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Genetics

क्रोमोजेनिक में सीटू हाइब्रिडाइजेशन एचपीवी से संबंधित सिर और गर्दन कैंसर निदान के लिए एक उपकरण एस

doi: 10.3791/59422 Published: June 14, 2019

Summary

मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) आरएनए क्रोमोजेनिक सीटू संकरीकरण में ट्यूमर के भीतर सक्रिय मानव पेपिलोमावायरस संक्रमण का पता लगाने के लिए सोने के मानकों में से एक माना जाता है। यह स्थानीयकरण और अपने संकेत के अर्द्धमात्रागत मूल्यांकन के साथ एचपीवी E6-E7 MRNA अभिव्यक्ति के दृश्य की अनुमति देता है.

Abstract

मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण ओरोफैरिनियल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ओपीएससी) के उपप्रकार के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है, जो शराब और तंबाकू से संबंधित OPSCC की तुलना में बेहतर परिणाम के साथ जुड़ा हुआ हो जाता है। एचपीवी वायरल आरएनए के सिटू हाइब्रिडाइजेशन (सीएसएच) में क्रोमोजेनिक ऑनकोजेनिक प्रोटीन E6 और E7 के वायरल टेप के अर्द्धमात्रात्मक मूल्यांकन और एक अच्छा स्थानिक संकल्प के साथ एक इनसीटू दृश्य की अनुमति दे सकता है। इस तकनीक ट्यूमरएचपी-संक्रमित कोशिकाओं में एचपीवी प्रतिलेखन के दृश्य के साथ एक सक्रिय संक्रमण के निदान की अनुमति देता है। इस तकनीक का एक लाभ ट्यूमर के निकट nonneoplastic एचपीवी संक्रमित कोशिकाओं से संदूषण से बचने है। कुल मिलाकर, अपने अच्छे निदान प्रदर्शन यह सक्रिय एचपीवी संक्रमण पहचान के लिए सोने के मानक माना जाता है. चूंकि सेल प्रोटीन pRb और p53 के साथ E6 और E7 वायरल प्रोटीन बातचीत सेल परिवर्तन के लिए अनिवार्य है, एचपीवी आरएनए सीआईएच कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक है और तीव्रता से सक्रिय oncogenic एचपीवी संक्रमण को दर्शाता है। इस तकनीक के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक रूप से प्रासंगिक है के बाद से "कम" या "उच्च" एचपीवी प्रतिलेखन के स्तर एचपीवी से संबंधित p16-सकारात्मक सिर और गर्दन के कैंसर के रोगियों के बीच दो रोग का रोग का पता चलता है समूहों की पहचान में मदद की. यहाँ हम मैनुअल एचपीवी आरएनए CISH के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत formalin-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) स्लाइड पर निर्माता से प्राप्त एक किट के साथ प्रदर्शन किया. क्रोमोजेनिक रहस्योद्घाटन के बजाय, situ संकरीकरण में आरएनए भी फ्लोरोसेंट रहस्योद्घाटन (RNA FISH) के साथ किया जा सकता है। यह भी पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है।

Introduction

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एचपीवी आरएनए सीएसएच सक्रिय एचपीवी संक्रमण का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो ओरोफैरिनक्स या गर्भाशय ग्रीवा जैसे विभिन्न स्थानों में सौम्य या घातक घावों में महत्वपूर्ण साबित हो सकता है। एक सक्रिय एचपीवी संक्रमण का पता लगाने से एचपीवी प्रेरित घाव के निदान का समर्थन हो सकता है और, जिससे, इसके उपचार और पूर्वानुमान को प्रभावित करते हैं।

एचपीवी सबसे अक्सर यौन संचारित संक्रमण है, और 100 से अधिक वायरल जीनोटाइप का वर्णन किया गया है1. Schematicly, कम जोखिम वाले जीनोटाइप जैसे जीनोटाइप 6 और 11 जननांग मौसा, आवर्तक श्वसन पेपिलोमैटोसिस, और अन्य सौम्य घावों को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, जबकि उच्च जोखिम वाले जीनोटाइप जैसे जीनोटाइप 16 और भी 18 अधिकांश गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के लिए जिम्मेदार हैं और गुदा कैंसर और क्षेत्रीय महामारी विज्ञान के आंकड़ों2के कारण के रूप में चर अनुपात में hnSCC oncogenesis में एक भूमिका निभाते हैं .

कई उपकरण एचपीवी संक्रमण का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं। एक उच्च जोखिम एचपीवी संक्रमण के रूप में वायरल oncogenic प्रोटीन E6 और E73की अभिव्यक्ति की ओर जाता है , E6 और E7 प्रतिलिपि का पता लगाने व्यापक रूप से सक्रिय एचपीवी संक्रमण पहचान4के लिए सोने के मानक के रूप में देखा जाता है . एचपीवी आरएनए सीएसएच एफएफई नमूनों पर किया जा सकता है जो विभिन्न एचपीवी से संबंधित बीमारियों से पीड़ित रोगियों से आसानी से प्राप्त किए जाते हैं। इसके प्रदर्शन गर्भाशय ग्रीवा में स्क्वैमस इंट्राएपिथील नियोप्लासिया में मूल्यांकन किया गया है, गुदा, और योनि, और गर्भाशय ग्रीवा में आक्रामक स्क्वैमससेल कार्सिनोमा में, गुदा, और ऊपरी एयरो पाचन पथ 5: यह 98% से अधिक की संवेदनशीलता को प्राप्त करता है एचपीवी डीएनए पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)-सकारात्मक मामलों के बीच। यह p16 इम्यूनोस्टेनिंग (93%) की तुलना में थोड़ा बेहतर है और situ संकरीकरण में एचपीवी डीएनए (डीएनए ISH: 97%), जो अधिक सामान्यतः उपयोग किया जाता है. सिर और गर्दन क्षेत्र से उत्पन्न होने वाले स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) के साथ 57 रोगियों के एक अन्य सहगण में, जननांग क्षेत्र, त्वचा, और मूत्र पथ, एचपीवी डीएनए ISH की तुलना में, एचपीवी आरएनए सीएसएच ने बेहतर संवेदनशीलता हासिल की (100% बनाम 88%) और विशिष्टता (87% बनाम 74%)6|

P16 इम्यूनोस्टेनिंग एक अप्रत्यक्ष मार्कर है जो कोशिका चक्र व्यवधान को दर्शाती है जो एचपीवी संक्रमण4,7द्वारा (लेकिन विशेष रूप से नहीं) के कारण हो सकता है । इस लागत प्रभावी परीक्षण अच्छी संवेदनशीलता और एक नकारात्मक भविष्य कहनेवाला मूल्य के पास है और oropharynx कैंसर में उच्च जोखिम एचपीवी संक्रमण के एक किराए मार्कर के रूप में सिफारिश की है (OPC) अमेरिकी पैथोलॉजिस्ट के कॉलेज द्वारा (कैप) और अंतरराष्ट्रीय के लिए संघ द्वारा कैंसर नियंत्रण (UICC)8|

हालांकि यह पत्र पूरी तरह से एचएनएससीसी में एचपीवी का पता लगाने पर केंद्रित है, एचपीवी आरएनए सीआईएच विभिन्न अन्य स्थितियों में नैदानिक रूप से प्रासंगिक है जिसमें एचपीवी संक्रमण शामिल है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक गर्भाशय ग्रीवा के कम ग्रेड स्क्वैमस इंट्राएपिथेलियल घावों के निदान की सटीकता में सुधार हो सकता है (LSIL, पूर्व में गर्भाशय ग्रीवा intraepithelial neoplasia के रूप में जाना जाता है, ग्रेड 1 [CIN1]) रूपात्मक अस्पष्ट मामलों के लिए9. ओरोफैरिनल एससीसी के बारे में, एचपीवी आरएनए सीएसी एच पी वी से संबंधित एससीसी की पहचान की अनुमति देता है, जो हेड और नेक कैंसर के टीएनएम वर्गीकरण के हाल के आठवें संस्करण में एचपीवी-असंबंधित ओरोफैरिनल एससीसी से अलग के रूप में लेबल किया गया है (अंतर्राष्ट्रीय कैंसर के लिए संघ की) नियंत्रण [UICC])10| चूंकि एचपीवी से संबंधित एससीसी एचपीवी से अधिक जीवित रहने और उन्नत रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी संवेदनशीलता के साथ एक बेहतर पूर्वानुमान दर्शाती है, क्योंकि एचपीवी-असंबंधित एससीसी11,12,13, एचपीवी संक्रमण का पता लगाने से प्रभाव पड़ सकता है रोगी प्रबंधन14,15. इसके अलावा, एचपीवी आरएनए सीएसएच का उपयोग एचपीवी से संबंधित मल्टीफेनोटाइपिक साइनोसनल कार्सिनोमा के निदान के लिए किया जा सकता है जिसमें एचपीवी डीएनए सीएच16की तुलना में उच्च संकेत है। कई बहुचर विश्लेषण सुझाव है कि E6 और E7 प्रतिलिपि का पता लगाने oropharyngal एससीसी समग्र7,15,17,18 में एक बेहतर पूर्वानुमान के साथ सहसंबद्ध है और p16-सकारात्मक ओरोफैरिन्गियल एससीसी19,20का उपसमूह।

यहाँ हम मैनुअल HPV आरएनए CISH के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत FFPE स्लाइड पर एक किट निर्माता से प्राप्त के साथ प्रदर्शन किया.

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Protocol

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प्रोटोकॉल नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करता है और नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (Comit]-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. सामग्री की तैयारी

  1. 1x धोने बफर की तैयारी
    1. आसुत जल के 2ण्94 ल और एक बोतल (60 एमएल) वॉश बफर (50x) (सामग्री की तालिकादेखें) को एक बड़े कारबॉय में जोड़कर 1x वॉश बफर का 3 ल तैयार कीजिए। अच्छी तरह मिला लें।
      नोट: 1x धोने बफर समय से पहले तैयार किया जा सकता है और अप करने के लिए 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत.
  2. अभिकर्मकों का मुकाबला करने की तैयारी
    1. 50% हेमेटॉक्सिलिन तैयार करें।
      1. एक धूआं हुड में, गिल के hematoxylin मैं (सामग्री की मेजदेखें) एक धुंधला पकवान में आसुत पानी के 100 एमएल करने के लिए 100 एमएल जोड़ें.
        नोट: 50% hematoxylin धुंधला समाधान अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है.
    2. 0.02% (w/v) अमोनिया पानी (ब्लिंग अभिकर्मक) तैयार करें।
    3. धूआं हुड में, एक स्नातक सिलेंडर या किसी अन्य कंटेनर में आसुत जल के 250 एमएल में 1 एन अमोनियम हाइड्रॉक्साइड का 1.43 एमएल मिलाएं। पैराफिन फिल्म के साथ सिलेंडर सील. इसकी सामग्री को 3x-5x के लिए अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: परख परिमाणकेता के लिए अमोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। अभिकर्मकों को समय से पहले तैयार किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि सभी कंटेनर कवर रहें।
  3. 1x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति अभिकर्मक की तैयारी
    1. एक बड़े बीकर में, आसुत जल के 630 एमएल में 10x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति अभिकर्मक के 70 एमएल जोड़ें (सामग्री की सारणीदेखें)।
    2. बीकर को चुंबकीय उत्तेजक के साथ हीटिंग प्लेट पर रखें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर.
    3. इसकी सामग्री को 10-15 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।
      नोट: यह 30 मिनट से अधिक के लिए फोड़ा मत करो.
  4. अभिकर्मक साम्य
    1. सुनिश्चित करें कि संकरीकरण ओवन पर और 40 डिग्री सेल्सियस पर है। ट्रे के नीचे गीला humidifying कागज रखें.
      नोट: एक संकरीकरण ओवन (सामग्री की तालिकादेखें) कदम 3.4 से 4.2 के लिए आवश्यक है.
    2. प्रवर्धन अभिकर्मकों निकालें (AMP1-AMP6, सामग्री की तालिकादेखें) रेफ्रिजरेटर से और उन्हें कमरे के तापमान पर रखने के लिए, प्रासंगिक ऊष्मायन कदम से पहले कम से कम 30 मिनट.
    3. प्रत्येक उपयोग से पहले, ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर या पानी के स्नान या इनक्यूबेटर में कम से कम 10 मिनट के लिए लक्ष्य और/या नियंत्रण जांच को गर्म करें।

2. धुएं के हुड में आडंशन बढ़ाने और deparaffinization

नोट: प्रोटोकॉल 3-5 m-थिक हिस्टोलॉजिकल नमूनों के साथ प्रारंभ करें जो बिना दाग वाली स्लाइडपर्वित किया गया है.

  1. आसंजन को बढ़ाने के लिए, स्लाइड को 1 एच के लिए 60 डिग्री सेल्सियस या ओवन में रात में 40 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना।
  2. बिना दाग वाले हिस्टोलॉजिकल स्लाइडों के साथ स्लाइड रैक को चार्ज करें। कभी कभी आंदोलन के साथ, एक धुंधला पकवान में निहित ताजा xylene में 5 मिनट के लिए स्लाइड रैक विसर्जित कर दिया। ताजा xylene के साथ दोहराएँ.
  3. लगातार आंदोलन के साथ, एक धुंधला पकवान में निहित ताजा 100% इथेनॉल में 3 मिनट के लिए स्लाइड रैक विसर्जित कर दिया। ताजा 100% इथेनॉल के साथ दोहराएँ.
  4. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए स्लाइड सूखी करते हैं।
    नोट: परख के बाद स्लाइड के निर्जलीकरण के लिए deparaffinization अभिकर्मकों का पुन: उपयोग न करें।

3. ऊतक pretreatment

नोट: इन चरणों का पालन करें "मानक" pretreatment सिफारिश सिर और गर्दन के नमूने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार. अनुभाग 3.1 और 3.2 के समय हेरफेर ऊतक के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.

  1. peroxidase गतिविधि की नाकाबंदी
    1. प्रत्येक स्लाइड में हाइड्रोजन पेरोक्साइड की 4-6 बूँदें जोड़ें (सामग्री की सारणीदेखें) और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए उन्हें इनक्यूबेट करें।
    2. कमरे के तापमान पर आसुत पानी में 2 मिनट के लिए स्लाइड 2x धो लें।
  2. आरएनए/ऊतक सीमा का टूटना
    1. एक पंजा के साथ, उबलते 1x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति अभिकर्मक (TTR1x) से अनुभाग 1.3 से एल्यूमीनियम पन्नी को हटा दें और हलचल बंद करो. स्लाइड रैक को धीरे-धीरे और बहुत ध्यान से 15 मिनट के लिए विसर्जित कर दिया। बीकर को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ फिर से कवर करें।
      नोट: इस चरण के दौरान जारी रखने के लिए simmering है।
      चेतावनी: पंजा का उपयोग करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी और स्लाइड रैक हेरफेर इतनी के रूप में जला चोटों से बचने के लिए. उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनने के लिए सुनिश्चित करें, इस तरह के दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट के रूप में.
    2. पंजा के साथ, तुरंत एक आसुत पानी स्नान करने के लिए गर्म स्लाइड रैक हस्तांतरण और 2 मिनट के लिए इसे धो लें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि नमूने TTR1x में शांत नहीं है.
    3. 2 मिनट के लिए ताजा 100% इथेनॉल में स्लाइड धो लें।
    4. स्लाइड 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखी करते हैं।
  3. बैरियर निर्माण
    1. एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ (सामग्री की तालिकादेखें), नमूना के चारों ओर एक बाधा आकर्षित. इसे कम से कम 5 मिनट के लिए सूखने दें।
      नोट: वास्तव में बाहर सूखी करने के लिए बाधा की अनुमति दें. यदि यह प्रक्रिया के दौरान बाहर पहनता है, इसे फिर से आकर्षित करने में संकोच नहीं करते। कलम के साथ ऊतक को छूने से बचें। प्रोटोकॉल रात भर यहाँ रोका जा सकता है.
  4. प्रोटीज़ पाचन
    1. स्लाइड रैक पर स्लाइड प्लेस और प्रति नमूना Protease प्लस के $ 4 बूँदें जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें).
    2. आर्द्रता नियंत्रण ट्रे को ढक्कन से ढकदें और इसे 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हाइब्रिडेशन ओवन में डालें।
      नोट: वाष्पीकरण को रोकने के लिए, बारी घुंडी पूरी तरह से ताला स्थिति के लिए बदल गया है सुनिश्चित करें.
    3. ओवन से ट्रे निकालें और स्लाइड रैक निकालें।
    4. एक समय में एक स्लाइड, जल्दी से किसी भी अतिरिक्त तरल को हटाने और आसुत पानी से भरा एक धुंधला पकवान में जलमग्न स्लाइड रैक में स्लाइड जगह है।
    5. कमरे के तापमान पर आसुत पानी में 2 मिनट के लिए स्लाइड 2x धो लें। लगातार आंदोलन करें।

4. परख चल रहा है

नोट: वर्गों ऊष्मायन चरणों के बीच बाहर सूखी मत देना।

  1. एचपीवी जांच का हाइब्रिडीकरण
    नोट: सुनिश्चित करें कि जांच का उपयोग करने से पहले किसी भी वर्षा भंग करने के लिए prewarmed हैं। इस कदम के लिए, एचपीवी जांचके बजाय, सकारात्मक नियंत्रण के लिए पेप्टिडिल-प्रोलील आइसोमेरेज़ बी (पीपीआईबी) या नकारात्मक नियंत्रण के लिए डाइहाइड्रोडिपिकोनेट रिडक्टेज (डीएपीपी) (सामग्री की तालिकादेखें) का भी उपयोग किया जा सकता है।
    1. किसी भी अतिरिक्त तरल को हटाने और उन्हें स्लाइड रैक में रखने के लिए स्लाइड को टैप करें और/ पूरी तरह से प्रत्येक अनुभाग को कवर करने के लिए एचपीवी जांच के $ 4 बूँदें जोड़ें।
    2. ट्रे को ढक्कन से ढककर 40 डिग्री सेल्सियसपर 2 ज के लिए ओवन में डालें .
      नोट: वाष्पीकरण को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि बारी nob पूरी तरह से ताला स्थिति में बदल गया है।
    3. ओवन से ट्रे निकालें और स्लाइड रैक निकालें।
    4. एक समय में एक स्लाइड, जल्दी से किसी भी अतिरिक्त तरल को हटाने और 1x धोने बफर से भरा एक धुंधला पकवान में जलमग्न स्लाइड रैक में स्लाइड जगह है।
    5. लगातार आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1x धोने बफर में स्लाइड धो लें। ताजा 1x धोने बफर के साथ इस दोहराएँ.
  2. AMP1, AMP2, AMP3, और AMP4 के हाइब्रिडीकरण
    नोट: इन चरणों में हाइब्रिडेशन ओवन और खरीदे गए किट से AMP1-AMP4 में संकरण शामिल हैं (सामग्री की तालिकादेखें)।
    1. स्लाइड से किसी भी अतिरिक्त तरल को हटाने और उन्हें स्लाइड रैक में रखने के लिए टैप करें और/ पूरी तरह से प्रत्येक अनुभाग को कवर करने के लिए AMP1 की $ 4 बूँदें जोड़ें.
    2. ट्रे को ढक्कन से ढककर 40 डिग्री सेल्सियसपर 30 मिनट के लिए ओवन में डालें .
    3. ओवन से ट्रे निकालें और स्लाइड रैक निकालें।
    4. एक समय में एक स्लाइड, जल्दी से किसी भी अतिरिक्त तरल को हटाने और 1x धोने बफर से भरा एक धुंधला पकवान में जलमग्न स्लाइड रैक में स्लाइड जगह है।
    5. लगातार आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1x धोने बफर में स्लाइड धो लें। ताजा 1x धोने बफर के साथ इस दोहराएँ.
    6. 4.2.1-4.2.5 चरणों को दोहराएँ, लेकिन AMP1 के बजाय AMP2 की 4 बूँदें और 40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट का उपयोग करें. 2 मिनट के लिए स्लाइड 2x धो लें, ताजा धोने बफर में दोनों बार.
    7. 4.2.1-4.2.5 चरणों को दोहराएँ, लेकिन AMP1 के बजाय AMP3 की 4 बूँदें और 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट का उपयोग करें. 2 मिनट के लिए स्लाइड 2x धो लें, ताजा धोने बफर में दोनों बार.
    8. 4.2.1-4.2.5 चरणों को दोहराएँ, लेकिन AMP1 के बजाय AMP4 की 4 बूँदें और 40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट का उपयोग करें. 2 मिनट के लिए स्लाइड 2x धो लें, ताजा धोने बफर में दोनों बार.
  3. AMP5 और AMP6 के हाइब्रिडाइजेशन
    नोट: इन चरणों ओवन में संकरलेकिना लेकिन कमरे के तापमान पर संकरीकरण शामिल नहीं है। AMP5 और AMP6 खरीदा किट से आते हैं (सामग्री की मेजदेखें).
    1. किसी भी अतिरिक्त तरल को हटाने और उन्हें स्लाइड रैक में रखने के लिए स्लाइड को टैप करें और/ पूरी तरह से प्रत्येक अनुभाग को कवर करने के लिए AMP5 की $ 4 बूँदें जोड़ें.
    2. ट्रे को ढक्कन से ढककर कमरे के तापमानपर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें .
    3. एक समय में एक स्लाइड, जल्दी से किसी भी अतिरिक्त तरल को हटाने और 1x धोने बफर से भरा एक धुंधला पकवान में जलमग्न एक स्लाइड रैक में जगह है।
    4. लगातार आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1x धोने बफर में स्लाइड धो लें। ताजा 1x धोने बफर के साथ इस दोहराएँ.
    5. 4.3.1-4.3.4 चरणों को दोहराएँ, लेकिन कमरे के तापमान पर AMP5 और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट के बजाय AMP6 की 4 बूँदें का उपयोग करें. 2 मिनट के लिए स्लाइड 2x धो लें, ताजा धोने बफर में दोनों बार.

5. 3,3'-diaminobenzidine के साथ सिग्नल का पता लगाने

चेतावनी: Diaminobenzidine (DAB) विषाक्त है. इस रसायन का निपटान और उसे संभालने के दौरान उचित सावधानियों और सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें।

  1. प्रत्येक विलयन की बूंदों की समान संख्या का वितरण करके एक उचित आकार की ट्यूब में DAB-A और DAB-B (सामग्री की सारणीदेखें) के बराबर खंडों को मिलाएं। प्रति अनुभाग DAB सब्सट्रेट के $120 $L बनाओ (प्रत्येक अभिकर्मक की $2 बूँदें / इसे 3x-5x के लिए अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. प्रत्येक स्लाइड ले लो, एक समय में एक, स्लाइड रैक से और नल और /
  3. प्रत्येक ऊतक अनुभाग पर DAB के Pipette $120 $L. सुनिश्चित करें कि वर्गों को कवर किया जाता है, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. स्थानीय विनियमन के अनुसार शेष DAB निपटान और नल के पानी से भरा एक धुंधला पकवान में डूब स्लाइड रैक में स्लाइड डालें।

6. काउंटरस्टेनिंग

  1. 50% hematoxylin धुंधला समाधान युक्त एक धुंधला पकवान के लिए स्लाइड रैक ले जाएँ यह कमरे के तापमान पर 30 s के लिए आराम करते हैं. ध्यान दें कि स्लाइड बैंगनी हो जाएगा.
  2. तुरंत नल के पानी युक्त एक धुंधला पकवान के लिए वापस स्लाइड रैक हस्तांतरण, और रैक ऊपर और नीचे ले जाकर स्लाइड 3x-5x धोने.
  3. स्लाइड स्पष्ट कर रहे हैं जब तक ताजा नल के पानी के साथ धोने कदम दोहरा रखें, जबकि वर्गों बैंगनी रहते हैं।
  4. 0.02% अमोनिया पानी के साथ धुंधला पकवान में नल के पानी की जगह. रैक ऊपर और नीचे 2x-3x ले जाएँ. ध्यान दें कि ऊतक अनुभाग नीला हो जाना चाहिए.
  5. अमोनिया के पानी को टैप के पानी से बदलें। स्लाइड3x-5x धो लें।

7. निर्जलीकरण

  1. धूआं हुड में 70% इथेनॉल युक्त एक धुंधला पकवान के लिए स्लाइड रैक ले जाएँ और यह कभी कभी आंदोलन के साथ 2 मिनट के लिए आराम करते हैं।
  2. 100% इथेनॉल युक्त एक पहले धुंधला पकवान के लिए स्लाइड रैक ले जाएँ और यह कभी कभी आंदोलन के साथ 2 मिनट के लिए आराम करते हैं।
  3. 100% इथेनॉल युक्त एक दूसरे धुंधला पकवान के लिए स्लाइड रैक ले जाएँ और यह कभी कभी आंदोलन के साथ 2 मिनट के लिए आराम करते हैं।
  4. एक धुंधला xylene युक्त पकवान के लिए स्लाइड रैक ले जाएँ और यह कभी कभी आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए आराम करते हैं.

8. स्लाइड बढ़ते

  1. स्लाइड रैक से स्लाइड निकालें और उन्हें धूआं हुड में सामना करना पड़ वर्गों के साथ फ्लैट रखना।
  2. प्रत्येक स्लाइड के लिए एक xylene आधारित बढ़ते माध्यम के 1 ड्रॉप जोड़कर और ध्यान से अनुभाग पर एक 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप रखकर एक समय में एक स्लाइड माउंट करें। किसी भी हवा के बुलबुले को फँसाने से बचें।
  3. एयर सूखी $ 5 मिनट के लिए स्लाइड.

9. नमूना मूल्यांकन

  1. 20x-40x आवर्धन पर एक मानक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक वर्गों की जांच.

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Representative Results

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जैसा कि यहाँ वर्णित है, सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कैंसर में, एक मामले को कोशिका द्रव्य में या ट्यूमर कोशिकाओं के नाभिक में भूरे रंग के punctiform धुंधला की उपस्थिति में सकारात्मक माना जा सकता है. ज्यादातर अध्ययनों में, संकेत या तो "सकारात्मक" या "पता नहीं"14के रूप में माना जाता है. सिग्नल के अर्ध-परिमाणीकरण के तरीकों की सूचना दी गई है लेकिन टीमों के बीच मानकीकरण की कमी है। उदाहरण के लिए, कुछ अध्ययनों में, संकेतों को ट्यूमर सेल प्रति 1+ के साथ 1+ के रूप में बनाए गए थे, 2 + ट्यूमर सेल प्रति 4-9 डॉट्स के साथ, या 3 + 10 डॉट्स या ट्यूमर सेल6प्रति अधिक के साथ; पोस्ट हॉक विश्लेषण में, केवल 2 + और 3 + संकेत, जो व्याख्या करने के लिए आसान थे, ध्यान में रखा गया. एक अन्य अध्ययन में, परिणाम दो स्कोर में विभाजित किया गया: आरएनए सीएसी "उच्च" और आरएनए सीएसआई "कम"। आरएनए CISH "उच्च" स्कोर दाग कैंसर कोशिकाओं के 50% से अधिक द्वारा परिभाषित किया गया था, या सेल सतह के 80% से अधिक को कवर धुंधला द्वारा (न्यूक्लियस और कोशिकाद्रव्य) कैंसर कोशिकाओं के कम से कम 30% में, के रूप में एक 20x उद्देश्य के साथ मनाया (चित्र 1)21.

सकारात्मक नियंत्रण के बारे में, PPIB संकेत 20x-40x आवर्धन पर सेल नाभिक के भीतर punctate डॉट्स के रूप में दिखाई देना चाहिए. नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड के लिए के रूप में, 20x माइक्रोस्कोप क्षेत्र प्रति पृष्ठभूमि DAB धुंधला प्रदर्शित हर 10 कोशिकाओं के लिए एक डॉट स्वीकार्य है.

Figure 1
चित्र 1: "कम" और "उच्च" आरएनए सीएसआई एस आई एस दाग के उदाहरण। (और बी) आरएनए सीएसआईश "कम" स्कोर ओरोफैरिनसी स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में धुंधला। दाग ट्यूमर कोशिकाओं के 50% के तहत में मनाया जाता है और सेल सतह के कम से कम 80% को शामिल किया गया है। (सी और डी) आरएनए सीएसएच "उच्च" स्कोर ओरोफैरिनसी स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में धुंधला। दाग ट्यूमर कोशिकाओं के 50% से अधिक में मनाया जाता है और, इस मामले में, धुंधला सतह ट्यूमर कोशिकाओं के 30% से अधिक में 80% से अधिक है। यह आंकड़ा Augustin एट अल से संशोधित किया गया है21कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

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Discussion

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एचपीवी आरएनए सीएसएच एक खरीदा किट के साथ प्रदर्शन वायरल प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और यह सक्रिय एचपीवी संक्रमण इंगित करता है। मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया, प्रोटोकॉल के चरणों का पालन करने के लिए समग्र आसान कर रहे हैं, और खरीदा किट सुविधाजनक है. इस तकनीक 19 हिस्टोलॉजिकल नमूनों के धुंधला प्लस एक बार में एक नियंत्रण स्लाइड की अनुमति देता है, और परख 8 एच के आसपास रहता है. यह महत्वपूर्ण है कि जब तक अन्यथा उल्लेख न किया जाए, तब तक नमूनों को चरणों के बीच सूखने न दें। pretreatment हालत हेरफेर ऊतक के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.

एचपीवी E6-E7 MRNA अभिव्यक्ति संकेत एक सटीक स्थानिक संकल्प के साथ पता चला है, जिससे ट्यूमर के निकट एचपीवी संक्रमित nonneoplastic कोशिकाओं से किसी भी संदूषण बाहर सत्तारूढ़. एचपीवी E6 और E7 आरएनए की जांच कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि इन ट्रांसक्रिप्ट्स कोशिकीय च53 और पीआरबी प्रोटीन4के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से एचपीवी प्रेरित सेल परिवर्तन के लिए आवश्यक हैं। इसलिए, गर्भाशय गर्भाशय ग्रीवा के precancerous घावों में, एचपीवी आरएनए सीएसएच कम ग्रेड इंट्राएपिथेलियल घावों (LSIL) उच्च ग्रेड इंट्राएपिथेलियल घावों (एचएसआईएल) से भेदभाव करने में मदद कर सकता है संकेत के स्थानीयकरण के अनुसार: LSIL के अधिकांश मामलों में, प्रचुर मात्रा में विसरित दाग नाभिक उपकला मोटाई भर में लेबल कर रहे हैं, एक उत्पादक चरण का संकेत. एचएसआईएल सतही परत में या तो प्रचुर मात्रा में फैलाना दाग सेल नाभिक प्रदर्शन, निचली परत में मजबूत परमाणु और कोशिकाद्रव्यी विराम संकेतों के साथ coexisting (पूर्व CIN2 के रूप में जाना जाता घावों में), या साइटोप्लाज्मिक डॉट्स के साथ मजबूत परमाणु दाग उपकला की मोटाई भर में, एचपीवी संक्रमण के परिवर्तनकारी चरण का संकेत (पहले CIN3 के रूप में जाना जाता घावों में)22.

हालांकि वहाँ के रूप में अभी तक संकेत के अर्द्धमात्रागत मूल्यांकन के लिए कोई मानक सिफारिश है, कुछ लेखकों एचपीवी E6 और E7 प्रतिलिपि के अर्द्धमात्रीय मूल्यांकन के बाद से एक नैदानिक प्रासंगिकता की रिपोर्ट दो prognostic की पहचान की अनुमति दी है एचपीवी से संबंधित HNSCC रोगियों के बीच समूहों21| यह माना गया है कि E6 और E7 प्रतिलिपि के बिना एचपीवी डीएनए का पता लगाने या E6 और E7 प्रतिलिपि के केवल कम स्तर के साथ कार्यात्मक अप्रासंगिक हो जाएगा और ऐसे रोगियों HPV-नकारात्मक कैंसर रोगियों के साथ जमा किया जाना चाहिए कि21, 23.

इस प्रक्रिया की सीमाओं के बारे में, यह माना जाता है कि कुछ गैर विशिष्ट पार संकरीकरण कुछ मामलों में हो सकता है, के रूप में Dreyer एट अल द्वारा hypothesized23 आरएनए CISH E6/E7 आरएनए प्रतिलिपि और वायरल के बीच भेदभाव के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है डीएनए, के रूप में प्रोटोकॉल एक 100 डिग्री सेल्सियस गर्मी उपचार कदम है, जो वायरल डीएनए विकृतीकरण23के लिए अनुमति देने के लिए संदिग्ध है भी शामिल है. यह सकारात्मक मामलों में संकेतों के दो प्रकार के अवलोकन द्वारा समर्थित है, अर्थात् मजबूत धुंधला मुख्य रूप से ट्यूमर सेल नाभिक में स्थानीयकृत, साथ ही कोशिका द्रव्य में एक ठीक दानेदार संकेत. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की गई जांच के रूप में विशेष रूप से एचपीवी जीनोटाइप 16 और 18 बांधता है, जो एचपीवी से संबंधित HNSCC4के एक विशाल बहुमत में शामिल हैं, कभी कभी एचपीवी-संबद्ध मामलों आरएनए सीएसएच द्वारा याद किया जा सकता है, या तो कुछ एचपीवी जीनोटाइप के कारण जो नहीं कर रहे हैं जांच में शामिल है, या क्योंकि उत्परिवर्तन या प्राइमर बाइंडिंग साइटों के विलोपन. अंत में, इस विधि महंगा अभिकर्मकों और उपकरणों की आवश्यकता है और नियमित अभ्यास में आसानी से सुलभ नहीं है.

हर नमूने के लिए, तीन वर्गों की कुल की जरूरत है: एक एचपीवी परख प्रदर्शन करने के लिए, सकारात्मक नियंत्रण के लिए एक, और नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक. के रूप में आरएनए एक नाजुक अणु है और FFPE नमूनों में समय के साथ खराब हो सकता है, प्रतिलिपि की गुणवत्ता हर नमूने के लिए जाँच की जानी है, पीपीआईबी जैसे सकारात्मक नियंत्रण जांच का उपयोग कर, डीएनए निर्देशित आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय subunit RPB1 (Polr2a), या polyubiquitin-C (UBC) , जो मानव गृह व्यवस्था जीन हैं. इसके अलावा, जब एक अर्द्धमात्रिक दृष्टिकोण है, संकेत हाउसकीपिंग जीन नियंत्रण जांच21को सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. प्रत्येक ऊतक के लिए अनुशंसित सकारात्मक नियंत्रण निर्माता के निर्देशों में पाया जा सकता है. हालांकि, हाल ही में एक अध्ययन की पुष्टि की है कि MRNA अभिव्यक्ति मजबूती से दोनों संभावित और पूर्वव्यापी नमूनों में अध्ययन किया जा सकता है, 2004 से नमूनों के बीच तुलनीय MRNA स्तर दिखा रहा है और 2008 से. यह समय24के साथ MRNA की सापेक्ष अखंडता के पक्ष में है . विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए इस्तेमाल की सिफारिश की नकारात्मक नियंत्रण जांच DAPB के लिए जीवाणु जीन कोडिंग है.

यहाँ एचपीवी आरएनए की स्थिति संकरण में क्रोमोजेनिक मैन्युअल रूप से प्रदर्शन के रूप में वर्णित है। इस तकनीक को फ्लोरोसेंट लेबलिंग और/या पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग के साथ भी किया जा सकता है।

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Disclosures

सीबी: बोर्डों, सेमिनार: एमएसडी, बीएमएस, Astrazeneca, Roche

Acknowledgments

लेखकों Hopital Europen जॉर्ज्स Pompidou और नेकर के पैथोलॉजी विभाग धन्यवाद (Laurianne Chambolle, Elodie मिशेल, और Gis$le Legall); PARCC के ऊतकविज्ञान मंच, होपिटल यूरोपेन जॉर्ज्स पॉम्पिडो (कोरिन लेसेफरे); भाषा संपादन के लिए वर्जीनिया क्लार्क; एलेक्जेंड्रा Elbakyan उसके योगदान के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

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References

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क्रोमोजेनिक में सीटू हाइब्रिडाइजेशन एचपीवी से संबंधित सिर और गर्दन कैंसर निदान के लिए एक उपकरण एस
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Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).More

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