Summary
我们提出了一种对胆酸合成酶活性的色度测定方案，用于定量果蝇组织均质中完整的线粒体质量。
Abstract
线粒体在细胞代谢中起着最突出的作用，通过氧化磷酸化产生ATP并调节各种生理过程。线粒体功能障碍是许多代谢和神经退行性疾病的主要原因。完整的线粒体对其正常功能至关重要。酶Citrate合成酶在线粒体基质中局部化，因此可用作完整线粒体质量的定量酶标记。鉴于许多在线粒体中具有重要功能的分子和途径在人类和果蝇之间高度保存，并且果蝇体内有一系列强大的遗传工具，果蝇是研究线粒体功能的良好模型系统。在这里，我们提出了一个协议，用于快速和简单地测量在组织同质体中与成苍蝇的胆酸合成酶活性，而无需隔离线粒体。该协议也适用于测量幼虫、培养细胞和哺乳动物组织中的锡酸盐合成酶活性。
Introduction
线粒体在大多数真核生物中最出名的是产生能量的细胞器，它通过三甲苯酸循环（即克雷布斯循环）和氧化磷酸化产生能量货币ATP。线粒体在许多其他生理过程中也起着重要作用，如细胞凋亡1，Ca2+平衡2，3，反应性氧化物种（ROS）第4代，和内质神经素（ER）-应激反应5。线粒体功能障碍可以影响身体的任何器官在任何年龄，是代谢，老化相关6，和神经退行性疾病7的主要原因。完整的线粒体与线粒体功能有机械关系。因此，正确定量完整的线粒体质量对于评价线粒体功能8非常重要。Citrate合成酶是三聚体酸循环9第一步的速率限制酶，在真核细胞内的线粒体基质中局部化，因此可用作完整线粒体质量9、10存在的定量标记。锡酸盐合成酶活性也可用作完整线粒体蛋白11、12的正常化因子。
果蝇，果蝇，果蝇黑色素，是研究线粒体功能的一个很好的模型系统，因为许多分子和途径，在线粒体中起着关键作用，从果蝇进化保存到人类13，14，15。在这里，我们提出了一种快速而简单的方法，通过果蝇组织中的色度测定以96孔板格式对质16进行色度测定，以快速而简单的方法测量锡酸盐合成酶活性。在锡酸盐合成酶活性测定中，果蝇组织中的锡酸合成酶均质化酶催化草酸与乙酰辅酶A（乙酰CoA）的反应，形成锡酸盐CoA-SH和H+。CoA-SH 随后与 5，5'-dithiobis-（2-硝基苯甲酸） （DTNB） 发生反应，以生成彩色产品，2-硝基-5 硫苯甲酸酯 （TNB），可在 412 nm 处轻松测量分光光度。色酸盐合成酶活性可以通过颜色生产速率来反映。
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Protocol
1. 色度色酸盐合成酶活性测定法D. 黑色素酶 16
- 收集10只成年苍蝇，每个样本。收集每个基因型的至少三联体样本。
- 在每个样品的1.5 mL试管中制备500 μL的冷萃取缓冲液，含有20 mM HEPES（pH = 7.2）、1 mM EDTA和0.1%三吨X-100。
- 在麻醉垫上用CO2麻醉成年苍蝇，并分离所需的组织。例如，要分离成年苍蝇胸斧，用一对钳子固定苍蝇胸斧，然后用剪刀沿胸和腹部的边界切割，分离苍蝇腹部。收集肌肉酸盐合成酶活性测定的苍蝇胸斧。
注：如果用它来使锡酸盐合成酶活性正常化，请确定此步骤中组织的新重量。 - 立即将10只成年苍蝇胸斧转移到100μL的冰冷萃取缓冲液中，并与冰上的虫子同质化。为了保持样品的冰冷，将样品在冰上均匀化5-10s，然后将样品放在冰上5s，然后重复，直到管中的所有组织完全均质化。
注：胶带管，检查均质，以确保同质物中没有血块，并且管中的组织完全均质。所有样品处理应在冰上进行。 - 将每个均质样品的10μL分到新管中，用于蛋白质含量测量。将样品保存在冰上进行蛋白质测量。
注：蛋白质样品可冷冻并储存在-80°C，以便日后分析。蛋白质浓度作为锡酸盐合成酶活性正常化的内部参数。 - 在每个剩余样品中加入400 μL的冷萃取缓冲液，使总体积达到500μL。对于每种反应，将1μL的稀释细胞解糖添加到150μL的新鲜制备反应溶液（20 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.1 mM DTNB，0.3m乙酰CoA，1 mM氧乙酸）。通过轻轻移液，避免气泡形成，立即彻底混合。使用板式读卡器，在 25°C 下，使用能够测量 412 nm 的吸光度，以最小间隔 10 秒的速度测量 412 nm 的吸光度，每 10-30 秒测量 4 分钟的吸光度 4 分钟。
注：在移液其他试剂之前，请更换吸头，避免在井中形成气泡。试剂的不完全混合可能导致测量变化。在采集样品后立即在室温下进行锡酸盐合成酶活性测定，因为此测定用于量化完整的线粒体质量。反应缓冲液应在使用前立即准备，不应存储。 - 将数据绘制为光密度 （OD） 吸收率 （abs）（Y 轴） 与时间（以分钟）（X 轴）。然后计算曲线线性部分的斜率，其中反应速率为
将值除以样品蛋白浓度，使锡酸盐合成酶活性正常化。锡酸盐合成酶活性计算为
注：样品蛋白质浓度可以通过蛋白质浓度测定试剂盒进行测量。
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Representative Results
图1给出了一个使用锡酸盐合成酶活性色测定测量不同基因型的果蝇胸肌组织均质的在412nm处获得OD吸收率的动力学曲线示例。众所周知，PGC-1+是线粒体生物成因的主要调节器。PGC-1+在果蝇和人类之间具有功能保护性。德罗索菲拉RNF34 （dRNF34） 是一种E3泛素连带酶，用于果蝇PGC-1+，dPGC-1，促进dPGC-1蛋白降解17。透射电子显微镜和线粒体DNA qPCR表明，在果蝇肌肉中敲除dRNF34会增加线粒体含量，通过敲除dPGC-117来抑制。根据这些结果，我们假设在果蝇肌肉中敲除dRNF34会增加线粒体胆酸合成酶活性，这应该通过敲除dPGC-1来逆转。事实上，使用此处描述的锡酸盐合成酶活性的色度测定，我们发现，在果蝇肌肉中敲除dRNF34会增加线粒体胆酸合成酶活性，而dPGC-1的敲除则逆转了这种活性。具体使用此处描述的方法，为每个测定建立了初始线性酶速率（图1）。趋势线及其公式和确定系数 （R2） 如图 （图 1 ）所示。趋势线的斜率表示最大反应速率，相当于不同基因型的最大锡酸盐合成酶活性。不同基因型的斜率不同 （图 1）。测定系数接近 1;趋势线的公式更可靠。根据图1数据计算了不同基因型最大锡酸盐合成酶活性的蛋白浓度正常化（图2）。与肌肉特异性dRNF34击倒的苍蝇胸斧的最大锡酸合成酶活性增加，这是由肌肉特异性dPGC-1击倒逆转（图2）。
图1：锡酸盐合成酶活性色测定的动力学曲线示例。成年苍蝇胸腔均质 （a） 24B-Gal4>+（b ） 24B-Gal4>dRNF34RNAi （II） 和 （c） 24B-Gal4>dRNF34RNAi （II）， dPGC-1RNAi 接受色度测定的锡酸合成酶活性.水平轴表示反应时间，垂直轴表示 412 nm 处的 OD 吸收。为每个基因型建立了线性酶率。绘制趋势线，并在图中显示趋势线的公式和 R2。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：从动力学曲线计算并按蛋白质浓度归化的最大锡酸盐合成酶活性。与肌肉特异性dRNF34击倒的苍蝇胸斧的最大锡酸合成酶活性增加，肌肉特异性dPGC-1击倒逆转。所有数据均表示为均值 = SEM（*p < 0.01，通过 ANOVA 检验，图基的多次比较测试，n = 3，每个复制 10 个 thoraxes）。这个数字是从Wei等人17号修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
以果蝇为模型的代谢研究必须考虑到苍蝇的遗传背景、饮食和种群维持。为了避免不同遗传背景对锡酸盐合成酶活性的测量的影响，不同的果蝇菌株应回到10代的对照菌株。实验中使用的所有果蝇菌株的遗传背景是w1118，所以我们用w1118作为对照。一般来说，我们认为w1118是一个很好的控制，因为它是大多数果蝇菌株的遗传背景，比广州-S更容易回溯。所有实验组的饮食和库存维持必须完全相同。在我们的实验中，苍蝇通常保持在25°C和50-60%的相对湿度。样品制备步骤也应谨慎执行。为实验设置的十字架应具有类似和适当的比例。为了设置一个十字架，3-4只雌性处女成年苍蝇被饲养在直径4厘米，15厘米高小瓶的2-3只雄性成年苍蝇中，提供新鲜食物。食物配方可能有所不同（例如，高脂肪饮食、正常饮食、高糖饮食），具体取决于实验设计。两天后，亲代的苍蝇被转移到一个新的小瓶与新鲜的食物。护理食物中孵化的幼虫包括在必要时加入一些水。当孝顺一代的苍蝇开始孵化时，小瓶每24小时翻转一次，所需基因型的苍蝇被收集到一个新的小瓶中，用于实验，并且苍蝇的孵化日期被标记在每个小瓶上。约20-30只采集的具有相同基因型、性别和年龄的苍蝇被保存在一个装有食物的瓶中。收集的苍蝇必须每两天转移到新鲜小瓶中，并带有适当的食物，直到实验完成。为了避免年龄对锡酸盐合成酶活性的影响，被测试的不同组的苍蝇应在同一天孵化。此外，苍蝇的性别应该匹配。通常女性的身体尺寸大于男性，因此女性身体的蛋白质浓度高于男性身体。
锡酸盐合成酶活性测定也可用于测量幼虫中的锡酸盐合成酶活性。为此，每个样本可以由五个游荡的三星幼虫组成。第三个星幼虫可以通过其后尖尖处的深橙色环来区分，在第二个星体幼虫中缺乏或弱小存在。
在步骤 6 中，样品的稀释率可能因样品而异。对于首次测量的样品，必须尝试几个稀释比来确定适当的稀释比，以确定测定中的线性酶率。在测定中建立线性酶速率的最大酶活性的总测量时间因酶基质比而异。如果基质与酶相比过量，则酶活性或反应速率达到最大值，从而在测定中建立线性酶率。随着反应的继续，基质的量减少，酶活性或反应速率减慢。如果无法绘制线性酶速率，这意味着基质与酶相比没有过量，则进一步稀释与反应溶液的组织均质，或缩短 412 nm 读数的间隔时间，直到线性酶率图建立。412 nm 读数的间隔时间不应超过 30 秒。412 nm 读数的持续时间基于反应速率和时间。当所有反应没有进一步的颜色变化时，分光光度计读数应停止。
锡酸盐合成酶活性可以通过样品蛋白浓度、样品新鲜重量或细胞数量进行归化。样品新鲜重量可在同质化之前进行测量，如步骤 3 所示。细胞数也可用于使培养细胞的分量正常化，但细胞必须完全分片。脱氧核糖核酸（DNA）含量不是内部控制的好选择，因为DNA提取程序可能会引入样本的变化，特别是对于含有少量DNA的样品。
如果在反应后未观察到颜色变化，则可以采取以下几种不同的故障排除步骤：
1. 检查样品制备步骤，确保正确处理样品，将样品保存在冰上，避免多次冻融循环。
2. 尝试使用较高的蛋白质浓度，因为某些样品的锡酸盐合成酶的表达水平可能低得多，而锡酸合成酶活性测定无法检测到这种酶。
3. 请注意，一些市售的锡酸合成酶活性测定试剂盒不能用于果蝇，因为这些试剂盒根据哺乳动物的云酸盐合成酶的免疫捕获确定线粒体胆酸合成酶活性，哺乳动物的锡酸合成酶抗体可能无法识别果蝇性胆酸合成酶。
同样，如果样本之间存在差异：
1. 确保井中没有气泡。
2. 检查这是否是由不良移液技术引起的。
与在纯化线粒体中通过色测定测量锡酸合成酶活性（每个基因型19的线粒体纯化需要近200只苍蝇）相比，我们提出了一种快速、简单的测定方案，用于在均质组织或全细胞提取物16中采用色度法测量锡酸合成酶活性。对于每个样本，只需要在同一天孵化的十只苍蝇;对于每种基因型的三联体样本，需要30只苍蝇。所述协议不仅适用于果蝇，也适用于其他系统，如培养细胞和哺乳动物组织。
除了锡酸盐合成酶活性测定外，其他方法也可用于定量线粒体质量。与其他常用的线粒体定量方法相比，如用qPCR测量线粒体DNA含量，用西印定量线粒体蛋白，无论线粒体功能如何，都检测出所有线粒体，采用丁酸盐合成酶活性测定法来量化完整线粒体质量的存在。与需要线粒体纯化和专用检测设备16的线粒体呼吸检测不同，锡酸盐合成酶活性测定允许研究人员通过光谱光度测定，使用简单的样品制备（如全细胞提取物或均匀化）进行快速测量，无需线粒体隔离。因此，锡酸盐合成酶活性测定是一种快速、经济的定量完整线粒体质量的测定方法。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（31401013和31471010）、上海市科委、上海浦江计划（14PJ1405900）和自然科学基金的资助。上海 （19ZR1446400）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
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