Summary
Протокол представлен с использованием методов синтетической биологии, чтобы синтезировать набор бактериальных биосенсоров для анализа остатков огнестрельных, и проверить функционирование устройств для их предполагаемого использования с помощью флуоресцентной спектроскопии.
Abstract
MicRoboCop является биосенсор, который был разработан для уникального применения в судебно-медицинской химии. MicRoboCop представляет собой систему из трех устройств, которые, при использовании вместе, может указывать на наличие огнестрельных остатков (ГСР), производя флуоресцентного сигнала в присутствии трех ключевых анализатов (сурьмы, свинца и органических компонентов ГСР). Протокол описывает синтез биосенсоров с использованием кишечной палочки (кишечная палочка) и аналитических методов химии, используемых для оценки селективности и чувствительности датчиков. Функционирование системы демонстрируется с помощью GSR, собранной из внутренней части отработавшего гильзы. После того как они подготовлены, биосенсоры могут храниться до тех пор, пока они не понадобятся, и могут быть использованы в качестве теста для этих ключевых анализаторов. Положительный отклик всех трех анализаторов обеспечивает предположительный положительный тест для ГСР, в то время как каждое отдельное устройство имеет приложения для обнаружения анализатора в других образцах (например, детектор для загрязнения свинцом в питьевой воде). Основным ограничением системы является время, необходимое для положительного сигнала; Будущая работа может включать изучение различных организмов для оптимизации времени отклика.
Introduction
Биосенсор — это любое аналитическое устройство, которое использует биологические компоненты (такие как белки, нуклеиновые кислоты или целые организмы), которые производят реакцию, которая может быть использована для обнаружения химического вещества или анализата. Например, угольная промышленность использовала биосенсор в течение большей части 20-го века для выявления наличия токсичных шахтных газов: канарейка в угольной шахте1. Реакция биологического организма (канарейки) (смерть или бедствие) на химический анализатор (окись углерода) наблюдалась шахтерами в целях защиты рабочих. В более современном и утонченном примере бактерии могут быть изменены с помощью синтетических методов биологии для реагирования на наличие определенного химического анализата, показывая конкретный ответ, например, выражение флуоресцентного белка.
Синтетическая биология является широкий термин, который относится к строительству биологических устройств и систем, которые не существуют, естественно, или ре-дизайн существующих биологических систем для конкретной цели2. Синтетическая биология отличается от генной инженерии стандартной методологией и существованием стандартизированных частей (стандартных синтетических генетических элементов биологии), которые могут быть использованы для синтеза устройств и систем. Часть вводится в геном устройства, такой организм, как бактерия, чтобы выразить определенную черту, которая послужит признаком функции. Например, во многих синтетических устройствах экспрессия флуоресцентного белка вводится в единый клеточный организм в качестве корреспондента белка. Несколько устройств могут быть объединены в систему. Геномов микроорганизмов, таких как бактерии легко манипулировать таким образом. Многочисленные примеры биосенсоров, специфических для широкого спектра химических анализаторов, были зарегистрированы в литературе за последнее десятилетие3,4.
В этой работе, система MicRoboCop представлена в качестве примера биосенсор разработан с использованием синтетических методов биологии с новыми приложениями в судебно-медицинской и экологической химии. MicRoboCop представляет собой систему из трех отдельных устройств, которые, в сочетании, позволит кишечной палочки , чтобы выразить красный флуоресцентный белок (ППП) в присутствии огнестрельных остатков (ГСР), который был собран из рук человека или поверхности. Каждое из трех устройств реагирует на конкретный химический анализатор, который, как известно, является компонентом GSR5. Три анализата, к которым реагирует система,-это I. 2, 4, 6-тритротолуол (ТНТ) и родственные соединения, II. свинца (в виде свинцо-ионов) и III. сурьмы (также в виде ионов).
ГСР состоит из множества различных химических веществ, но три обычно используются для идентификации остатков, поскольку GSR являются барием, свинцом и сурьмой5. Стандартным тестом доказательности для идентификации ГСР является использование сканирующей электронной микроскопии (РЭМ) с энергией диспергирующей рентгеновской флуоресценции (EDX)5. МДж-ЭДХ позволяет аналитикам идентифицировать уникальную морфологию и элементарные компоненты ГСР. В настоящее время есть несколько широко используются бинарные предположительные тесты доступны. Один недавно опубликованный предположительный тест использует Ion-мобильность спектроскопии (МСМ), который является специализированным оборудованием, которые не могут быть доступны во многих лабораториях6. Есть также несколько цветовых "точечные" тесты, которые могут быть использованы, хотя они, как правило, используются для определения расстояния или для идентификации GSR на пулевые отверстия и раны5. Дополнительно, было некоторое ограниченное внимание в литературе к электрохимическим испытаниям для GSR, которые используют волтамметрический анализ, который имеет преимущество потенциально быть полем портативным, или анодической зачистки волтамметрии, который является чрезвычайно чувствительный метод для металлических элементов7. Существует очень мало упоминается в литературе биосенсоров разработан специально для целей обнаружения ГСР, хотя некоторые биосенсоров для других судебно-медицинских заявок были опубликованы8.
Биологические элементы для каждого устройства в системе MicRoboCop и плазмированной конструкции проиллюстрированы на рисунке 1. Изогнутая стрелка в рисунке 1B представляет собой промоутер области, которая активируется в присутствии анализатора, овальные является рибосомальных связывания сайт, который позволяет перевод репортер белка, серый ящик с меткой ППП является ген, который выражает красный флуоресцентный белок, а красный восьмиугольник является прекращение транскрипции сайте. Все три устройства будут использоваться совместно в качестве системы для обнаружения GSR. Каждое устройство с определенным промоутером (SbRFP, PbRFP и ТНТ-ППП) будет инкубировали с образцом, который проходит испытания и флуоресценции ППП будут оцениваться. ППП будет выражен только если соответствующий химический анализатор присутствует и активирует промоутер региона. Были разработаны и представлены в этой работе три устройства, которые отвечают на некоторые химические вещества, присутствующие в ГСР.
Промоутеры, используемые в трех устройствах microbocop являются мышьяк и сурьмы чувствительных промоутер, sbrfp9,10, ведущий чувствительный промоутер, pbrfp11,12 и ТНТ чувствительный промоутер, ТНТ-ППП 13. потому что поиск в литературе выявлено не промоутер предназначен для реагирования на БАРИЙ, ТНТ промоутер был выбран вместо, так как этот промоутер чувствителен к ряду структурно связанных соединений (в частности, 2, 4-dinitrouene и динитобензола), которые, как известно, являются частью органических соединений, оставленных в ГСР. Этот промоутер успешно используется для специально обнаружить мельчайшие количества ТНТ и 2, 4-динитолуол (2, 4-DNT) в захороненных шахтах земли13. С помощью трех устройств вместе, как система, положительный тест на GSR будет производить флуоресценцию во всех трех устройствах. Флуоресцентное сигнала только в одном или двух устройствах будет указывать другой экологический источник анализатора (ы) или в случае промоутер ТНТ, активация соединения, которое не является органическим соединением, оставленному в GSR. С помощью всех трех устройств, возможность ложных положительных результатов из-за экологических источников сводится к минимуму. Свинец боеприпасов, который набирает популярность, по-прежнему составляет лишь около 5% от продажи боеприпасов в Соединенных Штатах; Следовательно, ложные отрицательные результаты из-за отсутствия свинца может быть возможность, но есть еще утилита в датчик, который использует свинец в качестве маркера для GSR14. В дополнение к этому конкретному судебно-медицинской заявке, каждое устройство может быть использовано отдельно для целей обнаружения загрязняющих веществ в окружающей среде.
Представленные протоколы включают в себя синтетические методы биологии, используемые для создания устройств (сенсорных бактерий) и аналитических методов, чтобы проверить функцию устройств и проанализировать флуоресцентных сигналов, полученных. Протокол также включает в себя сбор вещественных доказательств в виде ручного протирания для сбора ГСР из рук подозреваемого или Швабинга для сбора ГСР с поверхности. Результаты с устройства ведущего датчика приведены в качестве примера результатов, а также демонстрация положительного теста для GSR с использованием отработавшего гильзы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: синтез кишечной палочки , ВЫРАЖАЮЩЕЕ ППП, представлено.
1. Приготовление плазмид ДНК из кишечной палочки
- Оттепель E. coli , содержащая плазмид с геном ППП и гена устойчивости ампициллина и расти E. coli на Лурия бульон (lb) агар пластин, содержащих 100 мкг/мл ампициллина при 37 ° c для 24 ч. Например, используйте плазмид J10060 из реестра стандартных биологических частей, используемых для синтетической биологии (см. таблицу материалов). J10060 плазмида включает ген для ППП (красный флуоресцентный белок) под контролем pBad промоутер региона и гена сопротивления ампициллина. Кроме того, преобразование E. coli (обратитесь к шагу 3,2) с плазмид до роста на LB агар пластин.
- Следуйте стандартному протоколу миниподготовки (см. таблицу материалов), чтобы изолировать ДНК от 1 мл культуры E. coli , содержащей плазмид J10060. Цель следующего протокола заключается в удалении pBad промоутер и заменить его с желаемым промоутером для устройства.
- После пластичного miniprep, хранить ДНК в морозильнике до готовности для пищеварения.
2. ограничение пищеварения ферментов
- Установите следующую реакцию в трубке микроцентрифуги для пищеварения EcoRI и NheI: 10 мкл ДНК J10060 плазмид (изолированный в шаге 1), 8 мкл воды, и 1 мкл каждого из энзим EcoRI и Нхей, предварительно смешанных с 1 мкл буфера (см. таблицу материалов).
- Для ДНК промоутера, установите следующую реакцию в пробирке микроцентрифуги для пищеварения EcoRI и NheI: 10 мкл из отживших последовательностей ДНК промоутера (8 мкл воды, и 1 мкл каждого из EcoRI и Нхей ферментов предварительно смешанных с 1 мкл буфера.
- Для SB-, ПБ-, или ТНТ-ППП (см. таблицу материалов), растворить олигонуклеотиды в буфере (30 мм HEPES, pH 7,5; 100 mm ацетат калия), инкубировать в равных молярных концентрациях, тепла до 94 ° c в течение 2 мин, и постепенно охлаждать при комнатной температуре).
- Смешайте образцы по пипетки осторожно вверх и вниз с петле установлен на 10 мкл.
- Инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 ° c.
- Нагрейте инактивировать ферменты при температуре 80 ° c в течение 5 мин.
- Храните перевариваемые ДНК в морозильной камере до готовности к следующему шагу.
3. перевязки и трансформации
-
Перевязка
- Использование плазмида и промоутер ДНК, которые были двойные перевариваются с EcoRI и Нхей в шаге 2, настроить реакцию смеси показано в таблице 1 в микроцентрифуге трубки на льду; Добавьте в последний раз ДНК Т4 Лигасе.
Примечание: Таблица 1 показывает перевязку, используя молярное соотношение 1:3 вектор для вставки для указанных размеров ДНК. - Аккуратно Смешайте реакцию пипеттинг вверх и вниз и микроцентрифугу кратко.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Нагрейте инактивировать при температуре 65 ° c в течение 10 мин.
- Использование плазмида и промоутер ДНК, которые были двойные перевариваются с EcoRI и Нхей в шаге 2, настроить реакцию смеси показано в таблице 1 в микроцентрифуге трубки на льду; Добавьте в последний раз ДНК Т4 Лигасе.
-
Преобразования
- Разморозьте трубку с 20 мкл DH5-альфа компетентные E. coli клетки на льду до тех пор, пока последние кристаллы льда исчезают.
- Добавьте 5 мкл ДНК плазмида к клеточной смеси. Аккуратно вылить трубку 4-5 раз, чтобы смешать клетки и ДНК.
- Поместите смесь на лед в течение 2 мин.
- Тепловой удар ровно в 42 °C ровно в 30 с. Не смешивайте.
- Место на льду 2 мин. Не смешивайте.
- Пипетка 380 мкл комнатной температуры соц в смеси. Сразу же распространилась на LB агар пластины, содержащие ампициллина (100 мкг/мл) и инкубировать ночь на 37 ° c.
- Проверьте пластины в течение 24 ч для роста.
- Печать пластин с пленкой запечатывания и хранить в холодильнике до готовности к следующему шагу.
4. Колония ЦР
- Добавьте к трубке (установите 4 реакционной трубы) реакционную смесь, показанное в таблице 2.
- Нежно Смешайте реакции пипеттинг вверх и вниз.
- Использование желтой пипетки отзыв, царапать колонии (или очень небольшой области) преобразованный E. coli. Передача салфетки из этого E. coli на новый LB/ампициллин/агар пластины, которые были разделены, а затем вставить пипетки отзыв в трубку ЦР. Встряхните пипетки наконечник смешать E. coli с смесь ЦР. Повторите еще три раза для дополнительных колоний. Перенесите трубки ЦР в станок и начинайте термоциклику, используя программу, показанное в таблице 3.
- Запустить гель электрофорез использованием 2% агарозы гель в ТЭ, чтобы определить, какие колонии имеют лучшие перевязки в плазмид и вырастить эти колонии на новой пластине.
- Храните пластины в холодильнике до готовности к тестированию. Подготовить жидкую культуру в бульоне Luria с добавлением 100 мкг/мл ампициллина для химического тестирования.
5. секвенирование ДНК
- Для каждого образца добавьте 5 мкл плазмида, 4 мкл последовательности грунтовки и 3 мкл деионизированной воды.
- Поместите эту смесь в трубку и отправьте ее для секвенирования ДНК (см. таблицу материалов).
- Проанализируйте данные последовательности дна для того чтобы сравнить предпологаемую и наблюдаемую последовательность дна используя програмное обеспечение анализа последовательности дна для того чтобы обеспечить что никакая мутация и что гены правильно были вставлены.
Примечание: ниже приведены использование E. coli в качестве химического датчика.
6. Подготовка культур E. coli
- Приготовьте LB с 100 мкг/мл ампициллина для жидких культур.
- Подготовьте жидкие культуры бактерий датчика, положительный контроль * бактерии и отрицательный контроль * * бактерии.
Примечание: * положительный контроль бактерий: кишечная палочка , содержащая плазмид с гена ППП под контролем учредительный промоутер; плазмид E1010 из реестра стандартных биологических частей, используемых для синтетической биологии (см. таблицу материалов), использовался в этой работе.
* * Отрицательные бактерии контроля: кишечная палочка , содержащая плазмид с геном ППП под контролем различных промоутер, таких как pbad промоутер (плазмид J10060 из реестра стандартных биологических частей, используемых для синтетической биологии (см. таблицу Материалы)) или плазмида, не имеющего гена ППП. - Поместите культур в встряхивании инкубатор на 37 ° c и 220 оборотов в минуту в течение как минимум 8 ч, максимум 18 ч. облачный бульон указывает на рост бактерий.
7. titrating E. coli для того чтобы проверить функцию прибора
Примечание: после того, как датчики были титруют для проверки функции, этот шаг не должен быть повторен. Положительный контроль в виде добавления свинца, сурьмы, и 2, 4-DNT или 1, 3-динитробензол (1, 3-ДБР) может проверить функцию устройства для каждого использования без необходимости полного титрования.
- Подготовьте запас раствора анализата (ы) интереса при концентрации 10 промилле в воде. Если растворимость является проблемой, используйте 50/50 воды/метанола смеси.
- С помощью таблицы 4 в качестве ориентира, этикетка соответствующее количество стерильных труб культуры и поместите 2 мл культивированного бульона (от протокола шаг 6) в каждой трубе.
Примечание: для того, чтобы определить общий аналитический диапазон, сделайте по крайней мере три различных уровня анализата с датчиками датчика, один уровень с отрицательным контролем, и один уровень с положительным контролем. Там также должна быть одна трубка каждой из бактерий, которая не имеет добавленного металла (другой тип отрицательного контроля). Для более точного определения аналитического диапазона и пределов обнаружения используйте больший диапазон концентраций анализата. - Добавить анализатор решение запасов для труб, содержащих 2 мл бульона, как отмечалось в таблице 4, поместите Snap колпаки на культуру трубки, так что они свободны (чтобы поток воздуха в трубу), и вихрь культуры трубки.
- Оставляя Snap шапки свободно на культуру трубы, место в встряхивании инкубатор на 220 оборотов в минуту и 37 ° c, по крайней мере 24 ч.
- Удалить трубы из инкубатора, оснастки колпачки на трубы плотно, и хранить трубы в холодильнике до готовности для флуоресцентного анализа.
8. Использование кишечной палочки в качестве химического датчика для GSR
- Использование этанола основе протрите предназначены для удаления свинца (см. таблицу материалов), протрите все поверхности рук, в том числе между пальцами. Используйте отдельную протирать для каждой руки. Храните салфетки в надлежащим образом помечены герметичные мешочке до анализа.
- Для тестированных поверхностей: использование спиртовой основе протрите для больших поверхностей или ватным тампоном, смоченным этанола для малых поверхностей.
Примечание: чтобы продемонстрировать реакцию датчиков на GSR, внутренняя часть израсходованы. 40 калибр гильзы был швабру с этанола смоченной ватным тампоном. - Ношение чистых перчаток и с помощью ножниц, которые были очищены с алкоголем, вырезать примерно 1 см2 раздела из центра протрите.
- Поместите вырезать кусок руки протрите или ватным тампоном непосредственно в культуру трубки, которая содержит 2 мл датчика бактерий, гарантируя, что он погружен в бульон.
- Продолжайте, как описано выше, в шагах 7,4-7,5.
9. флуоресцентного анализа с использованием портативного спектрометра (см. таблицу материалов)
- Используйте вихревой смеситель, чтобы встряхнуть трубы.
- Подготовьте спектрометр для сбора флуоресценции излучения на соответствующей длине волны для вашего варианта ППП с длиной волны возбуждения 500 Нм.
- Используйте бульон Luria для записи пустого спектра.
- Тщательно переносите каждый супернатант на низкообъемный кювет и собирайте интенсивность излучения.
10. флуоресцентного анализа с использованием 96-хорошо пластины читателя (см. таблицу материалов)
- Используйте вихревой смеситель, чтобы встряхнуть трубы.
- Перенести 200 мл бульона на колодец в хорошо тарелке. Запись, какие образцы пошли в каждый колодец пластины.
- Настройка флюиметра для сбора интенсивности излучения на соответствующей длине волны для варианта ППП.
11. анализ данных
- Используя сигнал, полученный от всех негативных элементов управления (ППП отрицательных бактерий или датчиков бактерии, не добавил анализатор), рассчитать средний флуоресцентного сигнала для фона.
- Вычесть средний фоновый сигнал от каждого флуоресцентного сигнала, полученного для сенсорных бактерий, для получения фонового исправленной интенсивности флуоресценции.
- Оцените соотношение сигнала к шуму (S/N) путем деления фонового исправленной интенсивности флуоресценции средним фоновым сигналом. Если коэффициент S/N превышает 3, тест положительный.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Флуоресцентное спектры для варианта ППП, используемого в этой работе, показаны на рисунке 2. Эти данные с устройства PbRFP, как он реагирует на свинец и ТНТ-ППП устройство, как он реагирует на два анализата, 2, 4-DNT и 1, 3-ДНБ. Эта цифра показывает спектр отрицательного элемента управления (не добавлен анализатор), а также спектры на двух различных уровнях анализата. Максимальный флуоресцентного сигнала для варианта ППП используется наблюдалось на 575 Нм (возбуждение длины волны 500 Нм). Данные на рисунке 3 являются репрезентативными для одного эксперимента титрования (следовательно, никакие бары ошибки не включены) устройства pbrfp, титрования как в шаге 7 протокола. Рисунок 3a показывает данные, собранные с портативного спектрометра, в то время как Диаграмма 3a показывает данные, собранные из флюфиметр (из одного и того же набора решений). Существует общая тенденция увеличения флуоресценции, как концентрация металла увеличивается. Стоит отметить, что при высоких концентрациях, больше, чем около 800 частей на миллиард, ответ падает из-за токсичности металла при такой высокой концентрации. Этот максимальный уровень отклика может варьироваться в зависимости от используемого анализата. Наша Предыдущая работа с SbRFP показала, что бактерии могут терпеть более высокие уровни (по крайней мере до 1 000 частей на миллиард) мышьяка и сурьмы10. Литература по уровням этих анализатов, собранных из ручных мазков, указывает на то, что эти уровни свинца и сурьмы согласуются с тем, что может быть собрано из ручного тампона15. Кроме того, результаты, представленные на рисунке 4 , демонстрируют, что бактерии могут терпеть количество анализатов, присутствующих в тампоне без клеточной смерти, которое будет значительно выше того, что собрано из ручного тампона.
Используя рассчитанные значения S/N для этих данных, самый низкий обнаруженный уровень свинца составлял 12 частей на миллиард (определяемых как определено S/N больше 3). В отличие от этого, S/N для портативных спектрометров данных только 2 на самом высоком уровне испытания. Однако по-прежнему четко отмечается тенденция к увеличению флуоресценции при увеличении концентрации анализата.
На рисунке 4a показан положительный тест на GSR. Чтобы получить этот результат, этанола тампоны были собраны изнутри израсходованы. 40 калибра картриджа и добавил к трем бактериям датчика, как в шаге 8 протокола. Эта цифра также показывает положительный контроль (бактерии, которые конституционно выражает ППП) и отрицательный контроль в виде устройства SbRFP без анализата добавил. Тампоны в случае картриджа использовались в качестве доказательств-принципиальных результатов. В будущей работе, ручные мазки будут собраны из лиц, которые, как известно, выстрелил пистолет, чтобы показать, что датчики реагируют на ручные тампоны, а также.
| Компонент | 20 мкл реакция |
| 10X Т4 ДНК Лигасе буфер | 2 мкл |
| Плазмид ДНК (3 КБ) | 3 мкл |
| Промоутер ДНК (0,7 КБ) | 10 мкл |
| Нуклеаза-Свободная вода | 4 мкл |
| Т4 ДНК Лигасе | 1 мкл |
Таблица 1. Смесь реакции для перевязки, протокола шага 3.1.1.
| Компонент | 25 мкл реакции |
| 10 мкм Форвард праймер | 0,5 мкл |
| 10 мкм обратный грунт | 0,5 мкл |
| ОдинTaq 2x Мастер микс | 12,5 мкл |
| Нуклеаза-Свободная вода | 11 мкл |
Таблица 2. Реакционной смеси для колонии СР, протокол шаг 4,1.
| Шаг | Temp | Время |
| Начальная денатурации | 94 °C | 30-е годы |
| 30 циклов | 94 °C | 30-е годы |
| 55 °C | 45 s | |
| 68 °C | 60 s | |
| Окончательное продление | 68 °C | 5 мин. |
| Держать | с 4 °C |
Таблица 3. Параметры для термоциклики по протоколу для протокола 4,3.
| Идентификатор трубки | Бактерий | Добавлена концентрация анализационного раствора (промилле) | Металл добавлен | Объем анализата раствора добавлен в 2 000 мкл бульона | [анализатор], частей на миллиард |
| 1 | PbRFP | 10 | Pb | 2,5 | 12 |
| 2 | PbRFP | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | PbRFP | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | PbRFP | 0 | Ни один | 0 | 0 |
| 5 | ППП NEG | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | ППП POS | 10 | Pb | 10 | 50 |
Таблица 4. Общий эксперимент создан для титрования биосенсоров, протокол шага 7,2.
На рисунке 1. Биологические элементы устройств MicRoboCop. (a) диаграмма общего устройства для MicRoboCop в плазмид с геном сопротивления ампициллина. (b) схема каждого устройства, которое объединено для создания системы MicRoboCop. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 2. Флуоресцентных спектров PbRFP и ТНТ-ППП бактерии в присутствии и отсутствии анализата. Данные, собранные на флюиметр. a) флуоресцентного спектра бактерий PbRFP в присутствии и отсутствии анализата (ПБ). b) флуоресцентных спектров ТНТ-ППП бактерий при наличии и отсутствии двух анализатонов (2, 4-DNT и 1, 3-ДНБ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 3. Сравнение переносной спектрометрическая система и флюориметр для обнаружения флуоресцентных спектров бактерий PbRFP в присутствии и отсутствии анализаторного вещества (свинца). a) данные титрования свинца для бактерий датчика pbrfp,собранных на портативной спектрометриной системе. (b) Ведите данные титрования (такие же образцы) для бактерий датчика pbrfp, собранных на флюиметр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
На рисунке 4. Этанол мазки взяты из внутренней 40 калибра отработавшего пистолета картриджа, чтобы показать реакцию трех устройств GSR. S/N для всех сигналов было больше, чем 3, что указывает на положительный тест для GSR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модификации и устранение неполадок
Эксперимент, описанный в таблице 4 , может быть изменен любым способом, подходящим для разработанных датчиков. Наиболее важным аспектом химического датчика является оценка его чувствительности и специфичности. Это выгодно для того, чтобы проанализировать широкий диапазон концентраций анализата для определения полезного аналитического диапазона датчика. Также стоит определить максимальный уровень анализата для клеток. Поскольку в данном исследовании используются токсичные металлы (ПБ и SB) или органические соединения в растворе метанола (для производных ТНТ), существует верхний уровень, при котором гибель клеток из-за токсичности анализата или раствора будет происходить (обычно выше, чем 500 – 1, 0 00 частей на миллиард для экспериментов, проведенных до сих пор).
Ограничения методики
Результаты, представленные в этой работе, носят качественный характер, но призваны продемонстрировать количественный потенциал ППП, модифицированного E. coli. Чувствительность датчика может значительно варьироваться между культивируемых партий в зависимости от плотности клеток в бульоне. Если требуются количественные результаты, концентрация клеток должна быть оценена путем измерения оптической плотности жидких культур до анализа. Если определяется оптическая плотность культур, то клетки могут быть надлежащим образом ослаблены для уменьшения изменчивости между экспериментами. В качестве предполагаемого теста для желаемых анализаций, однако, качественный "подарок/не настоящий" ответ приемлем для обсуждаемых здесь приложений. Продолжительность жизни клеток на агаре пластины должны быть отмечены-Предыдущая работа указала, что пластины могут храниться в холодильнике на срок до 2 недель, но устройства не работают очень хорошо к концу этого периода времени и за его пределами.
Другим соображением является выбор оборудования, используемого для анализа флуоресцентного сигнала. Использование исследования класса спектрофотометр с 96-хорошо читатель пластины позволяет выбор точного возбуждения и излучения длин волн, которые могут повысить чувствительность. Используя эту систему, результаты до 96 экспериментов могут быть собраны одновременно. ППП флуоресценции также могут быть проанализированы с помощью портативного спектрометра системы. Портативные приборы типично позволяют выбранные полосы возбуждения, которые могут или не могут совпасть с максимумам возбуждения варианта ППП будучи используемым. Однако, покуда длина волны возбуждения находится внутри разумный ряд максимумов возбуждения, портативный прибор вообще будет исправн (Однако с потерей в чувствительности). Стоимость портативных систем значительно меньше, чем научно-исследовательский класс спектрофотометр, и переносимость, безусловно, может быть преимуществом. Основываясь на потенциальном применении бактерий, аналитик может решить, оправдана ли дополнительная стоимость и потеря переносимости с спектрофотометром.
Значимость в отношении существующих методов
Описанная в этой работе система из трех части Микробокс предназначена для использования в качестве качественного, предполагаемого теста на наличие ГСР. В настоящее время критерий доказательности «золотого стандарта» для ГСР требует экспертного анализа со стороны Рэм-ЭДКС. Оборудование Рэм-ЭДХ дорогое и, как правило, управляется узкоспециализированными аналитиками. Кроме того, данные ГСР весьма изменчивы при судебно-медицинской экспертизе, и многие переменные способствуют осаждению ГСР на руках и поверхностях16. Предполагаемый тест на ГСР могут быть полезны для следователей, как предоставление вероятной причиной для поиска лица или имущества. По сравнению с электрохимическим испытаний или тестов, таких как Ион мобильности спектроскопии, этот метод предлагает простые, легкодоступные приборы, к которым большинство аналитических лабораторий должны иметь доступ.
Другие приложения
Устройства, описанные в этой рукописи, предназначены для комбинированного использования в трехчастичной системе для предполагаемого определения ГСР. Однако, каждое устройство в системе MicRoboCop (SbRFP, PbRFP, и ТНТ-ППП) также могут быть использованы индивидуально для обнаружения химического загрязнения в пищевых продуктах, воде, или экологические образцы. Предыдущая работа показала, что устройство ТНТ-ППП может использоваться в качестве датчика на месте для наземных мин13,17. Результаты, представленные здесь и в нашей предыдущей работе10 показали, что sbrfp и pbrfp устройства могут обнаруживать концентрации достаточно низко, чтобы соперничать с более дорогим и сложное оборудование, такие как индуктивно сочетании плазменной атомной спектроскопии ( МСП) и атомно-абсорбционных спектроскопии (ААС). Датчик SbRFP чувствителен к мышьяка, а также сурьмы. Эти устройства могут обеспечить недорогой вариант для анализа токсического загрязнения тяжелых металлов.
Синтетический протокол биологии для подготовки E. coli представленные здесь применима к любой системе, которая использует стандартные синтетические биологические генетические части, чтобы синтезировать E. coli , которые выражают ППП. Аналитический метод применим к любой системе, которая выражает ППП, и поэтому может быть использован для анализа любой бактериальной системы биосенсор, который был создан с использованием методов синтетической биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить студентов в университете Лонгвуд в BIOL 324 (генетика) и студентов в хим 403 (Расширенный решение проблемы химической лаборатории), которые были вовлечены в первоначальную подготовку и тестирование биосенсоров сурьмы и свинца. Идея MicRoboCop была задумана на GCAT SynBIO семинар (лето 2014), который финансируется ННФ и Говард Хьюз медицинский институт и организовано в университете штата Мэриленд Балтимор County. Авторы также признают финансирование, полученное от университета Лонгвуд Кук-Коул колледжа искусств и наук и GCAT SynBio выпускников Грант.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
