Summary
Qui, presentiamo un protocollo che descrive l'isolamento e la coltura di espiante cartilaginee dalle ginocchia bovine. Questo metodo fornisce uno strumento facile e accessibile per descrivere i cambiamenti dei tessuti in risposta a stimoli biologici o nuove terapie mirati all'articolazione.
Abstract
I sistemi di coltura Ex vivo coprono un'ampia gamma di esperimenti dedicati allo studio della funzione cellulare e dei tessuti in un ambiente nativo. La cartilagine è un tessuto unico importante per il corretto funzionamento dell'articolazione sinoviale ed è costituito da una densa matrice extracellulare (ECM), ricca di collagene proteoglicano e di tipo II. I condrociti sono l'unico tipo di cellula presente all'interno della cartilagine e sono diffusi e relativamente bassi nel numero. Gli stimoli esterni alterati e la segnalazione cellulare possono portare a cambiamenti nella composizione e nel deterioramento dell'ECM, che sono importanti segni patologici in malattie come l'osteoartrite (OA) e l'artrite reumatoide.
I modelli di cartilagine Ex vivo consentono la profilazione di 1) di alterazioni mediate da condrociti del turnover del tessuto cartilagineo, 2) visualizzando la composizione ECM della cartilagine e 3) riarrangiamento dei condrociti direttamente nel tessuto. La profilazione di queste alterazioni in risposta a stimoli o trattamenti è di grande importanza in vari aspetti della biologia della cartilagine e completa gli esperimenti in vitro in condrociti isolati, o modelli più complessi in animali vivi in cui le condizioni sperimentali sono più difficili da controllare.
Gli esepanti della cartilagine presentano un metodo traslazionale e facilmente accessibile per valutare il rimodellamento dei tessuti nella cartilagine ECM in ambienti controllabili. Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare gli esoti della cartilagine bovina viva. Il metodo utilizza tessuto dal ginocchio bovino, che è facilmente accessibile dalla macelleria locale. Sia gli espianti che il mezzo di coltura condizionata possono essere analizzati per studiare il turnover dei tessuti, la composizione ECM e la funzione di condrocite, profilando così la modulazione ECM.
Introduction
I condrociti producono e mantengono la matrice della cartilagine. Per studiare la biologia dei condrociti e come loro e l'ECM circostante reagiscono a stimoli esterni, è fondamentale interrogarli nel loro ambiente nativo1,2. Lo studio del turnover dei tessuti cartilanei è importante per aumentare la comprensione dei meccanismi sottostanti nelle malattie articolari come l'OA, una malattia per la quale attualmente non esiste un trattamento che modifichi la malattia. Di conseguenza, vi è una notevole necessità di migliori modelli di traduzione2.
La caratterizzazione ex vivo degli effetti cellulari e tissutali è essenziale per completare altri modelli preclinici, sia in vitro, come le colture di motrice condrociti, sia in vivo, come i modelli oA indotti da interventi chirurgici o il modello di artrite autoimmune al collagene (CIA ). Numerosi studi hanno evidenziato le differenze tra il modo in cui le cellule si comportano nelle colture di monostrato 2D e nelle strutture 3D o nel loro tessuto nativo3,4. Molte cellule negli strati 2D adottano morfologie innaturali, comprese le differenze nella polarità cellulare e nell'attaccamento dei tessuti, con conseguenti differenze visive e funzionali nelle cellule all'interno dei tessuti nativi5. Le differenze sono evidenti anche nella funzionalità delle cellule, che possono spostare l'espressione proteica, portando a modelli di differenziazione profondamente alterati, macchinari regolatori e funzionalità cellulare5,6,7 ,8.
La cartilagine ECM consiste principalmente di collagene di tipo II che fornisce un quadro a matrice, e aggrecan, un proteoglicano che aiuta a trattenere il fluido all'interno del tessuto. Altre molecole matriciali come collagene di tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteina oligomericica cartilaginea (COMP), biglycan, decorin e perlecan sono presenti anche9.
Mentre l'eziologia dell'OA rimane poco chiara10,11, l'insorgenza della malattia si crede di essere causato da squilibri nel turnover dei tessuti e processi di riparazione12,13. La degradazione della cartilagine articolare è un segno distintivo di OA. I condrociti residenti nella cartilagine o le cellule nei tessuti circostanti aumentano il loro rilascio di citochine, stimolando la produzione elevata di proteine come le metalloproteine a matrice (MMP) e le aggrecanasi, che aumentano la degradazione della cartilagine ECM 14.Questa degradazione si traduce nel rilascio di piccoli frammenti proteici unici chiamati neo-epitopi, che possono essere quantificati nel siero, nelle urine o nel mezzo di coltura15. Dopo la formazione e la maturazione del collagene, vengono rilasciate anche le cosiddette proframmentazioni; questi possono essere quantificati come misura della produzione di matrici16.
Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire un modello di cartilagine ex vivo per confrontare l'effetto della stimolazione e/o del trattamento farmacologico sul turnover dei tessuti ECM. Il fatturato della cartilagine è profilato misurando i biomarcatori neo-epitopi derivanti dalla matrice direttamente nel mezzo di coltura condizionata utilizzando ELISA: AGNx1 (riflettendo l'attività dell'aggrecanasi), C2M (che riflette l'attività MMP a matrice) e ProC2 (riflettendo il collagene di tipo II) formazione). I risultati possono essere verificati dalla colorazione istologica dell'ECM, che visualizza anche l'organizzazione dei condrociti nei singoli espianti. Il protocollo descritto può essere utilizzato per testare l'effetto di nuovi trattamenti sulla funzione condrocite e sulla cartilagine turnover ECM. Una serie di studi ha utilizzato espianti della cartilagine per descrivere i processi biologici o l'effetto dell'intervento sugli espianti sfidati con citochine utilizzando approcci quantitativi istologici o immunohistochimici, mRNA, espressione proteica o proteomica2 ,17,18. Tuttavia, questi protocolli esulano dall'ambito del manoscritto corrente.
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Protocol
1. Isolamento dei tessuti
- Approvvigionamento dei tessuti
- Eseguire l'intera sezione di approvvigionamento dei tessuti all'esterno di una cappa a flusso laminare in un ambiente asettico.
- Dal macello locale, ottenere un'intera articolazione tibiofemorale del ginocchio bovino fresco dai vitelli tra 1,5 e 2 anni di età.
- Sezionare delicatamente il ginocchio del polpaccio rimuovendo prima la carne in eccesso, scoprendo i condili, il menisco, i tendini e la membrana sinoviale. Tagliare i tendini e la membrana sinoviale, permettendo all'articolazione di smembrare. Rimuovere il menisco per esporre i condili femorali.
- Isolare gli espianti dall'area portante dei condili femorali utilizzando un perforatore biopsia da 3 mm e rilasciarli dalla superficie articolare tagliando con un bisturi parallelo e il più vicino possibile all'osso subcondrale. La struttura dura dell'osso subcondrale dovrebbe garantire che gli espianti non contengano matrice calcificata. Sforzatevi di espianti con altezza uniforme.
- Conservare e mescolare immediatamente gli espianti in DMEM/F12- GlutaMAX - 1% di supporto di coltura P/S in un tubo da 50 mL o piatto Petri. Non mescolare espianti da ginocchia di mucca diverse, ma tenere separati per ogni studio.
- Coltura di tessuti
- Trasferire gli espianti in una piastra sterile da 96 po' di terreno in un cappuccio a flusso laminare.
- Lavare gli espianti 3 volte in mezzo di coltura o PBS e coltura in 200 , L di mezzo di coltura per pozzo fino all'inizio dell'esperimento. Utilizzare un periodo di lavaggio di 1 giorno per sincronizzare l'attività cellulare biopsia e il rilascio passivo di biomarcatori.
- Cultura degli espianti fino a 10 settimane in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2. Posizionare tutte le repliche all'interno di ogni gruppo diagonalmente nella piastra di coltura per ridurre al minimo la variazione indotta dall'evaporazione. Per evitare ulteriormente l'evaporazione del supernatante, aggiungere PBS ai pozzetti esterni della piastra di coltura.
2. Trattamento degli espiantatori della cartilagine bovina e valutazione dell'attività metabolica
- Coltura medio cambiamento e trattamento
- Cambiare il mezzo di coltura ogni 2-3 giorni in una cappa di flusso laminare.
- Se si applicano trattamenti, prepararli prima di cambiare il mezzo. Preparare i trattamenti alla concentrazione desiderata nei pozzi espiante per diluizione nel mezzo di coltura.
- Rimuovere delicatamente il supernatante da ogni pozzo e trasferirlo in una nuova piastra 96 pozzo. Conservare il supernatante con nastro adesivo a 20 gradi centigradi per l'analisi dei biomarcatori del turnover dei tessuti e dell'espressione proteica.
- Aggiungere immediatamente 200 l di fresco mezzo di coltura o trattamento per pozzo. Non lasciare che gli espianti si asciughino durante il cambio medio e assicurarsi che tutti gli espianti siano completamente sommersi nel nuovo mezzo.
- Colorazione di Resazurin
- Misurare l'attività metabolica una volta alla settimana come una misurazione indiretta della vitalità cellulare. Il test di resazurina è un modo semplice per valutare se l'attività metabolica degli espiantatori si deteriora per un singolo espianto a causa della morte cellulare o dei cambiamenti cellulari. Gli esepanti nel mezzo di coltura da soli hanno una lettura relativamente stabile di retozurina durante tutto il periodo dell'esperimento.
- Rendere una soluzione di mezzo di coltura con 10% resazurin.
- Raccogliere il supernatante come descritto al punto 2.1.3.
- Immergere gli espianti in una soluzione di resazurina del 10% per 3 h a 37 gradi centigradi o fino a quando i supernatanti non diventano viola. Includere 4 pozzi senza espiante come controlli di sfondo.
- Trasferire la soluzione di resazurina di controllo condizionato e di background in una piastra di microtitro nero e misurare la fluorescenza a 540 nm eccitazione/590 nm di emissione.
- Lavare accuratamente 3 volte in mezzo di coltura o PBS e immergere gli espianti nel mezzo di lavaggio per 5-10 min per consentire alla resazurina di diffondersi completamente. Aggiungere un nuovo mezzo di coltura o trattamenti se utilizzati.
3. Terminazione, fissaggio e archiviazione dei campioni
- Interruzione del periodo di coltura
- Misurare l'attività metabolica come descritto al punto 2.2. Aggiungere 200 l di PBS per pozzo.
- Fissaggio e stoccaggio
- Rimuovere il PBS, aggiungere 200 l di formaldeide per pozzo, e lasciare per 2 h a temperatura ambiente.
- Smaltire la formaldeide e aggiungere 200 l di PBS per bene. Coprire la piastra con del nastro adesivo e conservare a 4 gradi centigradi per l'analisi istochimica. Si consiglia di eseguire analisi istochimiche entro 3 mesi.
4. Biomarcatori del fatturato dei tessuti (ELISA)
- ELa Concorrenza indiretta concorrenziale
- Cappotto una piastra di streptavidin con il saggio biotinylato specifico target-peptide diluito 1:100 in tampone di altalina (100 -L per pozzo) per 30 min a 20 gradi centigradi.
- Lavare 5 volte con buffer di lavaggio standard e aggiungere un campione-supernatante (20 gradi al pozzo) insieme all'anticorpo monoclonale primario contro l'analisi bersaglio-peptide diluito 1:93.3 per ProC2 e 1:100 in cuscinetto di assaggio per AGNx1 (100 gradi al pozzo) e incubare per 2 h a 20 gradi centigradi con agitazione per ProC2 e 3 h a 20 gradi centigradi per AGNx1.
NOTA: il volume del campione viene prelevato direttamente dalle piastre sovrnatali immagazzinate. Se la concentrazione misurata è al di fuori dell'intervallo di misurazione dell'analisi, diluire il supernatante in una piastra di diluizione con fondo a V in PBS o buffer di analisi. - Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio standard e incubare con anticorpo secondario con etichetta perossidasi diluito 1:100 nel tampone di analisi (100 l per pozzo) per 1 h a 20 gradi centigradi.
- Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio standard e incubare con agitazione per 15 min al buio a 20 gradi centigradi con tetramethylbenzidine (TMB) come substrato perossidasi (100 luna per pozzo).
- Terminare la reazione con soluzione di arresto standard, 0,1 M H2SO4 (100 l per pozzo).
- Leggere la reazione colorimetrica a 450 nm assorbimento utilizzando un assorbimento di riferimento a 650 nm su un lettore di lastre di laboratorio standard.
- ELAS competitive dirette per la misurazione del turnover del tessuto cartilagineo nel supernatante
NOTA: questo quantifica C2M.- Cappotto una piastra di streptavidin con un saggio biotinylato specifico target-peptide diluito 1:100 in tampone di aspo (100 -L per pozzo) per 30 min a 20 gradi centigradi.
- Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio e aggiungere un campione-supernatante insieme a 100 l di anticorpo monoclonale con etichetta perossidase contro il pone target-peptide diluito 1:100 nel buffer di analisi (20L per pozzo). Incubare per 20 h a 2-8 gradi centigradi con agitazione.
NOTA: il volume del campione viene prelevato direttamente dalle piastre sovrnatali immagazzinate. Se la concentrazione misurata è al di fuori dell'intervallo di misurazione dell'analisi, diluire il supernatante in una piastra di diluizione con fondo a V in PBS o buffer di analisi. - Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio standard e incubare con agitazione per 15 min al buio a 20 gradi centigradi con TMB come substrato perossidase (100 l per pozzo).
- Terminare la reazione con soluzione di arresto standard, 0,1 M H2SO4 (100 l per pozzo).
- Leggere la reazione colorimetrica a 450 nm assorbimento con un assorbimento di riferimento a 650 nm su un lettore di lastre di laboratorio standard.
- AGNx1
- Quantificare la degradazione dell'aggrecan misurando il rilascio del neo-epitopo AGNx1. Questo analisi eLISA competitivo indiretto si rivolge al peptide aggrecan C-terminal (NITEGE373) generato da ADAMTS-4 e 5 scissione. L'anticorpo monoclonale riconosce tutti i frammenti con un epitopo NITEGE esposto. I dettagli sperimentali del saggio sono stati pubblicati altrove19.
- ProC2 (in via ProC2)
- Quantificare la formazione di collagene di tipo II misurando il rilascio della proframmentazione del collagene di tipo II. Questo test ELISA competitivo indiretto si rivolge all'epitopo del propeptide PIIBNP (QDVRQPG) generato da N-propeptidases durante il taglio del collagene di tipo II appena sintetizzato. I dettagli sperimentali del saggio sono stati pubblicati altrove16.
- C2M (in modo int
- Quantificare la degradazione del collagene di tipo II misurando il rilascio del frammento neo-epitopo C2M. Questo ELISA, competitivo diretto, riconosce il peptide del terminale C MMP (KPPGRDGAAG1053). Questo saggio differisce da AGNx1 e ProC2 in quanto è l'anticorpo primario che è etichettato perossidasi e quindi, utilizzato come rivelatore. I dettagli sperimentali del saggio sono stati pubblicati altrove20.
5. Analisi istologica
- Infiltrazione, incorporamento e taglio
- Posizionare gli espianti fissati (vedere il punto 3.2) in cassette etichettate singolarmente. Includere sia un'etichetta all'interno della cassetta che le cassette per garantire l'identificazione.
- Trasferire le cassette contenenti espianti in una macchina per robot tessuti. Poi infiltrati nelle espiante con paraffina in una serie di gradini di disidratazione e infiltrazione della paraffina.
- Disidratare con 96% etanolo per 90 min senza regolazione della temperatura. Ripetere questo passaggio 3 volte.
- Pulire l'etanolo con toluene per 90 min senza regolazione della temperatura. Ripetere questo passaggio 2 volte.
- Cancellare l'etanolo con toluene per 90 min a 60 gradi centigradi.
- Infiltrarsi con la cera di paraffina per 30 min a 60 gradi centigradi.
- Infiltrarsi con la cera di paraffina per 60 min a 60 gradi centigradi.
- Infiltrarsi con la cera di paraffina per 90 min a 60 gradi centigradi.
- Per ogni fase, aggiungere le soluzioni nella camera campione con flussi di pompaggio e pompaggio lenti al di sotto di 33-34 kPa. Eseguire il processo di infiltrazione in un ciclo di pressione/vuoto con un vuoto massimo da 65 a 70 kPa.
- Dopo l'infiltrazione, posizionare le cassette su un blocco riscaldante per consentire un'attenta rimozione degli espianti dalla cassetta. Incorporare delicatamente le espiante infiltrate in singoli blocchi di paraffina. Con pinze riscaldate, posizionare gli espianti con la cartilagine articolare superficiale e i lati ossei subcondrici perpendicolarmente alla superficie di taglio, garantendo la visualizzazione dei diversi strati della cartilagine all'interno di ogni sezione del provino.
- Tagliare 5 sezioni di blocchi di paraffina raffreddati con espianti incorporati su un microtoma. Trasferire le sezioni tagliate in un bagno d'acqua fredda. Se necessario, le sezioni possono essere separate utilizzando un bisturi o un vetro di copertura.
- Utilizzando con cura uno scivolo di vetro non rivestito, trasferire le sezioni in un bagno d'acqua calda (50 gradi centigradi), dove si dispiegano le sezioni. Sollevare ogni sezione su uno scivolo di copertura etichettato e posizionarlo su una piastra calda per 30 min.
- Mettete i vetrini in un cesto e incubatevi a 60 gradi centigradi per 1 h, quindi conservateli durante la notte a 37 gradi centigradi. In seguito, conservare i vetrini in contenitori chiusi a 4 gradi centigradi fino a colorare.
- Safranin O/Fast Green colorazione e visualizzazione
- Posizionare i vetrini da macchiare in un cesto e incubare i vetrini a 60 gradi centigradi per 1 ora.
- Preparare e filtrare tutti i reagenti con un filtro da 0,45 mm.
- In preparazione per la colorazione, versare i reagenti filtrati in becher in un volume che permette alle soluzioni di coprire completamente i vetrini durante l'immergenza del cestello. I becher utilizzati richiedevano un volume di 250 mL per coprire i vetrini.
- Deparaffinare i vetrini fusi sommergendo il cestello in toluene per 10 min due volte, 99% etanolo per 2 min due volte, 96% etanolo per 2 min due volte, e 70% etanolo per 2 min due volte. Quindi, idratare i vetrini in acqua per 2 min.
- Macchiare i vetrini deparati e idratati immergendo il cestello nella soluzione Iron Hematoxylin di Weigert (pH 1,5) per 10 minuti, immergere in 1% HCl una volta, e risciacquare con acqua corrente del rubinetto per circa 5 minuti o fino a quando il colore in eccesso è lavato via.
- Successivamente, macchia in 0.05% Fast Green soluzione (pH: 5.75) per 5 min, tuffo in 1% CH3COOH una volta, e macchia in 0.1% Safranin O (pH: 6.5) per 20 min.
- Disidratare e svuotare i vetrini immergendo due volte nel 70% di etanolo, 96% etanolo per 2 min due volte, 99% etanolo per 2 min due volte, e toluene 2 min due volte.
- Montare i vetrini in vetro non rivestiti con un mezzo resinoso che copre i vetrini dell'istologia.
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Representative Results
Gli espianti bovini a fondo sono stati isolati, coltivati e trattati per 3 settimane(Figura 1). Il mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di trattamento 3 volte a settimana. Una volta settimanalmente, l'attività metabolica è stata misurata dall'assaggio di resazurina. I biomarcatori del turnover di ECM sono stati misurati nel supernatore raccolto dalla piastra di coltura 3 volte a settimana. Gli esepanti sono stati divisi in 4 gruppi per il trattamento: 1) Oncostatin M e TNF ( 2) O-T - GM6001 (GM6001); 3) Insulina come fattore di crescita-1 (IGF-1); e 4) un controllo senza trattamento (w/o).
Attività metabolica.
Per tutti e quattro i gruppi, l'attività metabolica è stata relativamente stabile durante le 3 settimane (Figura 2A). C'era una tendenza per IGF-1 per aumentare l'attività metabolica leggermente al di sopra del gruppo w / o e per i gruppi O-T per diminuirlo. Il saggio resazurin è stato utilizzato per valutare facilmente l'attività dei condrociti in ogni espianto e per valutare indirettamente la vitalità cellulare senza estrarre esplants dall'esperimento. Se un espianto mostra un calo sostanziale dell'attività metabolica durante l'esperimento, l'eximpianto può essere escluso da ulteriori analisi.
Trattamento catabolico.
L'opzione O'T è stata applicata 3 volte alla settimana ai pozzi di coltura per analizzare la degradazione della cartilagine mediata da O-T (Figura 3, Figura 4). La degradazione e la degradazione dell'aggrecanae mediata dall'Aggrecanae mediata da MMP e AGNx1 sono state valutate da C2M e AGNx1 ELISA. L'aumento della degradazione del collagene di tipo II dai giorni 7-21 (Figura 3A) e la degradazione aggrecan dei giorni 3-14(Figura 4A) rispetto al gruppo w/o. Quando si aggiunge GM6001 (un inibitore MMP ad ampio spettro) in combinazione con il trattamento con O-T, il rilascio di C2M mediato da O-T è stato bloccato (Figura 3A,B). È stato osservato un rilascio di AGNx1 in diminuzione durante l'aggiunta di GM6001 nei giorni 3-7, ma il rilascio di AGNx1 raggiunge il picco il giorno 10 a livelli simili al gruppo O-T (Figura 4A), indicando che il GM6001 riduce solo la degradazione aggrecan in misura limitata. Questo modello nel rilascio di AGNx1 e C2M è il quadro generale osservato nel modello di cartilagine bovina stimolato con O-T. In primo luogo, AGNx1 viene rilasciato dal giorno 3 circa e picchi nei giorni 10-14, che rappresentano una degradazione precoce di aggrecan. Successivamente, dopo 2 settimane di coltura con O'T, la degradazione del collagene di tipo II viene osservata come misurata dal biomarcatore C2M.
Trattamento anabolizzante.
Per studiare come la stimolazione anabolizzante modula il turnover ECM cartilagine, Insulina come fattore di crescita-1 (IGF-1) è stato applicato 3 volte alla settimana per bovino espianti profondi. L'effetto di IGF-1 sugli espianti della cartilagine è stato osservato principalmente sulle misurazioni della formazione del collagene di tipo II, valutate da ProC2, come previsto per gli stimoli anabolizzanti (Figura 5). Il giorno 0 in questo modello mostra sempre misurazioni ProC2 elevate, forse come reazione all'estrazione di campioni. Questi livelli elevati diminuiscono sostanzialmente e si livellano dai giorni 7-21. Durante il trattamento con IGF-1, i livelli di ProC2 diminuiscono meno di quelli osservati nel gruppo w/o, indicando che IGF-1 stimola la formazione di collagene di tipo II dal giorno 7 (Figura 5B). I grafici ProC2 mostrano anche la variazione biologica delle mucche. In questi esperimenti sono stati utilizzati eseplants di due mucche con 6 esocre per cow per gruppo. La prima mucca aveva una cartilagine più spessa e generava espianti più grandi, con conseguente livelli di ProC2 più elevati al basale, mentre la seconda mucca era più piccola con cartilagine più sottile, con conseguente abbassamento dei livelli di ProC2 al basale. Per i gruppi w/o, IGF-1 e O-T, i livelli ProC2 raffigurati rappresentano la media degli espianti di entrambe le mucche, ma GM6001 è stato misurato solo nella seconda mucca con esplants più sottili. Così, il gruppo GM6001 ha iniziato con livelli di ProC2 più bassi al giorno 0, che è evidente nell'area ProC2 sotto la curva (AUC) (Figura 5C). La normalizzazione dei valori di ProC2 al giorno 0 livelli prende in considerazione la varianza biologica, mostrando così l'efficacia del trattamento (Figura 5B,D).
Safranin O e Fast Green sono state eseguite macchie istologiche per visualizzare il contenuto di proteoglicano e la struttura cartilaginea dell'espianto durante l'esperimento (Figura 6). Nei giorni 0, 7, 14 e 21, gli esplants del gruppo w/o, IGF-1 e O-T sono stati fissati per la colorazione istologica (Figura 6). Il gruppo w/o e IGF-1 sembrava avere un'intensità di colorazione SafraninA O simile all'eximpianto del giorno 0 durante l'esperimento, che è correlato ai risultati dei biomarcatori che mostrano che nessuno dei due gruppi ha aumentato il rilascio di AGNx1 (Figura 4). Il trattamento con O'T ha provocato una sostanziale perdita di contenuto proteoglicano il giorno 7 e una completa perdita il giorno 21. Inoltre, l'intensità di colorazione Fast Green diminuisce dai giorni 14-21, indicando una perdita di collagene in allineamento con i risultati C2M.
Figura 1: Panoramica schematica del metodo della cartilagine bovina.
Il primo giorno, i condili femorali bovini furono isolati dall'articolazione tibiofemorale posteriore. Gli espiante cartilaginee complete sono stati rilasciati dai condili con un bisturi e un punzone per biopsia. Gli espianti estratti sono stati lavati e trasferiti in una piastra sterile 96 ben coltura. Il giorno 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 e 21, il supernatore veniva raccolto dalla piastra di coltura, trasferito in un piatto di stoccaggio e mantenuto a 20 gradi centigradi, come illustrato nella fase 1 del Medium Change. Il supernatante immagazzinato è stato successivamente scongelato per la misurazione dei biomarcatori del turnover dei tessuti mediante specifici saggi ELISA. In Medium Change Step 2, dopo aver rimosso il supernatante, è stato applicato un nuovo mezzo di coltura contenente i diversi trattamenti o nessun trattamento per gli espianti di controllo. Il giorno 0, 7, 14 e 21, gli espianti sono stati incubati con una soluzione di resazurina del 10% per 3 h dopo la raccolta del supernatante. Il supernata del 10% è stato trasferito su una piastra nera di 96 pozzetto dove è stata misurata la reazione colorimetrica. I pozzi di coltura sono stati lavati 3 volte prima del nuovo mezzo di coltura con o senza trattamento è stato aggiunto agli espianti come mostrato nella fase di variazione media 2. Il giorno 21, dopo la raccolta della misurazione supernatante e retozurina, gli espianti sono stati fissati per incubazione con formaldeide per 2 h. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Attività metabolica misurata dalla resazurina.
Gli espianti della cartilagine bovini sono stati isolati e coltivati per 3 settimane. Il mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di un nuovo trattamento 3 volte a settimana (n - 12 espianti da 2 mucche). Il trattamento consisteva in IGF-1 [100 ng/mL], OSM ( , TNF ) [10/20 ng/mL] e O'T [10/20 ng/mL] , GM6001 (GM6001) [10-M]. È stato incluso un gruppo di controllo senza trattamento (w/o). Per il gruppo w/o, IGF-1 e O-T, vengono mostrati l'errore medio e standard della media (SEM) di 12 repliche da 2 mucche (6 repliche per mucca). Per il gruppo GM6001, la media e il SEM di 6 repliche da 1 mucca sono mostrati. (A) Attività metabolica misurata dalla resazurina. (B) Area sotto la curva (AUC) per i giorni 0-21 per i grafici di attività metabolica mostrati in (A). p > 0.0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Degradazione del collagene di tipo II misurata da C2M.
Gli espianti della cartilagine bovini sono stati isolati e coltivati per 3 settimane. Mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di nuovo trattamento 3 volte a settimana. Il trattamento consisteva in IGF-1 [100 ng/mL], OSM ( , TNF ) [10/20 ng/mL] e O'T [10/20 ng/mL] , GM6001 (GM6001) [10-M]. È stato incluso un gruppo di controllo senza trattamento (w/o). Per i gruppi w/o, IGF-1 e O-T, vengono mostrati la media e il SEM di 12 repliche da 2 mucche (6 repliche per mucca). Per il gruppo GM6001, la media e il SEM di 6 repliche da 1 mucca sono mostrati. (A) Misurazioni C2M. Il livello di significatività statistica di w/o è stato calcolato da misure ripetute (RM) ANOVA bidirezionale con il test di confronto multiplo di Sidak. (B) AUC per i giorni 0-21 per i grafici C2M mostrati in (A). La rilevanza statistica è stata calcolata dal test Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn. p > 0.0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: degradazione Aggrecan misurata da AGNx1.
Gli espianti della cartilagine bovini sono stati isolati e coltivati per 3 settimane. Mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di nuovo trattamento 3 volte a settimana. Il trattamento consisteva in IGF-1 [100 ng/mL], OSM ( , TNF ) [10/20 ng/mL] e O'T [10/20 ng/mL] , GM6001 (GM6001) [10-M]. È stato incluso un gruppo di controllo senza trattamento (w/o). Per il gruppo w/o, IGF-1 e O-T, vengono mostrati la media e il SEM di 12 repliche da 2 mucche (6 repliche per mucca). Per il gruppo GM6001, la media e il SEM di 6 repliche da 1 mucca sono mostrati. (A) Misurazioni AGNx1. Il livello di significatività statistica di w/o è stato calcolato da RM ANOVA bidirezionale con il test di confronto multiplo di Sidak. (B) AUC per i giorni 0-21 per i grafici AGNx1 mostrati in (A). La rilevanza statistica è stata calcolata dal test Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn. p> 0,01, p> 0,001,p > 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Formazione di collagene di tipo II misurata con ProC2.
Gli espianti della cartilagine bovini sono stati isolati e coltivati per 3 settimane. Mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di nuovo trattamento 3 volte a settimana. Il trattamento consisteva in IGF-1 [100 ng/mL], OSM ( , TNF ) [10/20 ng/mL] e O'T [10/20 ng/mL] , GM6001 (GM6001) [10-M]. È stato incluso un gruppo di controllo senza trattamento (w/o). Per il gruppo w/o, IGF-1 e O-T, vengono mostrati la media e il SEM di 12 repliche da 2 mucche (6 repliche per mucca). Per il gruppo GM6001, la media e il SEM di 6 repliche da 1 mucca sono state mostrate. (A) Misurazioni ProC2 dei giorni 0-21. (B) Valori ProC2 normalizzati alle misurazioni del giorno 0 per ogni singolo espianto. I risultati ProC2 spesso beneficiano della normalizzazione del giorno 0 per scoprire l'effetto di trattamento che può essere mascherato dagli alti livelli di biomarcatori il giorno 0. In A e B, il livello di significatività statistica è stato calcolato da RM ANOVA bidirezionale con il test di confronto multiplo di Sidak. (C) AUC per i giorni 0-21 per i grafici ProC2 mostrati in (A). (D) AUC per i giorni 0-21 per i grafici ProC2 normalizzati del giorno 0 riportati in (B). In C e D,la rilevanza statistica è stata calcolata dal test Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn. p> 0,01, p> 0,001,p > 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Visualizzazione istologica del contenuto proteoglicano da Safranin O/Fast Green colorazione.
Gli espianti della cartilagine bovini sono stati isolati e coltivati per 3 settimane. Mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di nuovo trattamento 3 volte a settimana. Il trattamento consisteva in IGF-1 [100 ng/mL] e OSM È stato incluso un gruppo di controllo senza trattamento (w/o). Il giorno 0, 7, 14 e 21, gli espiantati furono fissati, infiltrati con paraffina, infiltrati in paraffina, affettati, posizionati su vetrini di copertura e macchiati con ematossialina, Safranin O e Fast Green. Per ogni gruppo di trattamento e ogni punto temporale, viene visualizzato un espianto rappresentativo. La barra della scala mostrata nel campione di base (giorno 0) rappresenta 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentato per la profilazione del ricambio dei tessuti cartilari negli espepoli della cartilagine bovina può essere utilizzato per caratterizzare gli effetti di trattamento di molti tipi di farmaci, tra cui inibitori delle vie infiammatorie intracellulari, inibitori di enzimi proteolitici, o fattori di crescita anabolizzanti.
In questo protocollo sono state descritte due diverse impostazioni: un setup anabolizzante in cui gli espianti sono stati stimolati con fattore di crescita simile all'insulina 1 (IGF-1), e una configurazione catabolica che comprende la stimolazione con TNF-alpha e Oncostatin M, in cui il turnover dei tessuti può essere inibito da un inibitore MMP ad ampio spettro. La produzione principale di questo metodo è la quantificazione dei biomarcatori neo-epitopi direttamente nel mezzo condizionato, che viene raccolto durante tutto il periodo di coltura. Diversi biomarcatori possono essere misurati nel supernatante, consentendo la profilazione simultanea di diversi processi catabolici e anabolizzanti nello stesso campione. La colorazione istologica con Safranin O/Fast Green è stata utilizzata per convalidare i risultati dell'analisi dei biomarcatori. Oncostatin M, TNF-alpha e IGF-1 sono stati utilizzati per descrivere il protocollo; tuttavia, il metodo non è limitato a specifici stimolatori di citochine e questi possono essere facilmente scambiati con altri a seconda dell'ipotesi o del trattamento di prova.
L'interpretazione della produzione di biomarcatori è un esercizio temporale a causa dei cambiamenti dinamici nella funzione condrociti e nei profili di espressione con stimolazione anabolica o catabolica nel tempo. Negli aspiantati non trattati, la formazione di collagene di tipo II misurata dal biomarcatore ProC2 diminuisce rapidamente entro i primi 7-10 giorni. Stimolazione con IGF-1 o fattori di crescita simili mantiene il rilascio di ProC2 nel mezzo condizionato ad un livello paragonabile al basale; quindi, il declino è più graduale e il rilascio è aumentato rispetto agli esplants non trattati. In una configurazione catabolica, le citochine pro-infiammatorie inducono una maggiore espressione delle proteasi da parte del condrocito nei giorni 0-14; questo è costituito principalmente da aggrecanasi. Ciò causa un primo grande aumento dei frammenti proteici derivati dall'aggrecanasi, tra cui AGNx1. Nelle fasi successive della cultura, i condrociti esprimono più MMP, che guida il rilascio di marcatori generati da MMP, come C2M, intorno al giorno 14 e in poi. Pertanto, al fine di profilare l'effetto di un trattamento, è importante misurare i biomarcatori nell'intervallo di tempo giusto.
Come descritto, il trattamento con citochine infiammatorie come il cocktail O-T causerà la degradazione del tessuto cartilagineo nel tempo. Il pool totale di ECM è limitato dalle dimensioni dell'espianto e deve essere preso in considerazione quando si analizza il profilo del biomarcatore. Di conseguenza, dopo l'aumento iniziale del rilascio di biomarcatori, i livelli possono diminuire con il tempo semplicemente a causa della riduzione della quantità rimanente di ECM espianto.
In precedenza, l'OA era considerata principalmente una malattia della cartilagine articolare. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che l'OA dovrebbe essere vista come una malattia dell'intera articolazione, dove i primi cambiamenti legati alla malattia nei singoli compartimenti articolari, sinovium, ossa e cartilagine, si verificano in parallelo e nel tempo si verificano un guasto articolare12 ,21. È quindi importante riconoscere che in questo sistema modello, la cartilagine è isolata dal resto dell'articolazione (e dell'organismo), limitando l'influenza degli effetti di interazione dei tessuti e dei fattori sistemici che possono regolare l'omeostasi del tessuto. Invece, è una coltura semplificata di tessuto singolo in cui le condizioni controllate sperimentalmente possono essere modulate per rilevare cambiamenti patologici o interventiali al tessuto utilizzando tecniche biochimiche, biomarcatori o visualizzazione istologica. A causa dell'architettura della cartilagine, si prevede una variazione nel numero di cellule, nella composizione della matrice e nella variazione della quantità tra gli espianti e tra le fonti di tessuto. Poiché la grandezza relativa della produzione di biomarcatori può essere diversa tra gli esperimenti, si consiglia di normalizzare i set di dati per un confronto migliore.
Per garantire la minima variazione possibile e i migliori risultati, è importante utilizzare la cartilagine dalle ginocchia che sono il più fresco possibile, preferibilmente tra 1 e 24 h dopo la macellazione. L'isolamento del tessuto cartilagineo deve essere fatto in modo omogeneo con gli espianti che hanno all'incirca lo stesso spessore. Gli esepanti devono essere isolati dalle aree di cartilagine spessa, evitando le aree più vicine al centro. Il tessuto deve essere sempre umido per evitare la morte delle cellule e la decomposizione della matrice. La lunghezza dell'esperimento3, il tempo tra i cambiamenti medi, la tempistica della stimolazione della citochina e gli intervalli di trattamento possono essere regolati per adattarsi alla modalità ipotizzata di azione del singolo composto o meccanismo.
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Disclosures
CST, ACBJ e MK sono dipendenti di Nordic Bioscience. ACBJ e MK detengono azioni di Nordic Bioscience. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano lo staff tecnico di Nordic Bioscience per il supporto dei laboratori, nonché la Fondazione danese per la ricerca per il sostegno generale alla nostra ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
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