Summary
Vi presentiamo un protocollo per un saggio colorimetrico di attività di sinteassi citrate per la quantificazione della massa mitocondriale intatta negli omogenei del tessuto della Drosophila.
Abstract
I mitocondri svolgono i ruoli più importanti nel metabolismo cellulare producendo ATP attraverso la fosfororylazione ossidativa e regolando una varietà di processi fisiologici. La disfunzione mitocondriale è una causa primaria di una serie di malattie metaboliche e neurodegenerative. I mitocondri intatti sono fondamentali per il loro corretto funzionamento. L'enzima citrato synthasi è localizzato nella matrice mitocondriale e quindi può essere utilizzato come un marcatore enzimatico quantitativo di massa mitocondriale intatta. Dato che molte molecole e percorsi che hanno importanti funzioni nei mitocondri sono altamente conservati tra gli esseri umani e la Drosophila, e che una serie di potenti strumenti genetici sono disponibili in Drosophila, la Drosophila serve come un buon sistema modello per studiare la funzione mitocondriale. Qui, presentiamo un protocollo per la misurazione rapida e semplice dell'attività di sintetazione della citrata nell'omogenea tissutale da mosche adulte senza isolare i mitocondri. Questo protocollo è adatto anche per misurare l'attività di sintetasi citrate in larve, cellule coltivate e tessuti mammiferi.
Introduction
I mitocondri sono meglio conosciuti come gli organelle che producono energia nella maggior parte degli organismi eucarioti, che producono la valuta energetica, ATP, attraverso il ciclo dell'acido tricarboxylico (cioè il ciclo di Krebs) e il ciclo osofoso. I mitocondri si trovano anche a svolgere un ruolo importante in molti altri processi fisiologici, come la regolazione dell'apoptosi1, Ca 2 omeostasi2,3, specie reattiva di ossidazione (ROS) generazione4e reticolo endoplasmico (ER)-risposta di stress5. La disfunzione mitocondriale può colpire qualsiasi organo nel corpo a qualsiasi età ed è una causa primaria di metabolica, invecchiamento6e malattie neurodegenerative7. I mitocondri intatti sono meccanicamente correlati alla funzione mitocondriale. Pertanto, una corretta quantificazione della massa mitocondriale intatta è molto importante per valutare la funzione mitocondriale8. Citrate synthase, un enzima che limita il tasso nella prima fase del ciclo di acido tricarboxylico9, è localizzato nella matrice mitocondriale all'interno delle cellule eucariotiche, e quindi può essere utilizzato come marcatore quantitativo per la presenza di massa mitocondriale intatta9,10. L'attività synthase citrato può anche essere utilizzata come fattore di normalizzazione per proteine mitocondriali intatte11,12.
La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è un ottimo sistema modello per studiare la funzione mitocondriale, come molte molecole e percorsi che svolgono ruoli fondamentali nei mitocondri sono evolutivamente conservati dalla Drosophila agli esseri umani13,14,15. Qui, presentiamo un protocollo per un metodo semplice e veloce per la misurazione dell'attività di sinteassi citrati da un saggio colorimetrico in omogenato del tessuto della Drosophila 16 in un formato 96 beh piastra. Nel saggio di attività di sintetzia citrato, citrato synthase nel tessuto di Drosophila omogenato cala la reazione di osaloaceta con coenzima acetil A (acetyl CoA) per formare il citrate CoA-SH e H. CoA-SH reagisce successivamente con 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) per generare un prodotto colorato, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), che può essere facilmente misurato spettrometricamente a 412 nm. L'attività synthasi citrata può essere riflessa dal tasso di produzione del colore.
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Protocol
1. Colorimetric Citrate Synthase Activity Assay for D. melanogaster16
- Raccogli dieci mosche adulte per ogni campione. Raccogliere almeno campioni triplicati per ogni genotipo.
- Preparare 500 l di buffer di estrazione a freddo ghiaccio contenente 20 mHE HEPES (pH , 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 in una provetta da 1,5 mL per ogni campione.
- Anestesizza le mosche adulte con CO2 su un cuscinetto di anestesia e isola i tessuti desiderati. Per isolare il torasse del volo adulto, per esempio, fissare i diluvi di mosca da un paio di pinze, e quindi isolare l'addome di mosca tagliando lungo il bordo del torace e dell'addome utilizzando un paio di forbici. Raccogliere i thoraxes mosca per il muscolo citrato synthase attività saggio.
NOTA: Determinare il peso fresco del tessuto in questo passaggio se lo si utilizza per normalizzare l'attività di synthase citrato. - Trasferire immediatamente 10 dilaghi di mosca adulti a 100 -L di tampone di estrazione ghiacciata e omogeneizzare con un pestello sul ghiaccio. Per mantenere i campioni ghiacciati, omogeneizzare i campioni per 5-10 s sul ghiaccio, quindi avere i campioni sedersi sul ghiaccio per 5 s, e ripetere fino a quando tutti i tessuti nel tubo sono omogeneizzati completamente.
NOTA: Nastro il tubo, controllare gli omogenei per assicurarsi che non ci siano coaguli negli omogenei e che i tessuti nel tubo siano omogeneizzati completamente. Tutti i trattamenti campione devono essere eseguiti sul ghiaccio. - Prendete 10 l di ogni campione omogeneizzato in un nuovo tubo per la misurazione del contenuto proteico. Conservare i campioni per la misurazione delle proteine sul ghiaccio.
NOTA: I campioni di proteine possono essere congelati e conservati a -80 gradi centigradi per un'analisi successiva. Le concentrazioni proteiche servono come parametro interno per la normalizzazione delle attività di sintesi della citrata. - Aggiungere 400 l di tampone di estrazione a freddo ghiaccio ad ogni campione rimanente per fare un volume totale di 500 .L. Mescolare bene pipetting su e giù per almeno 5x, evitando la formazione di bolle. Per ogni reazione, aggiungere 1 luna di lisata a cellule diluite a 150 luna della soluzione di reazione appena preparata (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM di acetyl CoA, 1 mM di acido oxaloacetico). Mescolare accuratamente e immediatamente pipettando delicatamente, evitando la formazione di bolle. Misurare l'assorbimento a 412 nm ogni 10-30 s per 4 min a 25 gradi centigradi utilizzando un lettore di lamiere in grado di misurare l'assorbimento a 412 nm a intervalli minimi di 10 s.
NOTA: Modificare la punta prima di pipettare un reagente diverso ed evitare di formare bolle nei pozzetti. La miscelazione incompleta dei reagenti può causare variazioni nelle misurazioni. Il saggio di attività di sintease citrato deve essere fatto a temperatura ambiente immediatamente dopo che i campioni sono raccolti, come questo saggio viene utilizzato per quantificare intatta massa mitocondriale. Il buffer di reazione deve essere preparato immediatamente prima dell'uso e non deve essere memorizzato. - Tracciare i dati come assorbimento della densità ottica (OD) (abs) (asse Y) rispetto al tempo (in minuti) (asse X). Quindi calcolare la pendenza per la porzione lineare della curva, dove il tasso di reazione è
Dividere il valore per la concentrazione di proteine campione per normalizzare l'attività di sintesi della citrata. L'attività di sintetismo citrato è calcolata come
NOTA: La concentrazione di proteine del campione può essere misurata con un kit di analisi della concentrazione di proteine.
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Representative Results
La figura 1 presenta un esempio delle curve cinetiche per l'assorbimento OD a 412 nm nel tempo ottenute utilizzando il saggio colorimetrico dell'attività di citrate synthase per misurare i setgenati del tessuto toracico della Drosophila di diversi genotipi. È ben noto che il PGC-1 è un regolatore principale della biogenesi mitocondriale. Il PGC-1 è conservato funzionalmente tra la Drosophila e gli esseri umani. Drosophila RNF34 (dRNF34) è una ligase di ubiquitina E3 per la Drosophila PGC-1, dPGC-1 e promuove la degradazione della proteina dPGC-11. La microscopia elettronica a trasmissione e il qPCR del DNA mitocondriale hanno dimostrato che il knockdown di dRNF34 nel muscolo della Drosophila aumenta il contenuto mitocondriale, che viene soppresso dall'abbattimento di dPGC-117. Sulla base di questi risultati abbiamo ipotizzato che l'abbattimento di dRNF34 nel muscolo della Drosophila aumenterebbe l'attività di sintesi della citrate mitocondriale, che dovrebbe essere invertita per knockdown di dPGC-1. Infatti, utilizzando l'assaggio colorimetrico dell'attività di sinteassi citrate descritto qui, abbiamo scoperto che il knockdown di dRNF34 nel muscolo drosophila ha aumentato l'attività di sinteassi di citrate mitocondriale, che è stato invertito da knockdown di dPGC-1. In particolare utilizzando il metodo descritto di seguito, è stato stabilito un tasso ezimatico lineare iniziale per ogni analisi (Figura 1). Le linee di tendenza con le relative formule e il coefficiente di determinazione (R2) sono illustrate nel grafico (Figura 1). Le pendenze delle linee di tendenza rappresentano i tassi di reazione massimi, che sono equivalenti alle attività di sintetina citrate massima dei diversi genotipi. Le pendenze per i diversi genotipi sono diverse (Figura 1). Il coefficiente di determinazione è più vicino a 1; le formule delle linee di tendenza sono più affidabili. La concentrazione di proteine ha normalizzato le attività massime di sintesi del citrato di diversi genotipi sono state calcolate dai dati della Figura 1 (Figura 2). L'attività di sinteassi al citrato massima di fly thoraxes con il knockdown dRNF34 specifico del muscolo è aumentata, che è stata invertita dal knockdown dPGC-1 specifico del muscolo (Figura 2).
Figura 1: Un esempio delle curve cinetiche per l'assaggio colorimetrico dell'attività di synthasi citrato. La mosca adulta torace ottene di (a) 24B-Gal4> (b) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), e (c) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II),dPGC-1RNAi sono stati sottoposti al saggio colorimetrico dell'attività di sitrate synthase. Gli assi orizzontali rappresentano i tempi di reazione e gli assi verticali rappresentano le assorbenti OD a 412 nm. È stato stabilito un tasso ezimatico lineare per ogni genotipo. Le linee di tendenza sono state disegnate e le formule e R2 delle linee di tendenza sono mostrate nel grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le attività di sintesi della citrata massima calcolate dalle curve cinetiche e normalizzate dalla concentrazione proteica. L'attività di sinossi al citrato massima di fly thoraxes con knockdown dRNF34 specifico del muscolo è aumentato, che è stato invertito dal knockdown dPGC-1 muscolo-specifico. Tutti i dati sono rappresentati come mezzi: SEM (sep < 0.01, dal test ANOVA, e il test di Tukey per confronti multipli, n - 3, 10 thoraxes per replica). Questa cifra è stata modificata da Wei etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli studi metabolici che utilizzano la Drosophila come modello devono prendere in considerazione il background genetico, la dieta e il mantenimento delle scorte delle mosche18. Per evitare gli effetti di diversi background genetici sulla misurazione dell'attività synthase citrato, diversi ceppi di Drosophila dovrebbero essere riincrociati al ceppo di controllo per 10 generazioni. Il background genetico di tutti i ceppi di Drosophila utilizzati nei nostri esperimenti è w1118, quindi abbiamo usato w1118 come controllo. In generale, pensiamo che w1118 sia un buon controllo, in quanto è il background genetico per la maggior parte dei ceppi di Drosophila ed è molto più facile da arrancare rispetto a Canton-S. La dieta e il mantenimento delle scorte devono essere esattamente gli stessi per tutti i gruppi sperimentali. Nei nostri esperimenti, le mosche sono normalmente mantenute a 25 e 50-60% di umidità relativa. Anche il passaggio di preparazione del campione deve essere eseguito con cautela. Le croci impostate per l'esperimento dovrebbero essere di portata analoga e appropriata. Per impostare una croce, 3-4 mosche adulte vergini femminili sono tenute con 2-3 mosche adulte maschi in un diametro di 4 cm, fiala alta 15 cm fornita di cibo fresco. La ricetta alimentare può variare (ad esempio, dieta ad alto contenuto di grassi, dieta normale, dieta ad alto contenuto di zucchero), a seconda del progetto sperimentale. Due giorni dopo, la generazione parentale di mosche viene trasferita in una nuova fiala con cibo fresco. Prendersi cura delle larve schiuse nel cibo include l'aggiunta di un po 'd'acqua, se necessario. Quando la generazione filiale di mosche inizia a schiudersi, le fiale vengono capovolte ogni 24 h, le mosche del genotipo desiderato vengono raccolte in una nuova fiala per l'esperimento e la data di tratteggio delle mosche è contrassegnata su ciascuna fiala. Circa 20-30 mosche raccolte dello stesso genotipo, sesso ed età sono tenute in una fiala con cibo. Le mosche raccolte devono essere trasferite su fiale fresche con cibo adeguato ogni due giorni fino a quando non vengono eseguiti gli esperimenti. Per evitare l'effetto dell'età sull'attività di sinteassi citrate, le mosche dei diversi gruppi testati dovrebbero schiudersi nello stesso giorno. Inoltre, il sesso delle mosche dovrebbe essere abbinato. Di solito la dimensione corporea delle femmine è più grande di quella dei maschi, quindi la concentrazione proteica dei corpi femminili è superiore a quella dei corpi maschili.
Il saggio di attività synthase citrato può essere utilizzato anche per misurare l'attività di sinteassi citrato nelle larve. A tal fine, ogni campione può essere costituito da cinque larve erranti della terza stella. Le larve della terza stella possono essere distinte da un anello arancione scuro sulla punta dei loro spiracoli posteriori, che è carente o debolmente presente nelle seconde larve instar.
Nel passaggio 6, i rapporti di diluizione dei campioni possono variare a seconda dei campioni. Per i campioni che vengono prima misurati, è necessario cercare diversi rapporti di diluizione per determinare un rapporto di diluizione appropriato per stabilire un tasso enzimatico lineare nel saggio. Il tempo totale di misurazione per l'attività massima enzimatica che stabilisce un tasso enzimatico lineare nel saggio varia a seconda del rapporto enzima-substrato. Se il substrato è estremamente overdose rispetto all'enzima, l'attività enzimatica o il tasso di reazione raggiunge il massimo, che consente la creazione di un tasso enzimatico lineare nel saggio. Come la reazione va avanti, la quantità del substrato diminuisce, e l'attività enzimatica o il tasso di reazione rallenta. Se un tasso enzimatico lineare non può essere tracciato, il che significa che il substrato non è sovradosato rispetto all'enzima, diluire ulteriormente gli omogenati dei tessuti con la soluzione di reazione o abbreviare il tempo di intervallo per le letture di 412 nm fino a quando un grafico del tasso enzimatico lineare non è Stabilito. L'intervallo di tempo per la lettura di 412 nm non deve essere superiore a 30 s. La durata per la lettura di 412 nm si basa sul tasso di reazione e sul tempo. La lettura dello spettrofotometro dovrebbe interrompersi quando non si osservano ulteriori cambiamenti di colore per tutte le reazioni.
L'attività di sintesi citrata può essere normalizzata dalla concentrazione di proteine campione, campione di peso fresco, o numero di cellule. Il peso fresco del campione può essere misurato prima dell'omogeneizzazione come nel passaggio 3. Il numero di cella può anche essere utilizzato per normalizzare il lisato delle cellule coltivate, ma le cellule devono essere completamente lised. Il contenuto del DNA non è una buona opzione per un controllo interno, in quanto la procedura di estrazione del DNA può introdurre variazioni nei campioni, in particolare per i campioni contenenti una piccola quantità di DNA.
Se dopo la reazione non viene osservata alcuna modifica del colore, è possibile eseguire diverse procedure di risoluzione dei problemi:
1. Controllare la fase di preparazione del campione, assicurandosi di gestire correttamente i campioni, mantenere i campioni sul ghiaccio ed evitare più cicli di congelamento-scongelamento.
2. Provare a utilizzare una maggiore concentrazione di proteine, perché alcuni campioni potrebbero avere livelli di espressione molto più bassi di sintesi citrata che non sono rilevabili dal saggio di attività synthase citrato.
3. Si noti che alcuni kit disponibili in commercio per l'attività di sintesi citrato non possono essere utilizzati per la Drosophila, perché questi kit determinano l'attività synthasi citrate mitocondriale basata sull'immunocattura della sintesi del citrato dei mammiferi e l'anticorpo synthasi citrate citrate mammifero potrebbe non riconoscere la sintesi della drosophila citrate.
Allo stesso modo, se c'è una discrepanza tra i campioni:
1. Assicurarsi che non ci siano bolle nei pozzi.
2. Esaminare se ciò è causato da una tecnica di pipettaggio scadente.
A differenza di misurare l'attività di sinosse citrate da un saggio colorimetrico in mitocondri purificati, che richiede quasi 200 mosche per la purificazione dei mitocondri di ogni genotipo19, presentiamo un protocollo per un saggio veloce e semplice per la misurazione dell'attività di synthasi citrate con metodo acolorimetrico in setaccio omogeneo o in estratti cellulariinteri 16. Per ogni campione, solo dieci mosche covate nello stesso giorno sono necessari; per i campioni triplicati di ogni genotipo, sono necessarie 30 mosche. Il protocollo descritto è applicabile non solo alla Drosophila, ma anche ad altri sistemi, come le cellule coltivate e i tessuti dei mammiferi.
Oltre al saggio di attività di sinteassi citrato, altri metodi possono essere utilizzati per quantificare la massa mitocondriale. Rispetto ad altri metodi quantitativi comunemente usati dei mitocondri, come la misurazione del contenuto di DNA mitocondriale da qPCR e la quantificazione delle proteine mitocondriali dal gonfiore occidentale, che rilevano tutti i mitocondri indipendentemente dalla loro funzione, il saggio di attività synthasi cito viene utilizzato per quantificare la presenza di massa mitocondriale intatta. A differenza del saggio di respirazione mitocondriale, che ha bisogno di purificazione mitocondriale e attrezzature di analisi specializzate16, il saggio di attività synthase citrato consente ai ricercatori di effettuare misurazioni rapide con spettrofotometria con semplice preparazione del campione, come l'estratto di cellule intere o l'omogeneità del tessuto, e non c'è bisogno di isolamento mitocondriale. Così, il saggio di attività sinteassi citrati è un saggio rapido ed economico per la quantificazione della massa mitocondriale intatta.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), della Science and Technology Commission del comune di Shanghai, del Programma Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e della Natural Science Foundation di Shanghai (19-R1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
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