirir ve rutin uygulamada kolayca erişilebilir değildir.
Her örnek için, toplam üç bölümden gereklidir: bir HPV tahlil gerçekleştirmek için, bir pozitif kontrol için, ve bir negatif kontrol için. RNA kırılgan bir molekül olduğu ve ffpe örneklerinde zaman içinde bozulabilir gibi, ppıb, DNA-yönlendirilmiş RNA polimeraz II altbirim RPB1 (Polr2a) veya polyubiquitin-c (UBC) gibi pozitif kontrol probları kullanarak, transkriptlerin kalitesi her örnek için kontrol edilmelidir , insan temizliği genler vardır. Dahası, yarı niceliksel bir yaklaşım olduğunda, sinyal temizlik geni kontrol sondası21' e normalleştirilmelidir. Her doku için önerilen pozitif kontrol üreticinin talimatlarına bulunabilir. Ancak, yeni bir çalışmada mRNA ifadesinin hem prospektif ve retrospektif örneklerde hem de 2004 ve 2008 arasındaki örnekler arasında karşılaştırılabilir mRNA düzeylerini gösteren bir şekilde incelendiğini onaylar. Bu zaman içinde mRNA göreli bütünlüğü lehine24. Spesifik olmayan boyama önlemek için kullanılan önerilen negatif kontrol prob DAPB için bakteriyel gen kodlama olduğunu.
Burada HPV RNA 'sında kromojenik in situ hibridizasyon el ile gerçekleştirilen olarak tanımlanır. Bu teknik Ayrıca floresan etiketleme ve/veya konvansiyonel immünostasyon ile birlikte gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CB: panoları, seminerler: MSD, BMS, AstraZeneca, Roche
Acknowledgments
Yazarlar Hopital Européen Georges Pompidou ve Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel ve Gisèle Legall) patolojisi bölümüne teşekkür; PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre) Histoloji platformu; Virginia Clark dil düzenleme için; Onun katkısı için Alexandra Elbakyan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
