Summary
Vi presenterar ett protokoll för en kolorimetrisk analys av citratsyntas aktivitet för kvantifiering av intakt mitokondriell massa i Drosophila vävnad Homogenates.
Abstract
Mitokonbenerna spelar de mest framträdande rollerna i cellulär metabolism genom att producera ATP genom oxidativ fosforylering och reglera en mängd fysiologiska processer. Mitokondriell dysfunktion är en primär orsak till ett antal metabola och neurodegenerativa sjukdomar. Intakt mitokona är avgörande för deras korrekta funktion. Enzymet citrat syntas är lokaliserad i mitokondriell matris och därmed kan användas som en kvantitativ enzym markör för intakt mitokondriell massa. Med tanke på att många molekyler och vägar som har viktiga funktioner i mitokondrierna är starkt bevarade mellan människor och Drosophila, och att en rad kraftfulla genetiska verktyg finns tillgängliga i Drosophila, fungerar Drosophila som ett bra modellsystem för att studera mitokondriell funktion. Här presenterar vi ett protokoll för snabb och enkel mätning av citratsyntas aktivitet i vävnad homogena från vuxna flugor utan att isolera mitokonen. Detta protokoll är också lämpligt för att mäta citratsyntas aktivitet i larver, odlade celler, och däggdjursvävnader.
Introduction
Mitokondrier är mest kända som Power-producerande organeller i de flesta eukaryota organismer, som producerar energi valutan, ATP, genom trikarboxylsyracykeln Acid cykel (dvs, Krebs cykel) och oxidativ fosforylering. Mitokonskerna finns också att spela viktiga roller i en massa andra fysiologiska processer, såsom reglering av apoptos1, ca2 + homeostas2,3, reaktiv oxidation arter (ros) generation4, och endoplasmatiska nätmagen (er)-stress Response5. Mitokondriell dysfunktion kan påverka alla organ i kroppen i alla åldrar och är en primär orsak till metabola, åldrande-relaterade6, och neurodegenerativa sjukdomar7. Intakta mitokondrier är mekanistiskt relaterade till mitokondriell funktion. Sålunda, korrekt kvantifiering av intakt mitokondriell massa är mycket viktigt för att utvärdera mitokondriell funktion8. Citratsyntas, ett hastighetsbegränsande enzym i det första steget av trikarboxylsyracykeln9, lokaliseras i den mitokondriella matrisen inom eukaryota celler, och kan därför användas som en kvantitativ markör för närvaron av intakt mitokondriell massa9,10. Citratsyntas aktivitet kan också användas som en normaliserings faktor för intakta mitokondriella proteiner11,12.
Den fruktfluga, Drosophila melanogaster, är ett utmärkt modellsystem för att studera mitokondriell funktion, så många molekyler och vägar som spelar centrala roller i mitokondrier är evolutionärt bevaras från Drosophila till människor13,14,15. Här presenterar vi ett protokoll för en snabb och enkel metod för mätning av citrat syntas aktivitet genom en kolorimetrisk analys i Drosophila vävnad Homogenates16 i en 96 väl plåtformat. I citratsynthase Activity assay, citrat syntas i Drosophila vävnad Homogenatet katalyserar reaktionen av oxaloacetat med acetyl coenzym A (acetyl COA) att bilda citrat COA-sh och H+. CoA-SH reagerar därefter med 5,5 '-dithiobis-(2-nitrobensoesyra) (DTNB) för att generera en färgad produkt, 2-Nitro-5-thiobenzoate (TNB), som lätt kan mätas spektrofotometriskt vid 412 nm. Citratsynthase aktivitet kan återspeglas av graden av färgproduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kolorimetrisk citrat syntas aktivitetsanalys för D. melanogaster16
- Samla tio vuxna flugor för varje prov. Samla in minst tre exemplar prover för varje genotyp.
- Bered 500 μL av iskall extraktionsbuffert som innehåller 20 mM HEPER (pH = 7,2), 1 mM EDTA och 0,1% Triton X-100 i ett prov rör på 1,5 mL för varje prov.
- Anesthetize vuxna flugor med CO2 på en anestesi pad och isolera de önskade vävnaderna. För att isolera den vuxna fluga thoraxes, till exempel, fixa flyga thoraxes med ett par tång, och sedan isolera flyga abdomens genom att skära längs gränsen till bröstkorgen och buken med hjälp av ett par sax. Samla fluga thoraxes för muskel citrat syntas aktivitet analysen.
Notera: Bestäm den färska vikten av vävnad i detta steg om du använder den för att normalisera citratsyntas aktivitet. - Överför 10 vuxna fluga thoraxes till 100 μL av iskall extraktion buffert omedelbart och homogenisera med en mortelstöt på is. För att hålla proverna iskalla, homogenisera proverna för 5-10 s på is, sedan har proverna sitta på is för 5 s, och upprepa tills alla vävnader i röret är homogeniserade helt.
Obs: tejpa röret, kontrollera homogena att se till att det inte finns några proppar i homogena och att vävnaderna i röret är homogeniserade helt. Alla prov behandlingar ska utföras på is. - Ta 10 μL av varje homogeniserat prov i ett nytt rör för mätning av proteinhalten. Förvara proverna för protein mätning på isen.
Anmärkning: proteinproverna kan frysas och förvaras vid-80 ° c för senare analys. Proteinkoncentrationerna fungera som en intern parameter för normalisering av citrat syntas aktiviteter. - Tillsätt 400 μL iskall extraktionsbuffert i varje kvarvarande prov för att göra en total volym på 500 μL. Blanda väl genom att försiktigt Pipettera upp och ner minst 5x, undvika bubbelbildning. Tillsätt 1 μL utspädd celllysat till 150 μL av den nyberedda reaktions lösningen (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetyl CoA, 1 mM oxaloättiksyra) för varje reaktion. Blanda noggrant och omedelbart genom att försiktigt Pipettera, undvika bubbelbildning. Mät absorbansen vid 412 nm varje 10-30 s i 4 min vid 25 ° c med en Plattläsare som kan mäta absorbans vid 412 nm med minst 10 s intervall.
Obs: ändra spetsen innan du pipetterar ett annat reagens och Undvik att bilda bubblor i brunnarna. Ofullständig blandning av reagenser kan orsaka variationer i mätningarna. Citratsyntas aktivitet analysen bör göras vid rumstemperatur omedelbart efter proverna samlas in, eftersom denna analys används för att kvantifiera intakt mitokondriell massa. Reaktionsbufferten ska beredas omedelbart före användning och bör inte förvaras. - Rita data som optisk densitet (OD) absorbans (ABS) (Y-axeln) kontra tid (i minuter) (X-axeln). Beräkna sedan lutningen för den linjära delen av kurvan, där reaktionshastigheten är
Dividera värdet med provet protein koncentrationen att normalisera citratsyntas aktivitet. Citratsynthase aktiviteten beräknas som
Anmärkning: provet protein koncentrationen kan mätas med en proteinhalt assay kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett exempel på de kinetiska kurvorna för OD-absorbansen vid 412 nm över tid som erhålls med hjälp av citratsynthase aktivitet kolorimetrisk analys för att mäta Drosophila bröstkorgen vävnad homogena av olika genotyper. Det är välkänt att PGC-1 α är en Master regulator av mitokondriell biogenes. PGC-1 α är funktionellt bevarad mellan Drosophila och människor. Drosophila RNF34 (dRNF34) är en E3 ubiquitin Ligase för Drosophila PGC-1Α, dpgc-1, och främjar dpgc-1 proteinnedbrytning17. Transmissionselektronmikroskopi och mitokondriellt DNA qPCR har visat att knockdown av dRNF34 i Drosophila muskel ökar mitokondriellt innehåll, vilket dämpas av knockdown av dpgc-117. Baserat på dessa resultat vi hypotesen att knockdown av dRNF34 i Drosophila muskeln skulle öka mitokondriella citrat syntas aktivitet, som bör vändas genom knockdown av dpgc-1. I själva verket, med hjälp av kolorimetriska analysen av citrat syntas aktivitet som beskrivs här, fann vi att knockdown av dRNF34 i Drosophila muskel ökade mitokondriella citrat syntas aktivitet, som var omvänd genom knockdown av dpgc-1. Specifikt med den metod som beskrivs här fastställdes en initial linjär enzymatisk hastighet för varje analys (figur 1). Trendlinjerna med deras formler och bestämningsfaktor (R2) visas i grafen (figur 1). Sluttningarna av trendlinjerna representerar maximal reaktionshastigheter, som är motsvarigheter till maximal citrat syntas aktiviteter av olika genotyper. Backarna för de olika genotyperna är olika (figur 1). Determinationskoefficienten är närmare 1; formlerna för trendlinjerna är mer tillförlitliga. Protein koncentrationen normaliserade maximal citratsynthase verksamhet av olika genotyper beräknades från figur 1 data (figur 2). Den maximala citratsyntas aktivitet av fluga thoraxes med muskelspecifika dRNF34 knockdown ökade, som återställdes av muskelspecifika dPGC-1 knockdown (figur 2).
Figur 1: ett exempel på de kinetiska kurvorna för den kolorimetriska analysen av citratsynthase aktivitet. Den vuxne fluga bröstkorgen Homogenates av (a) 24b-Gal4 > + (b) 24b-Gal4 > dRNF34RNAi (II), och (c) 24b-Gal4 > dRNF34RNAi (II), dpgc-1rnai utsattes för kolorimetrisk analys av citrat syntas aktivitet. De horisontella axlarna representerar reaktionstider och de vertikala axlarna representerar OD-absorbenser vid 412 nm. En linjär enzymatisk frekvens fastställdes för varje genotyp. Trendlinjerna har ritats och formlerna och R2 för trendlinjerna visas i diagrammet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: den maximala citratsynthase-verksamheten beräknad utifrån kinetiska kurvor och normaliserad genom proteinkoncentration. Den maximala citrat syntas aktivitet av flyga thoraxes med muskelspecifika dRNF34 knockdown ökade, som återställdes av muskelspecifika dPGC-1 knockdown. Alla data representeras som medel ± SEM (*p < 0,01, genom ANOVA test, och Tukey test för flera jämförelser, n = 3, 10 thoraxes per replikat). Denna siffra är modifierad från Wei et al.17. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metaboliska studier med hjälp av Drosophila som modell måste ta hänsyn till den genetiska bakgrunden, diet, och lagerunderhåll av flugor18. För att undvika effekterna av olika genetiska bakgrunder på mätningen av citrat syntas aktivitet, olika stammar av Drosophila bör backkorsas till kontroll stammen i 10 generationer. Den genetiska bakgrunden till alla Drosophila stammar som används i våra experiment är w1118, så vi använde w1118 som en kontroll. Generellt tror vi att w1118 är en bra kontroll, eftersom det är den genetiska bakgrunden för de flesta Drosophila stammar och är mycket lättare att backcross än Canton-S. Kost och lagerunderhåll måste vara exakt samma för alla experimentella grupper. I våra experiment hålls flugor normalt vid 25 ° c och 50-60% relativ luftfuktighet. Prov berednings steget bör också utföras med försiktighet. De kors som har ställts in för experimentet bör vara i en liknande och lämplig skala. För att ställa in ett kors, 3-4 kvinnliga Virgin Adult flugor hålls med 2-3 manliga vuxna flugor i en 4 cm diameter, 15 cm hög flaska levereras med färsk mat. Maten receptet kan variera (t. ex., fettrik kost, normal kost, hög socker diet), beroende på experimentell design. Två dagar senare överförs den föräldragenerationen flugor till en ny injektionsflaska med färsk föda. Hand om larverna kläckts i maten ingår att lägga till lite vatten om det behövs. När den filial generationen flugor börjar kläcks, vänds flaskorna varje 24 h, flugorna av den önskade genotypen samlas i en ny injektionsflaska för experimentet och kläcks datumet på flugorna är markerat på varje injektionsflaska. Cirka 20-30 insamlade flugor av samma genotyp, kön, och ålder hålls i en injektionsflaska med mat. De insamlade flugorna måste överföras till färska flaskor med lämplig mat varannan dag tills experimenten utförs. För att undvika effekten av ålder på citrat syntas aktivitet, flugor av de olika grupperna testas bör kläcks på samma dag. Dessutom ska Flugornas kön matchas. Vanligtvis är kroppsstorleken hos honor större än hos hanar, alltså är protein koncentrationen av kvinnliga kroppar högre än för manliga kroppar.
Citratsyntas aktivitetsanalys kan också användas för att mäta citratsyntas aktivitet i larver. För detta ändamål kan varje prov bestå av fem vandrande tredje INSTAR larver. Den tredje INSTAR larverna kan särskiljas genom en mörk orange ring på spetsen av deras bakre spiracles, som saknas eller svagt närvarande i den andra INSTAR larverna.
I steg 6 kan utspädnings kvoterna för proverna variera för olika prover. För de prover som först mäts måste flera utspädnings kvoter prövas för att fastställa en lämplig utspädnings kvot för att fastställa en linjär enzymatisk hastighet i analysen. Den totala Mät tiden för maximal enzymaktivitet som etablerar en linjär enzymatisk hastighet i analysen varierar beroende på enzymet-substrat förhållandet. Om underlaget är extremt överdoserat jämfört med enzymet, då enzymaktiviteten eller reaktionshastigheten når maximal, vilket gör det möjligt att upprätta en linjär enzymatisk hastighet i analysen. Som reaktionen går på, mängden av substratet minskar, och enzymaktiviteten eller reaktionshastigheten saktar ner. Om en linjär enzymatisk hastighet inte kan ritas, vilket innebär att substratet inte är överdoserat jämfört med enzymet, späds ytterligare vävnadens homogena med reaktions lösning eller förkorta intervalltiden för 412 nm-värdena tills en linjär enzymatisk Etablerade. Intervalltiden för 412 nm-avläsning bör inte vara mer än 30 s. Varaktigheten för 412 nm-behandlingen baseras på reaktionshastigheten och tiden. Spektrofotometeravläsningen ska upphöra när ingen ytterligare färgförändring observeras för alla reaktioner.
Citratsynthase aktivitet kan normaliseras genom provet proteinkoncentration, prov färsk vikt, eller cell nummer. Provet färsk vikt kan mätas före homogenisering som i steg 3. Cell nummer kan också användas för att normalisera lysat av odlade celler, men cellerna måste vara helt lyserade. DNA-halten är inte ett bra alternativ för en intern kontroll, eftersom DNA-extraktionsförfarandet kan införa variationer i proverna, särskilt för prover som innehåller en liten mängd DNA.
Om ingen färgändring observeras efter reaktionen kan flera olika felsökningssteg tas:
1. Kontrollera provet förberedelsesteg, att se till att hantera proverna på rätt sätt, hålla proverna på is, och undvika flera frysa-Tina cykler.
2. försök att använda en högre proteinkoncentration, eftersom vissa prover kan ha mycket lägre uttrycks nivåer av citrat syntas som är omöjlig att upptäcka genom citrat syntas aktivitets analysen.
3. Observera att vissa kommersiellt tillgängliga kit för citratsyntas aktivitetsanalys inte kan användas för Drosophila, eftersom dessa kit bestämma mitokondriell citrat syntas aktivitet baserat på immunocapture av däggdjurs citrat syntas och däggdjurs citrat syntas antikropp kan inte erkänna Drosophila citrat syntas.
På samma sätt, om det finns en avvikelse mellan proverna:
1. se till att det inte finns några bubblor i brunnarna.
2. Undersök om detta beror på dålig pipetterande teknik.
I motsats till mätning citrat syntas aktivitet genom en kolorimetrisk analys i renad mitokona, som kräver nästan 200 flugor för rening av mitokonbenerna av varje genotyp19, presenterar vi ett protokoll för en snabb och enkel analys för mätning av citrat syntas aktivitet med en kolorimetrisk metod i vävnad homogena eller i hela cell extrakt16. För varje prov behövs bara tio flugor som kläckts samma dag. för tre exemplar prover av varje genotyp, 30 flugor behövs. Det beskrivna protokollet gäller inte bara för Drosophila utan även för andra system, såsom odlade celler och däggdjursvävnader.
Förutom citrat syntas aktivitet analys, andra metoder kan användas för att kvantifiera mitokondriell massa. Jämfört med andra vanliga kvantitativa metoder för mitokondrier, till exempel mätning av mitokondriell DNA-innehåll genom qPCR och kvantifiering av mitokondriella proteiner genom Western blotting, som detekterar alla mitokondrier oavsett deras funktion, citrat syntas aktivitet analysen används för att kvantifiera närvaron av intakt mitokondriell massa. Till skillnad från mitokondriell andning assay, som behöver mitokondriell rening och specialiserad analysutrustning16, citrat syntas aktivitet analysen gör det möjligt för forskare att utföra snabba mätningar av spektrofotometri med enkel provberedning, såsom hela cell extrakt eller vävnad homogena, och inget behov av mitokondriell isolering. Sålunda, citrat syntas aktivitets analysen är en snabb och ekonomisk analys för kvantifiering av intakt mitokondriell massa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (31401013 och 31471010), vetenskaps-och teknik kommissionen i Shanghai kommun, Shanghai Pujiang program (14PJ1405900), och Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al.
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
