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Biology

बोवाइन घुटने एक्सप्लांट्स में कार्टिलेज रीमॉडलिंग का एक पूर्व विवो ऊतक संस्कृति मॉडल

Published: November 3, 2019 doi: 10.3791/59467
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1
1Nordic Bioscience, 2Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल अलगाव और उपास्थि explants के गोजातीय घुटनों से culturing का वर्णन प्रस्तुत करते हैं. इस विधि जैविक उत्तेजनाओं या संयुक्त लक्ष्य उपन्यास चिकित्सकीय के जवाब में ऊतक परिवर्तन का वर्णन करने के लिए एक आसान और सुलभ उपकरण प्रदान करता है.

Abstract

पूर्व vivo संस्कृति प्रणालियों एक देशी सेटिंग में ऊतक और सेलुलर समारोह का अध्ययन करने के लिए समर्पित प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर. उपास्थि एक अद्वितीय ऊतक synovial संयुक्त के उचित समारोह के लिए महत्वपूर्ण है और एक घने extracellular मैट्रिक्स (ECM), proteoglycan और प्रकार द्वितीय कोलेजन में अमीर द्वारा गठित किया जाता है. Chondrocytes उपास्थि के भीतर मौजूद केवल सेल प्रकार हैं और बड़े पैमाने पर और संख्या में अपेक्षाकृत कम कर रहे हैं. बदल बाहरी उत्तेजनाओं और सेलुलर संकेतन ईसीएम संरचना और गिरावट में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) और रूमेटोइड गठिया जैसे रोगों में महत्वपूर्ण रोग पहचान कर रहे हैं।

Ex vivo उपास्थि मॉडल की अनुमति 1) उपास्थि ऊतक कारोबार के कोन्ड्रोसाइट मध्यस्थता परिवर्तन की रूपरेखा, 2) उपास्थि ECM संरचना visualizing, और 3) कोन्ड्रोसाइट पुनर्व्यवस्थित सीधे ऊतक में. उत्तेजनाओं या उपचार के जवाब में इन परिवर्तनों को प्रोफ़ेशनल उपास्थि जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं में उच्च महत्व के हैं, और अलग कोन्ड्रोसाइट्स में इन विट्रो प्रयोगों में पूरक, या लाइव जानवरों में अधिक जटिल मॉडल जहां प्रयोगात्मक स्थितियों नियंत्रित करने के लिए और अधिक कठिन हैं.

उपास्थि explants नियंत्रणीय सेटिंग्स में उपास्थि ECM में ऊतक remodeling का आकलन करने के लिए एक अनुवाद और आसानी से सुलभ विधि प्रस्तुत करते हैं. यहाँ, हम अलग करने और जीना गोजातीय उपास्थि explants culturing के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. विधि गोजातीय घुटने से ऊतक का उपयोग करता है, जो स्थानीय कसाई से आसानी से पहुँचा जा सकता है. दोनों explants और वातानुकूलित संस्कृति माध्यम ऊतक कारोबार की जांच करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, ECM संरचना, और कोन्ड्रोसाइट समारोह, इस प्रकार ECM मॉडुलन रूपरेखा.

Introduction

Chondrocytes उत्पादन और उपास्थि मैट्रिक्स बनाए रखने. कोन्ड्रोसाइट्स के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए और वे और आस-पास के ईसीएम बाहरी उत्तेजनाओं पर कैसे प्रतिक्रिया करते हैं, उनके मूल वातावरण1,2में उनसे पूछताछ करना महत्वपूर्ण है। उपास्थि ऊतक कारोबार का अध्ययन OA के रूप में संयुक्त रोगों में अंतर्निहित तंत्र की समझ को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है, एक बीमारी है जिसके लिए वर्तमान में कोई रोग उपचार को संशोधित है. नतीजतन, बेहतर अनुवाद मॉडल2के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है।

कोशिका और ऊतक प्रभाव के Ex vivo लक्षण अन्य पूर्व नैदानिक मॉडल के पूरक के लिए आवश्यक है, दोनों इन विट्रो में, इस तरह के कोन्ड्रोसाइट मोनोलेयर संस्कृतियों के रूप में, और विवो में, इस तरह के सर्जरी प्रेरित OA मॉडल या autoimmune कोलेजन प्रेरित गठिया मॉडल के रूप में (सीआईए ). अनेक अध्ययनों से यह उजागर हुआ है कि कोशिकाएं 2डी मोनोलेयर संस्कृतियों और 3 डी संरचनाओं में या उनके मूल ऊतक3,4में किस प्रकार व्यवहार करती हैं . 2 डी परतों में कई कोशिकाओं को अप्राकृतिक morphologies अपनाने, सेल polarity और ऊतक लगाव में मतभेद सहित, दोनों देशी ऊतकों के भीतर कोशिकाओं में दृश्य और कार्यात्मक मतभेद में जिसके परिणामस्वरूप5. मतभेद भी कोशिकाओं की कार्यक्षमता में स्पष्ट कर रहे हैं, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति बदलाव हो सकता है, गहराई से बदल भेदभाव पैटर्न के लिए अग्रणी, नियामक मशीनरी, और सेल कार्यक्षमता5,6,7 ,8.

उपास्थि ECM प्रकार द्वितीय कोलेजन के मुख्य रूप से एक मैट्रिक्स ढांचे प्रदान होते हैं, और एग्रीकैन, एक proteoglycan कि ऊतक के भीतर तरल पदार्थ बनाए रखने में मदद करता है. अन्य मैट्रिक्स अणुओं जैसे कोलेजन प्रकार IV, VI, IX, X, XI, XII, फाइब्रोनेक्टिन, उपास्थि ओलिगोमेरिक प्रोटीन (COMP), बिगलाइकन, डेकोरिन, और perlecan भी मौजूद हैं9.

हालांकि ओए का एटियोलॉजी10,11स्पष्ट नहीं है , लेकिन माना जाता है कि इस रोग की शुरुआत ऊतक कारोबार में असंतुलन और मरम्मतप्रक्रिया12,13के कारण होती है . संधि उपास्थि की गिरावट OA की एक पहचान है. उपास्थि निवासी कोन्ड्रोसाइट्स या आसपास के ऊतकों में कोशिकाओं साइटोकिन्स की उनकी रिहाई में वृद्धि, मैट्रिक्स धातु प्रोटीनेज (एमएचपी) और aggrecanases के रूप में प्रोटीन के ऊंचा उत्पादन उत्तेजक, जो उपास्थि ECM की गिरावट में वृद्धि 14इस गिरावट का परिणाम नवजात मूल के छोटे-छोटे प्रोटीन के टुकड़े छोड़ना होता है, जिसे सीरम, मूत्र या संस्कृति माध्यम15में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है । कोलेजन के गठन और परिपक्वता पर, तथाकथित profragments भी जारी कर रहे हैं; इन्हें मैट्रिक्स उत्पादन के माप के रूप में निर्धारित किया जा सकताहै.

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक पूर्व vivo उपास्थि मॉडल की स्थापना के लिए उत्तेजना के प्रभाव की तुलना करने के लिए है और / कार्टिलेज कारोबार ELISA का उपयोग कर वातानुकूलित संस्कृति माध्यम में सीधे मैट्रिक्स व्युत्पन्न नव-एपिटोप biomarkers को मापने के द्वारा profiled है: AGNx1 (रिफ़िकल aggrecanase गतिविधि), C2M (प्रतिवर्तन मैट्रिक्स एमएमपी गतिविधि), और ProC2 (रिफ़िकलिंग प्रकार द्वितीय कोलेजन गठन)। निष्कर्ष ईसीएम के हिस्टोलॉजिकल धुंधला द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, जो व्यक्तिगत explants में कोन्ड्रोसाइट्स के संगठन visualizes. वर्णित प्रोटोकॉल कोकोन्ड्रोसाइट समारोह और उपास्थि ईसीएम कारोबार पर उपन्यास उपचार के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अध्ययन ों की एक संख्या जैविक प्रक्रियाओं या मात्रात्मक हिस्टोलॉजिकल या इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दृष्टिकोण, MRNA, प्रोटीन अभिव्यक्ति, या proteomics 2 का उपयोग कर cytokine-चुनौती explants पर हस्तक्षेप के प्रभाव का वर्णन करने के लिए उपास्थि explants का इस्तेमाल किया है ,17,18. तथापि, ये प्रोटोकॉल वर्तमान पांडुलिपि के दायरे से बाहर हैं।

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Protocol

1. ऊतक अलगाव

  1. ऊतक सोर्सिंग
    1. एक aseptic वातावरण में एक स्तरी प्रवाह हुड के बाहर पूरे ऊतक सोर्सिंग अनुभाग प्रदर्शन करते हैं।
    2. स्थानीय कसाईखाना से, 1.5 और 2 साल की उम्र के बीच बछड़ों से एक पूरे ताजा गोजातीय tibiofemoral घुटने संयुक्त प्राप्त करें।
    3. पहले अतिरिक्त मांस को हटाने, condyles, मेनिस्कस, tendons, और synovial झिल्ली को उजागर करके बछड़ा घुटने को धीरे से विच्छेदन. कण्डरा और सिनोवियल झिल्ली को काटें, जिससे संयुक्त को अलग किया जा सकता है। ऊरु condyles का पर्दाफाश करने के लिए meniscus निकालें.
    4. एक 3 मिमी बायोप्सी पंचर का उपयोग कर के femoral condyles के लोड असर क्षेत्र से अलग explants और संभव के रूप में subchondral हड्डी के करीब के रूप में एक स्केलपेल समानांतर के साथ काटने के द्वारा उन्हें संधि की सतह से जारी. सबकोन्ड्राल हड्डी की कठोर संरचना को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि एक्सप्लांट्स में कैल्सिफ्ड मैट्रिक्स शामिल नहीं है। वर्दी ऊंचाई के साथ explants के लिए प्रयास करें.
    5. DMEM/F12- GlutaMAX + 1% P/S संस्कृति माध्यम में एक 50 एमएल ट्यूब या पेट्री डिश में तुरंत संग्रह और मिश्रण। अलग-अलग गाय घुटनों से एक्सप्लांट ्स्स मिक्स न करें बल्कि प्रत्येक अध्ययन के लिए अलग रखें।
  2. ऊतक चित्रांकन
    1. एक laminar प्रवाह हुड में एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली के लिए explants स्थानांतरण.
    2. एक्सप्लांट्स को संस्कृति माध्यम या पीबीएस में 3 बार धोएं और प्रयोग के प्रारंभ तक संस्कृति माध्यम के 200 डिग्री एल में उन्हें अच्छी तरह से संस्कृति में संस्कृति दें। बायोप्सी सेलुलर गतिविधि और निष्क्रिय biomarker रिलीज सिंक्रनाइज़ करने के लिए 1 दिन की एक washout अवधि का उपयोग करें.
    3. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10 सप्ताह तक एक्सप्लांट करें। वाष्पीकरण द्वारा प्रेरित भिन्नता को कम करने के लिए संस्कृति की प्लेट में तिरछे प्रत्येक समूह के भीतर सभी प्रतिकृतिएं रखें। सुपरनेंट के वाष्पीकरण से बचने के लिए, संस्कृति प्लेट के बाहरी कुओं में पीबीएस जोड़ें।

2. बोवाइन उपास्थि मलदर्ज मलन उपचार और चयापचय गतिविधि का आकलन

  1. संस्कृति मध्यम परिवर्तन और उपचार
    1. संस्कृति माध्यम एक laminar प्रवाह हुड में हर 2-3 दिन बदलें.
    2. यदि किसी भी उपचार लागू करने, इन माध्यम को बदलने से पहले तैयार करते हैं. संस्कृति माध्यम में कमजोर पड़ने से explant कुओं में वांछित एकाग्रता के लिए उपचार तैयार करें.
    3. धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से supernatant निकालें और यह एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरण. ऊतक कारोबार और प्रोटीन अभिव्यक्ति के biomarker विश्लेषण के लिए $ 20 डिग्री सेल्सियस पर सील टेप के साथ supernatant स्टोर.
    4. तुरंत ताजा संस्कृति मध्यम या अच्छी तरह से प्रति उपचार के 200 $L जोड़ें. एक्सप्लांट्स को मध्यम परिवर्तन के दौरान सूखने न दें और यह सुनिश्चित करें कि सभी एक्सप्लांट पूरी तरह से नए माध्यम में डूब े हैं।
  2. Resazurin धुंधला
    1. सेल व्यवहार्यता के एक अप्रत्यक्ष माप के रूप में एक बार साप्ताहिक चयापचय गतिविधि को मापने. Resazurin परीक्षण का आकलन करने के लिए एक आसान तरीका है अगर explants की चयापचय गतिविधि सेल मौत या सेलुलर परिवर्तन के कारण एक व्यक्ति के लिए खराब हो जाती है. अकेले संस्कृति माध्यम में एक्सप्लांट्स प्रयोग अवधि के दौरान एक अपेक्षाकृत स्थिर resazurin पढ़ने है.
    2. 10% resazurin के साथ संस्कृति माध्यम का एक समाधान बनाओ.
    3. चरण 2.1.3 में वर्णित के रूप में supernatant फसल.
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए 10% रेज़ुरिन समाधान में एक्सप्लांट्स को विसर्जित करें या जब तक कि सुपरनेट्स बैंगनी हो जाते हैं। पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में explants बिना 4 कुओं को शामिल करें।
    5. एक काले microtiter प्लेट करने के लिए वातानुकूलित और पृष्ठभूमि नियंत्रण resazurin समाधान स्थानांतरण और 540 एनएम उत्तेजना पर फ्लोरोसेंट उपाय /
    6. संस्कृति माध्यम या पीबीएस में अच्छी तरह से 3 बार धो लें और 5-10 मिनट के लिए धोने के माध्यम में explants डूब resazurin पूरी तरह से बाहर फैलाना करने के लिए अनुमति देते हैं. नई संस्कृति मध्यम या उपचार जोड़ें अगर इस्तेमाल किया.

3. समाप्ति, निर्धारण, और नमूना भंडारण

  1. कलटिंग अवधि की समाप्ति
    1. चरण 2.2 में वर्णित के रूप में चयापचय गतिविधि को मापने. प्रति अच्छी तरह से पीबीएस के 200 $L जोड़ें.
  2. फिक्सेशन और संग्रहण
    1. पीबीएस निकालें, प्रति अच्छी तरह से formaldehyde के 200 $L जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए छोड़ दें।
    2. फार्मेल्डिहाइड का निपटान करें और प्रति अच्छी तरह पीबीएस के 200 डिग्री एल जोड़ें। टेप सील के साथ प्लेट को कवर, और हिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। हम 3 महीने के भीतर हिस्टोकेमिकल विश्लेषण करने की सलाह देते हैं।

4. ऊतक कारोबार biomarkers (एलिसा)

  1. अप्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी ELISAs
    1. विशिष्ट biotinylated परख लक्ष्य के साथ एक streptavidin-प्लेट कोट-पेप्टाइड पतला 1:100 परख बफर में (100 $L प्रति अच्छी तरह से) 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर.
    2. मानक धोने बफर के साथ 5 बार धो एंबाबा और नमूना-सुपरनेंट (20 डिग्री सेल्सियस प्रति अच्छी तरह से) को प्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ साथ जोड़ें, परख लक्ष्य-पेप्टाइड पतला 1:93.3 ProC2 के लिए और 1:100 AGNx1 के लिए परख बफर में (100 एल प्रति अच्छी तरह से) और 20 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें। AGNx1 के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ProC2 और 3 एच के लिए मिलाते हुए के साथ।
      नोट: नमूना मात्रा सीधे संग्रहीत supernatant प्लेटों से लिया जाता है. यदि मापा एकाग्रता परख मापने रेंज से बाहर है, PBS या परख बफर में एक वी नीचे कमजोरपड़प्लेट में supernatant पतला.
    3. मानक धोने बफर के साथ 5 बार धोएं और peroxidase लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट परख बफर में 1:100 पतला (100 $L प्रति अच्छी तरह से) 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए।
    4. एक peroxidase सब्सट्रेट के रूप में टेट्रामेथिलबेन्जिन (TMB) के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए मिलाते हुए के साथ मानक धोने बफर और इनक्यूबेट के साथ 5 बार धोएं (100 $L प्रति अच्छी तरह से)।
    5. मानक रोक समाधान के साथ प्रतिक्रिया समाप्त, 0.1 M H2SO4 (100 $L प्रति अच्छी तरह).
    6. एक मानक प्रयोगशाला प्लेट रीडर पर 650 एनएम पर एक संदर्भ अवशोषण का उपयोग कर 450 एनएम अवशोषण पर colorimetric प्रतिक्रिया पढ़ें.
  2. सुपरनेंट में उपास्थि ऊतक कारोबार की माप के लिए प्रत्यक्ष प्रतियोगी ELISAs
    नोट: यह C2M मात्रा निर्धारित करता है.
    1. विशिष्ट biotinylated परख लक्ष्य के साथ एक streptavidin-प्लेट कोट-पेप्टाइड पतला 1:100 परख बफर में (100 $L प्रति अच्छी तरह से) के लिए 30 मिनट पर 20 डिग्री सेल्सियस.
    2. धोने बफर के साथ 5 बार धो लें और परख लक्ष्य के खिलाफ peroxidase-लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 100 डिग्री एल के साथ एक साथ नमूना-supernatant जोड़ें परख बफर में पतला 1:100 (20 $L प्रति अच्छी तरह से). मिलाते हुए के साथ 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 20 एच के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: नमूना मात्रा सीधे संग्रहीत supernatant प्लेटों से लिया जाता है. यदि मापा एकाग्रता परख मापने रेंज से बाहर है, PBS या परख बफर में एक वी नीचे कमजोरपड़प्लेट में supernatant पतला.
    3. एक peroxidase सब्सट्रेट (100 $L प्रति अच्छी तरह से) के रूप में TMB के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए मिलाते हुए के साथ मानक धोने बफर और इनक्यूबेट के साथ 5 बार धो लें।
    4. मानक रोक समाधान के साथ प्रतिक्रिया समाप्त, 0.1 M H2SO4 (100 $L प्रति अच्छी तरह).
    5. एक मानक प्रयोगशाला प्लेट रीडर पर 650 एनएम पर एक संदर्भ अवशोषण के साथ 450 एनएम अवशोषण पर colorimetric प्रतिक्रिया पढ़ें.
  3. AGNx1
    1. AGNx1 नव-एपिटोप की रिहाई को मापने के द्वारा aggrecan गिरावट Quantify. यह अप्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी एलिसा परख एग्रीकैन सी-टर्मिनल पेप्टाइड (NITEGE373) को एडमटीएस-4 और 5 क्लीवेज द्वारा उत्पन्न करता है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक उजागर NITEGE एपिटोप के साथ सभी टुकड़ों को पहचानता है। परख का प्रायोगिक विवरण कहीं औरप्रकाशितकिया गया है .
  4. ProC2
    1. प्रकार द्वितीय कोलेजन के profragment की रिहाई को मापने के द्वारा प्रकार द्वितीय कोलेजन गठन क्वांटिफी। यह अप्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी एलिसा परख नए संश्लेषित प्रकार द्वितीय कोलेजन की ट्रिमिंग के दौरान एन-प्रोप्टिडस द्वारा उत्पन्न पीआईबीएनपी प्रोपेप्टाइड (QDVRQPG) के एपिटोप को लक्षित करता है। परख का प्रायोगिक विवरण16अन्य त्रयंवण प्रकाशित किया गया है .
  5. सी 2 एम
    1. C2M नव-एपिटोप टुकड़ा की रिहाई को मापने के द्वारा प्रकार द्वितीय कोलेजन गिरावट क्वांटिफी। यह प्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी एलिसा एमएमपी-क्लीव्ड सी-टर्मिनल पेप्टाइड (KPPGRDGAAG1053) को पहचानता है। यह परख AGNx1 और ProC2 से अलग है क्योंकि यह प्राथमिक एंटीबॉडी है कि peroxidase लेबल और इस प्रकार, डिटेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया है. परख का प्रायोगिक विवरण अन्यत्र20प्रकाशित किया गया है .

5. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. घुसपैठ, एम्बेडिंग, और काटने
    1. अलग-अलग लेबल कैसेट में fixated explants प्लेस (चरण 3.2) देखें. पहचान सुनिश्चित करने के लिए कैसेट और लेबल कैसेट के भीतर दोनों एक लेबल शामिल करें.
    2. एक ऊतक प्रोसेसर मशीन के लिए explants युक्त कैसेट स्थानांतरण. फिर निर्जलीकरण और पैराफिन घुसपैठ कदम की एक श्रृंखला में पैराफिन के साथ explants घुसपैठ।
      1. कोई तापमान समायोजन के साथ 90 मिनट के लिए 96% इथेनॉल के साथ निर्जलीकरण। इस चरण को 3 बार दोहराएँ.
      2. कोई तापमान समायोजन के साथ 90 मिनट के लिए toluene के साथ इथेनॉल साफ़ करें। इस चरण को 2 बार दोहराएँ.
      3. 60 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए toluene के साथ इथेनॉल साफ़ करें।
      4. 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ।
      5. 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ।
      6. 60 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ।
      7. प्रत्येक चरण के लिए, 33-34 kPa के तहत धीमी गति से पंप-आउट और पंप-इन प्रवाह के साथ नमूना कक्ष में समाधान जोड़ें। $65 से $70 केपीए की अधिकतम निर्वात के साथ एक दबाव/वैक्यूम चक्र में घुसपैठ की प्रक्रिया को चलाएँ।
    3. घुसपैठ के बाद, एक हीटिंग ब्लॉक पर कैसेट जगह के लिए सावधान कैसेट से explants के हटाने की अनुमति. धीरे से व्यक्तिगत पैराफिन ब्लॉक में घुसपैठ explants एम्बेड. गर्म संदंश के साथ, सतही संधि उपास्थि और subchondral हड्डी पक्षों काटने की सतह के सीधा के साथ explants जगह है, प्रत्येक नमूना अनुभाग के भीतर विभिन्न उपास्थि परतों के दृश्य सुनिश्चित करने.
    4. एक microtome पर एम्बेडेड explants के साथ ठंडा पैराफिन ब्लॉक के 5 डिग्री मीटर वर्गों में कटौती। कट अनुभागों को ठंडे पानी के स्नान में स्थानांतरित करें. यदि आवश्यक हो, वर्गों या तो एक स्केलपेल या एक कवर ग्लास का उपयोग कर अलग किया जा सकता है।
    5. ध्यान से एक uncoated ग्लास स्लाइड का उपयोग करना, वर्गों एक गर्म पानी स्नान (50 डिग्री सेल्सियस) के लिए वर्गों हस्तांतरण, जहां वर्गों करेंगी। प्रत्येक अनुभाग को लेबल किए गए कवर स्लाइड पर रखें और 30 मिनट के लिए एक गर्म प्लेट पर रखें।
    6. स्लाइड को एक टोकरी में रखें और 1 h के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और फिर उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें। इसके बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर बंद कंटेनरों में दाग तक स्लाइड की दुकान.
  2. Safranin ओ / फास्ट ग्रीन धुंधला और दृश्य
    1. स्लाइड्स को एक टोकरी में दागने के लिए रखें और स्लाइड को 1 h के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. तैयार है और एक 0.45 मिमी फिल्टर के साथ सभी अभिकर्मकों फिल्टर.
    3. धुंधला करने के लिए तैयारी में, एक मात्रा है कि समाधान पूरी तरह से स्लाइड को कवर करने के लिए जब टोकरी submerging की अनुमति देता है करने के लिए बीकर में फ़िल्टर अभिकर्मकों डालना. बीकर स्लाइड को कवर करने के लिए 250 एमएल की मात्रा की आवश्यकता थी।
    4. 10 मिनट दो बार के लिए toluene में टोकरी submerging द्वारा पिघल स्लाइड deparaffinize, 2 मिनट के लिए 99% इथेनॉल दो बार, 2 मिनट के लिए 96% इथेनॉल दो बार, और 70% इथेनॉल के लिए 2 मिनट दो बार. फिर, 2 मिनट के लिए पानी में स्लाइड हाइड्रेट.
    5. 10 मिनट के लिए Weigert आयरन Hematoxylin समाधान (पीएच 1.5) में टोकरी submerging द्वारा deparaffinized और हाइड्रेटेड स्लाइड दाग, 1% एचसीएल में एक बार डुबकी, और लगभग 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के साथ कुल्ला या जब तक अतिरिक्त रंग बह गया है.
    6. अगले, में दाग 0.05% फास्ट ग्रीन समाधान (पीएच: 5.75) के लिए 5 मिनट, 1% CH3COOH में डुबकी एक बार, और में दाग 0.1% Safranin ओ (पीएच: 6.5) के लिए 20 मिनट.
    7. निर्जलीकरण और 70% इथेनॉल में दो बार डुबकी द्वारा स्लाइड स्पष्ट, 2 मिनट के लिए 96% इथेनॉल दो बार, 99% इथेनॉल के लिए 2 मिनट दो बार, और toluene 2 मिनट दो बार.
    8. बिना लेपित कांच की स्लाइड्स को राल माध्यम के साथ माउंट करें जो हिस्टोलॉजी स्लाइडको कवर करते हैं।

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Representative Results

बोवाइन पूर्ण गहराई से एक्सप्लांट्स अलग-थलग, सुसंस्कृत और 3 सप्ताह के लिए इलाज किए गए (चित्र 1)। संस्कृति माध्यम उपचार के अलावा के साथ बदल गया था 3 बार प्रति सप्ताह. एक बार साप्ताहिक, चयापचय गतिविधि resazurin परख से मापा गया था. ईसीएम कारोबार के Biomarkers संस्कृति प्लेट से काटा supernatant में मापा गया 3 बार प्रति सप्ताह. एक्सप्लांट्स को उपचार के लिए 4 समूहों में विभाजित किया गया था: 1) ओकोस्टेटिन एम और टीएनएफ (ओ + टी); 2) हे + टी + GM6001 (GM6001); 3) इंसुलिन जैसे विकास फैक्टर-1 (IGF-1); और 4) उपचार के बिना एक नियंत्रण (w/

चयापचय गतिविधि.

सभी चार समूहों के लिए, उपापचयी गतिविधि 3 सप्ताह भर में अपेक्षाकृत स्थिर थी (चित्र 2क)। IGF-1 के लिए एक प्रवृत्ति थी w/o समूह से थोड़ा ऊपर चयापचय गतिविधि को बढ़ाने के लिए और O + T समूहों के लिए इसे कम करने के लिए. resazurin परख आसानी से प्रत्येक explant में कोन्ड्रोसाइट्स की गतिविधि का आकलन करने के लिए और परोक्ष रूप से प्रयोग से explants निकालने के बिना सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यदि एक explant प्रयोग के दौरान चयापचय गतिविधि में काफी गिरावट से पता चलता है, explant आगे विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है.

कैटाबोलिक उपचार।

हे+टी को संस्कृति कूपों में साप्ताहिक रूप से 3 बार लागू किया गया था ताकि हे+टी-मध्यस्थ उपास्थि अवक्रमण की जांच की जा सके (चित्र 3, चित्र 4)। एमएमपी-मध्यस्थ प्रकार द्वितीय कोलेजन गिरावट और aggrecanase-मध्यस्थ एग्रीकैन गिरावट C2M और AGNx1 ELISAs द्वारा मूल्यांकन किया गया. O+T वृद्धि हुई प्रकार II कोलेजन अवक्रमण दिन 7-21 से (चित्र 3क) तथा घण्स ीय अवक्रमण दिन 3-14 से (चित्र 4क) w/ O+T उपचार के साथ संयोजन में GM6001 (एक व्यापक स्पेक्ट्रम MMP-inhibitor) जोड़ते समय, O+T-मध्यस्थ C2M रिलीज़ ब्लॉक किया गया था (चित्र 3A,B)। एक कमी AGNx1 रिलीज जब दिन 3-7 पर GM6001 जोड़ने देखा गया था, लेकिन AGNx1 रिलीज चोटियों पर दिन 10 O + T समूह के लिए इसी तरह के स्तर पर (चित्र 4ए),GM6001 का संकेत केवल एक सीमित सीमा तक aggrecan गिरावट कम हो जाती है. AGNx1 और C2M रिलीज में इस पैटर्न सामान्य तस्वीर ओ + टी के साथ प्रेरित गोजातीय उपास्थि मॉडल में मनाया जाता है. सबसे पहले, AGNx1 लगभग दिन से जारी है 3 और चोटियों दिन 10-14 में, aggrecan की एक प्रारंभिक गिरावट का प्रतिनिधित्व. अगले, O +T के साथ culturing के 2 सप्ताह के बाद, प्रकार द्वितीय कोलेजन गिरावट C2M biomarker द्वारा मापा के रूप में मनाया जाता है.

Anabolic उपचार.

जांच करने के लिए कैसे anabolic उत्तेजना उपास्थि ECM कारोबार modulates, विकास फैक्टर-1 की तरह इंसुलिन (IGF-1) लागू किया गया था 3 बार गोजातीय पूर्ण गहराई explants के लिए साप्ताहिक. उपास्थि explants पर IGF-1 का प्रभाव मुख्य रूप से प्रकार द्वितीय कोलेजन गठन की माप पर मनाया गया था, ProC2 द्वारा मूल्यांकन, anabolic उत्तेजनाओं के लिए उम्मीद के रूप में (चित्र 5). इस मॉडल में 0 दिन हमेशा उच्च ProC2 माप से पता चलता है, शायद नमूनों की निकासी के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में. इन उच्च स्तर काफी कमी है और दिन 7-21 से बाहर स्तर. IGF-1 के साथ इलाज करते समय, ProC2 स्तर w/o समूह में मनाया उन लोगों की तुलना में कम कमी, यह दर्शाता है कि IGF-1 प्रकार द्वितीय कोलेजन गठन को उत्तेजित करता है दिन से 7 (चित्र 5बी). ProC2 रेखांकन भी गायों की जैविक भिन्नता दिखा. इन प्रयोगों में प्रति समूह गाय के प्रति 6 एक्सप्लांट के साथ दो गायों के एक्सप्लांट का उपयोग किया गया। पहली गाय मोटा उपास्थि था और बड़ा explants उत्पन्न, आधार रेखा पर उच्च ProC2 के स्तर में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि दूसरी गाय पतली उपास्थि के साथ छोटा था, आधार रेखा पर कम ProC2 के स्तर में जिसके परिणामस्वरूप. w/o, IGF-1, और O+T समूहों के लिए, चित्रित ProC2 स्तर दोनों गायों से explants के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन GM6001 पतली explants के साथ दूसरी गाय में ही मापा गया था. इस प्रकार, GM6001 समूह 0 दिन में कम ProC2 स्तर के साथ शुरू किया है, जो वक्र के तहत ProC2 क्षेत्र में स्पष्ट है (AUC) (चित्र 5ग). दिन 0 के स्तर के लिए ProC2 मूल्यों के सामान्यीकरण खाते में जैविक विचरण लेता है, इस प्रकार उपचार की प्रभावशीलता दिखा (चित्र 5बी, डी).

Safranin हे और फास्ट ग्रीन हिस्टोलॉजिकल दाग प्रयोग भर में explant के proteoglycan सामग्री और उपास्थि संरचना कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया गया (चित्र 6) . दिन 0, 7, 14, और 21 पर w/o, IGF-1, और O+T समूह से पौधों को हिस्टोलॉजिकल धुंधला करने के लिए निर्धारित किया गया था (चित्र 6)। w/o और IGF-1 समूह के लिए इसी तरह Safranin ओ धुंधला तीव्रता दिन के लिए दिखाई दिया 0 प्रयोग भर में explant, जो biomarker परिणामों से संबंधित है कि दोनों समूहों में से कोई भी वृद्धि हुई AGNx1 रिलीज (चित्र 4). O+T के साथ उपचार के परिणामस्वरूप 7 दिन पर पर्याप्त proteoglycan सामग्री हानि और 21 दिन पर पूरा नुकसान. इसके अलावा, तेजी से ग्रीन धुंधला तीव्रता दिन 14-21 से कम हो जाती है, C2M परिणामों के साथ संरेखण में एक कोलेजन हानि का संकेत.

Figure 1
चित्रा 1: गोजातीय उपास्थि विधि के Schematic सिंहावलोकन.
पहले दिन, गोवंशीय ऊरु कोडिएलीज को पिछले टिबिओमोरल जोड़ से अलग कर दिया गया था। पूर्ण गहराई उपास्थि explants एक स्केलपेल और बायोप्सी पंचर के साथ condyles से जारी किए गए. निकाले गए एक्सप्लांट्स को धोया गया और एक बाँझ 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में स्थानांतरित कर दिया गया। दिन 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, और 21, supernatant संस्कृति की थाली से काटा गया था, एक भंडारण प्लेट में स्थानांतरित, और पर रखा $20 डिग्री सेल्सियस, मध्यम परिवर्तन चरण 1 में सचित्र के रूप में. संग्रहीत supernatant बाद में विशिष्ट ELISA परख द्वारा ऊतक कारोबार biomarkers के माप के लिए thawed था. मध्यम परिवर्तन चरण 2 में, supernatant को हटाने के बाद, नई संस्कृति माध्यम विभिन्न उपचार या नियंत्रण explants के लिए कोई उपचार युक्त लागू किया गया था. 0 दिन, 7, 14, और 21 पर, explants supernatant कटाई के बाद 3 एच के लिए 10% resazurin समाधान के साथ incubated थे. 10% resazurin supernatant एक काले 96 अच्छी तरह से थाली जहां colorimetric प्रतिक्रिया मापा गया था करने के लिए स्थानांतरित किया गया था. संस्कृति कुओं के साथ या उपचार के बिना नई संस्कृति के माध्यम से पहले 3 बार धोया गया था के रूप में मध्यम परिवर्तन चरण 2 में दिखाया गया explants के लिए जोड़ा गया था. 21 दिन, supernatant और resazurin माप की फसल के बाद, explants के लिए formaldehyde के साथ ऊष्मायन द्वारा तय किया गया 2 ज. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 2
चित्रा 2: मेटाबोलिक गतिविधि resazurin द्वारा मापा.
बोवाइन पूर्ण गहराई उपास्थि explants अलग और 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे. संस्कृति माध्यम नए उपचार के अलावा के साथ बदल गया था 3 बार प्रति सप्ताह (एन $ 12 2 गायों से explants). उपचार IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF ] (O+T) [10/20 ng/mL], और O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10]. उपचार के बिना एक नियंत्रण समूह (w/o) शामिल किया गया था. w/o, IGF-1, और O+T समूह के लिए, मतलब और मानक त्रुटि मतलब (SEM) के 12 से प्रतिकृति 2 गायों (6 प्रति गाय प्रतिकृति) दिखाए जाते हैं. GM6001 समूह के लिए, मतलब है और 6 के SEM 1 गाय से प्रतिकृति दिखाया जाता है. (ए) मेटाबोलिक गतिविधि resazurin द्वारा मापा. (ख) वक्र के अधीन क्षेत्र (एयूसी ) में दिखाए गए चयापचय गतिविधि ग्राफों के लिए 0-21 दिनों के लिए (ए) . च र्ं ०.०००१. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रकार द्वितीय कोलेजन गिरावट C2M द्वारा मापा.
बोवाइन पूर्ण गहराई उपास्थि explants अलग और 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे. संस्कृति माध्यम प्रति सप्ताह 3 बार नए उपचार के अलावा के साथ बदल गया था. उपचार IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF ] (O+T) [10/20 ng/mL], और O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10]. उपचार के बिना एक नियंत्रण समूह (w/o) शामिल किया गया था. w/o, IGF-1, और O+T समूहों के लिए, मतलब और SEM 12 से प्रतिकृति 2 गायों (6 प्रति गाय प्रतिकृति) दिखाए जाते हैं. GM6001 समूह के लिए, मतलब है और 6 के SEM 1 गाय से प्रतिकृति दिखाया जाता है. (ए) C2M माप. w/o के सांख्यिकीय महत्व स्तर दोहराया उपायों द्वारा गणना की गई (आरएम) दो तरह से Sidak के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ ANOVA. (ख) एयूसी (क) में दिखाए गए C2M ग्राफ के लिए दिन 0-21 के लिए AUC . सांख्यिकीय महत्व डन के कई तुलना परीक्षण के साथ Kruskal-वालिस परीक्षण द्वारा गणना की गई थी. च र्ं ०.०००१. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: Agnx1 द्वारा मापा गया एग्रीकन अवक्रमण।
बोवाइन पूर्ण गहराई उपास्थि explants अलग और 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे. संस्कृति माध्यम प्रति सप्ताह 3 बार नए उपचार के अलावा के साथ बदल गया था. उपचार IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF ] (O+T) [10/20 ng/mL], और O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10]. उपचार के बिना एक नियंत्रण समूह (w/o) शामिल किया गया था. w/o, IGF-1, और O+T समूह के लिए, मतलब और SEM 12 से प्रतिकृति 2 गायों (6 प्रति गाय प्रतिकृति) दिखाए जाते हैं. GM6001 समूह के लिए, मतलब है और 6 के SEM 1 गाय से प्रतिकृति दिखाया जाता है. (ए) AGNx1 माप. w/o के सांख्यिकीय महत्व स्तर RM दो तरह से Sidak के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ ANOVA द्वारा गणना की गई थी. (ब)एयूसी (क)में दिखाए गए AGNx1 ग्राफ के लिए दिन 0-21 के लिए AUC . सांख्यिकीय महत्व डन के कई तुलना परीक्षण के साथ Kruskal-वालिस परीक्षण द्वारा गणना की गई थी. * *पी और 0.01, * ** पी और 0.001, * * *पी और 0.0001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रकार द्वितीय कोलेजन गठन ProC2 द्वारा मापा.
बोवाइन पूर्ण गहराई उपास्थि explants अलग और 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे. संस्कृति माध्यम प्रति सप्ताह 3 बार नए उपचार के अलावा के साथ बदल गया था. उपचार IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNF ] (O+T) [10/20 ng/mL], और O+T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10]. उपचार के बिना एक नियंत्रण समूह (w/o) शामिल किया गया था. w/o, IGF-1, और O+T समूह के लिए, मतलब और SEM 12 से प्रतिकृति 2 गायों (6 प्रति गाय प्रतिकृति) दिखाए जाते हैं. GM6001 समूह के लिए, मतलब है और 6 के SEM 1 गाय से प्रतिकृति फिर से दिखाया. (एक) दिन 0-21 से ProC2 माप. (बी) ProC2 मान प्रत्येक व्यक्ति के लिए दिन 0 माप के लिए सामान्यीकृत. ProC2 परिणाम अक्सर दिन 0 सामान्यीकरण से लाभ उपचार प्रभाव है कि 0 दिन पर उच्च biomarker स्तर से प्रच्छन्न किया जा सकता है को उजागर करने के लिए. ए और बीमें, सांख्यिकीय महत्व स्तर RM दो तरह से Sidak के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ ANOVA द्वारा गणना की गई थी. (क) (क) में दिखाए गए ProC2 ग्राफों के लिए दिन 0-21 के लिए AUC . (डी) दिन के लिए एयूसी 0-21 दिन के लिए 0 सामान्यीकृत ProC2 रेखांकन में दिखाया गया है (बी) सी और डीमें, सांख्यिकीय महत्व डन के कई तुलना परीक्षण के साथ Kruskal-वालिस परीक्षण द्वारा गणना की गई थी. * *पी और 0.01, * ** पी और 0.001, * * *पी और 0.0001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: Safranin O/Fast Green धुंधला द्वारा प्रोटीओग्लिकन सामग्री का हिस्टोलॉजिकल दृश्य।
बोवाइन पूर्ण गहराई उपास्थि explants अलग और 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे. संस्कृति माध्यम प्रति सप्ताह 3 बार नए उपचार के अलावा के साथ बदल गया था. उपचार IGF-1 [100 ng/mL] और OSM + TNF ] (O+T) [10/20 ng/mL] शामिल थे। उपचार के बिना एक नियंत्रण समूह (w/o) शामिल किया गया था. दिन 0, 7, 14, और 21, explants तय कर रहे थे, पैराफिन के साथ घुसपैठ की, पैराफिन में एम्बेडेड, कटा हुआ, कवर स्लाइड पर रखा, और hematoxylin, Safranin ओ, और फास्ट ग्रीन के साथ दाग. प्रत्येक उपचार समूह और प्रत्येक timepoint के लिए, एक प्रतिनिधि explant दिखाया गया है. आधार रेखा नमूने (दिन 0) में दिखाया गया स्केलबार 200 डिग्री सेल्सियस का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

गोवंश उपास्थि explants में उपास्थि ऊतक कारोबार की रूपरेखा के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल दवाओं के कई प्रकार के उपचार के प्रभाव की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, भड़काऊ intracellular रास्ते के inhibitors सहित, के inhibitors प्रोटीओलिटिक एंजाइमों, या anabolic विकास कारक.

दो अलग setups इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया: एक anabolic सेटअप जहां explants इंसुलिन जैसे विकास कारक के साथ प्रेरित किया गया 1 (IGF-1), और TNF-अल्फा और Oncostatin एम के साथ उत्तेजना शामिल एक catabolic सेटअप, जिसमें ऊतक कारोबार हो सकता है एक व्यापक स्पेक्ट्रम एमएमपी अवरोध कसे नाकारता है. इस विधि में मुख्य उत्पादन वातानुकूलित माध्यम है, जो संस्कृति अवधि भर में काटा जाता है में सीधे नव-एपिटोप biomarkers के परिमाणीकरण है। कई biomarkers supernatant में मापा जा सकता है, एक ही नमूने में विभिन्न catabolic और anabolic प्रक्रियाओं की एक साथ रूपरेखा के लिए अनुमति देता है. Safranin ओ के साथ हिस्टोलॉजिकल धुंधला / फास्ट ग्रीन biomarker विश्लेषण से निष्कर्षों को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Oncostatin एम, TNF-अल्फा, और IGF-1 प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया; हालांकि, विधि विशिष्ट cytokine stimulators तक ही सीमित नहीं है और इन आसानी से परिकल्पना या परीक्षण उपचार के आधार पर दूसरों के लिए विमर्श किया जा सकता है.

biomarker उत्पादन की व्याख्या समय के साथ anabolic या catabolic उत्तेजना के साथ कोन्ड्रोसाइट समारोह और अभिव्यक्ति प्रोफाइल में गतिशील परिवर्तन के कारण एक अस्थायी व्यायाम है. अनुपचारित explants में, प्रकार द्वितीय कोलेजन गठन biomarker ProC2 द्वारा मापा तेजी से पहले 7-10 दिनों के भीतर कम हो जाती है. IGF-1 या इसी तरह के विकास कारकों के साथ उत्तेजना आधार रेखा के लिए तुलनीय स्तर पर वातानुकूलित माध्यम में ProC2 रिलीज का कहना है; इस प्रकार, गिरावट और अधिक क्रमिक है, और रिहाई अनुपचारित explants के सापेक्ष बढ़ जाती है. एक catabolic सेटअप में, समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स दिनों 0-14 में कोन्ड्रोसाइट द्वारा proteases की वृद्धि की अभिव्यक्ति प्रेरित; यह मुख्य रूप से aggrecanases के होते हैं. यह aggrecanase व्युत्पन्न प्रोटीन टुकड़े में एक प्रारंभिक बड़ी वृद्धि का कारण बनता है, AGNx1 सहित. संस्कृति के बाद के चरणों में, कोन्ड्रोसाइट्स अधिक एमएमपी व्यक्त करते हैं, जो एमएमपी-जनरेट किए गए मार्कर, जैसे सी 2 एम, 14 दिन और उसके बाद के आसपास जारी करता है। इस प्रकार, आदेश में एक उपचार के प्रभाव प्रोफ़ाइल करने के लिए, यह सही समय अंतराल में biomarkers को मापने के लिए महत्वपूर्ण है.

जैसा कि वर्णित है, ओ + टी कॉकटेल जैसे सूजन साइटोकिन्स के साथ उपचार समय के साथ उपास्थि ऊतक गिरावट का कारण होगा। ECM की कुल पूल explant आकार द्वारा सीमित है और जब biomarker प्रोफ़ाइल का विश्लेषण पर विचार किया जाना चाहिए. नतीजतन, biomarker रिलीज में प्रारंभिक वृद्धि के बाद, स्तर बस explant ECM की शेष राशि में कमी के कारण समय के साथ कम हो सकता है.

पहले, OA मुख्य रूप से संधि उपास्थि की एक बीमारी माना जाता था. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि OA पूरे संयुक्त, जहां जल्दी रोग से संबंधित व्यक्तिगत संयुक्त डिब्बों में परिवर्तन, synovium, हड्डी, और उपास्थि में परिवर्तन की एक बीमारी के रूप में देखा जाना चाहिए, समानांतर में होते हैं, और समय के साथ संयुक्त विफलता में परिणाम12 ,21. इसलिए यह समझना महत्वपूर्ण है कि इस मॉडल प्रणाली में, उपास्थि संयुक्त (और जीव) के बाकी हिस्सों से अलग है, ऊतक बातचीत प्रभाव और प्रणालीगत कारकों के प्रभाव को सीमित करता है जो ऊतक के homeostasis को विनियमित कर सकते हैं। इसके बजाय, यह एक सरलीकृत एकल ऊतक संस्कृति जहां प्रयोगात्मक नियंत्रित स्थितियों जैव रासायनिक तकनीक, biomarkers, या हिस्टोलॉजिकल दृश्य का उपयोग कर ऊतक के लिए रोग या हस्तक्षेप परिवर्तन का पता लगाने के लिए संग्राहक किया जा सकता है. उपास्थि की वास्तुकला के कारण, सेल संख्या में भिन्नता, मैट्रिक्स संरचना, और राशि भिन्नता दोनों explants के बीच और ऊतक स्रोतों के बीच की उम्मीद है. क्योंकि biomarker उत्पादन के सापेक्ष परिमाण प्रयोगों के बीच अलग हो सकता है, यह बेहतर तुलना के लिए डेटा सेट सामान्यीकृत करने के लिए सिफारिश की है.

कम से कम संभव भिन्नता और सबसे अच्छा परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह घुटनों से उपास्थि का उपयोग करें कि संभव के रूप में ताजा कर रहे हैं महत्वपूर्ण है, अधिमानतः के बीच 1 और 24 h कसाई के बाद. उपास्थि ऊतक के अलगाव explants मोटे तौर पर एक ही मोटाई जा रहा है के साथ एक समरूप तरीके से किया जाना चाहिए. एक्सप्लांट्स को मोटी उपास्थि के क्षेत्रों से अलग किया जाना चाहिए, जो मध्य के निकटतम क्षेत्रों से बचें। ऊतक हमेशा सेल मौत और मैट्रिक्स अपघटन से बचने के लिए नम होना चाहिए. प्रयोग की लंबाई3, मध्यम परिवर्तन के बीच समय, cytokine उत्तेजना के समय, और उपचार अंतराल व्यक्तिगत यौगिक या तंत्र की कार्रवाई के hypothesized मोड फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.

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Disclosures

सीएसटी, एसीबीजई और एमके नॉर्डिक बायोसाइंस के कर्मचारी हैं। ACBJ और एमके नॉर्डिक बायोसाइंस में शेयर रखती है. शेष लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों प्रयोगशाला सहायता के लिए नॉर्डिक बायोसाइंस में तकनीकी कर्मचारियों को धन्यवाद, साथ ही हमारे अनुसंधान के सामान्य समर्थन के लिए डेनिश रिसर्च फाउंडेशन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
45% Iron(III) chloride solution Sigma-Aldrich 12322
Acetic acid Merck 1.00056.2500
Alamar Blue Life tech Invitrogen DAL1100
Biopsy processing cassettes – green IHCWORLD BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm) Scandidat MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees) Local slaughterhouse
C2M Nordic Bioscience Fee for service
Corning 96-well plate Sigma-Aldrich CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm VWR 631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES Gibco 31331-028
Ethanol ≥96% VWR 83804.36
Ethanol absolute ≥99.5% VWR 83813.36
exAGNx1 Nordic Bioscience Fee for service
exPRO-C2 Nordic Bioscience Fee for service
Fast green Sigma-Aldrich F7252
Formaldehyde solution 4% Merck 1004965000
GM6001 Sigma-Aldrich M5939-5MG
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136
Hydrochloric acid Merck 30721-M
IGF-1 Sigma-Aldrich I3769-50UG
Oncostatin M Sigma-Aldrich O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S) Sigma-Aldrich P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy) HistoLab 811
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Safranin O Sigma-Aldrich S2255
Sterile Standard Scalpels Integra Miltex 12-460-451
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides Thermo scientific J1800AMNT
TNF-alpha R&D Systems 210-TA-100
Toluene Merck 1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax TPP 99955

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References

  1. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
  2. Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
  3. Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
  4. Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
  5. Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
  6. Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
  7. Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
  8. Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
  9. Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
  10. Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
  11. Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
  12. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  13. Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).
  14. Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
  15. Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
  16. Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
  17. Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
  18. Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
  19. Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
  20. Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
  21. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).

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Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C. An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants. J. Vis. Exp. (153), e59467, doi:10.3791/59467 (2019).

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