Summary
ونوصف طريقة لمعالجة سائل غسل القصبات الهوائية ومطابقة الدم المحيطي من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل مزمن على العلاج المضاد للفيروسات العكوسة لتقييم خزانات فيروس نقص المناعة البشرية الرئوية. هذه الأساليب تؤدي إلى الحصول على خلايا CD4 T نقية للغاية والضامة السنخية التي يمكن استخدامها في وقت لاحق لنماذج الفينومينية المناعية وفيروس نقص المناعة البشرية الحمض النووي /RNA القياس الكمي من قبل تفاعل سلسلة بوليميراز حساسة للغاية.
Abstract
تنظير القصبات هو إجراء طبي حيث يتم حقن المالحة الطبيعية في الرئتين عن طريق منظار القصبات ومن ثم يتم تطبيق الشفط، وإزالة سائل غسل القصبات الهوائية (BAL). سائل BAL غني بالخلايا وبالتالي يمكن أن يوفر "لقطة" من الوسط المناعي الرئوي. خلايا CD4 T هي أفضل الخزانات المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، في حين أن هناك أدلة قوية تشير إلى أن الضامة الأنسجة، بما في ذلك الضامة السنخية (AMs)، هي أيضا بمثابة خزانات الفيروسية. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير غير معروف عن دور التدابير المضادة للفيروس في سياق إنشاء خزان فيروس نقص المناعة البشرية وصيانته. لذلك، فإن وضع بروتوكول لمعالجة سائل BAL للحصول على الخلايا التي يمكن استخدامها في الاختبارات الفيروسية والمناعية لتوصيف وتقييم مجموعات الخلايا والمجموعات الفرعية داخل الرئة أمر مهم لفهم دور الرئتين كفيروس نقص المناعة البشرية الخزانات. هنا، ونحن نصف مثل هذا البروتوكول، واستخدام تقنيات قياسية مثل الطرد المركزي بسيطة والتدفق قياس السيتومترية. ويمكن بعد ذلك استخدام خلايا CD4 T وAMs للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك النماذج الفينوتية المناعية والحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية والقياس الكمي للحمض النووي الريبي.
Introduction
واحدة من أهم التحديات التي تواجه علاج الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية هو وجود خزان فيروس نقص المناعة البشرية الكامنة التي تسبب انتعاش فيريميا البلازما بعد انقطاع العلاج المضاد للفيروسات الرجعية (ART)1،2. في حين أن خزان فيروس نقص المناعة البشرية خلال العلاج المضاد للفيروسات القهقرية على المدى الطويل موثق بشكل جيد في العديد من مقصورات الأنسجة، بما في ذلك الأجهزة اللمفاوية الثانوية، والأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأمعاء (GALT)، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، تم تجاهل الرئتين كمنطقة دراسة منذ حقبة ما قبل الفن3. ومع ذلك، تلعب الرئتين دوراً محورياً في مسببات الأمراض من فيروس نقص المناعة البشرية. في الواقع، كانت الأعراض الرئوية من بين المؤشرات الأولى للعدوى الانتهازية المرتبطة بالإيدز4. وحتى في العصر الحديث للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، فإن الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية معرضون لخطر الإصابة بأمراض رئوية معدية وغير معدية على حد سواء من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. على سبيل المثال، الأشخاص المصابين بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية معرضون لخطر مرتفع للعدوى الرئوية العقدية الغازية، وكذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)5،6. وعلاوة على ذلك، يشكل العدوى المشتركة بالسل وفيروس نقص المناعة البشرية تحدياً كبيراً في مجال الصحة العامة في مناطق معينة من العالم، ولاسيما في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى، حيث أن احتمال إصابة الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية بالسل يزيد 16 إلى 27 مرة عن احتمال إصابة الأشخاص الذين لا يعانون من فيروس نقص المناعة البشرية(10) بـ 7. على الرغم من أن بعض التفسيرات لهذا التعرض للعدوى الرئوية والأمراض المزمنة قد اقترحت8،9،10، والآليات الخلوية الدقيقة التي الأفراد الذين يعانون من فيروس نقص المناعة البشرية قمعها لا يزال الحمل الفيروسي البلازما في خطر أعلى للمضاعفات الرئوية لم يتم توضيحها بشكل كامل. الأهم من ذلك، فيروس نقص المناعة البشرية هو عامل خطر قوي جدا للعدوى الرئوية والأمراض المزمنة، بغض النظر عن حالة التدخين6.
تحليل البيئة المناعية للرئة، لذلك، أمر بالغ الأهمية من أجل فهم دورها في الصحة والمرض. على الرغم من أن عينات البلغم المستحثة غير الغازية تميل إلى احتواء كميات كبيرة من الخلايا الظهارية والحطام مع الخلايا الليمفاوية الرئوية النادرة وليس AMs، مما يحد من دورها لتطبيقات محددة. وعلى العكس من ذلك ، لا يمكن الحصول على خزعات كبيرة من الأنسجة في غياب مرض مشتبه به بسبب المخاطر المرتبطة بالنزيف الكبير واسترواح الصدر (انهيار الرئة). وعلاوة على ذلك، فإن غالبية الخلايا المناعية الرئوية تقع أساسا على مستوى الغشاء المخاطي حيث يتم تحفيز الرئتين باستمرار من قبل المستضدات أثناء التنفس. ولهذا الغرض، فإن تنظير القصبات الهوائية للحصول على سائل BAL له ميزة توفير وصول آمن نسبياً إلى الخلايا الليمفاوية وأجهزة AMs (انظر الشكل1). تشكل الضامة أكبر نسبة من الخلايا داخل سائل BAL، تليها الخلايا الليمفاوية11. ولذلك، من المفيد وضع طريقة يمكن من خلالها معالجة سائل BAL للاستخدام في التطبيقات اللاحقة، مثل علم الفينومينات المناعية، أو زراعة الخلايا، أو النسخ، أو أي تطبيقات أخرى. بروتوكول لمعالجة السائل BAL المبينة هنا هو تكييفها من الإجراءات العامة التي سبق وصفها وتحسينها لمختلف الاختبارات المصب المستخدمة. وتسمح هذه المنهجية بعزل كل من الخلايا المناعية المخاطية الرئوية والميلويدية لتوصيفها الظاهري والوظيفي، فضلا عن تقييم خزان فيروس نقص المناعة البشرية لدى البالغين المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.
لوضع هذا البروتوكول، استخدمنا المعايير التالية لتوظيف المشاركين في الدراسة15. لكي يكون المشاركون مؤهلين للمشاركة في هذه الدراسة، يجب أن يكونوا من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية الذين يستوفون المعايير التالية: (1) بشأن العلاج المضاد للفيروسات القهقرية لمدة 3 سنوات على الأقل؛ (2) العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية لمدة 3 سنوات على الأقل؛ (3) في مجال العلاج المضاد للفيروسات القهقرية؛ (3) العلاج المضاد للفيروسات القهقرية؛ (3) العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية؛ (3) العلاج المضاد للفيروسات القهقرية لمدة 3 سنوات على الأقل؛ (3) (2) قمع الحمل الفيروسي (VL) لمدة لا تقل عن 3 سنوات؛ (3) CD4 T عدد الخلايا ≥200/mm 3؛ (4) على استعداد للخضوع لقياس التنفس وتنظير القصبات. تم استبعاد المرضى الذين يعانون من المعايير التالية من الدراسة: (1) موانع (موانع) لتنظير القصبات الهوائية. (2) ارتفاع خطر النزيف: اعتلال الأوعية أو على الوارفارين أو العلاج clopidogrel؛ (3) تجلط الدم (الصفائح الدموية منخفضة)؛ (4) العدوى الرئوية النشطة أو عملية أخرى من عملية النبض الحاد؛ (5) الحوامل / محاولة لتصبح حاملا.
Protocol
وقد أنشئ هذا البروتوكول البحثي مباشرة على أساس المبادئ الواردة في إعلان هلسنكي وحصل على موافقة مجالس المراجعة المؤسسية لمركز الصحة بجامعة ماكغيل (RI-MUHC, #15-031), the Université du Québec à مونتريال (UQAM, #602) ومركز مركز مستشفى جامعة مونتريال (CR-CHUM, #15-180).
1. القصبات الفيجيلة
ملاحظة: يصف هذا القسم تنظير القصبات كما يقوم به أخصائي تنفس مرخص بمساعدة معالج تشخصي16و17 .
- إعداد قطع من الأجهزة اللازمة لهذا الإجراء، بما في ذلك منظار القصبات والمالحة. إعطاء رذاذ مخدر إلى الجزء الخلفي من حلق المريض. تجنب الاستخدام المفرط للتخدير الموضعي عندما يكون ذلك ممكناً. تطبيق القلب يؤدي إلى الصدر من أجل رصد معدل ضربات القلب والإيقاع ومسبار الأكسجين إلى الإصبع الأول من اليد من أجل رصد تشبع الأكسجين. إدراج قنية الأنف في الخياشيم لتوفير الأكسجين التكميلي.
- وضع المريض، ويفضل في موقف supine. إدارة التخدير على النحو التالي: ميدازولام 0.01-0.04 ملغ / كغ والفينتانيل 50-100 ميكروغرام (لتسهيل راحة المريض وتقليل رد الفعل السعال) عن طريق الوريد، في وجود طبيب التنفس أو التخدير.
- تقدم منظار القصبات المرنة حتى يتم وضعها في القصبات الفرعية الفرعية المطلوبة. غرس المالحة (50-60 مل في وقت واحد) مع الحقنة، ومن ثم تطبيق شفط لطيف (50-80 مم زئبق). سوف يتم جمع سائل الغسل في الحقنة ثم يتم نقله إلى حاوية تجميع.
- كرر تدفق إلى ما مجموعه 200-300 مل من الغسل. جمع ما لا يقل عن 100 مل من السائل BAL إذا كان ذلك ممكنا.
- ضع سائل BAL على الجليد.
2. عزل خلايا BAL
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء التالي في ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية، الفئة الثانية (BSL2) أو أعلى.
-
الاحتفاظ عينات BAL على الجليد حتى تتم معالجتها.
- دوامة BAL في أنبوب جمع الأصلي ونقله إلى أنبوب 50 مل باستخدام ماصة المصلية. إذا كان السائل BAL يبدو عكر جدا أو ملوثة من قبل الأنسجة الخيطية، تصفية السائل من خلال مرشح شبكة النايلون 70 ميكرومتر في أنبوب جديد 50 مل.
- الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 50 مل. تفريق بيليه بلطف مع طرف ماصة وإعادة تعليقها في 1 مل من RPMI 1640 المتوسطة.
- نقل 1 مل من supernatant إلى كل من 10X 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وsupernatant المتبقية إلى 15 مل أنابيب، 10 مل في كل. تخزين جميع أنابيب supernatant في -80 درجة مئوية.
-
معالجة بيليه الخلية BAL.
- إعادة تعليق بيليه في 10 مل من RPMI 1640 لكل 25 مل من العينة الأصلية. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 15 مل (تجاهل بعد التأكد من وجود ما يكفي من الخلايا في بيليه).
- إعادة تعليق بيليه في 1 مل من RPMI 1640 + 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) وحساب باستخدام الأزرق تريبان ومقياس الهيموتوميومتر.
ملاحظة: إذا لم يتم فصل السائل BAL عن طريق الالتزام الخلايا قبل الفرز، انتقل إلى القسم 4.
3. الالتزام بخلايا BAL (اختياري)
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا البروتوكول البديل قبل أو بدلاً من فرز الخلايا. يجب تنفيذ الإجراء التالي في ظروف معقمة في خزانة BSL2 (أو أعلى).
- نقل العدد المطلوب من خلايا BAL للفرز إلى أنبوب جديد 15 مل ويشكلون وحدة التخزين الصحيحة ل1.5 × 106 الضامة / مل. لوحة 2 مل من الخلايا لكل بئر في لوحات 6-جيدا وحضانة لمدة 2ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2، لإتاحة الوقت للانضمام.
- بعد الحضانة، يستنشق بعناية وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا غير ملتصقة ونقلها إلى أنبوب 15 مل. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة supernatant وإعادة تعليق في 1 × 107 خلايا / مل في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) + 2 ٪ FBS ونقل التعليق إلى أنبوب البوليسترين 5 مل جولة القاع. هذا الكسر اللمفاوي هو الآن على استعداد لوصمة عار لفرز الخلايا.
- إلى الخلايا الملتصقة المتبقية في اللوحة، أضف 1 مل لكل بئر من محلول فك الارتباط الخلوي (انظر جدولالمواد) وحضانة لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،حتى تنفصل الخلايا بسهولة عن اللوحة مع طرف ماصة.
- بلطف ولكن بدقة كشط الخلايا الملتصقة من سطح البئر باستخدام طرف ماصة، واستخدام 1 مل من السائل في البئر للمساعدة في مفرزة. نقل الخلايا إلى أنبوب جديد 15 مل. غسل الآبار مع 1 مل من PBS وإضافة هذا إلى نفس الأنبوب. تشكل محتوى الأنبوب إلى 5 مل مع PBS.
- الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقائق في RT. إزالة supernatant، إعادة تعليق في 1 × 107 خلايا / مل PBS + 2٪ FBS، ونقل التعليق إلى أنبوب البوليسترين 5 مل جولة القاع. هذا الكسر النخاعي هو الآن على استعداد لوصمة عار لفرز الخلايا.
4. عزل خلايا الدم الطرفية أحادية النونافية
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء التالي في ظروف معقمة في خزانة BSL2 (أو أعلى).
- في نفس اليوم من تنظير القصبات (عموما مباشرة قبل جمع BAL)، والحصول على ستة أنابيب من الدم الوريدي من متبرع في أنابيب حمض اثيلين ديايمينتيترا (EDTA) (حوالي 10 مل لكل أنبوب).
- فصل الدم عن طريق الطرد المركزي أنابيب الدم في 300 × ز لمدة 15 دقيقة في RT. نقل البلازما إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في aliquots 1 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
-
تنفيذ فصل تدرج الكثافة.
- أضف 2 مل من RPMI 1640 إلى كل أنبوب دم واخلط جيدا باستخدام ماصة مصلية.
- نقل إلى أنابيب 3X 50 مل ويشكلون حجم في كل أنبوب إلى 25 مل مع RPMI 1640.
- إعداد دفعة أخرى من أنابيب 3X 50 مل، كل منها تحتوي على 20 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية (LSM) (انظر جدولالمواد) في RT. ببطء وبلطف طبقة 25 مل من الدم المخفف على رأس LSM لكل من الأنابيب الثلاثة، وعقد الأنبوب في زاوية 45 درجة .
- الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 25 دقيقة في RT مع تسارع منخفض وليس تباطؤ (الفرامل قبالة).
-
إجراء غسل للخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMCs).
- نقل طبقة من الخلايا في واجهة المرحلتين السائلتين في الأنبوب إلى أنبوب 50 مل باستخدام ماصة مصلية؛ إذا كان هناك أكثر من 30 مل من الحجم، تقسيمه إلى أنبوبين. تشكل وحدة التخزين في كل أنبوب إلى 50 مل مع PBS.
- الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق في RT وإزالة قدر supernatant ممكن.
- إعادة تعليق بيليه ويشكلون حجم إلى 25 مل مع PBS. الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 10 دقائق في RT وإزالة قدر من supernatant ممكن.
- كرر خطوة الغسيل الموضحة في الخطوة 4.4.3.
- إعادة تعليق بيليه في 5 مل من PBS + 2٪ FBS وعد الخلايا.
5. فرز خلايا BAL كله وPBMCs
ملاحظة: يجب أن يتم الإجراء التالي في ظل ظروف معقمة في BSL2 (أو أعلى).
- إعداد المخزن المؤقت للفرز الذي يحتوي على PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4). إعداد 5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع مع 1 مل من FBS لجمع المجموعات الفرعية خلية فرزها.
-
أداء تلطيخ.
- إعداد أنابيب البوليستيرين المستديرة القاع بدرجة 3x 5 مل، لكل منها لـ BAL (الخلايا الكاملة أو الخلايا الليمفاوية والكسور النخاعية بعد الالتزام) وPBMCs (انظر القسم 4). لكل مجموعة فرعية، وإعداد أنبوب واحد مع الخلايا لفرز واثنين من أنابيب من 5 × 105 الخلايا لاستخدامها لضوابط التعويض وصمة عار غير ملطخة والبقاء.
- الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatants، إعادة تعليق الخلايا للعناصر التحكم في 100 μL من PBS، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى يمكن إعداد عناصر تحكم التعويض كما هو موضح في الخطوة 5.2.6.
- إعداد تخفيف 1:20 من مستقبلات Fc (FcR) حجب الكاشف في PBS + 5٪ FBS (انظر جدول المواد-لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة لFcR على الخلايا التعبير عن FcR). إعادة تعليق الخلايا لفرزها في 1 × 107 الخلايا في 250 درجة مئوية من خليط FcR حجب. احتضانها لمدة 1 ساعة عند 4 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، أضف كوكتيل الأجسام المضادة المناسب (انظر الجدول1) إلى الخلايا وحضانة لمدة 1 ساعة عند 4 درجة مئوية في الظلام.
- بعد 1 ساعة من تلطيخ، إضافة 1 مل من PBS إلى الخلايا والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت الفرز أن يكون 1 × 107 الخلايا في 250 درجة مئوية.
- إعداد عناصر تحكم التعويض.
- إضافة ثلاث قطرات كل من المضادة للماوس Ig، والخرز التعويض السيطرة السلبية (انظر جدولالمواد) لكل 1 مل من PBS في أنبوب الطرد المركزي الصغير ونقل 100 ميكرولتر إلى كل 5 مل جولة القاع أنبوب البوليسترين لاستخدامها للتعويض. إعداد أنبوب واحد لكل فلوروكروم موجودة في الكوكتيل لاستخدامها.
- إضافة 1 ميكرولتر من كل جسم مضاد في الكوكتيل إلى أنبوب مختلف يحتوي على الخرز. إضافة 1 μL من وصمة عار الصلاحية إلى واحد من أنابيب 5 × 105 الخلايا المنصوص عليها في الخطوة 5.2.1. حضانة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية في الظلام.
- إضافة 1 مل من PBS إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 250 درجة مئوية من PBS. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى يُلزم الأمر.
- فرز الخلايا عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) في أنابيب جمع أعدت مع 1 مل من FBS ودوامة بلطف لمعطف الجانبين من الأنابيب مع المصل.
- فرز خلايا BAL في الضغط المنخفض. خلايا البوابة أولاً لاستبعاد الضوضاء وتشمل العيش، CD45+ الخلايا، وداخل هذه البوابة السكان خارج خلايا doublet (انظر الشكل 3). ضمن ال [ميلويد] كبيرة مجموعة فرز [كد206] و [كد169] مزدوجة إيجابيّة خلايا ك [يمس]; داخل أصغر الخلايا الليمفاوية عزل CD3+ الخلايا وفرز كل من CD4 و CD8 السكان إيجابية واحدة (انظر الشكل 3; استراتيجية gating مفصلة في قسم النتائج التمثيلية).
- عند فرز PBMCs، خلايا البوابة أولاً لاستبعاد الضوضاء وتشمل الخلايا الحية، CD45+ ، وداخل هذه البوابة السكانية خارج خلايا doublet. بعد ذلك، بوابة على خلايا CD3 وداخل CD3- السكان، بوابة أولا على CD14 وفرز الخلايا الأحادية إيجابية واحدة، ومن ثم داخل CD3+ بوابة السكان على CD4 و CD8 وفرز كل من السكان إيجابية واحدة (استراتيجية gating مفصلة في قسم النتائج التمثيلية.
6- النمط المناعي للأجهزة المضادة للأفراد وثنائي الفينيل متعدد البروم
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء التالي في ظروف معقمة في خزانة BSL2 (أو أعلى).
- إضافة ما يصل إلى 1 مليون من AMs وPBMCs إلى اثنين منفصلة 5 مل جولة القاع أنابيب البوليسترين. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant.
- تنفيذ حظر FcR لتحسين خصوصية تلطيخ الأجسام المضادة. لهذا، إعادة تعليق الخلايا في 100 درجة مئوية من PBS + 2٪ FBS وإضافة 1.4 درجة مئوية من FcR حجب الكاشف. حضانة لمدة 20 دقيقة في 4 سC.
-
أداء تلطيخ خارج الخلية.
- بعد الحضانة مع كتلة FcR، إضافة الكوكتيل المطلوب خارج الخلية الأجسام المضادة، دوامة الأنابيب، وحضانة لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- غسل 2X عن طريق إضافة 500 درجة مئوية من PBS والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
-
الاستعداد للتثبيت ونفاذية (انظر جدول المواد للحصول على الكواشف المحددة المستخدمة).
- إعداد حل نفاذية مع 1 جزء نفاذية العازلة و 3 أجزاء العازلة مخفف. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من حل نفاذية وحضانة لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- إعداد محلول غسل باستخدام 1 جزء غسل العازلة و 4 أجزاء H2O. إضافة 2 مل من محلول الغسيل إلى الخلايا نفاذيبيليد والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant.
-
أداء تلطيخ داخل الخلايا.
- إعادة تعليق الخلايا في 100 درجة مئوية من 1X حل الغسيل، إضافة الأجسام المضادة داخل الخلايا المطلوب، دوامة الأنابيب، وحضانة لمدة ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية في الظلام.
- إضافة 2 مل من محلول الغسيل والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق في RT. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 200 درجة مئوية من PBS. تخزين الخلايا في 4 درجة مئوية في الظلام حتى الحاجة.
7. ما تبقى من خلايا BAL
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء التالي في ظروف معقمة في خزانة BSL2 (أو أعلى).
- يسمح أرقام الخلايا، حفظ الخلايا الحية بالتبريد من بيليه الخلية BAL (من الخطوة 2.2.2).
- إعداد وسائل التجميد التي تحتوي على 90٪ FBS + 10٪ ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO).
- طرد مركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant وإعادة تعليق في 1.5 مل من وسائل الإعلام تجميد في قارورة المبردة. نقل قارورة المبردة إلى حاوية تجميد معدل تسيطر عليها (انظر جدولالمواد) ووضعها في -80 درجة مئوية. نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة.
-
الحفاظ على خلايا BAL ككريات جافة.
- نقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مضاد في 6000 × ز لمدة دقيقة واحدة. تخزين بيليه في -80 درجة مئوية.
8- الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية والتحديد الكمي للحمض النووي الريبي
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء التالي في ظروف معقمة في خزانة BSL2 (أو أعلى).
- مجموع القياس الكمي للحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية
- لتجنب تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع الحطام بال lysate، استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي (انظر جدولالمواد) لاستخراج الحمض النووي من عينة من خلايا BAL وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام 15 ميكرولتر من هذا الحمض النووي جنبا إلى جنب مع مزيج رئيسي في خطوة preamplification الموضحة أدناه (الخطوة 8.1.3).
- إعداد تخفيف منحنى القياسية.
- كما هو موضح أعلاه، استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من بيليه من 2 × 106 خلايا ACH-2 (انظر جدولالمواد).
- بعد إهليل الحمض النووي، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من الحمض النووي ACH-2 لتوليد ستة تخفيفات، تتراوح بين 3 × 105 خلايا إلى 3 خلايا لكل 15 ميكرولتر.
- تنفيذ خطوة preamplification.
- في غرفة منفصلة، قم بإعداد المزيج الرئيسي لـ n + 2 عينات تتألف من 1x عازل بوليميراز، 3 مم من MgCl 2، 300 μM dNTPs، و 2.5 U من بولميراز الحمض النووي Taq (انظر جدول المواد)و 300 nM من كل من المواد التمهيدية الأربعة (انظر الخطوة 8-1-3-2). تنفيذ جميع التدابير في الآبار الثلاثية.
- استخدم المواد التمهيدية hCD3OUT5'، hCD3OUT3'، ULF1، وUR1 لتوليد الحمض النووي المتضخم من كل من CD3 البشري وفيروس نقص المناعة البشرية (انظر التسلسلات في الجدول2). لاحظ أن كلا الجينات يتم تضخيمها مسبقا في نفس الأنبوب. يُمزج بلطف ويُدور أسفل الأنبوب لضمان الخلط الكامل.
- توزيع 35 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر في لوحة PCR 96-well وإضافة 15 ميكرولتر من الحمض النووي القياسية أو عينة. حجم التفاعل الكلي هو 50 درجة مئوية.
- أداء preamplification (denaturation في 95 درجة مئوية لمدة 8 دقائق، تليها 12 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 40 ق، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، واستطالة في 72 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة).
- تنفيذ PCR في الوقت الحقيقي.
- لتحديد كمية CD3 وفيروس نقص المناعة البشرية الحمض النووي، وإعداد اثنين من يمزج الرئيسية التي تحتوي على 1X PCR مزيج التفاعل الرئيسي (انظر جدولالمواد)، 1250 nM التمهيديات المناسبة، و 100 nM التحقيق. استخدام التمهيديات HCD3IN5 ' وHCD3IN3 ' ومسبار CD3 FamZen لتحديد CD3 الإنسان في رد فعل واحد، والتمهيديات UR2 و LambdaT والتحقيق UHIV FamZen لتحديد الحمض النووي فيروس نقص المناعة البشرية في رد فعل آخر (انظر التسلسل في الجدول 2). توزيع 13.6 ميكرولتر من كل مزيج في أنابيب قابلة للتكيف مع qPCR.
- تمييع المنتج PREAmplification PCR في 1:10 في الماء المعقم، DNase، RNase، والبروتياز مجانا. إضافة 6.4 ميكرولتر من كل عينة مخففة إلى 13.6 ميكرولتر من مزيج qPCR في أنابيب قابلة للتكيف مع qPCR لكمية التفاعل الإجمالية 20 ميكرولتر.
- تنفيذ PCR في الوقت الحقيقي باستخدام البرنامج التالي: denaturation في 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق و 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 3 s و 60 درجة مئوية ل 10 s مع اكتساب واحد.
- استقراء عدد نسخ فيروس نقص المناعة البشرية ومكافئات الخلايا العددية في كل أنبوب رد فعل من المنحنيات القياسية. حساب عدد نسخ الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية/106 خلايا.
- قياس كمية الحمض النووي الريبي HIV
- استخراج الحمض النووي الريبي من عينة من خلايا BAL، وذلك باستخدام مجموعة استخراج RNA (انظر جدولالمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم 17 ميكرولتر من هذا الحمض النووي الريبي في خطوة النسخ العكسي وpreamplification الموضحة أدناه (الخطوة 8.2.4).
- يستخدم LTR-هفوة RNA توليفها في المختبر وكميا بدقة كمعيار. هو ارتفعت في صحة متبرع استخراج الحمض النووي الريبي لتطبيع GUSB. إعداد ستة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من هذا المعيار، المقابلة ل3 × 105 خلايا إلى ثلاث نسخ من الحمض النووي الريبي LTR-هفوة في 17 درجة مئوية.
- توزيع 17 ميكرولتر من كل تخفيف قياسي وكل عينة في لوحة PCR 96-well وعلاج العينات مع DNase (انظر جدولالمواد) لمدة 10 دقائق في 25 درجة مئوية لإزالة الحمض النووي الجيني الملوث. وقف رد الفعل عن طريق إضافة 2 درجة مئوية من 25 MM EDTA واحتضان العينات لمدة 10 دقيقة في 65 درجة مئوية.
- إجراء النسخ العكسي (RT) وPREAMPlification PCR.
- قم بتنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة RT-PCR من خطوة واحدة (راجع جدولالمواد) وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدام التمهيديات GUSB إلى الأمام 1، GUSB عكس 1، UR1، وULF1 لتوليد cDNA تضخيم من كل من GUSB الإنسان كجين التدبير المنزلي وLTR-هفوة فيروس نقص المناعة البشرية RNA (انظر التسلسلفي الجدول 2). سيتم استخدام قيم GUSB لتطبيع قيم فيروس نقص المناعة البشرية.
- توزيع 31 درجة مئوية من المزيج الرئيسي لكل بئر في نفس لوحة PCR 96-well التي تحتوي على المعايير المعالجة DNase والعينات ومزيج جيدا. حجم التفاعل الكلي هو 50 درجة مئوية.
- تشغيل لوحة لمدة 16 دورات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، مع درجة حرارة الصلب من 55 درجة مئوية.
- تنفيذ PCR في الوقت الحقيقي.
- إعداد اثنين من يمزج الرئيسية التي تحتوي على 1X PCR مزيج رد الفعل الرئيسي (كما هو موضح أعلاه في الخطوة 8.1.4.1)، 1250 nM التمهيديات المناسبة، و 100 nM التحقيق. استخدام التمهيديات GUSB إلى الأمام 2، GUSB عكس 2، والتحقيق GUSB-HEX لتحديد CDNA GUSB في رد فعل واحد؛ استخدام التمهيديات UR2، LambdaT، والتحقيق UHIV FamZen لتحديد كمية فيروس نقص المناعة البشرية cDNA في رد فعل آخر (انظر التسلسل في الجدول 2).
- توزيع 13.6 ميكرولتر من كل مزيج رئيسي في أنابيب قابلة للتكيف مع qPCR. تخفيف RT preamplification PCR المنتجات 1:10 في الماء المعقم، DNase، RNase، والبروتياز مجانا، وإضافة 6.4 ميكرولتر من كل عينة مخففة أو معيار إلى مزيج PCR المناسبة. حجم التفاعل الكلي هو 20 درجة مئوية.
- تنفيذ PCR في الوقت الحقيقي باستخدام البرنامج التالي: denaturation في 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق و 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 3 ق و 60 درجة مئوية لمدة 10 ق مع اقتناء واحد (حدد القناة الخضراء لFamZen والأصفر لHEX).
Representative Results
في معظم غير المدخنين، يتم تلقي السائل BAL في حاوية معقمة وهو سائل عكر قليلا الأصفر والبرتقالي اللون. قد يكون السائل وردي اللون إذا خضع المتبرع للخزعات داخل الشعب الهوائية أثناء تنظير القصبات وحدث بعض النزيف. قد يكون السائل أغمق في اللون إذا كان المتبرع مدخنًا. بعد الطرد المركزي، فإن supernatant BAL تكون واضحة تقريبا والبرتقالي قليلا، في حين أن بيليه الخلية يمكن أن تتراوح في اللون من خارج الأبيض إلى البني الداكن جدا، اعتمادا على حالة العينة وما إذا كان المانح مدخنأم لا.
عند حساب عينة BAL بأكملها، يمكن تصور أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك أكبر، الضامة المستديرة حول 17 ميكرومتر في القطر والخلايا الليمفاوية جولة أصغر حول 7.3 ميكرومتر في القطر18،19 (انظر الشكل 2). يتم توسيع الضامة في المدخنين بحوالي 40٪18. التمييز بين أنواع الخلايا يسمح لحساب الضامة والخلايا الليمفاوية بشكل منفصل. وقد يكون هناك أيضا بعض الحطام المرئي في الميدان، ولا سيما في عينات من المدخنين. الضامة هي نوع الخلية الأكثر وفرة في BAL، مما يمثل ما يقرب من 85٪ من الخلايا في غير المدخنين20، ويتم إثراؤها في المدخنين حتى أنها قد تبدو حصرية تقريبا.
خلايا BAL لديها ميل إلى تجميع، لذلك يجب أن تكون مختلطة بشكل جيد خلال جميع التلاعبات. بيليه قد تظهر مظلمة حتى بعد عدة خطوات غسل. إذا كان الحطام الخيطي واضحًا في الكسر بعد تلطيخ الخلايا، فمرر الخلايا من خلال فلتر بـ 70 ميكرومتر قبل تشغيلها من خلال فارز الخلايا.
يجب أن يتم فرز خلايا BAL في ضغط منخفض لضمان أحجام قطرات كبيرة بما يكفي لاستيعاب الضامة. يتم الآن بوابات الخلايا لتشمل كافة خلايا CD45+21، ثم تستند إلى الجدوى لضمان استبعاد جميع الخلايا الميتة (انظر الشكل3). ثم يتم اختيار الخلايا المفردة وضمن هذا، يتم بوابات اثنين من السكان على أساس الحجم ومورفولوجيا، وهي الخلايا النخاعية أكبر والخلايا الليمفاوية أصغر (انظر الشكل 3). داخل الخلايا الكبيرة، يتم ترتيب الخلايا على CD20622و23 و CD16922 ويتم فرز الخلايا ذات الإيجابية المزدوجة كـ AMs، بينما يتم اختيار خلايا CD3+ وبوابات داخل الخلايا الأصغر حجماً وبوابات على CD4 وCD8; يتم فرز الخلايا ذات الإيجابية المفردة وCD8 أحادية الشكل (انظر الشكل3). تم اختيار العلامات المستخدمة على أساس الأنماط الظاهرية الموصوفة سابقا من AMs، مثل مستقبلات مانوز CD206، وجدت على الخلايا الفيوسية23، ومستقبلات sialoadhesin CD16922.
عند فرز PBMCs، يتم ترتيب الخلايا أولاً على مبعثر إلى الأمام والجانب الذي ينبغي أن يظهر مجموعة متجانسة من الخلايا الليمفاوية، والتي تؤخذ جميعها، باستثناء الضوضاء القريبة من المحور الصفري (البيانات غير المعروضة). يتم بوابات السكان على قابلة للحياة وCD45، وتستخدم الخلايا CD45+ الحية. ثم يتم بوابات هذه التجمعات على CD3; لعزل الخلايا الأحادية، يتم ترتيب CD3- السكان في وقت لاحق على CD14 ويتم فرز جميع الخلايا الإيجابية واحدة. لعزل المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية، يتم ترتيب خلايا CD3+ على CD4 وCD8 ويتم فرز كل من المجموعات السكانية الإيجابية وخلايا واحدة.
الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول: مخطط يوضح سير عمل البروتوكول، بما في ذلك الاستخدامات المحتملة للنماذج التي تم إنشاؤها في النضوّر. PBMC = خلايا الدم الطرفية أحادية النووية؛ BAL = غسل القصبات الهوائية. LSM = وسط فصل الخلايا الليمفاوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 مجهر المجال عرض من السائل بال كله: صور المجهرمن (أ) غير مدخن و (ب) مدخن مع الخلايا الليمفاوية المرئية (L)، الضامة (M)، وخلايا الدم الحمراء (RBC). التكبير هو 1000x (10X عدسة العين و 100X مع الغمر النفط). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 استراتيجية التجشمع التمثيلي لفرز الخلايا من خلايا BAL كاملة. استراتيجية التغواص المستخدمة لفرز الضامة السنخية (AM) وCD4 وCD8 T الخلايا من عينات خلايا BAL كاملة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عينه | جسم | فلوروكروم | استنساخ | حجم لكل اختبار (μL) |
| BAL وPBMC | يعيش / ميت | APC-H7 | - | 1 |
| CD45 | PE-Cy7 | HI30 | 5 | |
| CD3 | محمد الدوسري | محمد الدوسري | 2 | |
| CD4 | PE-cy5 | RPA-T4 | 4 | |
| CD8 | BV605 | SK1 | 3 | |
| BAL فقط | CD206 | Pe | 19-2 | 10 سنوات |
| CD169 | BB515 | 7-239 | 5 | |
| PBMC فقط | CD14 | BV786 | M5E2 | 5 |
الجدول 1: لوحة تدفق لفرز خلايا BAL بأكملها ومركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم المعزولة.
| الهدف | خطوه | اسم التمهيدي | تسلسل التمهيدي | |||
| فيروس نقص المناعة البشرية مجموع الحمض النووي أو فيروس نقص المناعة البشرية LTR-غاغا RNA | قبل تضخيم PCR | UR1 | 5'-CCA TCT CTC TCC TTC TTC TAG C-3' | |||
| ULF1 | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT TGT TCT CTC TGG TTA GAC-3' | |||||
| في الوقت الحقيقي PCR | UR2 | 5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3' | ||||
| لامدات | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3' | |||||
| UHIV FamZen: | 5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3' | |||||
| CD3 الحمض النووي | قبل تضخيم PCR | HCD3 من أصل 5' | 5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3' | |||
| HCD3 من 3' | 5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3' | |||||
| في الوقت الحقيقي PCR | HCD3 في 5' | 5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3' | ||||
| HCD 3 في 3' | 5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3' | |||||
| CD3 فامزن: | 5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3' | |||||
| GUSB RNA | قبل تضخيم PCR | GUSB إلى الأمام 1: | 5'-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3' | |||
| GUSB عكس 1: | 5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3' | |||||
| في الوقت الحقيقي PCR | GUSB إلى الأمام 2: | 5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3' | ||||
| GUSB عكس 2: | 5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3' | |||||
| GUSB-HEX: | 5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCGGACC/3IABkFQ/-3' | |||||
الجدول 2: التسلسل التمهيدي ومسبار الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية والحمض النووي الريبي القياس الكمي.
Discussion
هنا وصفنا طريقة لمعالجة السائل BAL للحصول على خلايا CD4 T وAMs، جنبا إلى جنب مع PBMCs المتطابقة، والتي يمكن دراستها للتحقيق في خزان فيروس نقص المناعة البشرية داخل الرئتين. أبلغنا مؤخرا عن قياس الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية في خلايا CD4 T من الدم المحيطي المتطابقة وعينات BAL، ومجموعتنا أظهرت أن فيروس نقص المناعة البشرية هو 13 مرات أكثر وفرة في خلايا CD4 T الرئوية مما كانت عليه في تلك من الدم المحيطي15. ومع ذلك، فإن مستويات الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية في AMs تعتمد على الجهات المانحة، وحتى الآن، لم يكن هناك ارتباط ثابت بين مستويات الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية في الخلايا الليمفاوية مقارنة الضامة15. ومع ذلك، فإن الوصول إلى هذه المجموعات الفرعية الأولية لخلايا الضامة سيكون أداة حيوية للتحقيق في هذه المسألة واكتساب فهم أفضل للحمولة الفيروسية في الرئة في سياق خزان فيروس نقص المناعة البشرية.
في حقبة ما قبل العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية وفي العديد من الدراسات الأخرى باستخدام سائل BAL، خضعالمشاركون لتنظير القصبات الهوائية من أجل تشخيص الأمراض المشتبه بها أو الحصول على تشخيص ميكروبيولوجي لأعراض الجهاز التنفسي 3. ومع ذلك، تمكنا من توظيف المشاركين دون أي أعراض رئوية نشطة أو أمراض ووقع جميع المشاركين على استمارة موافقة أخلاقية15. تمكنا من توظيف مشاركين من مركزنا الذين كانوا يشاركون في دراسات أخرى، مثل دراسة فحص قياس التنفس لمرض الرئة الانسدادي24،وكذلك أولئك الذين يخضعون لإجراءات بحثية أخرى، مثل داء اللوكاباريس، و تنظير القولون. أظهرت الأبحاث السابقة بين المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية أن الإيثار هو عامل رئيسي يحفز المشاركة في الدراسات البحثية25. كما هو الحال مع العديد من العينات البشرية، لاحظنا قدرا كبيرا من التباين بين شخص إلى شخص. لم يكن هناك طريقة "للتنبؤ" من المشاركين التي سوف نحصل على BAL مع جيدة مقابل ضعف عائدات الخلايا. على عكس الدم المحيطي، الذي ينتج أرقام متسقة إلى حد ما من الخلايا الليمفاوية، وأرقام الخلايا في السائل BAL متغيرجدا. حقن كمية أكبر من المالحة الطبيعية في الرئتين (مع الأمل في الحصول على عائد أكبر من السائل BAL) ليس من الممكن دائما كما ترتبط كميات أكبر من المالحة العادية في كثير من الأحيان مع المزيد من السعال وارتفاع خطر الحمى بعد تنظير القصبات. لاحظنا أن استخدام منظار قصبي قطري أصغر (وليس أكبر) مكن أخصائي التنفس من الوصول إلى أعمق في الشعب الهوائية والحصول على السوائل التي تحتوي على كميات أكبر من الخلايا. وكانت النتيجة المتسقة أن مدخني التبغ لديهم نسب أكبر بكثير من AMs من الخلايا الليمفاوية داخل السائل BAL، والذي من المتوقع أن تغمر AMs الحطام والجسيمات. وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن سائل BAL من المدخنين يحتوي على حطام قد يمنع المعدات المستخدمة، مثل آلات PCR وأجهزة قياس التدفق. ويمكن ملاحظة مسائل مماثلة في المناطق التي ترتفع فيها درجة التلوث أو يتعرض الأفراد لسوء نوعية الهواء على نحو أكثر تواترا.
وفيما يتعلق بدورها في إنشاء خزانات فيروس نقص المناعة البشرية والمثابرة الفيروسية، فإن نقاء خلايا CD4 T وAMs هو أحد الاعتبارات الرئيسية. لهذا السبب، اخترنا استخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) للحصول على مجموعات الخلايا النقية للغاية. ومن الممكن أيضا أن يكون السائل BAL التي تم جمعها ملوثة بالدم كما هو متوقع بعض النزيف الطفيف خلال تنظير القصبات. وجود الخلايا الساذجة B تشير إلى هذا، ويمكن غسل الخلايا في العازلة تحليل خلايا الدم الحمراء للتحايل على هذه المشكلة. وثمة تحد آخر مع دراسة السائل BAL يتعلق كميا علامات التهابية والسيتوكينات، والتي هي مهمة لفهم استمرار فيروس نقص المناعة البشرية26. كما الملال المغروس يخفف السائل BAL، قد يكون من الصعب قياس مستويات الوسطاء الالتهابية والسيتوكينات. على الرغم من أنه تم اقتراح عامل تصحيح اليوريا لحساب التخفيف، هناك القليل نسبيا من المؤلفات التي تصف استخدامه27،28.
AMs هي الفلورسنت التلقائي للغاية، مما يشكل مشكلة أثناء فرز الخلايا وتدفق تحليل الفينوتيبيك الخلوي. على وجه الخصوص، فإن التأثير هو أكثر وضوحا في المدخنين الذين AMs قد تكون سوداء تماما في اللون، مما يؤثر بشكل كبير على autofluorescence. عندما متحمس من قبل معيار الليزر الأزرق 488 نانومتر، وAUTOfluorescence AM هو في ذروته في حوالي 540 نانومتر، والذي يتداخل مع أطياف الفلورية من البوابات المستخدمة عادة مثل FITC وPE29،30. ومن الجدير بالذكر أنه يمكن استخدام ليزرين منفصلين لإثارة FITC وPE (على سبيل المثال، PE من قبل الأصفر / الأخضر وFITC بواسطة الليزر الأزرق 488). للتغلب على الفلورة الكامنة مع FITC، استخدمنا AMs غير ملطخة لتحديد خلفية autofluorescence. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام ضوابط الفلورة ناقص واحد (FMO) يمكن أن يكون مفيداً جداً لمكافحة هذه المسائل التقنية. ويمكن استخدام حبات أكبر (على سبيل المثال، 7.5 ميكرومتر)، وهي أقرب حجماً لتعويض تجمعات الضامة، مقارنة بالخرز الأصغر حجماً (على سبيل المثال، 3.0 ميكروغرام)، والتي يمكن استخدامها لتعويض مجموعات الخلايا الليمفاوية. والنهج الأكثر ملاءمة هو استخدام جزء صغير من الخلايا كضوابط وصمة عار واحدة، وذلك باستخدام علامة معروفة، وأعرب عن هاف ة على المجموعة الفرعية، مثل HLA-DR أو CD45، مترافقة مع كل من الفلوروكرومات المطلوبة، والتي من شأنها أن تسمح لأكثر من ذلك بكثير تعويض دقيق مما يمكن تحقيقه مع الخرز. في حالة عينات المدخنين، وهذا التكتيك مفيد بشكل خاص كما الضامة هي أكبر بكثير وأكثر الفلورسنت. وبالإضافة إلى ذلك، من خطوة الإعداد، يمكن أن تكون عينة BAL بأكملها مستوّلة في طبق قبل الفرز كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول، للسماح بفصل السكان عن طريق الانضمام. وبهذه الطريقة ، يمكن عزل الضامة الملتصقة عن الخلايا الأخرى غير الملتزمة مثل الخلايا الليمفاوية. التعويض هو أقل تحديا بكثير إذا تم فصل الخلايا الليمفاوية والسكان AM بدلا من فحصها معا; ومع ذلك، فإن الاعتماد على الالتزام سيؤدي إلى فقدان الضامة، وهو اعتبار مهم عندما تكون أرقام الخلايا مقيدة بالفعل. أيضا، خطوة الالتزام يمكن أن يؤدي إلى التنشيط غير المرغوب فيه من الخلايا الأحادية الملتصقة، والتي قد تؤثر على نتائج المصب التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الخلايا. يجب الموازنة بين قيمة فرز الخلايا بكفاءة إلى مجموعات أنقى مقابل تقييد وجود عدد أقل من هذه الخلايا للتجارب اللاحقة.
وقد استخدمت نماذج أخرى، أبرزها نماذج المورين، لدراسة الخصائص المناعية الضامة والبيولوجيا. في حين أن هذه النماذج مفيدة للغاية وتسمح بنظرة ثاقبة كبيرة إلى نوع الخلية التي يصعب التلاعب بها، لديهم قيود. العديد من علامات سطح الخلية تختلف بين الفئران والبشر بحيث لا يفهم تماما النمط المناعي للAMs الإنسان. ومع ذلك، يتطلب هذا النظام النموذجي تجميع العديد من الفئران للتحقق بسبب انخفاض أعداد الخلايا المتاحة من كل الحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ضرورة تجميع العينات تستبعد اعتبارات الاستعداد الوراثي والجنس. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن الجنس يلعب دورا في العدوى من الضامة من قبل فيروس نقص المناعة البشرية-1 بسبب التعبير المتباينة من عامل تقييد SAMHD-131. تمثل الرئيسيات غير البشرية (NHP) أقرب نموذج للبشر وتسهل دراسة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية (SIV) وتأثيرها على الجهاز المناعي، مما يوفر نظرة ثاقبة في دور الضامة المقيمة في الأنسجة مقارنة مع الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية. في المكاك rhesus، وقد تبين أيضا أن الضامة الرئة يعزل من BAL ميناء فيروس النسخ المتماثل المختصة; تم استخدام فحص نمو فيروسي (VOA) لتحليل سلوك SIV في الخلايا المقيمة في الأنسجة32. وهذه النتيجة ذات قيمة بحثية هامة ولكن لا يزال يتعين التحقق من صحتها في البشر قبل أن يمكن تطبيقها، ويحول ارتفاع تكلفة استخدام التقارير الوطنية عن استخدام التقارير الوطنية عن استخدام مجموعات كبيرة من العينات. وبالإضافة إلى ذلك، ستكون التدابير المضادة للفيروسات الكحالة البشرية مفيدة للعديد من التطبيقات الأخرى مثل اختبارات العدوى الفيروسية/الميكروبية في المختبر وفي دراسات مسببات الأمراض الأخرى مثل العدوى المشتركة بالسل/فيروس نقص المناعة البشرية.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ أن ينوه بالممولين: المعاهد الكندية للبحوث الصحية (منح #153082 إلى المركز، والمجلس الدولي للصحة، والمعهد الوطني للصحة؛ والمعهد الكندي للبحوث الصحية( (منح ة #153082 إلى المركز، والمعهد الكندي للبحوث الصحية، والمعهد الكندي للبحوث الصحية؛ والمعهد الكندي للبحوث الصحية؛ والمعهد الكندي للبحوث الصحية؛ والمعهد الكندي للبحوث الصحية؛ والمعهد الكندي للبحوث الصحية؛ والمعهد الكندي للبحوث الصحية؛ والمعهد الكندي للبحوث الصحية؛ و والشبكة السويدية للتنمية الدولية والأمراض المعدية في مؤسسة البحوث في كيبيك - سانتي (FRQ-S) التي منحت التمويل لCC وMAJ وكلية الطب في جامعة ماكغيل الذين منحوا التمويل لCC. كما تم دعم هذه الدراسة في جزء من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) - بتمويل من الكندية فيروس نقص المناعة البشرية علاج المشاريع (CanCURE) فريق منح HB2 - 164064 إلى MAJ، CC وNC. يحمل MAJ كرسي البحوث في كندا CIHR المستوى 2 في علم الفيروسات المناعية وCC وNC عقد FRQ-S جونيور 1 وجونيور 2 جائزة الرواتب البحثية، على التوالي. ET حاصل على جائزة RI-MUHC للعلوم في العلوم والماجستير.
وبالإضافة إلى ذلك، يود أصحاب البلاغ أن يعترفوا بخوسيه جيروارد وجميع الموظفين السريريين المشاركين في تنسيق العينات والحصول عليها، فضلاً عن المعالجين التنفسيين؛ ايكاترينا اورتشنكو، هيلين باجي- فيليت، وماري هيلين لاكومب في منصة RI- MUHC Immunophenotyping؛ والدكتورة ماريانا أورلوفا لتوفير الصور المجهرية. والأهم من ذلك، يود المؤلفون أن يشكروا العديد من المتطوعين الذين لولاهم للم يكن هذا البحث ممكناً.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
| ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
| BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
| BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
| Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
| Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
| CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
| CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
| CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
| CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
| CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
| dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
| FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
| HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
| HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
| Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
| PBS 1x | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
| PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
| RPMI 1640 1x | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
| Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
| Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride |
| Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |
References
- Chun, T. W., Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).
- Finzi, D., et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).
- Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection. Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).
- Center for Disease Control and Prevention. A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).
- Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus. Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).
- Kunisaki, K. M. Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease? Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).
- World Health Organization. WHO | Tuberculosis and HIV. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).
- Jambo, K. C., et al. Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function. Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).
- Yeligar, S. M., et al. Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).
- Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages. AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).
- Holt, P. G., et al. Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure. Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).
- Brenchley, J. M., et al. High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage. Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).
- Mwandumba, H. C., et al. Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection. The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).
- Gordon, S. B., et al. Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses. Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).
- Costiniuk, C. T., et al. HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy. AIDS. 32, 2279-2289 (2018).
- American Thoracic Society. American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).
- King, T. E. Jr Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).
- Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls. European Respiratory Journal. 50, (2017).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50, 243-248 (1985).
- Heron, M., et al. Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung. Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).
- Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Yu, Y. R. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).
- Geiser, M. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).
- Costiniuk, C. T., et al. Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study. HIV Medicine. , (2019).
- Balfour, L., et al. Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173). AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).
- Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir. Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).
- Rennard, S. I., et al. Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution. Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).
- Twigg, H. L., et al. Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects. The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).
- Duan, M., et al. Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease. The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).
- Garn, H. Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).
- Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Avalos, C. R., et al. Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).
