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Genetics

Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose

doi: 10.3791/59422 Published: June 14, 2019

Summary

Die chromogene In-situ-Hybridisierung des humanen Papillomavirus (HPV) rna gilt als einer der Goldstandards für den aktiven Nachweis der Infektion durch das humane Papillomavirus in Tumoren. Es ermöglicht die Visualisierung der HPV E6-E7 mRNA-Expression mit Lokalisierung und semiquantitativer Auswertung seines Signals.

Abstract

Die Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) ist ein wichtiger Risikofaktor für einen Subtyp des oropharyngealen Plattenepithelkarzinoms (OPSCC), das tendenziell mit einem besseren Ergebnis als alkohol- und tabakbedingte OPSCC in Verbindung gebracht wird. Die chromogene In-situ-Hybridisierung (CISH) der HPV-viralen RNA könnte die semiquantitative Auswertung viraler Transkripte der onkogenen Proteine E6 und E7 und eine In-situ-Visualisierung mit einer guten räumlichen Auflösung ermöglichen. Diese Technik ermöglicht die Diagnose einer aktiven Infektion mit der Visualisierung der HPV-Transkription in den tumoralen HPV-infizierten Zellen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Vermeidung von Kontaminationen durch nichtneoplastische HPV-infizierte Zellen, die an den Tumor angrenzen. Insgesamt, seine guten DiagnoseLeistungen haben es als der Goldstandard für aktive HPV-Infektion Identifizierung betrachtet. Da die virale Proteininteraktion von E6 und E7 mit den Zellproteinen pRb und p53 für die Zelltransformation obligatorisch ist, ist HPV RNA CISH funktionell relevant und reflektiert akut eine aktive onkogene HPV-Infektion. Diese Technik ist auch klinisch relevant, da "niedrige" oder "hohe" HPV-Transkriptionsspiegel zur Identifizierung von zwei Prognosegruppen unter HPV-bezogenen p16-positiven Kopf- und Halskrebspatienten beitrugen. Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV-RNA-CISH vor, das auf formalinfixierten Paraffin-embedded (FFPE)-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird. Anstelle chromogener Offenbarung kann die RNA-In-situ-Hybridisierung auch mit fluoreszierender Offenbarung (RNA FISH) durchgeführt werden. Es kann auch mit konventioneller Immunostainierung kombiniert werden.

Introduction

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HPV RNA CISH ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis einer aktiven HPV-Infektion, die sich bei gutartigen oder bösartigen Läsionen an verschiedenen Orten wie dem Oropharynx oder dem Gebärmutterhals als entscheidend erweisen kann. Der Nachweis einer aktiven HPV-Infektion kann die Diagnose einer HPV-induzierten Läsion unterstützen und dadurch ihre Behandlung und Prognose beeinflussen.

HPV ist die häufigste sexuell übertragbare Infektion, und über 100 virale Genotypen wurden beschrieben1. Schematisch sind genotyparme Genotypen wie die Genotypen 6 und 11 dafür bekannt, Genitalwarzen, rezidivierende Atmungspapillomatose und andere gutartige Läsionen zu induzieren, während Hochrisiko-Genotypen wie die Genotypen 16 und auch 18 für die meisten Gebärmutterhalskrebserkrankungen verantwortlich sind. und Analkrebs und spielen eine Rolle bei der HNSCC-Onkogenese in variablen Anteilen, wie sie in den regionalen epidemiologischen Daten2berücksichtigt werden.

Für den Nachweis von HPV-Infektionen stehen mehrere Tools zur Verfügung. Da eine HPV-Infektion mit hohem Risiko zur Expression der viralen onkogenen Proteine E6 und E73führt, wird der Nachweis von E6- und E7-Transkripten weithin als Goldstandard für die aktive HPV-Infektionsidentifikationangesehen 4. HPV RNA CISH kann an FFPE-Proben durchgeführt werden, die ganz einfach von Patienten mit verschiedenen HPV-bedingten Erkrankungen gewonnen werden können. Seine Leistung wurde bei der plattenepitheliale Neoplasie im Gebärmutterhals, im Anus und in der Vagina sowie bei invasivem Plattenepithelkarzinom im Gebärmutterhals,anus und im oberen aerodigestiven Trakt 5 bewertet: es erreicht eine Empfindlichkeit von über 98% HPV DNA-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-positive Fälle. Dies ist etwas besser als p16 Immunostaining (93%) und HPV-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH: 97%), die häufiger verwendet werden. In einer anderen Kohorte von 57 Patienten mit Plattenepithelkarzinom (SCC) aus dem Kopf- und Nackenbereich, dem Genitalbereich, der Haut und den Harnwegen erreichte HPV RNA CISH eine bessere Empfindlichkeit (100% versus 88%) Spezifität (87% versus 74%)6.

P16 Immunostaining ist ein indirekter Marker, der eine Unterbrechung des Zellzyklus widerspiegelt, die (aber nicht ausschließlich) durch hpV-Infektionen verursacht werden kann4,7. Dieser kostengünstige Test besitzt eine gute Empfindlichkeit und einen negativen Vorhersagewert und wird als Ersatzmarker für eine hochriskante HPV-Infektion bei Oropharynxkrebs (OPC) vom College of American Pathologists (CAP) und von der Union for International empfohlen. Krebsbekämpfung (UICC)8.

Obwohl sich dieses Papier ausschließlich auf den Nachweis von HPV in HNSCC konzentriert, ist HPV RNA CISH klinisch relevant unter verschiedenen anderen Bedingungen, die eine HPV-Infektion beinhalten. Zum Beispiel kann diese Technik die Genauigkeit der Diagnose von niedriggradigen plattenförmigen intraepithelialen Läsionen des Gebärmutterhalses (LSIL, früher bekannt als zervikale intraepitheliale Neoplasie, Grad 1 [CIN1]) für morphologisch mehrdeutige Fälleverbessern 9. In Bezug auf oropharyngeale SCC ermöglicht HPV RNA CISH die Identifizierung von HPV-bezogenem SCC, das in der jüngsten achten Ausgabe der TNM-Klassifikation von Kopf- und Halskrebs (der Union für internationalen Krebs) als von HPV-unabhängigem oropharyngealem SCC bezeichnet wird. Steuerung [UICC])10. Da HPV-bezogenes SCC eine bessere Prognose mit längerem Überleben und verbesserter Strahlentherapie und Chemotherapie-Empfindlichkeit aufweist als HPV-unabhängige SCC11,12,13, kann der Nachweis einer HPV-Infektion Patientenmanagement14,15. Außerdem kann HPV RNA CISH zur Diagnose von HPV-bezogenem multiphänotypischem sinonasatypischem Karzinom mit einem höheren Signal als HPV DNA CISH16verwendet werden. Mehrere multivariate Analysen deuten darauf hin, dass der Nachweis von E6- und E7-Transkripten mit einerbesseren Prognose bei oropharyngealen SCC insgesamt 7,15,17,18 und Untergruppe p16-positiver oropharyngealer SCC19,20.

Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV RNA CISH vor, das auf FFPE-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird.

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Protocol

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Das Protokoll folgt ethischen Richtlinien und wurde vom Ethikausschuss (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04) gebilligt.

1. Herstellung der Materialien

  1. Vorbereitung des 1x Waschpuffers
    1. Bereiten Sie 3 L 1x Waschpuffer vor, indem Sie einem großen Carboy 2,94 l destilliertes Wasser und eine Flasche (60 ml) Waschpuffer (50x) (siehe Materialtabelle)hinzufügen. Gut mischen.
      HINWEIS: Der 1x Waschpuffer kann im Voraus vorbereitet und bei Raumtemperatur bis zu 1 Monat gelagert werden.
  2. Herstellung von Gegenfärbungsreagenzien
    1. 50% Hämatoxylin vorbereiten.
      1. In einer Dunstabzugshaube 100 ml Gills Hämatoxylin I (siehe Materialtabelle)zu 100 ml destilliertem Wasser in einer Färbeschale geben.
        HINWEIS: Die 50% Hämatoxylin-Färbungslösung kann bis zu 1 Woche lang wiederverwendet werden.
    2. 0,02% (w/v) Ammoniakwasser (bluing reagenz) vorbereiten.
    3. In der Dunstabzugshaube 1,43 ml 1 N Ammoniumhydroxid zu 250 ml destilliertem Wasser in einem abgestuften Zylinder oder einem anderen Behälter geben. Versiegeln Sie den Zylinder mit Paraffinfolie. Mischen Sie seinen Inhalt gut für 3x–5x.
      HINWEIS: Für die Assay-Quantifizierung ist es wichtig, Ammoniumhydroxid zu verwenden. Die Reagenzien können im Voraus hergestellt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Container abgedeckt bleiben.
  3. Vorbereitung von 1x Ziel-Retrieval-Reagenz
    1. In einem großen Becherstück 70 ml 10x Zielabrufreagenz (siehe Materialtabelle)zu 630 ml destilliertem Wasser hinzufügen.
    2. Legen Sie das Becherglas mit einem Magnetrührer auf eine Heizplatte. Bedecken Sie es mit Aluminiumfolie.
    3. Den Inhalt bei 100 °C 10–15 min aufkochen.
      HINWEIS: Lassen Sie es nicht mehr als 30 min kochen.
  4. Reagenz-Gleichgewicht
    1. Stellen Sie sicher, dass der Hybridisierungsofen eingeschaltet und bei 40 °C ist. Nassbefeuchtungspapier an der Unterseite des Fachs legen.
      HINWEIS: Für die Schritte 3.4 bis 4.2 wird ein Hybridisierungsofen (siehe Materialtabelle)benötigt.
    2. Entfernen Sie die Amplifikationsreagenzien (AMP1–AMP6, siehe Materialtabelle) aus dem Kühlschrank und halten Sie sie bei Raumtemperatur, mindestens 30 min vor dem entsprechenden Inkubationsschritt.
    3. Vor jedem Gebrauch die Ziel- und/oder Steuersonden mindestens 10 min bei 40 °C im Ofen oder in einem Wasserbad oder Inkubator erwärmen.

2. Haftungsverbesserung und Deparaffinierung in der Dunstabzugshaube

HINWEIS: Starten Sie das Protokoll mit 3–5 m dicken histologischen Proben, die auf unbefleckten Dias montiert sind.

  1. Um die Haftung zu verbessern, backen Sie die Dias bei 60 °C für 1 h oder bei 40 °C über Nacht im Ofen.
  2. Laden Sie das Diagestell mit ungefärbten histologischen Dias auf. Tauchen Sie das Schieberegal für 5 min in frisches Xylol in einer Färbeschale enthalten, mit gelegentlicher Erregung. mit frischem Xylol wiederholen.
  3. Tauchen Sie das Schieberegal für 3 min in frisches 100% Ethanol in einer Färbeschale enthalten, mit ständiger Rührung. Mit frischem 100% Ethanol wiederholen.
  4. Lassen Sie die Dias 2 min bei Raumtemperatur trocknen.
    HINWEIS: Verwenden Sie deparaffinisierungsreagenzien nicht zur Dehydrierung der Dias nach dem Test wieder.

3. Gewebevorbehandlung

HINWEIS: Diese Schritte folgen der "Standard"-Vorbehandlungsempfehlung gemäß den Anweisungen des Herstellers für Kopf- und Nackenproben. Das Timing der Abschnitte 3.1 und 3.2 muss möglicherweise je nach manipuliertem Gewebe angepasst werden.

  1. Blockade der Peroxidase-Aktivität
    1. Fügen Sie jedem Dia 4–6 Tropfen Wasserstoffperoxid (siehe Materialtabelle)hinzu und inkubieren Sie sie 10 min bei Raumtemperatur.
    2. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur.
  2. Bruch von RNA/Gewebegrenzen
    1. Mit einer Kralle die Aluminiumfolie aus dem siedenden1x Ziel-Retrieval-Reagenz (TTR1x) aus Abschnitt 1.3 entfernen und das Rühren abbrechen. Tauchen Sie das Schiebegestell 15 min lang langsam und sehr vorsichtig ein. Bedecken Sie den Becher erneut mit der Aluminiumfolie.
      HINWEIS: Das Simmern muss während dieses Schritts bestehen bleiben.
      VORSICHT: Verwenden Sie die Kralle, um die Aluminiumfolie und das Schiebeträger zu manipulieren, um Brandverletzungen zu vermeiden. Achten Sie darauf, die richtige persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und einen Labormantel zu tragen.
    2. Mit der Kralle das heiße Schieberegal sofort in ein destilliertes Wasserbad geben und 2 min waschen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Proben im TTR1x nicht abkühlen.
    3. Waschen Sie die Rutschen in frischem 100% Ethanol für 2 min.
    4. Lassen Sie die Dias bei Raumtemperatur für 2 min trocknen.
  3. Barriere-Erstellung
    1. Mit einem hydrophoben Barrierestift (siehe Materialtabelle)ziehen Sie eine Barriere um die Probe. Lassen Sie es mindestens 5 min austrocknen.
      HINWEIS: Lassen Sie die Barriere wirklich austrocknen. Wenn es während des Eingriffs abnutzt, zögern Sie nicht, es wieder zu zeichnen. Vermeiden Sie es, das Gewebe mit dem Stift zu berühren. Das Protokoll kann hier über Nacht angehalten werden.
  4. Protease-Verdauung
    1. Legen Sie die Dias auf das Schiebegestell und fügen Sie pro Probe 4 Tropfen Protease Plus hinzu (siehe Materialtabelle).
    2. Bedecken Sie die Feuchtigkeitskontrollwanne mit einem Deckel und legen Sie es 30 min bei 40 °C in den Hybridisierungsofen ein.
      HINWEIS: Um Verdunstung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Drehknopf vollständig in die Verriegelungsposition gedreht ist.
    3. Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen und entfernen Sie das Schiebegestell.
    4. Eine Rutsche nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie die Rutsche in einem Schiebeträger in einer Färbeschale mit destilliertem Wasser gefüllt.
    5. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Rühren Sie ständig.

4. Ausführen des Assays

HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte zwischen den Inkubationsschritten nicht austrocknen.

  1. Hybridisierung der HPV-Sonde
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Sonden vorgewärmt sind, um alle Niederschläge vor der Verwendung aufzulösen. Für diesen Schritt kann anstelle der HPV-Sondeauch Peptidyl-Prolyl-Isomerase B (PPIB) zur Positivkontrolle oder Dihydrodipicolinat-Reduktase (DAPB) zur Negativkontrolle verwendet werden (siehe Materialtabelle).
    1. Tippen und/oder flicken Sie die Dias, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und legen Sie sie in das Schiebeträger. Fügen Sie 4 Tropfen HPV-Sonde hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.
    2. Bedecken Sie das Fach mit einem Deckel und legen Sie es für 2 h bei 40 °Cin den Ofen ein.
      HINWEIS: Um Verdunstung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Dreh-Nob vollständig in die Verriegelungsposition gedreht ist.
    3. Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen und entfernen Sie das Schiebegestell.
    4. Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie die Rutsche in einem Schiebeträger in einer Färbeschale mit 1x Waschpuffer gefüllt.
    5. Waschen Sie die Dias in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung. Wiederholen Sie dies mit einem frischen 1x Waschpuffer.
  2. Hybridisierung von AMP1, AMP2, AMP3 und AMP4
    HINWEIS: Zu diesen Schritten gehören die Hybridisierung im Hybridisierungsofen und AMP1-AMP4 aus dem gekauften Kit (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Tippen und/oder flicken, um überschüssige Flüssigkeit aus den Dias zu entfernen und in das Schiebegestell zu legen. Fügen Sie 4 Tropfen AMP1 hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.
    2. Bedecken Sie das Fach mit einem Deckel und legen Sie es 30 min bei 40 °Cin den Ofen.
    3. Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen und entfernen Sie das Schiebegestell.
    4. Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie die Rutsche in einem Schiebeträger in einer Färbeschale mit 1x Waschpuffer gefüllt.
    5. Waschen Sie die Dias in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung. Wiederholen Sie dies mit einem frischen 1x Waschpuffer.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1–4.2.5, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP2 anstelle von AMP1 und brüten Sie 15 min bei 40 °C. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1–4.2.5, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP3 anstelle von AMP1 und brüten Sie 30 min bei 40 °C. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1–4.2.5, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP4 anstelle von AMP1 und brüten Sie 15 min bei 40 °C. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.
  3. Hybridisierung von AMP5 und AMP6
    HINWEIS: Diese Schritte beinhalten keine Hybridisierung im Ofen, sondern Hybridisierung bei Raumtemperatur. AMP5 und AMP6 stammen aus dem gekauften Kit (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Tippen und/oder flicken Sie die Dias, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und legen Sie sie in das Schiebeträger. Fügen Sie 4 Tropfen AMP5 hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.
    2. Bedecken Sie das Tablett mit einem Deckel und brüten Sie für 30 min bei Raumtemperatur.
    3. Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und legen Sie es in einem Schieberegal in einer Färbeschale mit 1x Waschpuffer gefüllt.
    4. Waschen Sie die Dias in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung. Wiederholen Sie dies mit einem frischen 1x Waschpuffer.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.4, aber verwenden Sie 4 Tropfen AMP6 anstelle von AMP5 und brüten Sie 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Dias 2x für 2 min, beide Male in frischem Waschpuffer.

5. Signaldetektion mit 3,3'-Diaminobenzidin

VORSICHT: Diaminobenzidin (DAB) ist giftig. Befolgen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheitsrichtlinien bei der Entsorgung und Handhabung dieser Chemikalie.

  1. Mischen Sie gleiche Volumina von DAB-A und DAB-B (siehe Materialtabelle) in einem Rohr in angemessener Größe, indem Sie die gleiche Anzahl von Tropfen jeder Lösung austeilen. Machen Sie pro Abschnitt 120 L DAB-Substrat (2 Tropfen pro Reagenz/Gesamtmenge von 4). Mischen Sie es gut für 3x–5x.
  2. Nehmen Sie jede Folie nacheinander aus dem Schiebeträger und tippen sie und/oder flicken Sie, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, bevor Sie sie in das Schiebeträger legen.
  3. Pipette 120 L DAB auf jeden Gewebeabschnitt. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte abgedeckt sind, und brüten Sie für 10 min bei Raumtemperatur.
  4. Entsorgen Sie den verbleibenden DAB gemäß der örtlichen Regelung und legen Sie die Rutsche in ein Schieberegal ein, das in eine mit Leitungswasser gefüllte Färbeschale getaucht ist.

6. Gegenfärbung

  1. Bewegen Sie das Schiebegestell in eine Färbeschale mit 50% Hämatoxylin-Färbungslösung und lassen Sie es 30 s bei Raumtemperatur ruhen. Beachten Sie, dass die Folien violett werden.
  2. Übertragen Sie das Schieberegal sofort zurück auf eine Färbeschale mit Leitungswasser und waschen Sie die Dias 3x–5x, indem Sie das Rack nach oben und unten bewegen.
  3. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem Leitungswasser, bis die Rutschen frei sind, während die Abschnitte violett bleiben.
  4. Ersetzen Sie das Leitungswasser in der Färbeschale durch 0,02% Ammoniakwasser. Bewegen Sie das Rack 2x–3x nach oben und unten. Beachten Sie, dass der Gewebeabschnitt blau werden sollte.
  5. Ersetzen Sie das Ammoniakwasser durch Leitungswasser. Waschen Sie die Dias 3x–5x.

7. Dehydrierung

  1. Bewegen Sie das Schiebegestell in eine Färbeschale mit 70% Ethanol in der Dunstabzugshaube und lassen Sie es 2 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.
  2. Bewegen Sie das Schiebegestell zu einer ersten Färbeschale, die 100% Ethanol enthält, und lassen Sie es 2 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.
  3. Bewegen Sie das Schiebegestell in eine zweite Färbeschale mit 100% Ethanol und lassen Sie es 2 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.
  4. Bewegen Sie das Schiebegestell in eine Färbeschale, die Xylol enthält, und lassen Sie es 5 min bei gelegentlicher Rührung ruhen.

8. Schiebemontage

  1. Entfernen Sie die Dias aus dem Schiebeträger und legen Sie sie flach mit den Abschnitten nach oben in der Dunstabzugshaube.
  2. Montieren Sie jeweils einen Schlitten nach dem anderen, indem Sie jedem Schieberegler 1 Tropfen eines Xylol-basierten Montagemediums hinzufügen und einen 24 mm x 50 mm Abdeckungsslip sorgfältig über den Querschnitt legen. Vermeiden Sie es, Luftblasen einzufangen.
  3. Die Rutschen werden für 5 min lufttrocknend.

9. Stichprobenbewertung

  1. Untersuchen Sie die Gewebeabschnitte unter einem Standard-Hellfeldmikroskop mit 20x-40-facher Vergrößerung.

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Representative Results

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Wie hier beschrieben, kann bei Kopf- und Halsplattenzellkrebs ein Fall in Gegenwart von brauner punktiformer Färbung im Zytoplasma oder in den Kernen von Tumorzellen als positiv betrachtet werden. In den meisten Studien wird das Signal entweder als "positiv" oder "nicht erkannt"14betrachtet. Es wurden Methoden zur Semiquantifizierung des Signals berichtet, aber es fehlt die Standardisierung zwischen den Teams. Zum Beispiel wurden die Signale in einigen Studien mit 1+ mit 1–3 Punkten pro Tumorzelle, 2+ mit 4–9 Punkten pro Tumorzelle oder 3+ mit 10 Punkten oder mehr pro Tumorzelle6bewertet; Bei Post-hoc-Analysen wurden nur 2+ und 3+ Signale berücksichtigt, die leichter zu interpretieren waren. In einer anderen Studie wurden die Ergebnisse in zwei Punkte unterteilt: RNA CISH "high" und RNA CISH "low". Der "hohe" RNA-CISH-Score wurde durch mehr als 50 % der gefärbten Krebszellen oder durch Färbung definiert, die mehr als 80 % der Zelloberfläche (Kern und Zytoplasma) in mindestens 30 % der Krebszellen bedeckte, wie mit einem 20-fachen Objektiv beobachtet wurde (Abbildung 1)21.

In Bezug auf positive Kontrollen sollte das PPIB-Signal als Punktpunkt innerhalb von Zellkernen bei 20x-40-facher Vergrößerung sichtbar sein. Was Negative Kontrollschlitten betrifft, ist ein Punkt zu allen 10 Zellen akzeptabel, der die DAB-Hintergrundfärbung pro 20-fachem Mikroskopfeld anzeigt.

Figure 1
Abbildung 1: Beispiele für "niedrige" und "hohe" RNA-CISH-Färbung. (A und B) RNA CISH "low" Score Färbung bei oropharyngealen Plattenepithelkarzinome. Färbung wird in weniger als 50% der Tumorzellen beobachtet und bedeckt weniger als 80% der Zelloberfläche. (C und D) RNA CISH "high" Score Färbung bei oropharyngealen Plattenepithelkarzinome. Färbung wird in mehr als 50% der Tumorzellen beobachtet und in diesem Fall überschreitet die Färbefläche 80% in mehr als 30% der Tumorzellen. Diese Zahl wurde von Augustin et al.21geändert.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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HPV RNA CISH, das mit einem gekauften Kit durchgeführt wird, ist ein leistungsstarkes Werkzeug für den Nachweis viraler Transkripte und weist auf eine aktive HPV-Infektion hin. Manuell ausgeführt, sind die Schritte des Protokolls insgesamt einfach zu befolgen, und das gekaufte Kit ist bequem. Diese Technik ermöglicht die Färbung von 19 histologischen Proben plus einem Steuerschlitten auf einmal, und der Test dauert etwa 8 h. Es ist wichtig, die Proben nicht zwischen den Stufen austrocknen zu lassen, sofern nicht anders angegeben. Die Vorbehandlungsbedingung muss möglicherweise je nach manipuliertem Gewebe angepasst werden.

Das HPV E6-E7 mRNA-Expressionssignal wird mit einer präzisen räumlichen Auflösung erkannt, wodurch eine Kontamination durch HPV-infizierte nichtneoplastische Zellen, die an den Tumor angrenzen, ausgeschlossen wird. Der Nachweis von HPV E6 und E7 RNA ist funktionell relevant, da diese Transkripte für die HPV-induzierte Zelltransformation durch ihre Interaktion mit den zellulären p53- und pRb-Proteinen4benötigt werden. Daher kann HPV RNA CISH bei präkanzerösen Läsionen des Gebärmutterhalses helfen, niedriggradige intraepitheliale Läsionen (LSIL) von hochgradigen intraepithelialen Läsionen (HSIL) gemäß der Lokalisation des Signals zu unterscheiden: in den meisten Fällen von LSIL, reichlich diffus gefärbte Kerne werden in der gesamten Epitheldicke beschriftet, was auf eine produktive Phase hindeutet. HSIL zeigen entweder reichlich diffus gefärbte Zellkerne in der oberflächlichen Schicht, die mit starken kernadischen und zytoplasmatischen Punktionssignalen in der unteren Schicht (in Läsionen, die früher als CIN2 bekannt waren) koexistierend oder starke Kernfärbungen mit zytoplasmatischen Punkten aufweisen. während der gesamten Dicke des Epithels, was auf die transformative Phase der HPV-Infektion hindeutet (in Läsionen, die früher als CIN3 bekannt waren)22.

Obwohl es noch keine Standardempfehlung für die semiquantitative Bewertung des Signals gibt, berichten einige Autoren von einer klinischen Relevanz, da die semiquantitative Auswertung von HPV E6- und E7-Transkripten die Identifizierung von zwei prognostischen HPV-bezogenen HNSCC-Patienten21. Es wurde postuliert, dass der Nachweis von HPV-DNA ohne E6- und E7-Transkripte oder mit nur geringen Konzentrationen von E6- und E7-Transkripten funktionell irrelevant wäre und dass solche Patienten mit HPV-negativen Krebspatienten gebündelt werden sollten21, 23.

In Bezug auf die Einschränkungen dieses Verfahrens wird postuliert, dass in einigen Fällen einige unspezifische Kreuzhybridisierungen auftreten können, wie von Dreyer et al.23 RNA CISH vermutet, möglicherweise nicht für die Diskriminierung zwischen E6/E7 RNA-Transkripten und viralen DNA, da das Protokoll einen 100 °C-Wärmebehandlungsschritt enthält, der im Verdacht steht, eine virale DNA-Denaturierung zu ermöglichen23. Dies wird durch die Beobachtung von zwei Arten von Signalen in positiven Fällen unterstützt, nämlich starke Färbung, die hauptsächlich in Tumorzellkernen lokalisiert ist, sowie ein feines granulates Signal im Zytoplasma. Da die in diesem Protokoll verwendete Sonde speziell die HPV-Genotypen 16 und 18 bindet, die an einer überwiegenden Mehrheit der HPV-bezogenen HNSCC4beteiligt sind, können gelegentliche HPV-assoziierte Fälle von RNA CISH übersehen werden, entweder aufgrund bestimmter HPV-Genotypen, die nicht oder aufgrund von Mutationen oder Löschungen von Primerbindungsstellen. Schließlich erfordert diese Methode kostspielige Reagenzien und Geräte und ist in der Routinepraxis nicht leicht zugänglich.

Für jede Probe werden insgesamt drei Abschnitte benötigt: einer für die HPV-Assay, einer für die Positivkontrolle und einer für die Negativkontrolle. Da RNA ein zerbrechliches Molekül ist und sich im Laufe der Zeit in FFPE-Proben verschlechtern könnte, muss die Qualität der Transkripte für jede Probe überprüft werden, mit Positivenkontrollsonden wie PPIB, DNA-gerichteter RNA-Polymerase-II-Untereinheit RPB1 (Polr2a) oder Polyubiquitin-C (UBC) , die menschliche Haushaltsgene sind. Darüber hinaus muss das Signal bei einem semiquantitativen Ansatz normalisiert werden, um die Haushaltsgenkontrollsonde21zu erhalten. Die empfohlene Positivkontrolle für jedes Gewebe kann in den Anweisungen des Herstellers gefunden werden. Eine aktuelle Studie bestätigt jedoch, dass die mRNA-Expression sowohl in prospektiven als auch in retrospektiven Proben robust untersucht werden kann, was vergleichbare mRNA-Werte zwischen Proben aus dem Jahr 2004 und 2008 zeigt. Dies spricht für die relative Integrität von mRNA im Laufe der Zeit24. Die empfohlene Negativkontrollsonde zur Vermeidung unspezifischer Färbung ist die bakterielle Genkodierung für DAPB.

Hier wird die chromogene In-situ-Hybridisierung von HPV-RNA als manuell durchgeführt beschrieben. Diese Technik kann auch mit fluoreszierender Etikettierung und/oder in Kombination mit konventioneller Immunostainierung durchgeführt werden.

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Disclosures

CB: Boards, Seminare: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche

Acknowledgments

Die Autoren danken der Abteilung für Pathologie von Hopital Européen Georges Pompidou und Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel und Giséle Legall); die Histologie-Plattform von PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark für Sprachbearbeitung; Alexandra Elbakyan für ihren Beitrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5, (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24, (3), 505-507 (2018).
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Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose
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Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).More

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