Summary
פרוטוקול מוצג באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי כדי לסנתז סט של חיישנים ביולוגיים לניתוח שאריות ירי, כדי לבדוק את תפקוד המכשירים לשימוש המיועד שלהם באמצעות ספקטרוסקופיית הזריחה.
Abstract
Microbocop הוא ביוסנסור כי תוכנן עבור יישום ייחודי בכימיה משפטית. MicRoboCop היא מערכת מורכבת משלושה מכשירים כי, כאשר משתמשים יחד, יכול להצביע על נוכחות של שאריות ירי (GSR) על ידי הפקת אות פלואורסצנטית בנוכחות של שלושה אנליטים מפתח (אנטימון, עופרת, ורכיבים אורגניים של GSR). הפרוטוקול מתאר את הסינתזה של הביוחיישנים באמצעות es, coli קולי (E. coli), ושיטות הכימיה האנליטיות המשמשות להערכת הסלקטיביות והרגישות של החיישנים. תפקוד המערכת מוצג באמצעות GSR שנאסף מתוך מעטפת מחסנית בילה. ברגע שהוכן, הביוחיישנים ניתן לאחסן עד הצורך, והוא יכול לשמש כמבחן עבור אלה מקשים מנתחי. תגובה חיובית של כל שלושת האנליטים מספק בדיקה חיובית שוערת עבור GSR, בעוד כל מכשיר בודד יש יישומים לגילוי האנליטים בדגימות אחרות (למשל, גלאי להוביל זיהום מים שתייה). המגבלה העיקרית של המערכת היא הזמן הנדרש עבור אות חיובי; עבודה עתידית עשויה להיות כרוכה בלימוד אורגניזמים שונים כדי למטב את זמן התגובה.
Introduction
ביוסנסור הוא כל מכשיר אנליטי המשתמשת ברכיבים ביולוגיים (כגון חלבונים, חומצות גרעין, או אורגניזמים שלמים) המייצרים תגובה כי ניתן להשתמש לאיתור חומר כימי או מכשיר. כדוגמה, תעשיית כריית הפחם בשימוש ביוסנסור עבור הרבה של המאהה -20 כדי לזהות את הנוכחות של גזים רעילים מוקש: הקנרית במכרה פחם1. תגובת האורגניזם הביולוגי (מוות או מצוקה) לאנליטה כימית (פחמן חד-חמצני) נצפתה על ידי הכורים כדי להגן על העובדים. בדוגמה מודרנית ומתוחכמת יותר, ניתן לשנות חיידקים באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטית כדי להגיב לנוכחות של משתמש כימי מסוים על ידי המציגות תגובה ספציפית, כגון ביטוי של חלבון פלורסנט.
ביולוגיה סינתטית היא מונח רחב המתייחס לבניית מכשירים ביולוגיים ומערכות שאינן קיימות באופן טבעי, או עיצוב מחדש של מערכות ביולוגיות קיימות למטרה מסוימת2. ביולוגיה סינתטית נבדל מהנדסה גנטית על-ידי מתודולוגיה סטנדרטית וקיום חלקים סטנדרטיים (אלמנטים גנטיים סטנדרטיים בביולוגיה סינתטי) שניתן להשתמש בהם כדי לסנתז מכשירים ומערכות. חלק מוצג לתוך הגנום של המכשיר, אורגניזם כגון חיידק, כדי לבטא תכונה מסוימת שתשמש כאינדיקציה לפונקציה. לדוגמה, במכשירים סינתטיים רבים, הביטוי של חלבון פלורסנט מוצג לתוך אורגניזם תא יחיד כחלבון עיתונאי. ניתן לשלב התקנים מרובים במערכת. הגנום של מיקרואורגניזמים כגון חיידקים קל לתמרן באופן זה. דוגמאות רבות של ביוחיישנים ספציפיים למגוון רחב של מנתחי כימיים דווחו בספרות בעשור האחרון3,4.
בעבודה זו, מערכת microbocop מוצג כדוגמה ביוסנסור שתוכננה באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי עם יישומים חדשניים בכימיה משפטית וסביבתית. MicRoboCop היא מערכת של שלושה מכשירים נפרדים, כי, כאשר בשילוב, יאפשר es, coli לבטא חלבון פלורסנט אדום (rfp) בנוכחות של שאריות ירי (gsr) כי נאסף מידי אדם או משטח. כל אחד משלושת המכשירים מגיב למכשיר כימי מסוים שידוע כמרכיב של GSR5. שלושת האנליטים שבהם המערכת מגיבה הם אני. 2, 4, 6-trinitrotolene (TNT) ותרכובות קשורות, II. עופרת (בצורת יונים מובילים) ו-III. אנטימון (גם בצורת יונים).
GSR מורכב מחומרים כימיים רבים ושונים, אבל השלושה משמשים בדרך כלל כדי לזהות שאריות כמו GSR הם בריום, עופרת, ו אנטימון5. בדיקת הראיות הסטנדרטית לזיהוי של GSR היא להשתמש סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) עם אנרגיה מפזרים X-ray פלואורסצנטית (EDX)5. SEM-EDX מאפשר לאנליסטים לזהות את המבנה הייחודי ואת הרכיבים היסודיים של GSR. כיום, ישנם מספר בדיקות שימוש נרחב שוערת בינארי זמין. בדיקה שוערת שפורסמה לאחרונה משתמשת בספקטרוסקופיית מוביליות (IMS), שהיא ציוד מיוחד שעשוי שלא להיות זמין במעבדות רבות6. יש גם כמה צבעים "ספוט" בדיקות שניתן להשתמש בהם, למרות שהם משמשים בדרך כלל לקביעת מרחק או לזיהוי GSR על חורי קליע ופצעים5. בנוסף, יש כבר כמה תשומת לב מוגבלת בספרות כדי בדיקות אלקטרוכימי של GSR כי להעסיק ניתוח וולטמטרי, אשר יש את היתרון של הפוטנציאל להיות נייד בתחום, או בנוכחות אנוטמטריה הלונדית, שהיא מאוד שיטה רגישה לאלמנטים מתכתיים7. יש מעט מאוד להזכיר בספרות של אנלייזרים תוכנן במיוחד לצורך זיהוי gsr, למרות כמה ביולוגי יישומים משפטיים אחרים פורסמו8.
האלמנטים הביולוגיים של כל מכשיר במערכת המיקרובווטר, והבנייה הפלסמיד, מומחשים באיור 1. החץ המעוקל באיור 1b מייצג את אזור המקדם המופעל בנוכחות האנליטה, האליפסה היא אתר הכריכה הריבוזומלי המאפשר תרגום של חלבון הכתב, התיבה האפורה הנקראת rfp הוא הגן המבטא אדום חלבון פלורסנט, והמתומן האדום הוא האתר לסיום התמלול. כל שלושת המכשירים ישמשו יחד כמערכת כדי לזהות GSR. כל התקן עם מיזם מסוים (SbRFP, PbRFP, ו-TNT-RFP) יהיה מודבטים עם המדגם כי הוא נבדק והזריחה של RFP יהיה נמדד. RFP יהיה רק להתבטא אם האנליטה הכימי המתאים קיים ומפעיל את אזור היזם. שלושה מכשירים המגיבים לחלק מהחומרים הכימיים המצויים בתוך GSR תוכננו ומוצגים בעבודה זו.
היזמים המשמשים את שלושת המכשירים microbocop הם מקדם ארסן ו אנטימון רגיש, sbrfp9,10, מקדם רגיש להוביל, pbrfp11,12 ו מיזם רגיש TNT, TNT-RFP 13. בגלל חיפוש בספרות חשף מקדם שנועד להגיב בריום, מיזם TNT נבחר במקום מיזם זה הוא רגיש למספר תרכובות קשורות מבנית (בפרט, 2, 4-dinitrotoluene ו dinitrobenzene נזן) כי הם ידועים להיות חלק התרכובות אורגני שנותרו מאחור GSR. יזם זה בהצלחה שימש לזהות באופן ספציפי כמויות דקות של TNT ו 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) במכרות אדמה קבורים13. באמצעות שלושת המכשירים יחד כמערכת, בדיקה חיובית עבור GSR יפיק פלואורסצנטית בכל שלושת המכשירים. אות פלואורסצנטית רק אחד או שניים התקנים יציין מקור אחר של הסביבה של האנליטה (s) או במקרה של מקדם TNT, הפעלה על ידי תרכובת שאינה תרכובת אורגנית שנותרה מאחור ב-GSR. על ידי שימוש בכל שלושת המכשירים יחד, האפשרות של תוצאות חיוביות שווא בשל מקורות סביבתיים הוא ממוזער. תחמושת ללא עופרת, הצוברת פופולריות, עדיין מייצגת רק כ -5% ממכירת התחמושת בארצות הברית; מכאן, תוצאות שליליות שווא בשל היעדר העופרת עשויה להיות אפשרות אבל יש עדיין שירות בחיישן המשתמשת להוביל כסמן עבור GSR14. בנוסף ליישום המשפטי הספציפי הזה, ניתן להשתמש בכל אחד מההתקנים בנפרד לצורך זיהוי מזהמים סביבתיים.
הפרוטוקולים המוצגים כוללים את טכניקות ביולוגיה סינתטי המשמשים כדי ליצור את המכשירים (חיידקים חיישן) ואת הטכניקות האנליטיות כדי לבדוק את התפקוד של המכשירים ולנתח את אותות הזריחה שהתקבלו. הפרוטוקול כולל גם אוסף של ראיות משפטית בצורה של יד מנגב לאסוף GSR מידיהם של חשוד או שאיפה לאסוף את GSR מפני השטח. תוצאות מהתקן החיישן המוביל מוצגים כתוצאות לדוגמה, יחד עם הדגמה של בדיקה חיובית עבור GSR באמצעות מעטפת מחסנית בילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: סינתזה של E. coli המבטא rfp מוצג.
1. הכנת ה-DNA פלמיד מ E. coli
- הפשרת e. coli המכיל פלבין עם גן rfp וגנים אמפיצילין התנגדות ולגדול E. Coli על לוריא ציר (LB) אגר לוחות המכילים 100 μg/ML אמפיצילין ב 37 ° צ' עבור 24 h. לדוגמה, השתמשו בJ10060 פלמיד מהרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטית (ראו טבלת חומרים). פלאביניים J10060 כולל גן RFP (חלבון פלורסנט אדום) תחת שליטה של אזור מקדם pBad ו גן התנגדות אמפיצילין. לחילופין, להפוך את E. coli (להתייחס לשלב 3.2) עם הפלסמיד לפני הצמיחה על לוחות LB אגר.
- בצע את פרוטוקול miniprep רגיל (ראה טבלת חומרים) כדי לבודד DNA מ 1 מ ל של תרבות E. coli המכיל את J10060 פלביניים. מטרת הפרוטוקול הבא היא להסיר את המקדם pBad ולהחליף אותו עם היזם הרצוי עבור המכשיר.
- מאחסנים דנ א במקפיא. עד שהוא מוכן לעיכול
2. הגבלת עיכול האנזים
- הגדר את התגובה הבאה בצינור מיקרוצנטריפוגה עבור העיכול EcoRI ו NheI: 10 μL של ה-DNA J10060 באמצע (מבודד בשלב 1), 8 μL של מים, ו 1 μL כל אחד EcoRI ו NheI אנזימים מעורב מראש עם 1 μL של מאגר (ראה לוח חומרים).
- עבור ה-DNA של היזם, להגדיר את התגובה הבאה בצינור מיקרוצנטריפוגה עבור EcoRI והעיכול NheI: 10 μL של היזם המקדם DNA רצפים (8 μL של מים, ו 1 μL כל אחד EcoRI ו-NheI אנזימים מעורב מראש עם 1 μL של מאגר.
- עבור Sb-, Pb-, או TNT-rfp (ראה טבלה של חומרים), לפזר את פורוזימטר במאגר (30 מ"מ hepes, pH 7.5; 100 mm אשלגן אצטט), מודחלת בריכוזים שווים מולרי, חום 94 ° c עבור 2 דקות, בהדרגה קריר בטמפרטורת החדר).
- מערבבים את הדגימות על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה עם הפיפטה מוגדר 10 μL.
- דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
- החום מפעיל את האנזימים ב-80 ° c במשך 5 דקות.
- לאחסן את ה-DNA מתעכל במקפיא עד מוכן לשלב הבא.
3. הארכה וטרנספורמציה
-
צדו
- באמצעות ה-DNA היזם ולקדם את זה היו מתעכל כפול עם EcoRI ו NheI בשלב 2, להגדיר את תערובת התגובה המוצגת בטבלה 1 בשפופרת מיקרוצנטריפוגה על הקרח; הוסיף את ה-DNA Ligase T4 האחרון.
הערה: טבלה 1 מציגה הארכה תוך שימוש ביחס מולרי של 1:3 וקטור להוספה לגודלי ה-DNA המצוינים. - בעדינות לערבב את התגובה על ידי ליטוף למעלה ולמטה ו מיקרוצנטריפוגה בקצרה.
- דגירה בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.
- החום מתבצע ב-65 ° c במשך 10 דקות.
- באמצעות ה-DNA היזם ולקדם את זה היו מתעכל כפול עם EcoRI ו NheI בשלב 2, להגדיר את תערובת התגובה המוצגת בטבלה 1 בשפופרת מיקרוצנטריפוגה על הקרח; הוסיף את ה-DNA Ligase T4 האחרון.
-
טרנספורמציה
- הפשרת צינור עם 20 μL של DH5-alpha המוסמכת תאי החיידק על הקרח עד גבישי הקרח האחרון נעלמים.
- הוסף 5 μL של דנ א פלמיד לתערובת התא. בזהירות קפיצי את הצינור 4-5 פעמים כדי לערבב את התאים DNA.
- מניחים את התערובת על הקרח עבור 2 דקות.
- הלם חום בדיוק 42 ° צלזיוס בדיוק 30 s. אל תערבב.
- . מניחים על קרח במשך 2 דקות אל תערבב.
- פיפטה 380 μL של טמפרטורת החדר SOC לתוך התערובת. להתפשט מיד על צלחת ליברות אגר המכיל אמפיצילין (100 μg/mL) ו-דגירה לילה ב 37 ° c.
- בדוק את הצלחות. בתוך 24 שעות לצמיחה
- לאטום את הצלחות עם איטום הסרט ולאחסן במקרר עד מוכן לשלב הבא.
4. המושבה ה-PCR
- הוסיפו לצינור ה-PCR (הגדר 4 שפופרות תגובה) תערובות התגובה המוצגות בטבלה 2.
- לערבב בעדינות את התגובות על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
- השימוש בעצת פיפטה צהובה מגרד מושבה (או אזור קטן מאוד) של ה -E. coliהשונה. להעביר לסחוב את זה E. coli על צלחת חדש LB/אמפיצילין/אגר כי כבר הנחה את, ולאחר מכן להכניס את הקצה הצינור לתוך השפופרת PCR. טלטל את קצה הפיפטה כדי לערבב את החיידק הקולי בתערובת ה - PCR. חזור על שלוש פעמים נוספות עבור מושבות נוספות. העבר את צינורות ה-PCR למכונת PCR והתחל בשימוש תרמי באמצעות התוכנית המוצגת בטבלה 3.
- הפעל אלקטרופורזה ג'ל באמצעות 2% agarose ג'ל ב-טה כדי לקבוע אילו מושבות יש את הדבר הטוב ביותר לתוך הפלבאמצע ולגדול את המושבות האלה על צלחת חדשה.
- לאחסן את הצלחות במקרר עד מוכן לבדיקה. הכינו תרבות נוזלית בציר לוריא עם 100 μg/mL אמפיצילין נוסף לבדיקות כימיות.
5. רצפי דנ א
- עבור כל דוגמה, להוסיף 5 μL של פלאדי1, 4 μL של רצף הצבע, ו 3 μL של מים מיניים.
- מניחים את התערובת הזאת בשפופרת ושולחים אותו לרצפי דנ א (ראו טבלת חומרים).
- ניתוח נתונים רצף ה-DNA להשוואת רצפי ה-DNA צפוי ונצפה באמצעות ניתוח רצף DNA תוכנה כדי להבטיח כי אין מוטציה וכי הגנים הוכנסו בצורה נכונה.
הערה: שימוש ב -E. coli כחיישן כימי מוצג להלן.
6. הכנת תרבויות E. coli
- הכינו LB עם 100 μg/mL אמפיצילין עבור תרבויות נוזלי.
- הכנת תרבויות נוזלי של חיידקים חיישן, שליטה חיובית * חיידקים ושליטה שלילית * * בקטריה.
הערה: * בקרת חיידקים חיוביים: E. coli המכיל פלמיד עם הגן rfp תחת שליטה של מקדם קונסטיטוטיבי; בעבודה זו נעשה שימוש בפלסמיד E1010 מתוך הרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטית (ראה טבלת חומרים).
* * בקרת חיידקים שליליים: E. coli המכיל פלאבין עם הגן rfp תחת שליטה של מיזם שונה, כגון היזם pbad (פלJ10060 בינוני מתוך הרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים המשמשים לביולוגיה סינתטית (ראה טבלת חומרים)) או פלאמיד שאין בו גן rfp. - מניחים את התרבויות לתוך אינקובטור רועד ב 37 ° c ו 220 סל ד למינימום של 8 h, מקסימום של 18 h. מרק מעונן מעיד על גידול חיידקי.
7. החיידק לבדוק את תפקוד המכשיר
הערה: ברגע שהחיישנים מתפקדים לבדיקה, שלב זה אינו צריך לחזור על עצמו. שליטה חיובית בצורה של תוספת של עופרת, אנטימון, ו-2, 4-DNT או 1, 3-dinitrobenzene נזן (1, 3-DNT) יכול לבדוק את הפונקציה של התקנים עבור כל שימוש ללא צורך titration מלא.
- הכנת פתרון מניות של האנליטה (s) של עניין בריכוז של 10 דפים לדקה במים. אם מסיסות היא בעיה, להשתמש 50/50 מים/מתנול תערובת.
- באמצעות טבלה 4 כמדריך, התווית את המספר המתאים של צינורות התרבות הסטרילית ומניחים 2 מ ל של הציר התרבותי (משלב הפרוטוקול 6) לתוך כל צינורית.
הערה: כדי לקבוע טווח אנליטי כללי, יש לפחות שלוש רמות שונות של אנליטה עם חיידק החיישן, רמה אחת עם השליטה השלילית, ורמה אחת עם השליטה החיובית. צריך גם להיות שפופרת אחת של כל אחד החיידקים כי אין מתכת הוסיף (סוג אחר של שליטה שלילית). כדי לקבוע במדויק יותר טווח אנליטי ומגבלות של איתור, השתמש בטווח גדול יותר של ריכוזי האנליטה. - הוסף פתרון מלאי אנליט לצינורות המכילים 2 מ ל של מרק כמצוין בטבלה 4, מניחים את כובעי הצמד על שפופרת התרבות, כך שהם רופפים (כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור), ומערבולת צינור התרבות.
- השארת מכסי הצמד באופן רופף על צינורות התרבות, מקום לתוך אינקובטור רועד ב 220 rpm ו 37 ° c עבור לפחות 24 שעות.
- להסיר את הצינורות מן החממה, להצמיד את כובעים על הצינורות בחוזקה, ולאחסן את הצינורות במקרר עד מוכן ניתוח פלואורסצנטית.
8. השימוש E. coli כחיישן כימי של gsr
- באמצעות מחיקה אתנול מבוסס המיועד להסרת עופרת (ראה טבלת חומרים), לנגב את כל המשטחים של הידיים, כולל בין האצבעות. השתמש במחיקה נפרדת עבור כל יד. אחסן את המגבונים בשקית שמסומנת כראוי לאיטום עד לניתוח.
- עבור משטחים להיבדק: השתמש במחיקה על בסיס אלכוהול למשטחים גדולים או לספוגית כותנה שנישחת באתנול למשטחים קטנים.
הערה: כדי להדגים את התגובה של החיישנים ל-GSR, החלק הפנימי של מעטפת מתוך המחסנית היתה מ40. - לבישת כפפות נקיות ושימוש במספריים שנוקו עם אלכוהול, חותכים בערך 1 ס מ בחלק ממרכז הניגוב.
- מניחים את פיסת לחתוך את היד לנגב או כותנה לנקות ישירות לתוך צינור תרבות המכיל 2 מ ל של חיידקים חיישן, להבטיח כי הוא שקוע בתוך המרק.
- המשך כמתואר לעיל בשלבים 7.4 – 7.5.
9. ניתוח פלואורסצנטית באמצעות ספקטרומטר נייד (ראה טבלת חומרים)
- השתמש במיקסר מערבולת כדי לנענע את הצינורות.
- להכין את ספקטרומטר כדי לאסוף פליטת הזריחה באורך הגל המתאים עבור variant RFP שלך עם אורך הגל של 500 ננומטר.
- השתמשו בציר לוריא כדי להקליט ספקטרום ריק.
- העבר בזהירות כל supernatant לקובט נפח נמוך לאסוף את עוצמת הפליטה.
10. ניתוח פלואורסצנטית באמצעות 96-ובכן קורא צלחת (ראה טבלת חומרים)
- השתמש במיקסר מערבולת כדי לנענע את הצינורות.
- העברת 200 mL של ציר לבאר בצלחת הבאר. הקלט אילו דגימות. הלכו לכל טוב של הלוחית
- להגדיר את fluorimeter כדי לאסוף את עוצמת הפליטה באורך הגל המתאים עבור משתנה RFP.
11. ניתוח מידע
- באמצעות האות המתקבל מכל הפקדים שליליים (RFP חיידקים שליליים או חיידקים חיישן ללא אנליטה הוסיף), לחשב אות ממוצע של זריחה עבור הרקע.
- להחסיר את האות הרקע הממוצע מכל אות הזריחה שהתקבל עבור חיידקים חיישן לקבל רקע מתוקן עוצמה פלואורסצנטית.
- הערכת יחס האות לרעש (S/N) על-ידי חלוקת עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית שתוקנה באמצעות אות הרקע הממוצע. אם יחס ה-S/N גדול מ-3, הבדיקה חיובית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ספקטרום של קרינה פלואורסצנטית עבור משתנה RFP המשמש בעבודה זו מוצגים באיור 2. נתונים אלה הם מן PbRFP המכשיר כפי שהוא מגיב להוביל ואת TNT-RFP המכשיר כפי שהוא מגיב לשני אנליטים, 2, 4-DNT ו 1, 3-DNT. איור זה מציג את הספקטרום של שליטה שלילית (לא הוסיף אנליטה), ואת ספקטרום בשתי רמות שונות של אנליטה הוסיף. האות המקסימלי הפלואורסצנטית עבור המשתנה RFP בשימוש נצפתה ב 575 nm (עירור אורך הגל 500 nm). הנתונים באיור 3 מייצגים של ניסוי טיטור בודד (ולכן לא כלולים קווי שגיאה) של ההתקן PbRFP, התקן כמו בשלב 7 של פרוטוקול. איור 3a מראה נתונים שנאספו מתוך ספקטרומטר נייד, בעוד איור 3a מראה נתונים שנאספו מן fluorimeter (מאותה קבוצה של פתרונות). יש מגמה כללית של הגדלת הזריחה כמו ריכוז של עליות מתכת. ראוי לציין כי בריכוזים גבוהים, גדול יותר מאשר על 800 ppb, התגובה יורדת בשל רעילות של המתכת בריכוז כזה גבוה. רמת תגובה מקסימלית זו עשויה להשתנות בהתאם לשימוש באמצעות האנליטה. העבודה הקודמת שלנו עם SbRFP הראו כי החיידק יכול לסבול רמות גבוהות יותר (לפחות עד 1,000 ppb) של ארסן ו אנטימון10. ספרות על רמות של אנליטים אלה שנאספו מתוך מטליות יד מציין כי רמות אלה של העופרת ו אנטימון עקביים עם מה יכול להיות נאסף מספוגית יד15. בנוסף, התוצאות המוצגות באיור 4 להדגים כי החיידקים יכולים לסבול את כמויות האנליטים נוכח בנרתיק מחסנית ללא מוות תאים, אשר יהיה גבוה באופן משמעותי ממה שנאסף מספוגית יד.
באמצעות ערכי ה-S/N המחושבים עבור נתונים אלה, רמת ההפניה הנמוכה ביותר המוגדרת לזיהוי היתה 12 ppb (שזיהוי כפי שהוגדר באמצעות S/N גדול מ-3). לעומת זאת, ה-S/N עבור נתונים ספקטרומטר נייד הוא רק 2 ברמה הגבוהה ביותר נבדק. עם זאת, המגמה של הגדלת הזריחה עם ריכוז האנליטה הגוברת עדיין צוין בבירור.
איור 4a מראה בדיקה חיובית עבור gsr. כדי להשיג את התוצאה הזאת, מטליות האתנול נאספו מתוך מעטפת בילה 40 בקוטר קליבר והוסיף שלושה חיידקים חיישן, כמו בשלב 8 של הפרוטוקול. איור זה גם מראה שליטה חיובית (חיידקים המבטא באופן מבחינה RFP) ושליטה שלילית בצורה של התקן SbRFP ללא אנליטה הוסיף. הדגימות מארגז המחסניות שימשו כתוצאות של הוכחת העיקרון. בעבודה בעתיד, עבודת יד ייאספו מאנשים הידועים כי ירו אקדח כדי להראות כי החיישנים מגיבים גם הדגימות יד.
| רכיב | 20 התגובה μL |
| מאגר ה-DNA של 10 x T4 | 2 מיקרומטר |
| דנ א פלמיד (3 kb) | 3 מיקרומטר |
| לקדם דנ א (1.2 kb) | 10 מיקרומטר |
| Nuclease-מים ללא תשלום | 4 מיקרומטר |
| T4 לligase | 1 ליטר |
. שולחן 1 , תערובת התגובה לצורך הארכה. שלב הפרוטוקול 3.1.1
| רכיב | התגובה ל -25 μL |
| 10 מטרים קדימה פריימר | 0.5 מיקרומטר |
| 10 היפוך פריימר הפוכה | 0.5 מיקרומטר |
| אחדTaq 2X מיקס מאסטר | 12.5 מיקרומטר |
| Nuclease-מים ללא תשלום | 11 ליטר |
. שולחן 2 תערובות תגובה למושבה. ה-PCR, פרוטוקול שלב 4.1
| צעד | TEMP | זמן |
| דנטורציה ראשונית | 94 ° c | שלושים בנות |
| 30 מחזורים | 94 ° c | שלושים בנות |
| 55 ° c | 45 ס | |
| 68 ° c | 60 ס | |
| הארכה סופית | 68 ° c | 5 דקות |
| החזיק | 4 מעלות צלזיוס |
. שולחן 3 הפרמטרים של ה-PCR לרכיבת אופניים עבור הפרוטוקול שלב 4.3.
| מזהה צינורית | חיידקים | ריכוז תמיסת האנליטה נוסף (ppm) | מתכת נוספת | נפח של פתרון אנליט התווסף ל 2,000 מציר μL | . בסדר |
| 1 | הוראות המשך | 10 | Pb | 2.5 | 12 |
| 2 | הוראות המשך | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | הוראות המשך | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | הוראות המשך | 0 | לא | 0 | 0 |
| מיכל 5 | RFP שלילי | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | RFP | 10 | Pb | 10 | 50 |
. שולחן 4 הניסוי הכללי הוגדר לטיטור של הביוחיישנים, פרוטוקול שלב 7.2.
איור 1. אלמנטים ביולוגיים של המכשירים המיקרובווטרים. (a) דיאגרמה של המכשיר הכללי של MicRoboCop בפלסמיד עם גן התנגדות אמפיצילין. (ב) דיאגרמה של כל התקן המשולב ליצירת מערכת MicRoboCop. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. ספקטרום של קרינה פלואורסצנטית של PbRFP ו TNT-RFP חיידקים בנוכחות והעדר של אנליטה. נתונים שנאספו על פלואורימטר. (א) ספקטרום של קרינה פלואורסצנטית של חיידקים PbRFP בנוכחות והעדר של אנליטה (Pb). (ב) ספקטרום הקרינה של חיידקים TNT-rfp בנוכחות והעדר שני אנליטים (2, 4-dnt ו 1, 3-dnt). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. השוואה של מערכת ספקטרומטר נייד ופלואורימטר לאיתור ספקטרום הזריחה של חיידקים PbRFP בנוכחות והעדר של אנליטה (עופרת). (א) להוביל נתוני טיטור עבור חיידקים חיישן pbrfp שנאספו על מערכת ספקטרומטר נייד. (ב) להוביל נתוני טיטור (אותם דגימות) עבור בקטריה חיישן pbrfp שנאסף על פלואורימטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. מטליות אתנול שנלקחו מתוך החלק הפנימי של מחסנית אקדח 40 קליבר בזבז כדי להראות את התגובה של שלושת המכשירים כדי GSR. S/N עבור כל האותות היה גדול מ-3, המציין בדיקה חיובית עבור GSR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים ופתרון בעיות
ניתן לשנות את הניסוי המתואר בטבלה 4 בכל דרך המתאימה לחיישנים שעוצבו. ההיבט החשוב ביותר של החיישן הכימי הוא להעריך את רגישותו ואת הספציפיות. זה מועיל כדי להבטיח כי מגוון רחב של ריכוזים של האנליטה מנותח כדי לקבוע את מגוון אנליטי שימושי של החיישן. כדאי גם לקבוע רמה מקסימלית של אנליטה עבור התאים. בגלל האנליטים המשמשים במחקר זה הם רעילים מתכות (Pb ו-Sb) או תרכובות אורגניות בפתרון מתנול (עבור נגזרות TNT), יש רמה העליון שבו מוות תאים בשל רעילות של הפתרון או להתרחש (בדרך כלל גבוה יותר מ 500 – 1, 0 00 ppb עבור הניסויים שנערכו עד כה.
מגבלות הטכניקה
התוצאות המוצגות בעבודה זו הן איכותיות בטבע, אך נועדו להדגים את היכולות הכמותיות של RFP E. coliשונה. רגישות החיישן יכולה להשתנות באופן משמעותי בין הקבוצות המתורבתות בהתאם לצפיפות התאים בציר. אם יש צורך בתוצאות כמותיים, יש להעריך את ריכוז התא על ידי מדידת הדחיסות האופטית של התרביות הנוזלי לפני הניתוח. אם הצפיפות האופטית של התרבויות נקבעת, התאים יכולים להיות מדולל כראוי כדי להפחית את השונות בין ניסויים. כמבחן שוערת עבור האנליטים הרצוי, אולם, התשובה האיכותית "הווה/לא קיים" מקובלת על היישומים שנדונו כאן. תוחלת החיים של התאים על הצלחת אגר צריך גם להיות ציין – העבודה הקודמת הראו כי הצלחות ניתן לאחסן במקרר עד 2 שבועות, אבל המכשירים לא עובדים היטב לקראת סוף המסגרת זמן ומעבר.
שיקול נוסף הוא בחירת הציוד המשמש לניתוח האות הפלואורסצנטית. באמצעות כיתה מחקר ספקטרוסקופיה עם קורא צלחת 96-באר מאפשר מבחר של עירור מדויק אורכי גל, אשר יכול להגביר את הרגישות. באמצעות מערכת זו, ניתן לאסוף את התוצאות של עד 96 ניסויים בו. ניתן גם לנתח את הקרינה RFP באמצעות מערכת ספקטרומטר נייד. מכשירים ניידים בדרך כלל לאפשר להקות עירור נבחר, אשר עשוי או לא חופפים עם עירור מקסימה של המשתנה RFP בשימוש. עם זאת, כל עוד אורך הגל עירור הוא בטווח סביר של עירור מקסימה, המכשיר הנייד יהיה בדרך כלל להיות שמיש (אם כי עם אובדן רגישות). עלות המערכות הניידות היא פחות משמעותית מהספקטרוסקופיה כיתה מחקרית, וניידות עשוי בהחלט להיות יתרון. בהתבסס על היישום הפוטנציאלי של החיידק, האנליסט יכול להחליט אם העלות הנוספת ואובדן הניידות עם מערכת הספקטרוסקופיה מוצדקת.
משמעות ביחס לשיטות קיימות
מערכת MicRoboCop שלושה חלקים המתוארים בעבודה זו נועדה לשמש כשוערת איכותית, מבחן לנוכחות GSR. כיום, מבחן הראיות "תקן זהב" עבור GSR דורש ניתוח מומחה על ידי SEM-EDX. SEM-EDX ציוד הוא יקר בדרך כלל מופעל על ידי אנליסטים מאוד מיוחדים. בנוסף, ראיות GSR הוא משתנה מאוד בתיקים משפטיים ומשתנים רבים תורמים לתצהיר של GSR על הידיים ומשטחים16. מבחן שוערת עבור GSR עשוי להועיל לחוקרים כמתן עילה סבירה לחיפוש של אדם או רכוש. בהשוואה לבדיקות אלקטרוכימי או בדיקות כגון ספקטרוסקופיית היונים, שיטה זו מציעה מיכשור פשוט וזמין שאליו מעבדות האנליטי ביותר צריכות לגשת.
יישומים אחרים
המכשירים המתוארים בכתב יד זה תוכננו להיות משולבים למערכת שלושה חלקים עבור זיהוי שוערת של GSR. עם זאת, כל מכשיר במערכת MicRoboCop (SbRFP, PbRFP, ו-TNT-RFP) יכול לשמש גם באופן אינדיבידואלי כדי לזהות זיהום כימי במזון, מים, או הסביבה דגימות. העבודה הקודמת הראתה כי המכשיר TNT-rfp ניתן להשתמש בתור חיישן באתרו עבור מכרות קרקע13,17. תוצאות שהוצגו כאן, בעבודה הקודמת שלנו10 הראו כי Sbrfp ו pbrfp התקנים יכולים לזהות ריכוזים נמוכים מספיק כדי להתחרות בציוד יקר יותר ומתוחכם כגון השראה מצמידים פלזמה פליטה האטום ספקטרוסקופית ( הקאמרי-AES) וספקטרוסקופיה לקליטת האטום (AAS). חיישן SbRFP רגיש לארסן, כמו גם אנטימון. מכשירים אלה עשויים לספק אפשרות בעלות נמוכה לניתוח זיהום מתכת כבדה רעילה.
הפרוטוקול הביולוגיה הסינתטית להכנת החיידק המוצג כאן חל על כל מערכת המשתמשת בחלקים גנטיים סטנדרטיים בביולוגיה סינתטי כדי לסנתז את ה-coli המהיר rfp. השיטה האנליטית ישימה לכל מערכת המבטא את RFP, ולכן ניתן להשתמש בה כדי לנתח כל מערכת ביו-חיישן חיידקית שנוצרה באמצעות שיטות ביולוגיה סינתטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את התלמידים באוניברסיטת Longwood ב BIOL 324 (גנטיקה) והסטודנטים בכימיה 403 (פתרון בעיה כימית מתקדמת מעבדה) אשר היו מעורבים הכנה הראשונית ובדיקות של אנטימון וחיישנים ביולוגיים עופרת. הרעיון של MicRoboCop היה שנוצר ב-GCAT SynBIO הסדנה (קיץ 2014), אשר ממומן על ידי NSF והווארד יוז המכון הרפואי מתארח על ידי אוניברסיטת מרילנד בבולטימור קאונטי. המחברים גם להכיר מימון שהתקבלו באוניברסיטת Longwood המכללה לאמנויות ומדעים ומענק GCAT SynBio בוגרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
