Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Verarbeitung von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit und abgestimmtem peripherem Blut von chronisch HIV-infizierten Personen auf antiretrovirale Therapie zur Beurteilung von lungenen HIV-Reservoirs. Diese Methoden führen zum Erwerb von hochreinen CD4-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen, die anschließend zur Immunphenotypisierung und HIV-DNA/RNA-Quantifizierungen durch ultraempfindliche Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt werden können.
Abstract
Bronchoskopie ist ein medizinisches Verfahren, bei dem normale Saline über ein Bronchoskop in die Lunge injiziert wird und dann abgesaugt wird, wodurch Bronchoalveolar-Lavage (BAL)-Flüssigkeit entfernt wird. Die BAL-Flüssigkeit ist zellreich und kann somit eine "Schnappschuss" des lungenen Immunmilieus liefern. CD4-T-Zellen sind die am besten charakterisierten HIV-Reservoirs, während es starke Hinweise darauf gibt, dass Gewebemakrophagen, einschließlich Alveolarmakrophagen (AMs), auch als virale Reservoirs dienen. Über die Rolle von AMs im Zusammenhang mit der Einrichtung und Wartung von HIV-Reservoirs ist jedoch noch vieles unbekannt. Daher ist die Entwicklung eines Protokolls zur Verarbeitung von BAL-Flüssigkeit zur Gewinnung von Zellen, die in virologischen und immunologischen Assays zur Charakterisierung und Bewertung der Zellpopulationen und Teilmengen innerhalb der Lunge verwendet werden können, für das Verständnis der Rolle der Lunge als HIV relevant. Stauseen. Hierin beschreiben wir ein solches Protokoll, das Standardtechniken wie einfache Zentrifugation und Durchflusszytometrie verwendet. Die CD4-T-Zellen und AMs können dann für nachfolgende Anwendungen verwendet werden, einschließlich Immunphenotypisierung und HIV-DNA- und RNA-Quantifizierung.
Introduction
Eine der größten Herausforderungen für eine Heilung einer HIV-Infektion ist das Vorhandensein des latenten HIV-Reservoirs, das nach der Unterbrechung der antiretroviralen Therapie (ART)1,2eine Erholung der Plasmavirämie verursacht. Während das HIV-Reservoir während der Langzeit-ART in mehreren Gewebeteilen gut dokumentiert ist, einschließlich sekundärer Lymphorgane, Darm-assoziiertem Lymphgewebe (GALT) und des zentralen Nervensystems (ZNS), wurde die Lunge als Untersuchungsgebiet übersehen. seit der Vor-ART-Ära3. Die Lunge spielt jedoch eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von HIV. Tatsächlich gehörten Lungensymptome zu den ersten Indikatoren für AIDS-bedingte opportunistische Infektionen4. Selbst in der modernen ART-Ära haben HIV-Infizierte ein höheres Risiko, sowohl an infektiösen als auch nicht infektiösen Lungenerkrankungen zu erkranken als Menschen ohne HIV. Zum Beispiel sind Menschen mit HIV-Infektion eneinem erhöhten Risiko für invasive Streptokokken-Pneumonie-Infektion, sowie chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD)5,6. Darüber hinaus stellt die Mitinfektion von Tuberkulose (TB) und HIV in bestimmten Regionen der Welt, insbesondere in Afrika südlich der Sahara, eine erhebliche Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar, da HIV-Infizierte 16- bis 27-mal häufiger an Tuberkulose leiden als Hiv-Infizierte7. Obwohl einige Erklärungen für diese Anfälligkeit für Lungeninfektionen und chronische Krankheiten vorgeschlagen wurden8,9,10, die genauen zellulären Mechanismen, durch die Personen mit unterdrücktem HIV Plasmaviruslast weiterhin ein höheres Risiko für lungenmonale Komplikationen sind nicht vollständig aufgeklärt. Wichtig ist, dass HIV ein sehr starker Risikofaktor für Lungeninfektionen und chronische Krankheiten ist, unabhängig vom Raucherstatus6.
Die Analyse der Immunumgebung der Lunge ist daher von entscheidender Bedeutung, um ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Obwohl nichtinvasive, induzierte Sputumproben in der Regel große Mengen an Epithelzellen und Ablagerungen mit seltenen pulmonalen Lymphozyten und ohne AMs enthalten, beschränkt sie ihre Rolle auf bestimmte Anwendungen. Umgekehrt können große Biopsien des Gewebes nicht in Ermangelung einer vermuteten Erkrankung aufgrund des damit verbundenen Risikos von signifikanten Blutungen und Pneumothorax (Kollaps der Lunge) erhalten werden. Darüber hinaus befindet sich die Mehrheit der lungenen Immunzellen hauptsächlich auf der Schleimhautebene, wo die Lunge während der Atmung kontinuierlich durch Antigene stimuliert wird. Zu diesem Zweck hat die Bronchoskopie zur Gewinnung von BAL-Flüssigkeit den Vorteil, dass sie einen relativ sicheren Zugang zu Lymphozyten und AMs bietet (siehe Abbildung 1). Makrophagen stellen den größten Anteil an Zellen innerhalb der BAL-Flüssigkeit dar, gefolgt von Lymphozyten11. Es ist daher sinnvoll, ein Verfahren festzulegen, mit dem BAL-Flüssigkeit für die Verwendung in späteren Anwendungen wie Immunphenotypisierung, Zellkultur, Transkriptomik oder weiteren Anwendungen verarbeitet werden kann. Das hier skizzierte Protokoll zur Verarbeitung der BAL-Flüssigkeit wird an die zuvor beschriebenen allgemeinen Verfahren angepasst und für die verschiedenen eingesetzten Downstream-Assays optimiert. Diese Methode ermöglicht die Isolierung sowohl pulmonaler Lymphoid- als auch myeloischer Schleimhautimmunzellen für ihre phänotypische und funktionelle Charakterisierung sowie eine Bewertung des HIV-Reservoirs bei Erwachsenen, die mit HIV leben.
Um dieses Protokoll zu erstellen, haben wir die folgenden Kriterien verwendet, um Studienteilnehmer zu rekrutieren15. Damit die Teilnehmer an dieser Studie teilnehmen können, mussten sie HIV-infizierte Personen sein, die mindestens drei Jahre lang die folgenden Kriterien erfüllten: (1) auf ART; (2) unterdrückte Viruslast (VL) für mindestens 3 Jahre; (3) CD4 T-Zellzahl von 200/mm3; (4) bereit, sich der Forschungsspirometrie und Bronchoskopie zu unterziehen. Patienten mit folgenden Kriterien wurden von der Studie ausgeschlossen: (1) Kontraindikation(en) zur Bronchoskopie; (2) hohes Blutungsrisiko: Koagulopathie oder Warfarin- oder Clopidogrel-Therapie; (3) Thrombozytopenie (niedrige Thrombozyten); (4) aktive Lungeninfektion oder ein anderer akuter pulmonischer Prozess; (5) Schwanger werden/versuchen, schwanger zu werden.
Protocol
Dieses Forschungsprotokoll wurde direkt auf der Grundlage der in der Erklärung von Helsinki enthaltenen Grundsätze erstellt und von den Institutionellen Fachkollegien des McGill University Health Centre (RI-MUHC, #15-031), der Université du Québec, genehmigt. Montréal (UQAM, #602) und das Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CR-CHUM, #15-180).
1. Bronchoalveolar Lavage
HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Bronchoskopie, die von einem lizenzierten Respirologen mit Unterstützung eines Atemtherapeuten durchgeführt wird16,17.
- Bereiten Sie die für den Eingriff benötigten Geräte vor, einschließlich eines Bronchoskops und einer Saline. Anästhetikum an der Rückseite des Rachens des Patienten verabreichen. Vermeiden Sie eine übermäßige Anwendung der topischen Anästhesie, wenn möglich. Tragen Sie Herzführt zur Brust auf, um die Herzfrequenz und den Rhythmus und eine Sauerstoffsonde auf den ersten Finger einer Hand zu überwachen, um die Sauerstoffsättigung zu überwachen. Setzen Sie Nasenkanüle in die Nasenlöcher, um zusätzlichen Sauerstoff zu liefern.
- Positionieren Sie den Patienten vorzugsweise in der Supine-Position. Sedierung wie folgt verabreichen: Midazolam 0,01-0,04 mg/kg und Fentanyl 50-100 g (zur Erleichterung des Patientenkomforts und zur Minimierung des Hustenreflexes) inGegenwart eines Respirologen oder Anästhesisten intravenös.
- Fördern Sie das flexible Bronchoskop, bis es in den gewünschten subsegmentalen Bronchus eingekeilt ist. Mit der Spritze die Saline (50-60 ml) einflößen und dann eine sanfte Absaugung (50-80 mmHg) auftragen. Die Spülflüssigkeit sammelt sich in der Spritze und wird dann in einen Sammelbehälter überführt.
- Wiederholen Sie den Spülvorgang auf insgesamt 200-300 ml Lavage. Sammeln Sie nach Möglichkeit mindestens 100 ml BAL-Flüssigkeit.
- Legen Sie die BAL-Flüssigkeit auf Eis.
2. Isolierung von BAL-Zellen
HINWEIS: Das folgende Verfahren muss unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II (BSL2) oder höher durchgeführt werden.
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Bewahren Sie die BAL-Proben auf Eis auf, bis sie verarbeitet werden.
- Wirbeln Sie den BAL im Original-Sammelrohr und übertragen Sie ihn mit einer serologischen Pipette in ein 50 ml-Rohr. Wenn die BAL-Flüssigkeit sehr trüb oder durch fadenförmiges Gewebe kontaminiert erscheint, filtern Sie die Flüssigkeit durch einen 70 m-Nylon-Netzfilter in ein neues 50 ml-Rohr.
- Zentrifuge bei 200 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 50 ml Rohr. Das Pellet vorsichtig mit einer Pipettenspitze aufbrechen und in 1 ml RPMI 1640 medium wieder aufhängen.
- Übertragen Sie 1 ml des Überstandes auf jeweils 10x 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre und den restlichen Überstand auf 15 ml Rohre, jeweils 10 ml. Alle überstandenen Rohre bei -80 °C lagern.
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Verarbeiten Sie das BAL-Zellpellet.
- Setzen Sie das Pellet in 10 ml RPMI 1640 für jeweils 25 ml der Originalprobe wieder aus. Zentrifuge bei 200 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 15 ml Rohr (entsorgen, nachdem sichergestellt ist, dass sich genügend Zellen im Pellet befinden).
- Setzen Sie das Pellet in 1 ml RPMI 1640 + 10% fetales Rinderserum (FBS) wieder auf und zählen Sie mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
HINWEIS: Wenn die BAL-Flüssigkeit nicht durch die Haftung der Zellen vor der Sortierung getrennt wird, fahren Sie mit Abschnitt 4 fort.
3. Haftung von BAL-Zellen (optional)
HINWEIS: Dieses alternative Protokoll kann vor oder anstelle der Zellensortierung ausgeführt werden. Das folgende Verfahren muss unter sterilen Bedingungen in einem BSL2-Schrank (oder höher) durchgeführt werden.
- Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von BAL-Zellen für die Sortierung in ein neues 15 ml-Rohr und bilden Sie das richtige Volumen für 1,5 x 106 Makrophagen/ml. Platte 2 ml Zellen pro Brunnen in 6-Well-Platten und inkubieren für 2h bei 37 °C mit 5 % CO2, um Zeit für die Haftung zu lassen.
- Nach der Inkubation das Medium, das nicht haftende Zellen enthält, sorgfältig ansaugen und in ein 15 ml-Rohr übertragen. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn bei 1 x 107 Zellen/ml in phosphatgepufferter Saline (PBS) + 2 % FBS wieder auf und übertragen Sie die Suspension in ein 5 ml rundes Polystyrolrohr. Diese Lymphozytenfraktion ist nun bereit, für die Zellsortierung zu färben.
- Zu den verbleibenden haftenden Zellen in der Platte 1 ml pro Bohrkörper der Zelldisassoziationslösung hinzufügen (siehe Materialtabelle) und mindestens15 min bei 37 °C mit 5% CO2 brüten, bis sich die Zellen mit einer Pipettespitze leicht von der Platte trennen.
- Die anhaftenden Zellen mit einer Pipettenspitze vorsichtig, aber gründlich von der Brunnenoberfläche abkratzen und 1 ml Flüssigkeit im Brunnen verwenden, um die Ablösung zu unterstützen. Übertragen Sie die Zellen in ein neues 15 ml-Rohr. Waschen Sie die Brunnen mit 1 ml PBS und fügen Sie diese in das gleiche Rohr. Machen Sie den Inhalt der Röhre auf 5 ml mit PBS.
- Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie bei 1 x 107 Zellen/ml PBS + 2% FBS auf und übertragen Sie die Suspension auf ein 5 ml rundbodeniges Polystyrolrohr. Diese myeloische Fraktion ist nun bereit, für die Zellsortierung zu färben.
4. Isolierung von peripheren Mononuklezellen im Blut
HINWEIS: Das folgende Verfahren muss unter sterilen Bedingungen in einem BSL2-Schrank (oder höher) durchgeführt werden.
- Am selben Tag der Bronchoskopie (in der Regel direkt vor der BAL-Sammlung) erhalten sechs Tuben venöses Blut von einem Spender in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Röhren (ca. 10 ml pro Tube).
- Trennen Sie das Blut durch Zentrifugieren der Blutröhrchen bei 300 x g für 15 min bei RT. Übertragen Sie das Plasma in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in 1 ml Aliquots und lagern Sie es bei -80 °C.
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Führen Sie die Dichtegradiententrennung durch.
- Fügen Sie 2 ml RPMI 1640 zu jedem Blutröhrchen hinzu und mischen Sie sie gut mit einer serologischen Pipette.
- In 3x 50 ml Rohre übertragen und das Volumen in jedem Rohr mit RPMI 1640 auf 25 ml aufstellen.
- Bereiten Sie eine weitere Charge von 3x 50 ml Tuben vor, die jeweils 20 ml Lymphozytentrennmedium (LSM) enthalten (siehe Materialtabelle) bei RT. Langsam und sanft schichten Sie die 25 ml verdünntes Blut auf dem LSM für jedes der drei Röhren, wobei das Rohr in einem 45°-Winkel gehalten wird. .
- Zentrifuge bei 600 x g für 25 min bei RT mit geringer Beschleunigung und ohne Verzögerung (Bremse).
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Waschen von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs).
- Übertragen Sie die Zellschicht an der Schnittstelle der beiden flüssigen Phasen im Rohr mit einer serologischen Pipette in ein 50 ml-Rohr; wenn mehr als 30 ml Volumen vorhanden sind, teilen Sie es in zwei Rohre auf. Machen Sie das Volumen in jedem Rohr mit PBS auf 50 ml.
- Zentrifuge bei 700 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.
- Setzen Sie das Pellet wieder auf und bilden Sie das Volumen mit PBS auf 25 ml. Zentrifuge bei 350 x g für 10 min bei RT und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.
- Wiederholen Sie den in Schritt 4.4.3 beschriebenen Waschschritt.
- Setzen Sie das Pellet in 5 ml PBS + 2% FBS aus und zählen Sie die Zellen.
5. Sortieren ganzer BAL-Zellen und PBMCs
HINWEIS: Das folgende Verfahren muss unter sterilen Bedingungen in einem BSL2 (oder höher) durchgeführt werden.
- Vorbereiten des Sortierpuffers mit PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7.4). Bereiten Sie 5 ml rundbodenige Polystyrolröhren mit 1 ml FBS für die Sammlung sortierter Zellteilmengen vor.
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Führen Sie Färbung.
- Bereiten Sie 3x 5 ml rundbodenige Polystyrolröhren vor, jeweils für BAL (ganze Zellen oder Lymphozyten- und Myeloidfraktionen nach Deritonie) und PBMCs (siehe Abschnitt 4). Bereiten Sie für jede Teilmenge ein Rohr mit zu sortierenden Zellen und zwei Röhren mit 5 x 105 Zellen für ungefärbte und lebensfähigkeitsgefährdete Fleckenkompensationskontrollen vor.
- Zentrifuge bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie die Überräube, setzen Sie die Zellen für Kontrollen in 100 l PBS wieder aus und lagern Sie sie bei 4 °C, bis die Kompensationskontrollen wie in Schritt 5.2.6 beschrieben vorbereitet werden können.
- Bereiten Sie eine 1:20 Verdünnung des Fc-Rezeptor-Blockern(FcR)-Blockerreagenz esregt in PBS + 5% FBS vor (siehe Materialtabelle-, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an FcR an FcR-exebrierende Zellen zu verhindern). Setzen Sie die Zellen wieder aus, um sie an 1 x 107 Zellen in 250 l fcR-blockierender Mischung zu sortieren. Inkubieren Sie sie für 1 h bei 4 °C.
- Nach der Inkubation den entsprechenden Antikörpercocktail (siehe Tabelle1) in die Zellen geben und im Dunkeln 1 h bei 4 °C brüten.
- Nach 1 h Färbung 1 ml PBS zu den Zellen und Zentrifugen bei 350 x g für 5 min bei 4 °C geben. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen im Sortierpuffer wieder auf, um 1 x 107 Zellen in 250 l zu haben. Filtern Sie die Zellen bei Bedarf durch einen 70-mm-Filter.
- Bereiten Sie Kompensationskontrollen vor.
- Fügen Sie je drei Tropfen Anti-Maus-Ig-, B- und Negativkontrollkompensationsperlen (siehe Materialtabelle)pro 1 ml PBS in einem Mikrozentrifugenrohr hinzu und übertragen Sie 100 l auf jedes 5 ml runde Polystyrolrohr, das zur Kompensation verwendet werden soll. Bereiten Sie eine Röhre für jedes Fluorchrom vor, das im Cocktail enthalten ist.
- Fügen Sie 1 L von jedem Antikörper im Cocktail in eine andere Tube mit Perlen. Fügen Sie einem der Inröhrchen von 5 x 105 Zellen, die in Schritt 5.2.1 beiseite gelegt werden, einen L-L-Lebensfähigkeitsfleck hinzu. 20 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml PBS in jedes Rohr und Zentrifuge bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 l PBS wieder auf. Bei 4 °C im Dunkeln lagern, bis es nötig ist.
- Sortieren Sie die Zellen nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) in Sammelröhrchen, die mit 1 ml FBS hergestellt werden, und wirbeln Sie sanft, um die Seiten der Rohre mit Serum zu beschichten.
- Sortieren Sie BAL-Zellen bei niedrigem Druck. Gate-Zellen zuerst rauschen auszuschließen und enthalten live, CD45+ Zellen, und innerhalb dieser Grundgesamtheit Gate aus Doppelzellen (siehe Abbildung 3). Innerhalb der größeren myeloischen Population sortieren CD206 und CD169 doppelte positive Zellen als AMs; innerhalb der kleineren Lymphozytenpopulation isolieren CD3+ Zellen und sortieren sowohl CD4- als auch CD8-Einzel-positive Populationen (siehe Abbildung 3; Gating-Strategie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse).
- Beim Sortieren von PBMCs schließen Gate-Zellen zuerst Rauschen aus und schließen live, CD45+ Zellen und innerhalb dieser Grundgesamtheit Gate aus Doppelzellen. Als nächstes Gate auf CD3-Zellen und innerhalb der CD3- Population, Gate zuerst auf CD14 und sortieren einzelne positive Monozyten, und dann innerhalb der CD3+ Population Gate auf CD4 und CD8 und sortieren beide einzelnen positiven Populationen (Gating-Strategie in der Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
6. Immunophenotypisierung von AMs und PBMCs
HINWEIS: Das folgende Verfahren muss unter sterilen Bedingungen in einem BSL2-Schrank (oder höher) durchgeführt werden.
- Addieren Sie jeweils bis zu 1 Million AMs und PBMCs zu zwei separaten 5 ml runden Polystyrolröhren. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
- Führen Sie fcR-Blockierung durch, um die Spezifität der Antikörperfärbung zu verbessern. Setzen Sie dazu die Zellen in 100 l PBS + 2% FBS wieder aus und fügen Sie 1,4 l FcR-Blockierungsreagenz hinzu. 20 min bei 4 oCinkubieren.
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Führen Sie extrazelluläre Färbung.
- Nach der Inkubation mit FcR-Block den gewünschten extrazellulären Antikörpercocktail hinzufügen, die Schläuche wirbeln und 1 h bei 4 °C im Dunkeln brüten.
- 2x waschen, indem Man 500 l PBS und Zentrifugieren bei 350 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen.
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Vorbereitung auf Fixierung und Permeabilisierung (siehe Materialtabelle für bestimmte verwendete Reagenzien).
- Bereiten Sie permeabilization Solution mit 1 Teil Permeabilisationspuffer und 3 Teilen Verdünnungspuffer vor. Das Pellet in 1 ml Permeabilisationslösung aussetzen und 40 min bei 4 °C im Dunkeln brüten.
- Bereiten Sie Die Waschlösung mit 1Teil Waschpuffer und 4 Teilen H2 O. Fügen Sie 2 ml Waschlösung zu den permeabilisierten Zellen und Zentrifuge bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
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Führen Sie intrazelluläre Färbung durch.
- Die Zellen in 100 l 1x Waschlösung wieder aufsetzen, die gewünschten intrazellulären Antikörper hinzufügen, die Röhrchen wirbeln und im Dunkeln mindestens 1 h bei 4 °C brüten.
- 2 ml Waschlösung und Zentrifuge bei 350 x g für 5 min bei RT hinzufügen. Den Überstand entfernen und das Pellet in 200 l PBS wieder aufhängen. Bewahren Sie die Zellen bei 4 °C im Dunkeln auf, bis sie benötigt werden.
7. Rest der BAL-Zellen
HINWEIS: Das folgende Verfahren muss unter sterilen Bedingungen in einem BSL2-Schrank (oder höher) durchgeführt werden.
- Zellnummern erlauben, kryokonservieren lebende Zellen aus dem BAL-Zellpellet (ab Schritt 2.2.2).
- Bereiten Sie Gefriermedien mit 90% FBS + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) vor.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie in 1,5 ml Gefriermedium in einer kryogenen Durchstechflasche aus. Die kryogenen Durchstechflaschen in einen gefrierbaren Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate (siehe Materialtabelle)übertragen und bei -80 °C platzieren. Übertragen Sie die Zellen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff, sobald die Temperatur erreicht ist.
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Bewahren Sie die BAL-Zellen als trockene Pellets auf.
- Übertragen Sie die verbleibenden Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifuge in einer Gegen-Top-Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet bei -80 °C lagern.
8. HIV-DNA und RNA-Quantifizierung
HINWEIS: Das folgende Verfahren muss unter sterilen Bedingungen in einem BSL2-Schrank (oder höher) durchgeführt werden.
- HIV-DNA-Quantifizierung insgesamt
- Um die Hemmung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit BAL-Lysat-Abfall zu vermeiden, verwenden Sie ein DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle), um DNA aus einer Probe von BAL-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Verwenden Sie 15 l dieser DNA in Kombination mit einem Master-Mix im unten beschriebenen Vorverstärkungsschritt (Schritt 8.1.3).
- Bereiten Sie Standard-Kurvenverdünnungen vor.
- Verwenden Sie wie oben ein DNA-Extraktionskit, um DNA aus einem Pellet von 2 x 106 ACH-2-Zellen zu extrahieren (siehe Tabelle der Materialien).
- Führen Sie nach der Elution der DNA serielle 10-fache Verdünnungen der ACH-2-DNA durch, um sechs Verdünnungen zu erzeugen, die von 3 x 105 Zellen bis zu 3 Zellen pro 15 l reichen.
- Führen Sie einen Vorverstärkungsschritt aus.
- Bereiten Sie in einem separaten Raum den Master-Mix für n + 2 Proben vor, die 1x Polymerase-Puffer, 3 mM MgCl2, 300 M dNTPs und 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (siehe Materialtabelle)und 300 nM jeder der vier Primer (siehe Schritt 8.1.3.2). Führen Sie alle Maßnahmen in dreifachen Brunnen durch.
- Verwenden Sie primer hCD3OUT5', hCD3OUT3', ULF1 und UR1, um amplifizierte DNA sowohl aus humanem CD3 als auch aus HIV zu erzeugen (siehe die Sequenzen in Tabelle 2). Beachten Sie, dass beide Gene in der gleichen Röhre vorverstärkt werden. Mischen Sie sanft und drehen Sie das Rohr nach unten, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten.
- Verteilen Sie 35 l Master-Mix pro Bohrung in einer 96-Well-PCR-Platte und fügen Sie 15 l Standard- oder Proben-DNA hinzu. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 50 l.
- Führen Sie die Vorverstärkung (Denaturierung bei 95 °C für 8 min, gefolgt von 12 Zyklen von 95 °C für 1 min, 55 °C für 40 s, 72 °C für 1 min und Dehnung bei 72 °C für 15 min).
- Führen Sie Echtzeit-PCR durch.
- Zur Quantifizierung von CD3- und HIV-DNA bereiten Sie zwei Master-Mischungen vor, die den 1x PCR-Reaktions-Master-Mix (siehe Tabelle derMaterialien), 1.250 nM geeignete Primer und 100 nM-Sonde enthalten. Verwenden Sie die Primer HCD3IN5' und HCD3IN3' und sondieren CD3 FamZen, um menschliche CD3 in einer Reaktion zu quantifizieren, und primer UR2 und LambdaT und Sonde UHIV FamZen, um HIV-DNA in einer anderen Reaktion zu quantifizieren (siehe die Sequenzen in Tabelle 2). Verteilen Sie 13,6 l jeder Mischung in qPCR-angepassten Rohren.
- Verdünnen Sie das Preamplifikations-PCR-Produkt bei 1:10 in sterilem Wasser, DNase, RNase und Proteasefrei. Fügen Sie 6,4 l jeder verdünnten Probe zu 13,6 l qPCR-Mischung in qPCR-angepassten Röhren für ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 l hinzu.
- Führen Sie die Echtzeit-PCR mit folgendem Programm durch: Denaturierung bei 95 °C für 4 min und 40 Zyklen von 95 °C für 3 s und 60 °C für 10 s mit Einzelerfassung.
- Extrapolieren Sie die Anzahl der HIV-Kopien und die Anzahl der Zelläquivalente in jedem Reaktionsrohr aus den Standardkurven. Berechnen Sie die Anzahl der HIV-DNA-Kopien/106 Zellen.
- HIV-RNA-Quantifizierung
- Extrahieren Sie RNA aus einer Probe von BAL-Zellen, mit einem RNA-Extraktionskit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 17 l dieser RNA in dem unten beschriebenen Reverse-Transkriptions- und Vorverstärkungsschritt (Schritt 8.2.4).
- LTR-Gag-RNA synthetisiert in vitro und genau quantifiziert wird als Standard verwendet; es wird in gesunde Spender-RNA-Extrakt für GUSB-Normalisierung gespickt. Bereiten Sie sechs serielle 10-fache Verdünnungen dieses Standards vor, was 3 x 105 Zellen drei Kopien von LTR-Gag-RNA in 17 l entspricht.
- Verteilen Sie 17 l jeder Standardverdünnung und jeder Probe in einer 96-Well-PCR-Platte und behandeln Sie die Proben mit DNase (siehe Materialtabelle) 10 min bei 25 °C, um die genomische Schadstoff-DNA zu entfernen. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 2 l von 25 mM EDTA hinzufügen und die Proben für 10 min bei 65 °C inkubieren.
- Führen Sie Reverse Transkription (RT) und Vorverstärkung PCR.
- Führen Sie diesen Schritt mit einem einstufigen RT-PCR-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Verwenden Sie die Primer GUSB forward 1, GUSB reverse 1, UR1 und ULF1, um verstärkte cDNA sowohl aus humanem GUSB als Housekeeping-Gen als auch aus LTR-Gag-HIV-RNA zu erzeugen (siehe die Sequenzen in Tabelle 2). Die GUSB-Werte werden verwendet, um die HIV-Werte zu normalisieren.
- Verteilen Sie 31 l Master-Mix pro Bohrung in der gleichen 96-Well-PCR-Platte, die die DNase-behandelten Standards und Proben enthält, und mischen Sie sie gut. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 50 l.
- Führen Sie die Platte für 16 Zyklen gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit einer Glühtemperatur von 55 °C.
- Führen Sie Echtzeit-PCR durch.
- Bereiten Sie zwei Master-Mischungen vor, die 1x PCR-Reaktionsmaster-Mix (wie oben in Schritt 8.1.4.1), 1250 nM geeignete Primer und 100 nM Sonde enthalten. Verwenden Sie Primer GUSB forward 2, GUSB reverse 2, und sondieren Sie GUSB-HEX, um GUSB cDNA in einer Reaktion zu quantifizieren; Ur2, LambdaT und Sonde UHIV FamZen verwenden, um HIV-cDNA in einer anderen Reaktion zu quantifizieren (siehe die Sequenzen in Tabelle 2).
- Verteilen Sie 13,6 l von jedem Master-Mix in qPCR-angepassten Rohren. Verdünnen Sie die RT-Vorverstärkungs-PCR-Produkte 1:10 in sterilem Wasser, DNase, RNase und Proteasefrei, und fügen Sie 6,4 l jeder verdünnten Probe oder normierten Probe oder Norm in den entsprechenden PCR-Mix ein. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 20 l.
- Führen Sie die Echtzeit-PCR mit folgendem Programm durch: Denaturierung bei 95 °C für 4 min und 40 Zyklen von 95 °C für 3 s und 60 °C für 10 s mit einmaliger Erfassung (wählen Sie den grünen Kanal für FamZen und gelb für HEX).
Representative Results
Bei den meisten Nichtrauchern wird BAL-Flüssigkeit in einem sterilen Behälter empfangen und ist eine leicht trübe gelb-orange farbenfrohe Flüssigkeit. Die Flüssigkeit kann rosafarbener sein, wenn der Spender während der Bronchoskopie endobronchiale Biopsien durchlief und einige Blutungen auftraten. Die Flüssigkeit kann dunkler sein, wenn der Spender raucherist. Nach der Zentrifugation wird der BAL-Überstand fast klar und leicht orange sein, während das Zellpellet in der Farbe von off-white bis sehr dunkelbraun reichen kann, abhängig vom Zustand der Probe und ob der Spender raucher war oder nicht.
Beim Zählen der gesamten BAL-Probe können verschiedene Zelltypen visualisiert werden, einschließlich größerer, runder Makrophagen mit einem Durchmesser von etwa 17 m und kleineren runden Lymphozyten mit einem Durchmesser von18,19 (siehe Abbildung 2). Makrophagen werden bei Rauchern um etwa 40%18vergrößert. Die Unterscheidung zwischen den Zelltypen ermöglicht es, die Makrophagen und Lymphozyten getrennt zu zählen. Es kann auch einige Trümmer auf dem Feld sichtbar sein, vor allem in Proben von Rauchern. Makrophagen sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp in der BAL, macht etwa 85% der Zellen bei Nichtrauchern20aus, und sie sind bei Rauchern angereichert, so dass sie fast exklusiv erscheinen können.
Die BAL-Zellen neigen dazu, sich zu aggregieren, daher müssen sie bei allen Manipulationen gut gemischt werden. Das Pellet kann auch nach mehreren Waschschritten dunkel erscheinen. Wenn fadenförmige Räuschchen in der Fraktion nach der Färbung für die Zellsortierung sichtbar sind, passieren Sie die Zellen durch einen 70-m-Filter, bevor Sie sie durch den Zellsortierer führen.
Die Sortierung von BAL-Zellen muss unter niedrigem Druck erfolgen, um sicherzustellen, dass Tröpfchengrößen groß genug sind, um die Makrophagen aufzunehmen. Die Zellen werden zuerst mit allen CD45+21-Zellen abgegrenzt und dann auf der Grundlage der Lebensfähigkeit verwendet, um sicherzustellen, dass alle abgestorbenen Zellen ausgeschlossen sind (siehe Abbildung 3). Singlet-Zellen werden dann ausgewählt und innerhalb dieser werden zwei Populationen basierend auf Größe und Morphologie abgegrenzt, nämlich größere myeloische Zellen und kleinere Lymphozyten (siehe Abbildung 3). Innerhalb der größeren Zellen werden Zellen auf CD20622,23 und CD16922 abgegrenzt und die doppelpositiven Zellen werden als AMs sortiert, während innerhalb der kleineren Zellen CD3+ Zellen auf CD4 und CD8 ausgewählt und geziert werden; CD4-Einzel- und CD8-Einzel-Positivzellen werden sortiert (siehe Abbildung 3). Die verwendeten Marker wurden auf der Grundlage zuvor beschriebener Phänotypen von AMs ausgewählt, wie dem Mannoserezeptor CD206, der auf phagozytischen Zellen23gefunden wurde, und dem Sialoadhesin-Rezeptor CD16922.
Beim Sortieren der PBMCs werden die Zellen zuerst nach vorne und seitlich gestand, die eine homogene Lymphozytenpopulation aufweisen sollten, die alle genommen werden, mit Ausnahme von Rauschen in der Nähe der Nullachse (Daten nicht dargestellt). Die Population wird auf Lebensfähigkeit und CD45 abgegrenzt, und Live-CD45+ Zellen werden verwendet. Diese Population wird dann auf CD3 abgegrenzt; um Monozyten zu isolieren, wird die CD3-Population anschließend auf CD14 abgegrenzt und alle einzelnen positiven Zellen sortiert. Um Lymphozyten-Untermengen zu isolieren, werden die CD3+ Zellen auf CD4 und CD8 abgegrenzt und sowohl einzelne positive als auch Zellpopulationen sortiert.
Abbildung 1 : Protokollübersicht. Ein Schaltplan, der den Workflow des Protokolls anzeigt, einschließlich möglicher nachgelagerter Verwendungen der generierten Samples. PBMC = periphere mononukleäre Blutzellen; BAL = bronchoalveolare Lavage; LSM = Lymphozytentrennmedium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Mikroskopfeldansicht der gesamten BAL-Flüssigkeit. Mikroskopbilder von (A) einem Nichtraucher und (B) einem Raucher mit sichtbaren Lymphozyten (L), Makrophagen (M) und roten Blutkörperchen (RBC). Die Vergrößerung erfolgt aus 1.000x (10x Okular- und 100-fache Linse mit Öleintauchen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Repräsentative Gating-Strategie für die Zellsortierung ganzer BAL-Zellen. Gating-Strategie verwendet, um alveolar Makrophagen (AM), CD4 und CD8 T-Zellen aus ganzen BAL-Zellproben zu sortieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| probe | antikörper | Fluorochrom | klonieren | Volumen pro Test (L) |
| BAL und PBMC | Live/Dead | APC-H7 | - | 1 |
| CD45 | PE-Cy7 | HI30 | 5 | |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 2 | |
| CD4 | PE-cy5 | RPA-T4 | 4 | |
| CD8 | BV605 | SK1 | 3 | |
| NUR BAL | CD206 | Pe | 19,2 | 10 |
| CD169 | BB515 | 7-239 | 5 | |
| Nur PBMC | CD14 | BV786 | M5E2 | 5 |
Tabelle 1: Flusspanel zur Sortierung ganzer BAL-Zellen und isolierter PBMCs.
| zielscheibe | schritt | Primername | Primer-Sequenz | |||
| HIV Total DNA oder HIV LTR-Gag RNA | Vorverstärkung PCR | UR1 | 5'-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3' | |||
| ULF1 | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3' | |||||
| Echtzeit-PCR | UR2 | 5'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3' | ||||
| LambdaT | 5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3' | |||||
| UHIV FamZen: | 5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IAbkFQ/-3' | |||||
| CD3 DNA | Vorverstärkung PCR | HCD3 aus 5' | 5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3' | |||
| HCD3 aus 3' | 5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3' | |||||
| Echtzeit-PCR | HCD3 in 5' | 5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3' | ||||
| HCD 3 in 3' | 5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3' | |||||
| CD3 FamZen: | 5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IAbkFQ/-3' | |||||
| GUSB-RNA | Vorverstärkung PCR | GUSB Vorwärts 1: | 5'-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3' | |||
| GUSB Reverse 1: | 5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3' | |||||
| Echtzeit-PCR | GUSB Vorwärts 2: | 5'-TGC TGG CTA CTT GAA G-3' | ||||
| GUSB Reverse 2: | 5'- CCT TGT CTG CAT AGT TAG A-3' | |||||
| GUSB-HEX: | 5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IAbkFQ/-3' | |||||
Tabelle 2: Primer- und Sondensequenzen für HIV-DNA und RNA-Quantifizierung.
Discussion
Hierin beschrieben wir ein Verfahren zur Verarbeitung von BAL-Flüssigkeit zur Gewinnung von CD4-T-Zellen und AMs, zusammen mit übereinstimmenden PBMCs, die untersucht werden können, um das HIV-Reservoir in der Lunge zu untersuchen. Wir berichteten vor kurzem über DIE HIV-DNA-Quantifizierung in CD4-T-Zellen aus übereinstimmenden peripheren Blut- und BAL-Proben, und unsere Gruppe zeigte, dass HIV in Lungen-CD4-T-Zellen 13-mal häufiger vorkommt als in denen aus peripherem Blut15. Allerdings sind die HIV-DNA-Werte in AMs von Spendern abhängig, so dass es bisher keine konsistente Korrelation zwischen den HIV-DNA-Spiegeln in den Lymphozyten im Vergleich zu Makrophagen15gegeben hat. Der Zugang zu diesen primären Makrophagenzell-Untergruppen wird jedoch ein wichtiges Werkzeug sein, um diese Frage zu hinterfragen und ein besseres Verständnis der Viruslast in der Lunge im Zusammenhang mit dem HIV-Reservoir zu erlangen.
In der Vor-ART-Ära und in mehreren anderen Studien unter Verwendung von BAL-Flüssigkeit wurden die Teilnehmer einer Bronchoskopie unterzogen, um eine vermutete Pathologie zu diagnostizieren oder eine mikrobiologische Diagnose für Atemwegssymptome zu erhalten3. Wir konnten jedoch Teilnehmer ohne aktive Lungensymptome oder Pathologien rekrutieren und alle Teilnehmer unterzeichneten ein ethisches Einverständnisformular15. Wir konnten Teilnehmer aus unserem Zentrum rekrutieren, die an anderen Studien wie einer Spirometrie-Screening-Studie für obstruktive Lungenerkrankungen24teilnahmen, sowie solche, die sich anderen Forschungsverfahren wie Leukapherese und Koloskopie. Frühere Untersuchungen unter HIV-Infizierten zeigten, dass Altruismus ein Schlüsselfaktor ist, der die Teilnahme an Forschungsstudien motiviert25. Wie bei vielen menschlichen Exemplaren haben wir eine große Variabilität von Mensch zu Mensch festgestellt. Es gab keine Möglichkeit, "vorherzusagen", von welchen Teilnehmern wir BAL mit guten oder schlechten Zellerträgen erhalten würden. Im Gegensatz zu peripherem Blut, das eine ziemlich konsistente Anzahl von Lymphozyten ergibt, sind die Zellzahlen in BAL-Flüssigkeit sehr variabel. Die Injektion eines größeren Volumens an normaler Saline in die Lunge (mit der Hoffnung auf eine größere Rückkehr von BAL-Flüssigkeit) ist nicht immer möglich, da größere Mengen an normaler Saline oft mit mehr Husten und einem höheren Risiko für eine Fieber-Postbronchoskopie verbunden sind. Wir bemerkten, dass die Verwendung eines kleineren (anstatt größeren) Durchmessers Bronchoskop ermöglichte es dem Respirologen, tiefer in die Bronchien zu gelangen und Flüssigkeit zu erhalten, die größere Mengen an Zellen enthält. Eine konsequente Feststellung war, dass Tabakraucher viel größere Anteile an AMs hatten als Lymphozyten in ihrer BAL-Flüssigkeit, was erwartet wird, da AMs Schutt und Feinstaub verschlingen. Darüber hinaus beobachteten wir, dass BAL-Flüssigkeit von Rauchern Ablagerungen enthielt, die die verwendeten Geräte blockieren können, wie PCR-Maschinen und Durchflusszytometer. Ähnliche Probleme können in Gebieten mit hoher Verschmutzung oder Personen beobachtet werden, die häufiger einer schlechten Luftqualität ausgesetzt sind.
Im Hinblick auf ihre Rolle bei der Etablierung von HIV-Reservoirs und viraler Persistenz ist die Reinheit von CD4-T-Zellen und AMs eine zentrale Überlegung. Aus diesem Grund haben wir uns für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) entschieden, um hochreine Zellpopulationen zu erhalten. Es ist auch möglich, dass die gesammelte BAL-Flüssigkeit mit Blut kontaminiert sein kann, da einige kleinere Blutungen während einer Bronchoskopie erwartet werden; das Vorhandensein naiver B-Zellen würde dies anzeigen, und Zellen können in einem Lysepuffer für rote Blutkörperchen gewaschen werden, um dieses Problem zu umgehen. Eine weitere Herausforderung bei der Untersuchung von BAL-Flüssigkeit betrifft die Quantifizierung von Entzündungsmarkern und Zytokinen, die für das Verständnis der HIV-Persistenz wichtig sind26. Da die instillierte Saline die BAL-Flüssigkeit verdünnt, kann der Gehalt an Entzündungsmediatoren und Zytokinen schwierig zu messen sein. Obwohl ein Harnstoffkorrekturfaktor vorgeschlagen wurde, um die Verdünnung zu berücksichtigen, gibt es relativ wenig Literatur, die seine Verwendung beschreibt27,28.
AMs sind stark autofluoreszierend, was ein Problem bei der Zellsortierung und Flusszytometrie phäkotypische Analyse darstellt. Insbesondere ist der Effekt bei Rauchern, deren AMs vollständig schwarz sein können, ausgeprägter, was ihre Autofluoreszenz erheblich beeinflusst. Wenn die AM-Autofluoreszenz von einem standardmäßigen blauen 488 nm Laser angeregt wird, erreicht sie ihren Höhepunkt bei etwa 540 nm, der sich mit den Fluoreszenzspektren von häufig verwendeten Konjugaten wie FITC und PE29,30überschneidet. Es ist erwähnenswert, dass zwei separate Laser verwendet werden können, um FITC und PE zu begeistern (z. B. PE durch das Gelb/Grün und FITC durch den blauen 488 Laser). Um die inhärente Autofluoreszenz mit FITC zu überwinden, verwendeten wir ungefärbte AMs, um den Hintergrund der Autofluoreszenz zu bestimmen. Darüber hinaus kann die Verwendung von Fluoreszenz-Kontrollen abzüglich 1 (FMO) sehr nützlich sein, um diese technischen Probleme zu bekämpfen. Es können größere Perlen (z.B. 7,5 m) verwendet werden, die näher an der Größe zum Ausgleich von Makrophagenpopulationen sind, im Vergleich zu kleineren Perlen (z. B. 3,0 m), die zur Kompensation von Lymphozytenpopulationen verwendet werden können. Ein noch geeigneterer Ansatz wäre es, einen kleinen Zellanteil als Einzelflecksteuerung zu verwenden, wobei ein bekannter, hochgradig exprimierter Marker auf der Teilmenge, wie HLA-DR oder CD45, zu jedem der gewünschten Fluorchrome konjugiert würde, was eine viel mehr eine genaue Kompensation, die mit Perlen erreicht werden kann. Bei Raucherproben ist diese Taktik besonders nützlich, da die Makrophagen viel größer und autofluoreszierender sind. Darüber hinaus konnte ab dem Vorbereitungsschritt die gesamte BAL-Probe vor der Sortierung wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben in einer Platte kultiviert werden, um eine Trennung der Populationen durch Einhaltung zu ermöglichen. Auf diese Weise können die anhaftenden Makrophagen von anderen nicht haftenden Zellen wie Lymphozyten isoliert werden. Die Kompensation ist weit weniger anspruchsvoll, wenn die Lymphozyten- und AM-Populationen getrennt werden, anstatt sie gemeinsam zu untersuchen; Wenn Sie sich jedoch auf die Einhaltung verlassen, wird dies zu einem Verlust von Makrophagen führen, was eine wichtige Überlegung ist, wenn die Zellzahlen bereits begrenzt sind. Außerdem kann ein Adhärenzschritt zur unerwünschten Aktivierung von anhaftenden Monozyten führen, was sich auf die mit diesen Zellen erzeugten nachgelagerten Ergebnisse auswirken kann. Der Wert der effizienten Sortierung von Zellen in reinere Populationen muss gegen die Beschränkung abgewogen werden, weniger solche Zellen für nachfolgende Experimente zu haben.
Andere Modelle, vor allem murine Modelle, wurden verwendet, um makrophagenimmunologische Eigenschaften und Biologie zu studieren. Diese Modelle sind zwar äußerst nützlich und ermöglichen einen großartigen Einblick in einen schwer zu manipulierenden Zelltyp, aber sie haben Einschränkungen. Viele der Zelloberflächenmarker variieren zwischen Mäusen und Menschen, so dass der Immunophenotyp menschlicher AMs nicht vollständig verstanden wird. Dieses Modellsystem erfordert jedoch die Bündelung mehrerer Mäuse für Assays aufgrund der geringen Zellzahlen, die von jedem Tier zur Verfügung stehen. Darüber hinaus schließt die Notwendigkeit, Proben zu bündeln, Überlegungen zur genetischen Veranlagung und zum Geschlecht aus. Kürzlich hat sich gezeigt, dass Sex eine Rolle bei der Infektiosität von Makrophagen durch HIV-1 spielt, aufgrund der unterschiedlichen Expression des Restriktionsfaktors SAMHD-131. Nichtmenschliche Primaten (NHP) stellen das dem Menschen am nächsten ste Teer modellte und erleichterten die Untersuchung der Simian-Immundefizienzvirus-Infektion (SIV) und ihrer Wirkung auf das Immunsystem, was einen Einblick in die Rolle von geweberesidenten Makrophagen im Vergleich zu monozytenabgeleiteten Makrophagen. In Rhesusmakaken wurde auch gezeigt, dass Lungenmakrophagenisolate von BAL ein replikationsfähiges Virus beherbergen; ein viraler Auswuchs-Assay (VOA) wurde verwendet, um das Verhalten von SIV in geweberesidenten Zellen zu analysieren32. Ein solcher Befund ist von erheblichem Forschungswert, muss aber noch beim Menschen validiert werden, bevor er angewendet werden kann, und die hohen Kosten für die Verwendung von NHPs schließen die Verwendung großer Stichprobenpopulationen aus. Darüber hinaus werden menschliche AMs für viele andere Anwendungen wie In-vitro-Virus/Mikroben-Infektionstests und für Studien mit anderen Krankheitserregern wie Tuberkulose/HIV-Koinfektion nützlich sein.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren möchten ihre Geldgeber würdigen: die Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant #153082 an CC, MAJ, NC); die Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S), die CC und MAJ und der Medizinischen Fakultät der McGill University, die CC gefördert haben, Mittel gewährten. Diese Studie wurde auch teilweise von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt- finanziert Canadian HIV Cure Enterprise (CanCURE) Team Grant HB2 – 164064 to MAJ, CC und NC. MAJ hält den CIHR Canada Research Chair Tier 2 in Immunovirology und CC und NC einen FRQ-S Junior 1 bzw. Junior 2 Research Salary Award. ET ist MIT dem RI-MUHC Studentship MSc Award ausgezeichnet.
Darüber hinaus möchten die Autoren Josée Girouard und alle klinischen Mitarbeiter, die an der Koordinierung und Beschaffung der Proben beteiligt sind, sowie die Atemtherapeuten würdigen; Ekaterina Iourtchenko, Héléne Pagé-Veillette und Marie-Héléne Lacombe auf der RI- MUHC Immunophenotyping Plattform; und Dr. Marianna Orlova für die Bereitstellung der Mikroskopiefotos. Vor allem aber möchten sich die Autoren bei den vielen ehrenamtlichen Helfern bedanken, ohne die diese Forschung nicht möglich wäre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
| ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
| BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
| BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
| Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
| Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
| CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
| CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
| CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
| CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
| CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
| CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
| dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
| EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
| FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
| FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
| FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
| HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
| HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
| Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation |
| OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
| PBS 1x | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
| PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
| PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
| QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
| Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
| RPMI 1640 1x | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
| Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
| Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride |
| Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |
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