Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Хромогенные На ситу Гибридизация SS инструмент для ВПЧ связанных головы и шеи диагностики рака

doi: 10.3791/59422 Published: June 14, 2019

Summary

Вирус папилломы человека (ВПЧ) РНК-хромогенная на месте гибридизация считается одним из золотых стандартов для активного обнаружения папилломавируса вируса человека в опухолях. Это позволяет визуализировать экспрессию ВПЧ E6-E7 mRNA с локализацией и полуколичественной оценкой его сигнала.

Abstract

Инфекция папилломавируса человека (ВПЧ) является основным фактором риска для подтипа ортоглянского плоскоклеточного карциномы (OPSCC), который, как правило, связан с лучшим результатом, чем алкоголь и табак, связанных OPSCC. Хромогенная на месте гибридизация (CISH) вирусной РНК ВПЧ может позволить полуколичественную оценку вирусных транскриптов онкогенных белков E6 и E7 и визуализацию на месте с хорошим пространственным разрешением. Этот метод позволяет диагностировать активную инфекцию с визуализацией транскрипции ВПЧ в опухолевых ВПЧ-инфицированных клетках. Преимуществом этого метода является предотвращение загрязнения от неопластических ВПЧ-инфицированных клеток, прилегающих к опухоли. В целом, его хорошие показатели диагностики он считается золотым стандартом для активной идентификации ВПЧ-инфекции. Поскольку взаимодействие вирусного белка E6 и E7 с клеточными белками pRb и p53 является обязательным для преобразования клеток, ВПЧ РНК CISH является функционально актуальным и остро отражает активную онкогенную инфекцию ВПЧ. Этот метод является клинически актуальным, а так как "низкий" или "высокий" уровень транскрипции ВПЧ помогли определить две группы прогноза среди ВПЧ связанных p16-положительных больных раком головы и шеи. Здесь мы представляем протокол для ручного ВПЧ РНК CISH выполняется на формалин фиксированной парафина встроенных (FFPE) слайды с комплектом, полученным от производителя. Вместо хромогенного откровения, РНК на месте гибридизации также может быть выполнена с флуоресцентным откровением (РНК FISH). Он также может сочетаться с обычными иммуностоинга.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ВПЧ РНК CISH является мощным инструментом для обнаружения активной инфекции ВПЧ, которые могут оказаться решающими в доброкачественных или злокачественных поражений в различных местах, таких как ротоглотки или шейки матки. Обнаружение активной инфекции ВПЧ может способствовать диагностике поражений, вызванных ВПЧ, и, таким образом, влиять на его лечение и прогноз.

ВПЧ является наиболее частой инфекцией, передаваемой половым путем, и более 100 вирусных генотипов были описаны1. Схематично, генотипы низкого риска, такие как генотипы 6 и 11, как известно, вызывают генитальные бородавки, рецидивирующие респираторные папилломатоз и другие доброкачественные поражения, в то время как генотипы высокого риска, такие как генотипы 16, а также 18, отвечают за большинство раковых заболеваний шейки матки и анальный рак и играют роль в ONSCC онкогенеза в переменных пропорциях, как учтивается региональными эпидемиологическими данными2.

Для выявления ВПЧ-инфекции имеется несколько инструментов. Как высокого риска ВПЧ инфекции приводит к выражению вирусных онкогенных белков E6 и E73, обнаружение E6 и E7 стенограммы широко рассматривается как золотой стандарт для активной идентификации ВПЧ инфекции4. ВПЧ РНК CISH может быть выполнена на образцах FFPE, которые довольно легко получить от пациентов, страдающих от различных заболеваний, связанных с ВПЧ. Его производительность была оценена в плоской интраэпителиальной неоплазии в шейке матки, ануса и влагалища, и в инвазивных плоскоклеточной карциномы в шейке матки, анус, и верхний аэропищеварительный тракт5: он достигает чувствительности более 98% среди ВПЧ ДНК-полимеразы цепной реакции (ПЦР) -положительных случаев. Это немного лучше, чем p16 иммуностоинга (93%) и ДНК ВПЧ на месте гибридизации (ДНК ISH: 97%), которые чаще используются. В другой когорте из 57 пациентов с плоскоклеточной карциномой (SCC), вытекающей из области головы и шеи, области половых органов, кожи и мочевыводящих путей, по сравнению с ВПЧ ДНК ISH, ВПЧ РНК CISH достигла лучшей чувствительности (100% против 88%) и специфика (87% против 74%)6.

P16 иммуностоинга является косвенным маркером, отражающим нарушение клеточного цикла, которые могут быть вызваны (но не исключительно) впч-инфекцией4,7. Этот экономически эффективный тест обладает хорошей чувствительностью и отрицательным прогностическим значением и рекомендуется в качестве суррогатного маркера инфекции ВПЧ высокого риска при раке ротоглотки (OPC) Колледжем американских патологоанатомов (CAP) и Союзом международных Борьба с раком (UICC)8.

Хотя эта статья посвящена исключительно выявлению ВПЧ в HNSCC, ВПЧ РНК CISH клинически актуальна в различных других условиях, которые связаны с ВПЧ-инфекцией. Например, этот метод может повысить точность диагностики низкосортных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки (LSIL, ранее известный как цервикальная интраэпителиальная неоплазия, класс 1 «CIN1» для морфологически неоднозначных случаев9. Что касается ротоглотки SCC, ВПЧ РНК CISH позволяет идентификации ВПЧ связанных SCC, помечены как отличие от ВПЧ-не связанных ротоглотки SCC в недавнем восьмом издании TNM классификации головы и рака шеи (Союза для международного рака Управление (UICC)10. Так как ВПЧ связанных SCC экспонатов лучший прогноз с более длительной выживаемости и повышенной лучевой терапии и химиотерапии чувствительность, чем ВПЧ-не связанных SCC11,12,13, обнаружение впч-инфекции может повлиять управление пациентом14,15. Кроме того, ВПЧ РНК CISH может быть использован для диагностики ВПЧ связанных мультифенотипической синуазальной карциномы с более высоким сигналом, чем ВПЧ ДНК CISH16. Несколько многовариантных анализов показывают, что обнаружение стенограмм E6 и E7 коррелирует с лучшим прогнозом в ротоглофалии SCC в целом7,15,17,18 и в подгруппа p16-позитивной ротоглотки SCC19,20.

Здесь мы представляем протокол для ручного ВПЧ РНК CISH выполняется на слайдах FFPE с комплектом, полученным от производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол соответствует этическим принципам и был одобрен Комитетом по этике (Comite-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. Подготовка материалов

  1. Приготовление буфера для мытья 1x
    1. Подготовка 3 L 1x мыть буфер, добавив 2,94 л дистиллированной воды и одна бутылка (60 мл) мыть буфера (50x) (см. таблицу материалов) к большой carboy. Хорошо перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для мытья 1x может быть подготовлен заранее и храниться при комнатной температуре до 1 месяца.
  2. Подготовка контр-истогреных реагентов
    1. Приготовьте 50% гематоксилин.
      1. В дым капюшон, добавить 100 мл гематоксилин Гилл i (см. таблицу материалов) до 100 мл дистиллированной воды в окрашивание блюдо.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 50% гематоксилин окрашивающий раствор может быть повторно использован на срок до 1 недели.
    2. Подготовка 0,02% (w/v) аммиачной воды (bluing реагент).
    3. В капот дыма добавьте 1,43 мл гидроксида аммония в 250 мл дистиллированной воды в цилиндре или другом контейнере. Запечатать цилиндр парафиновой пленкой. Смешайте его содержимое хорошо для 3x-5x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки оценки, очень важно использовать гидроксид аммония. Реагенты могут быть подготовлены заранее. Убедитесь, что все контейнеры остаются закрытыми.
  3. Подготовка реагента поиска цели 1x
    1. В большой стакан добавьте 70 мл 10-х реагента для поиска целей (см. таблицуматериалов) к 630 мл дистиллированной воды.
    2. Поместите стакан на нагревательную пластину с магнитным мешалкой. Накройте его алюминиевой фольгой.
    3. Отварить его содержимое при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 10-15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не дайте ему закипеть более 30 мин.
  4. Равновесие реагентов
    1. Убедитесь, что печь гибридизации включена и при температуре 40 градусов по Цельсию. Поместите влажную увлажняющую бумагу в нижней части лотка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Печь гибридизации (см. таблицуматериалов) необходима для шагов 3.4 до 4.2.
    2. Удалите реагенты усиления (AMP1-AMP6, см. таблицу материалов) из холодильника и держите их при комнатной температуре, по крайней мере за 30 минут до соответствующего шага инкубации.
    3. Перед каждым использованием разогрейте целевые и/или контрольные зонды в течение не менее 10 минут при температуре 40 градусов по Цельсию в духовке или на водяной бане или инкубаторе.

2. Адгезия повышения и депарафинизации в дым капот

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните протокол с гистологических образцов толщиной 3-5 мкм, установленных на неокрашенных слайдах.

  1. Для того, чтобы усилить сливки, испечь слайды при 60 градусах по Цельсию в течение 1 ч или при температуре 40 градусов на ночь в духовке.
  2. Зарядите стойку слайда неокрашенными гистологическими слайдами. Погрузите стойку слайда в течение 5 минут в свежий ксилен, содержащийся в окрашивание блюдо, с редким волнением. повторить со свежим ксиленом.
  3. Погрузите стойку слайда в течение 3 мин в свежий 100% этанол, содержащийся в окрашивающей тарелке, с постоянным возбуждением. Повторите со свежим 100% этанолом.
  4. Пусть горки высохнут в течение 2 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте депарафинизации реагентов для обезвоживания слайдов после проведения асссе.

3. Предобработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги следуют "стандартной" рекомендации по предварительной обработке в соответствии с инструкциями производителя для образцов головы и шеи. Сроки разделов 3.1 и 3.2, возможно, должны быть скорректированы в зависимости от манипулируемых тканей.

  1. Блокада пероксидаза деятельности
    1. Добавьте 4–6 капель перекиси водорода (см. таблицуматериалов) к каждому слайду и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре.
    2. Вымойте горки 2x в течение 2 минут в дистиллированной воде при комнатной температуре.
  2. Разрыв границ РНК/ткани
    1. С коготь, удалить алюминиевую фольгу из кипения 1x цель поиска реагента (TTR1x) из раздела 1.3 и остановить помешивая. Погрузите горку стойку медленно и очень осторожно в течение 15 мин. Обложка стакан снова с алюминиевой фольгой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Simmering должен сохраняться во время этого шага.
      ВНИМАНИЕ: Используйте коготь, чтобы манипулировать алюминиевой фольгой и слайд стойку, чтобы избежать ожоговых травм. Убедитесь в том, чтобы носить надлежащее индивидуальное защитное оборудование, такие как перчатки и лабораторное пальто.
    2. С коготь, немедленно передать горячую стойку слайд дистиллированной водяной бане и мыть его в течение 2 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образцы не охлаждается в TTR1x.
    3. Вымойте горки в свежем 100% этанола в течение 2 мин.
    4. Пусть горки высохнут при комнатной температуре в течение 2 мин.
  3. Создание барьера
    1. С гидрофобной перо барьера (см. таблицуматериалов), нарисуйте барьер вокруг образца. Дайте ему высохнуть не менее 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешить барьер, чтобы действительно высохнуть. Если он изнашивается во время процедуры, не стесняйтесь рисовать его снова. Избегайте прикосновения ткани с ручкой. Протокол может быть приостановлен на ночь здесь.
  4. Пищеварение протеазы
    1. Поместите слайды на слайд-стойку и добавьте 4 капли Protease Plus за образец (см. таблицу материалов).
    2. Накройте поднос контроля влажности крышкой и вставьте его в духовку гибридизации в течение 30 мин при температуре 40 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить испарение, убедитесь, что ручка поворота полностью превращена в положение замка.
    3. Выньте лоток из духовки и снимите стойку слайда.
    4. Один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости и поместить слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено дистиллированной водой.
    5. Вымойте горки 2x в течение 2 минут в дистиллированной воде при комнатной температуре. Агитировать постоянно.

4. Запуск асссе

ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте секциям высохнуть между инкубационными шагами.

  1. Гибридизация зонда ВПЧ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что зонды предварительно разогреты, чтобы растворить любые осадки до использования. Для этого шага, вместо зонда ВПЧ,пептидил-пролил изомеразы B (PPIB) для положительного контроля или дигидродипификолинат редуктаза (DAPB) для отрицательного контроля (см. Таблица материалов) также могут быть использованы.
    1. Нажмите и / или Флик слайды, чтобы удалить излишки жидкости и поместить их в слайд стойку. Добавьте 4 капли зонда ВПЧ, чтобы полностью покрыть каждый раздел.
    2. Накройте поднос крышкой и вставьте его в духовку на 2 ч при температуре 40 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить испарение, убедитесь, что поворот nob полностью превращен в положение блокировки.
    3. Выньте лоток из духовки и снимите стойку слайда.
    4. Один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости и поместить слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено 1x мыть буфера.
    5. Вымойте слайды в 1x мыть буфер в течение 2 минут при комнатной температуре с постоянным возбуждением. Повторите это с помощью свежего буфера 1x мытья.
  2. Гибридизация AMP1, AMP2, AMP3 и AMP4
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги включают в себя гибридизацию в печи гибридизации и AMP1-AMP4 из купленного комплекта (см. таблицуматериалов).
    1. Нажмите и / или Флик, чтобы удалить излишки жидкости со слайдов и поместить их в слайд стойку. Добавьте 4 капли AMP1, чтобы полностью покрыть каждый раздел.
    2. Накройте поднос крышкой и вставьте его в духовку в течение 30 минут при температуре 40 градусов по Цельсию.
    3. Выньте лоток из духовки и снимите стойку слайда.
    4. Один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости и поместить слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено 1x мыть буфера.
    5. Вымойте слайды в 1x мыть буфер в течение 2 минут при комнатной температуре с постоянным возбуждением. Повторите это с помощью свежего буфера 1x мытья.
    6. Повторите шаги 4.2.1-4.2.5, но используйте 4 капли AMP2 вместо AMP1 и инкубировать в течение 15 минут при температуре 40 градусов по Цельсию. Вымойте слайды 2x в течение 2 минут, оба раза в свежем буфере мыть.
    7. Повторите шаги 4.2.1-4.2.5, но используйте 4 капли AMP3 вместо AMP1 и инкубизируете в течение 30 минут при температуре 40 градусов по Цельсию. Вымойте слайды 2x в течение 2 минут, оба раза в свежем буфере мыть.
    8. Повторите шаги 4.2.1-4.2.5, но используйте 4 капли AMP4 вместо AMP1 и инкубировать в течение 15 минут при температуре 40 градусов по Цельсию. Вымойте слайды 2x в течение 2 минут, оба раза в свежем буфере мыть.
  3. Гибридизация AMP5 и AMP6
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги не включают гибридизацию в духовке, но гибридизации при комнатной температуре. AMP5 и AMP6 поставляются из купленного комплекта (см. Таблицу материалов).
    1. Нажмите и / или Флик слайды, чтобы удалить излишки жидкости и поместить их в слайд стойку. Добавьте 4 капли AMP5, чтобы полностью покрыть каждый раздел.
    2. Накройте поднос крышкой и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
    3. Один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости и поместить его в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено 1x мыть буфера.
    4. Вымойте слайды в 1x мыть буфер в течение 2 минут при комнатной температуре с постоянным возбуждением. Повторите это с помощью свежего буфера 1x мытья.
    5. Повторите шаги 4.3.1-4.3.4, но используйте 4 капли AMP6 вместо AMP5 и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды 2x в течение 2 минут, оба раза в свежем буфере мыть.

5. Обнаружение сигнала с 3,3'-диаминобензидин

ВНИМАНИЕ: Диаминобензидин (DAB) является токсичным. Следуйте соответствующим мерам предосторожности и рекомендациям по безопасности при утилизации и обработке этого химического вещества.

  1. Смешайте равные объемы DAB-A и DAB-B (см. таблицу материалов) в трубке соответствующего размера, распределяя одинаковое количество капель каждого раствора. Сделайте 120 евро субстрата DAB на секцию (2 капли каждого реагента/всего 4). Хорошо перемешать для 3x-5x.
  2. Возьмите каждый слайд, по одному, от слайд стойки и крана и / или Флик, чтобы удалить лишнюю жидкость, прежде чем поместить его в слайд стойку.
  3. Пипетка 120 л DAB на каждой секции ткани. Убедитесь, что секции покрыты, и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Утилизировать оставшиеся DAB в соответствии с местным и вставить слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено водопроводной водой.

6. Противодействие

  1. Переместите стойку слайда в окрашивание блюдо, содержащее 50% гематоксилин окрашивающий раствор дайте ему отдохнуть в течение 30 с при комнатной температуре. Обратите внимание, что слайды станут фиолетовыми.
  2. Немедленно перенесите стойку слайда обратно в окрашивание блюдо, содержащее водопроводную воду, и мыть слайды 3x-5x, перемещая стойку вверх и вниз.
  3. Продолжайте повторять шаг стирки с пресной водопроводной водой, пока слайды не ясны, в то время как разделы остаются фиолетовыми.
  4. Замените водопроводную воду в окрашивающей тарелке 0,02% аммиачной воды. Переместите стойку вверх и вниз 2x-3x. Обратите внимание, что секция ткани должна посинеть.
  5. Замените воду из аммиака водопроводной водой. Вымойте слайды 3x-5x.

7. Обезвоживание

  1. Переместите стойку слайда в окрашивание блюдо, содержащее 70% этанола в дым капот и дайте ему отдохнуть в течение 2 минут с редким волнением.
  2. Переместите стойку слайда к первому окрашиванию, содержащему 100% этанол, и дайте ему отдохнуть в течение 2 минут с случайным возбуждением.
  3. Переместите стойку слайда на вторую окрашивание блюдо, содержащее 100% этанола и дайте ему отдохнуть в течение 2 минут с редким волнением.
  4. Переместите стойку слайда в окрашивание блюдо, содержащее ксилен и дайте ему отдохнуть в течение 5 минут с редким волнением.

8. Слайд-монтаж

  1. Удалите слайды из слайд-стойки и положите их плоскими с разделами, стоящими вверх в капоте дыма.
  2. Смонтируйте один слайд за один раз, добавляя 1 каплю ксиленовой среды крепления к каждому слайду и тщательно размещая надсекцией крышку размером 24 мм х 50 мм. Избегайте захвата любых пузырьков воздуха.
  3. Воздушно-сухие горки в течение 5 мин.

9. Выборочная оценка

  1. Изучите участки тканей под стандартным ярко-полевым микроскопом при увеличении в 20раз 40раз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Как описано здесь, в голова и шея плоскоклеточный рак, случай может считаться положительным в присутствии коричневого точечных окрашивания в цитоплазме или в ядрах опухолевых клеток. В большинстве исследований сигнал считается либо "позитивным", либо "не обнаруженным"14. Сообщалось о методах полуколичественной оценки сигнала, но не было стандартизации между группами. Например, в некоторых исследованиях, сигналы были забиты как 1 "с 1-3 точек на опухолевую клетку, 2"с 4-9 точек на опухолевую клетку, или 3 "с 10 точками или более на опухолевую клетку 6; в послехокамский анализ, только 2 "и 3" сигналы, которые были легче интерпретировать, были приняты во внимание. В другом исследовании результаты были разделены на две оценки: РНК CISH "высокий" и РНК CISH "низкий". РНК CISH "высокий" балл был определен более чем 50% окрашенных раковых клеток, или путем окрашивания, охватывающих более 80% поверхности клетки (ядро и цитоплазма) по крайней мере 30% раковых клеток, как это наблюдается с 20x цели (Рисунок 1)21.

Что касается положительных элементов управления, ppIB сигнал должен быть виден как пунктуатные точки в ядрах клетки на 20x-40x увеличение. Что касается отрицательных слайдов контроля, одна точка на каждые 10 клеток, отображающих фон DAB окрашивания на 20x микроскоп поле является приемлемым.

Figure 1
Рисунок 1: Примеры "низкого" и "высокого" окрашивания РНК CISH. (A и B) РНК CISH "низкий" оценка окрашивания в ротоглотки плоскоклеточной карциномы. Окрашивание наблюдается в менее чем 50% опухолевых клеток и охватывает менее 80% поверхности клетки. (C и D) РНК CISH "высокий" счет окрашивания в ротоглотки плоскоклеточной карциномы. Окрашивание наблюдается в более чем 50% опухолевых клеток, и в этом случае, окрашивание поверхности превышает 80% в более чем 30% опухолевых клеток. Эта цифра была изменена с Augustin et al.21Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ВПЧ РНК CISH выполняется с приобретенным комплектом является мощным инструментом для обнаружения вирусных стенограмм и он указывает на активную инфекцию ВПЧ. Выполненные вручную, шаги протокола в целом легко следовать, и приобрел комплект удобно. Этот метод позволяет окрашивать 19 гистологических образцов плюс один контрольный слайд одновременно, а асссея длится около 8 ч. Очень важно не допустить, чтобы образцы высохли между шагами, если не упоминается иное. Условие предварительной обработки может быть скорректировано в зависимости от манипулируемых тканей.

Сигнал экспрессии ВПЧ E6-E7 mRNA обнаруживается с точным пространственным разрешением, тем самым исключая любое загрязнение от инфицированных ВПЧ ненеопластических клеток, прилегающих к опухоли. Обнаружение ВПЧ E6 и E7 РНК является функционально актуальным, поскольку эти транскрипты необходимы для ВПЧ-индуцированной трансформации клеток через их взаимодействие с клеточными белками p53 и pRb4. Таким образом, при предраковых поражениях шейки матки, ВПЧ РНК CISH может помочь дискриминировать низкосортных интраэпителиальных поражений (LSIL) от полноценных интраэпителиальных поражений (HSIL) в зависимости от локализации сигнала: в большинстве случаев LSIL, обильные диффузно окрашенные ядра помечены по всей толщине эпителии, что указывает на продуктивную фазу. HSIL выставляют либо обильные диффузно окрашенные ядра клеток в поверхностном слое, сосуществующие с сильными ядерными и цитоплазмическими сигналами пунктуации в нижнем слое (в поражениях, ранее известных как CIN2), либо сильное ядерное окрашивание цитоплазмическими точками толщина эпителия, что указывает на преобразующую фазу ВПЧ-инфекции (в поражениях, ранее известных как CIN3)22.

Хотя пока нет стандартной рекомендации для полуколичественной оценки сигнала, некоторые авторы сообщают о клинической значимости, так как полуколичественная оценка стенограмм ВПЧ E6 и E7 позволила определить два прогнозных группы среди пациентов, связанных с ВПЧ HNSCC21. Было постулировано, что обнаружение ДНК ВПЧ без E6 и E7 стенограммы или только с низким уровнем E6 и E7 стенограммы будут функционально неуместными и что такие пациенты должны быть объединены с ВПЧ-отрицательных больных раком21, 23.

Что касается ограничений этой процедуры, постулируется, что несколько неспецифических перекрестных гибридизации может произойти в некоторых случаях, как предполагается Dreyer et al.23 RNA CISH не может быть пригодным для дискриминации между E6/E7 РНК стенограммы и вирусные ДНК, так как протокол включает в себя 100 градусов по Цельсию тепловой обработки шаг, который, как предполагается, позволяют вирусной денатурации ДНК23. Этому подкрепляетнаблюдение двумя типами сигналов в положительных случаях, а именно сильным окрашиванием, в основном локализованным в ядрах опухолевых клеток, а также тонким гранулированным сигналом в цитоплазме. Поскольку зонд, используемый в этом протоколе, специально связывает генотипы ВПЧ 16 и 18, которые участвуют в подавляющем большинстве связанных с ВПЧ HNSCC4, случайные случаи, связанные с ВПЧ, могут быть пропущены РНК CISH, либо из-за некоторых генотипов ВПЧ, которые не являются включены в зонд, или из-за мутаций или удаления грунтовки связывания сайтов. Наконец, этот метод требует дорогостоящих реагентов и устройств и не легко доступен в обычной практике.

Для каждого образца, в общей сложности три раздела необходимы: один для выполнения анализВП, один для положительного контроля, и один для отрицательного контроля. Поскольку РНК является хрупкой молекулой и может со временем ухудшаться в образцах FFPE, качество стенограмм ы должно быть проверено для каждого образца, используя положительные контрольные зонды, такие как PPIB, ДНК-направленное РНК-полимераза II подразделение RPB1 (Polr2a), или полиубичитин-C (UBC) , которые являются человеческими генами домашнего хозяйства. Кроме того, при наличии полуколичественного подхода, сигнал должен быть нормализован к зонду управления геном домашнего хозяйства21. Рекомендуемый положительный контроль для каждой ткани можно найти в инструкциях производителя. Однако недавнее исследование подтверждает, что экспрессия мРНК может быть тщательно изучена как в перспективных, так и в ретроспективных образцах, показывая сопоставимые уровни мРНК между образцами с 2004 года по 2008 год. Это в пользу относительной целостности мРНК с течениемвремени 24. Рекомендуемый отрицательный контрольный зонд, используемый для предотвращения неспецифического окрашивания, является кодированием генов бактерий для DAPB.

Здесь хромогенная на месте гибридизация РНК ВПЧ описывается как выполняемая вручную. Этот метод также может быть выполнен с флуоресцентной маркировки и / или в сочетании с обычными иммуномаркировки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB: доски, семинары: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche

Acknowledgments

Авторы благодарят кафедру патологии Хопитал Европеен Джордж Помпиду и Некер (ЛаурианН Шамболле, Элоди Мишель и Гизеле Легалл); гистологическая платформа PARCC, Хопитал Европеен Джордж Помпиду (Коринн Лесаффр); Вирджиния Кларк для редактирования языка; Александра Эльбакян за ее вклад.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5, (1), 18-23 (2012).
  2. Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game? Clinical Cancer Research. 24, (3), 505-507 (2018).
  3. Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21, (10), 1510-1517 (2002).
  4. Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15, (12), 1319-1331 (2014).
  5. Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41, (5), 607-615 (2017).
  6. Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
  7. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
  8. Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142, (5), 559-597 (2018).
  9. Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42, (2), 192-200 (2018).
  10. El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. WHO Classification of Head and Neck Tumours. International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).
  11. Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363, (1), 24-35 (2010).
  12. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73, (1), 128-138 (2013).
  13. Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
  14. Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28, (12), 1518-1527 (2015).
  15. Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36, (12), 1874-1882 (2012).
  16. Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
  17. Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27, (36), 6213-6221 (2009).
  18. Kuo, K. -T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21, (4), 376-386 (2008).
  19. Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. (2018).
  20. Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126, (8), 1882-1894 (2009).
  21. Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. (2018).
  22. Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9, (3), e91142 (2014).
  23. Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462, (4), 381-389 (2013).
  24. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. (2017).
Хромогенные На ситу Гибридизация SS инструмент для ВПЧ связанных головы и шеи диагностики рака
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).More

Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter