Summary
हम ड्रोसोफिला ऊतक समरूपों में बरकरार माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान की मात्रा के लिए साइट्रेट सिंथाज गतिविधि के एक रंगीन परख के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के माध्यम से एटीपी का उत्पादन करके और विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करके सेलुलर मेटाबोलिज्म में सबसे प्रमुख भूमिकाएं निभाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई मेटाबोलिक और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों का प्राथमिक कारण है। उनके उचित कामकाज के लिए अक्षुण्ण माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण हैं। एंजाइम साइट्रेट सिंथाज माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में स्थानीयकृत है और इस प्रकार बरकरार माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान के मात्रात्मक एंजाइम मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह देखते हुए कि माइटोकॉन्ड्रिया में महत्वपूर्ण कार्यों वाले कई अणु और रास्ते मनुष्यों और ड्रोसोफिला केबीच अत्यधिक संरक्षित हैं, और ड्रोसोफिलामें शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों की एक सरणी उपलब्ध है, ड्रोसोफिला माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है। यहां, हम माइटोकॉन्ड्रिया को अलग किए बिना वयस्क मक्खियों से होमोग्नेट ऊतक में साइट्रेट सिंथाज गतिविधि के तेज और सरल माप के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल लार्वा, सुसंस्कृत कोशिकाओं और स्तनधारी ऊतकों में साइट्रेट सिंथाज गतिविधि को मापने के लिए भी उपयुक्त है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया को सबसे अधिक यूकेरियोटिक जीवों में बिजली उत्पादक ऑर्गेनेल्स के रूप में जाना जाता है, जो ट्राइकार्बोक्लिक एसिड चक्र (यानी, क्रेब्स चक्र) और ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलाइजेशन के माध्यम से ऊर्जा मुद्रा, एटीपी का उत्पादन करते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया कई अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाने के लिए भी पाया जाता है, जैसे एपोप्टोसिस1,सीए2 + होमोस्टोसिस2,3,प्रतिक्रियाशील ऑक्सीकरण प्रजातियां (आरओएस) पीढ़ी4,और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर)-तनाव प्रतिक्रिया5। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन किसी भी उम्र में शरीर में किसी भी अंग को प्रभावित कर सकता है और मेटाबोलिक, उम्र बढ़ने से संबंधित6और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों का प्राथमिक कारण है7। अक्षुण्ण माइटोकॉन्ड्रिया मशीनी रूप से माइटोकॉन्ड्रियल समारोह से संबंधित हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन8के मूल्यांकन के लिए अक्षुण्ण माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान का उचित मात्राकरण बहुत महत्वपूर्ण है। ट्राइकार्बॉक्सिक एसिड चक्र9के पहले चरण में एक दर-सीमित एंजाइम, सिट्रेट सिंथासे को यूकेरियोटिक कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में स्थानीयकृत किया गया है, और इस प्रकार बरकरार माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान9,10की उपस्थिति के लिए मात्रात्मक मार्कर के रूप में उपयोग किया जा सकता है। सिट्रेट सिंथाज गतिविधि को अक्षुण्ण माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन11,12के लिए सामान्यीकरण कारक के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर,माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है, क्योंकि माइटोकॉन्ड्रिया में निर्णायक भूमिका निभाने वाले कई अणु ओं और रास्ते को ड्रोसोफिला से मनुष्योंतक 13,14,15को विकासात्मक रूप से संरक्षित किया जाता है। यहां, हम एक 96 अच्छी प्लेट प्रारूप में ड्रोसोफिला ऊतक समरूप16 में एक रंगीन परख द्वारा साइट्रेट सिंथाज गतिविधि के मापने के लिए एक तेज और सरल विधि के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। सिट्रेट सिंथाज गतिविधि परख में, ड्रोसोफिला ऊतक में साइट्रेट सिंथाज सिटाइल कोएंजाइम ए (एसीटिल सीओए) के साथ ऑक्सालोसेटेट की प्रतिक्रिया को कैटरेट सीओए-एसएच और एच+बनाने के लिए उत्प्रेरक करता है। सीओए-एसएच बाद में एक रंगीन उत्पाद उत्पन्न करने के लिए 5,5'-डिथिओबिस-(2-नाइट्रोबेंजोइक एसिड) (डीटीएनबी) के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिसे आसानी से 412 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिकल रूप से मापा जा सकता है। सिट्रेट सिंथाज गतिविधि रंग उत्पादन की दर से परिलक्षित हो सकती है।
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Protocol
1. डी मेलानोगास्टर16 के लिए कोलोरीमेट्रिक साइट्रेट सिंथासे गतिविधि परख
- प्रत्येक नमूने के लिए दस वयस्क मक्खियों को इकट्ठा करें। प्रत्येक जीनोटाइप के लिए कम से कम ट्रिपलीकेट नमूने एकत्र करें।
- प्रत्येक नमूने के लिए 1.5 मीटर परीक्षण ट्यूब में 20 एमएम हेप्स (पीएच = 7.2), 1 एमएम ईटीए और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 युक्त बर्फ-ठंडा निष्कर्षण बफर के 500 माइक्रोन तैयार करें।
- एनेस्थेटाइज़ वयस्क मक्खियों को एनेस्थीसिया पैड पर सीओ2 के साथ और वांछित ऊतकों को अलग करें। वयस्क फ्लाई थोरेक्स को अलग करने के लिए, उदाहरण के लिए, संदंश की एक जोड़ी द्वारा फ्लाई थोरैक्स को ठीक करें, और फिर कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके छाती और पेट की सीमा के साथ काटकर फ्लाई पेट को अलग करें। मांसपेशियों के सिट्रेट सिंथाज गतिविधि परख के लिए फ्लाई थोरेक्स लीजिए।
नोट: इस कदम पर ऊतक के ताजा वजन का निर्धारण अगर यह साइट्रेट वाक्य गतिविधि को सामान्य करने के लिए उपयोग कर रहे हैं । - बर्फ-ठंडे निष्कर्षण बफर के 100 माइक्रोन को 10 वयस्क फ्लाई थोरेक्स स्थानांतरित करें और बर्फ पर मूसल के साथ समरूप करें। नमूनों को बर्फ-ठंडा रखने के लिए, बर्फ पर 5-10 एस के लिए नमूनों को समरूप करें, फिर नमूने 5 एस के लिए बर्फ पर बैठते हैं, और तब तक दोहराएं जब तक कि ट्यूब में सभी ऊतक पूरी तरह से समरूप न हो जाएं।
नोट: ट्यूब को टेप करें, यह सुनिश्चित करने के लिए समरूपों की जांच करें कि समरूपमें कोई थक्के नहीं हैं और ट्यूब में ऊतक पूरी तरह से समरूप हैं। सभी नमूना उपचार बर्फ पर किया जाना चाहिए। - प्रोटीन सामग्री माप न होने के लिए एक नई ट्यूब में प्रत्येक समरूप नमूने के 10 μL लें। बर्फ पर प्रोटीन माप के लिए नमूनों को रखें।
नोट: प्रोटीन के नमूनों को बाद में विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे और संग्रहीत किया जा सकता है। प्रोटीन सांद्रता साइट्रेट सिंथाज गतिविधियों को सामान्य बनाने के लिए एक आंतरिक पैरामीटर के रूप में काम करती है। - 500 माइक्रोन की कुल मात्रा बनाने के लिए प्रत्येक शेष नमूने में बर्फ-ठंडा निष्कर्षण बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें। बुलबुला गठन से बचने के लिए कम से कम 5x को धीरे-धीरे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, ताजा तैयार प्रतिक्रिया समाधान (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0), 0.1 एमएम डीटीएनबी, 0.3 एम एम एसिटाइल सीओए, 1 एमएम ऑक्सलोसेटिक एसिड) के 150 माइक्रोन में पतला सेल लाइसेट का 1 माइक्रोन जोड़ें। बुलबुला गठन से बचते हुए, धीरे-धीरे पाइपिंग करके अच्छी तरह से और तुरंत मिलाएं। 10 एस के न्यूनतम अंतराल पर 412 एनएम पर अवशोषण को मापने में सक्षम प्लेट रीडर का उपयोग करके 25 डिग्री सेल्सियस पर 4 न्यूनतम के लिए हर 10-30 एस पर अवशोषण को मापें।
नोट: एक अलग अभिकर्ता को पाइप करने से पहले टिप बदलें और कुओं में बुलबुले बनाने से बचें। अभिकर्मकों के अधूरे मिश्रण से माप में भिन्नता हो सकती है। नमूनों को एकत्र करने के तुरंत बाद कमरे के तापमान पर साइटरेट सिंथाज गतिविधि परख की जानी चाहिए, क्योंकि इस परख का उपयोग अक्षुण्ण माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रतिक्रिया बफर को उपयोग से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए और संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए। - ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) अवशोषण (एबीएस) (वाई-एक्सिस) बनाम समय (मिनटों में) (एक्स-एक्सिस) के रूप में डेटा प्लॉट करें। फिर वक्र के रैखिक भाग के लिए ढलान की गणना करें, जहां प्रतिक्रिया दर है
सिट्रेट सिंथाज गतिविधि को सामान्य करने के लिए नमूना प्रोटीन एकाग्रता द्वारा मूल्य को विभाजित करें। साइट्रेट सिंथाज गतिविधि की गणना की जाती है
नोट: नमूना प्रोटीन एकाग्रता एक प्रोटीन एकाग्रता परख किट द्वारा मापा जा सकता है ।
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Representative Results
चित्रा 1 विभिन्न जीनोटाइप के ड्रोसोफिला छाती ऊतक समरूपों को मापने के लिए साइटरेट सिंथासे गतिविधि रंगीन परख का उपयोग करके प्राप्त समय के साथ 412 एनएम पर ओडी अवशोषण के लिए गतिज घटता का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है। यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि पीजीसी-1α माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस का एक मास्टर रेगुलेटर है। पीजीसी-1α कार्यात्मक रूप से ड्रोसोफिला और मनुष्यों के बीच संरक्षित है। ड्रोसोफिला RNF34 (dRNF34) ड्रोसोफिला पीजीसी-1α, dPGC-1 के लिए एक E3 सर्वव्यापी लिगास है, और DPGC-1 प्रोटीन क्षरण17को बढ़ावा देता है । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए क्यूपीसीआर ने दिखाया है कि ड्रोसोफिला मांसपेशियों में DRNF34 के नॉकडाउन से माइटोकॉन्ड्रियल कंटेंट बढ़ जाता है, जिसे डीपीजीसी-117के नॉकडाउन से दबा दिया जाता है । इन परिणामों के आधार पर हमने परिकल्पना की कि ड्रोसोफिला मांसपेशी में dRNF34 का नॉकडाउन माइटोकॉन्ड्रियल सिट्रेट सिंथाज गतिविधि में वृद्धि करेगा, जिसे DPGC-1 के नॉकडाउन से उलट दिया जाना चाहिए। दरअसल, यहां वर्णित साइटेट सिंथाज गतिविधि के रंगीन परख का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि ड्रोसोफिला मांसपेशी में dRNF34 के नॉकडाउन ने माइटोकॉन्ड्रियल साइट्रेट सिंथाज गतिविधि में वृद्धि की, जिसे डीपीजीसी-1 के नॉकडाउन से उलट दिया गया था। विशेष रूप से यहां वर्णित विधि का उपयोग करते हुए, प्रत्येक परख(चित्रा 1)के लिए एक प्रारंभिक रैखिक एंजाइमैटिक दर स्थापित की गई थी। उनके सूत्रों और दृढ़ संकल्प के गुणांक (आर2)के साथ प्रवृत्ति लाइनों ग्राफ(चित्र ा 1)में दिखाया गया है । प्रवृत्ति लाइनों की ढलान अधिकतम प्रतिक्रिया दरों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो विभिन्न जीनोटाइप की अधिकतम साइटेट सिंथाज गतिविधियों के बराबर हैं। विभिन्न जीनोटाइप के लिए ढलान अलग हैं(चित्र 1)। दृढ़ संकल्प का गुणांक 1 के करीब है; ट्रेंड लाइनों के सूत्र अधिक विश्वसनीय हैं। प्रोटीन एकाग्रता ने विभिन्न जीनोटाइप की अधिकतम साइट्रेट वाक्यों की गतिविधियों की गणना चित्रा 1 डेटा(चित्र ा 2)से की गई थी। मांसपेशियों के विशिष्ट dRNF34 नॉकडाउन के साथ फ्लाई थोरैक्स की अधिकतम साइटेट सिंथाज गतिविधि में वृद्धि हुई, जिसे मांसपेशियों-विशिष्ट dPGC-1 नॉकडाउन(चित्रा 2)से उलट दिया गया था।
चित्रा 1: साइट्रेट सिंथाज गतिविधि के रंगीन परख के लिए गतिज घटता का एक उदाहरण। वयस्क मक्खी छाती के होमोजेनेट(ए)24B-Gal4>+(b)24B-Gal4>dRNF34RNAi (II), और(c)24B-Gal4>dRNF34RNAi (II), dPGC-1RNAi citrate synthase गतिविधि के रंगीन रूप के अधीन थे । क्षैतिज कुल्हाड़ी प्रतिक्रिया समय का प्रतिनिधित्व करते हैं, और ऊर्ध्वाधर कुल्हाड़ी 412 एनएम पर ओडी अवशोषण का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रत्येक जीनोटाइप के लिए एक रैखिक एंजाइमैटिक दर स्थापित की गई थी। ट्रेंड लाइनें खींची गईं और ट्रेंड लाइनों के फॉर्मूले और आर2 ग्राफ में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: अधिकतम साइट्रेट वाक्य क्रियाशील गतिविधियों की गणना गतिज घटता से की जाती है और प्रोटीन एकाग्रता द्वारा सामान्यीकृत होती है। मांसपेशियों के विशिष्ट dRNF34 नॉकडाउन के साथ फ्लाई थोरैक्स की अधिकतम साइटेट सिंथाज गतिविधि में वृद्धि हुई, जिसे मांसपेशियों-विशिष्ट dPGC-1 नॉकडाउन से उलट दिया गया था। सभी डेटा का प्रतिनिधित्व एनोवा परीक्षण द्वारा ± एसईएम (*पी एंड एलटी; 0.01, और कई तुलनाओं के लिए टकी के परीक्षण, एन = 3, 10 छाती प्रति दोहराने के रूप में किया जाता है)। यह आंकड़ा वी एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग करमेटाबोलिक अध्ययनों को आनुवंशिक पृष्ठभूमि, आहार और मक्खियों के स्टॉक रखरखाव को ध्यान में रखना चाहिए18। साइट्रेट सिंथाज गतिविधि के माप पर विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव से बचने के लिए, ड्रोसोफिला के विभिन्न उपभेदों को 10 पीढ़ियों के लिए नियंत्रण तनाव तक बैकक्रॉस किया जाना चाहिए। हमारे प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले सभी ड्रोसोफिला उपभेदों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि डब्ल्यू1118है, इसलिए हमने डब्ल्यू1118 का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया। आम तौर पर, हमें लगता है कि डब्ल्यू1118 एक अच्छा नियंत्रण है, क्योंकि यह सबसे ड्रोसोफिला उपभेदों के लिए आनुवंशिक पृष्ठभूमि है और कैंटन-एस की तुलना में बैकक्रॉस करना बहुत आसान है। आहार और स्टॉक रखरखाव सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए बिल्कुल समान होना चाहिए। हमारे प्रयोगों में, मक्खियों को सामान्य रूप से 25 डिग्री सेल्सियस और 50-60% सापेक्ष आर्द्रता पर बनाए रखा जाता है। सैंपल तैयार करने के कदम को भी सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। प्रयोग के लिए जो क्रॉस स्थापित किए जाते हैं, वे समान और उपयुक्त पैमाने पर होने चाहिए। एक क्रॉस स्थापित करने के लिए, 3-4 मादा कुंवारी वयस्क मक्खियों को 4 सेमी व्यास में 2-3 पुरुष वयस्क मक्खियों के साथ रखा जाता है, 15 सेमी उच्च शीशी ताजा भोजन के साथ आपूर्ति की जाती है। खाद्य नुस्खा प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर (जैसे, उच्च वसा आहार, सामान्य आहार, उच्च चीनी आहार) भिन्न हो सकते हैं। दो दिन बाद, मक्खियों की माता-पिता पीढ़ी को ताजा भोजन के साथ एक नई शीशी में स्थानांतरित कर दिया जाता है। भोजन में रची लार्वा की देखभाल करने में यदि आवश्यक हो तो कुछ पानी जोड़ना शामिल है। जब मक्खियों की संतानीय पीढ़ी निकलने लगती है, तो शीशियों को हर 24 घंटे में फ़्लिप किया जाता है, वांछित जीनोटाइप की मक्खियों को प्रयोग के लिए एक नई शीशी में एकत्र किया जाता है, और मक्खियों की हैच तिथि प्रत्येक शीशी पर चिह्नित होती है। लगभग 20-30 एकत्र मक्खियों एक ही जीनोटाइप, लिंग, और उम्र के भोजन के साथ एक शीशी में रखा जाता है। एकत्र की गई मक्खियों को हर दो दिनों में उचित भोजन के साथ ताजा शीशियों में स्थानांतरित किया जाना चाहिए जब तक कि प्रयोग नहीं किए जाते। साइट्रेट सिंथाज गतिविधि पर उम्र के प्रभाव से बचने के लिए, परीक्षण किए गए विभिन्न समूहों की मक्खियों को एक ही दिन निकलना चाहिए। इसके अलावा मक्खियों के लिंग का मिलान किया जाना चाहिए। आमतौर पर मादाओं का शरीर का आकार पुरुषों की तुलना में बड़ा होता है, इस प्रकार महिला निकायों की प्रोटीन एकाग्रता पुरुष निकायों की तुलना में अधिक होती है।
सिट्रेट सिंथाज गतिविधि परख का उपयोग लार्वा में साइट्रेट सिंथाज गतिविधि को मापने के लिए भी किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, प्रत्येक नमूने में पांच भटकते हुए तीसरे इंस्टार लार्वा शामिल हो सकते हैं। तीसरे इंस्टार लार्वा को उनके पीछे के सर्पिल की नोक पर एक गहरे नारंगी रंग की अंगूठी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जो दूसरे इंस्टार लार्वा में कमी या कमजोर रूप से मौजूद है।
चरण 6 में, नमूनों के कमजोर पड़ने का अनुपात विभिन्न नमूनों के लिए भिन्न हो सकता है। पहले मापे गए नमूनों के लिए, परख में रैखिक एंजाइमेटिक दर स्थापित करने के लिए एक उपयुक्त कमजोर पड़ने के अनुपात को निर्धारित करने के लिए कई कमजोर पड़ने के अनुपात को निर्धारित करने की कोशिश की जानी चाहिए । अधिकतम एंजाइम गतिविधि है कि परख में एक रैखिक एंजाइम की दर स्थापित करने के लिए कुल मापने का समय एंजाइम-सब्सट्रेट अनुपात के आधार पर बदलता है । यदि एंजाइम की तुलना में सब्सट्रेट की अत्यंत अधिक खुराक है, तो एंजाइम गतिविधि या प्रतिक्रिया दर अधिकतम तक पहुंच जाती है, जो परख में रैखिक एंजाइमीय दर की स्थापना की अनुमति देती है। जैसे-जैसे प्रतिक्रिया बढ़ती है, सब्सट्रेट की मात्रा कम हो जाती है, और एंजाइम गतिविधि या प्रतिक्रिया दर धीमी हो जाती है। यदि एक रैखिक एंजाइम़िक दर की साजिश नहीं रची जा सकती है, जिसका अर्थ है कि एंजाइम की तुलना में सब्सट्रेट की अधिक खुराक नहीं है, तो ऊतक को प्रतिक्रिया समाधान के साथ कमजोर करें या 412 एनएम रीडिंग के लिए अंतराल समय को छोटा करें जब तक कि एक रैखिक एंजाइम़टिक दर प्लॉट न हो जाए स्थापित. 412 एनएम पढ़ने के लिए अंतराल का समय 30 से अधिक नहीं होना चाहिए। 412 एनएम पढ़ने की अवधि प्रतिक्रिया दर और समय पर आधारित है। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर रीडिंग तब बंद होनी चाहिए जब सभी प्रतिक्रियाओं के लिए आगे कोई रंग परिवर्तन नहीं देखा जाता है।
सिट्रेट सिंथाज गतिविधि नमूना प्रोटीन एकाग्रता, नमूना ताजा वजन, या सेल संख्या द्वारा सामान्यीकृत किया जा सकता है। नमूना ताजा वजन चरण 3 के रूप में समरूपहोने से पहले मापा जा सकता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिसेट को सामान्य करने के लिए सेल नंबर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कोशिकाओं को पूरी तरह से तैयार किया जाना चाहिए। डीएनए सामग्री एक आंतरिक नियंत्रण के लिए एक अच्छा विकल्प नहीं है, क्योंकि डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया नमूनों में बदलाव शुरू कर सकती है, विशेष रूप से डीएनए की एक छोटी राशि वाले नमूनों के लिए ।
यदि प्रतिक्रिया के बाद कोई रंग परिवर्तन नहीं देखा जाता है, तो कई अलग-अलग समस्या निवारण चरण उठाए जा सकते हैं:
1. नमूना तैयारी कदम की जांच करें, नमूनों को ठीक से संभालना सुनिश्चित करें, नमूनों को बर्फ पर रखें, और कई फ्रीज-गल चक्र ों से बचें।
2. एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करने की कोशिश करें, क्योंकि कुछ नमूनों में सिट्रेट सिंथाज का बहुत कम अभिव्यक्ति स्तर हो सकता है जो साइट्रेट सिंथाज गतिविधि परख से अज्ञेय हैं।
3. ध्यान दें कि साइट्रेट सिंथाज़ गतिविधि परख के लिए कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग ड्रोसोफिलाके लिए नहीं किया जा सकता है, क्योंकि ये किट स्तनधारी साइट्रेट सिंथाज के इम्यूनोकैप्चर के आधार पर माइटोकॉन्ड्रियल साइटरेट सिंथाज़ गतिविधि का निर्धारण करती हैं और स्तनधारी साइट्रेट सिंथासे एंटीबॉडी ड्रोसोफिला साइट्रेट सिंथासे को पहचान नहीं सकती है।
इसी तरह, यदि नमूनों के बीच विसंगति है:
1. सुनिश्चित करें कि कुओं में कोई बुलबुले नहीं हैं।
2. जांच करें कि क्या यह खराब पाइपिंग तकनीक के कारण होता है।
शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया में एक रंगीन परख द्वारा सिट्रेट सिंथाज गतिविधि को मापने के विपरीत, जिसके लिए प्रत्येक जीनोटाइप19के माइटोकॉन्ड्रिया की शुद्धि के लिए लगभग 200 मक्खियों की आवश्यकता होती है, हम ऊतक के होमोजनेट या पूरे सेल अर्क16में एक रंगीन विधि द्वारा सिट्रेट सिंथसे गतिविधि के मापने के लिए एक तेज और सरल परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रत्येक नमूने के लिए, एक ही दिन में रची गई केवल दस मक्खियों की आवश्यकता होती है; प्रत्येक जीनोटाइप के त्रिपाल के नमूनों के लिए, 30 मक्खियों की आवश्यकता होती है। वर्णित प्रोटोकॉल न केवल ड्रोसोफिला पर बल्कि अन्य प्रणालियों, जैसे सुसंस्कृत कोशिकाओं और स्तनधारी ऊतकों के लिए भी लागू होता है।
साइट्रेट सिंथाज गतिविधि परख के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान की मात्रा निर्धारित करने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रिया के अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मात्रात्मक तरीकों की तुलना में, जैसे क्यूपीसीआर द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए सामग्री का मापन और पश्चिमी दाग द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का मात्राकरण, जो उनके कार्य की परवाह किए बिना सभी माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगाता है, साइटरेट सिंथिस गतिविधि परख का उपयोग बरकरार माइटोकॉन्शियलड्रोल द्रव्यमान की उपस्थिति को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परख के विपरीत, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धि और विशेष परख उपकरण16की आवश्यकता होती है, साइटरेट सिंथाज़ गतिविधि परख शोधकर्ताओं को सरल नमूना तैयारी के साथ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा तेजी से मापन करने की अनुमति देता है, जैसे कि पूरे सेल निकालने या ऊतक होमोजेनेट, और माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव की कोई आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, साइट्रेट सिंथाज़ गतिविधि परख बरकरार माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान के परिमाणीकरण के लिए एक तेजी से और किफायती परख है।
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Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१४०१०१३ और ३१४७१०१०), शंघाई नगर पालिका के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग, शंघाई पुजियांग कार्यक्रम (14PJ1405900), और प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था शंघाई (19ZR1446400) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
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