Summary
프로토콜은 총 총 잔류물의 분석을 위한 세균 바이오 센서의 세트를 합성 하 고, 형광 분 광 법을 사용 하 여 그들의 의도 된 사용을 위한 장치의 기능을 테스트 하기 위해 합성 생물학 기술을 사용 하 여 제시 된다.
Abstract
MicRoboCop은 법의학 화학에서 독특한 응용을 위해 설계 된 바이오 센서입니다. MicRoboCop는 3 개의 주요 분석 물 (안티 몬, 납 및 유기 성분 GSR의)의 존재 하에서 형광 신호를 제조 함으로써 함께 사용 될 때, 총 탄 잔류물 (GSR)의 존재를 나타낼 수 있는 세 개의 장치로 구성 된 시스템 이다. 이 프로토콜은 대장균 (대장균)을 사용 하 는 바이오 센서의 합성 및 센서의 선택성 및 민감도를 평가 하는 데 사용 되는 분석 화학 방법을 설명 합니다. 시스템의 기능은 사용 된 카트리지 케이스의 내부에서 수집한 GSR을 통해 입증 됩니다. 일단 준비 되 면, 바이오 센서는 필요할 때까지 보관할 수 있으며 이러한 주요 분석 물에 대 한 테스트로 사용할 수 있습니다. 3 개의 분석 물 모두에서 긍정적 인 반응은 GSR에 대 한 추정 양성 검사를 제공 하는 반면, 각 개별 장치에는 다른 샘플의 분석 물을 검출 하는 응용 프로그램이 있습니다 (예: 식 수의 납 오염 검출기). 시스템의 주요 제한은 양성 신호에 필요한 시간입니다. 미래 작업은 응답 시간을 최적화 하기 위해 다른 유기 체를 연구 하는 것을 수반할 수 있습니다.
Introduction
바이오 센서는 화학 물질 또는 분석 물의 검출에 사용 될 수 있는 반응을 생성 하는 생물학적 성분 (예컨대 단백질, 핵 산 또는 전체 유기 체)을 사용 하는 임의의 분석 장치 이다. 예를 들어 석탄 광산 산업은 20 세기의 대부분을 위해 석탄 광산1의 카나리아 인 독성 광산 가스의 존재를 감지 하는 바이오 센서를 사용 했습니다. 작업자를 보호 하기 위해 화학 물질 분석 물 (일산화 탄소)에 대 한 생물학적 유기 체의 반응 (카나리아의 사망 또는 고통)이 광부에 의해 관찰 되었습니다. 보다 현대적이 고 정교한 예에서, 박테리아는 형광 단백질의 발현과 같은 특이 적 반응을 나타내는 것에 의해 특정 화학적 분석 물질의 존재에 반응 하는 합성 생물학 기술을 사용 하 여 변경 될 수 있다.
합성 생물학은 자연적으로 존재 하지 않는 생물학적 장치 및 시스템의 건설을 지칭 하는 광범위 한 용어이 고, 또는 특정 목적을 위한 기존의 생물학적 시스템의 재설계2이다. 합성 생물학은 장치 및 시스템을 합성 하는 데 사용할 수 있는 표준 방법론 및 표준화 된 부품 (표준 합성 생물학 유전 요소)의 존재에 의해 유전 공학과 구별 된다. 일부 는 장치의게놈에 도입 되 고, 박테리아와 같은 생물체는 기능의 표시 역할을 할 특정 특성을 표현 합니다. 예를 들어, 많은 합성 장치에서, 형광 단백질의 발현은 리포터 단백질로 서 단일 세포 유기 체로 도입 된다. 여러 장치를 하나의 시스템으로 결합할 수 있습니다. 박테리아와 같은 미생물의 게놈은 이러한 방식으로 조작 하기 쉽습니다. 광범위 한 화학 분석 물에 특정 한 바이오 센서의 수많은 예가 지난 10년동안 문헌에서 보고 되었습니다.
이 작업에서, MicRoboCop 시스템은 법의학 및 환경 화학에 새로운 응용 프로그램과 합성 생물학 기술을 사용 하 여 설계 된 바이오 센서의 예로서 제시 된다. MicRoboCop은 결합 될 때, 대장균 이 사람의 손 또는 표면에서 수집 된 총 탄 잔류물 (gsr)의 존재 하에서 적색 형광 단백질 (rfp)을 발현 할 수 있게 하는 3 개의 분리 된 장치 시스템입니다. 3 개의 장치 각각은 GSR5의 구성 요소로 알려져 있는 특정 화학 물질 분석 물에 반응 합니다. 시스템이 응답 하는 3 개의 분석 물은 i. 2, 4, 6-트리니타로 톨루엔 (TNT) 및 관련 화합물 II. (납 이온의 형태로), III. 안티 몬 (이온의 형태로도).
GSR은 많은 다른 화학 물질로 구성 되어 있지만, 세 가지는 일반적으로 GSR은 바 륨, 납 및 안티 몬의5와 같은 잔류물을 식별 하는 데 사용 됩니다. GSR의 식별을 위한 표준 비 치열 시험은 에너지 분산형 X 선 형광을 가진 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용 하는 것입니다. 분석가는 SEM을 통해 GSR의 고유한 형태와 원소 성분을 확인할 수 있습니다. 현재, 사용할 수 있는 몇 가지 널리 사용 되는 바이너리 추정 테스트. 최근에 출판 된 추정 테스트는 많은 실험실에서 사용 하지 못할 수 있는 특수 장비 인 이온 이동성 분광학 (IMS)을 사용 합니다. 그들은 일반적으로 거리 결정 또는 총알 구멍과 상처에 GSR 식별을 위해 사용 되지만, 사용할 수 있는 몇 가지 색상 "스팟" 테스트도 있습니다5. 또한, 잠재적으로 현장 휴대용, 또는 양극 스트리핑 voltammetric의 장점을가지고 있는 voltammetric 분석을 사용 하는 GSR에 대 한 전기 화학 시험 문헌에 몇 가지 제한 된 주의가 있었다,이는 매우 금속 원소에 대 한 민감한 방법7. GSR을 검출 하기 위한 목적으로 특별히 설계 된 바이오 센서 문헌에는 거의 언급 되어 있지 않지만, 다른 포렌식 어플리케이션을 위한 바이오 센서는8 개출판 되었습니다.
마이크로 보 캅 시스템에서 각 장치에 대 한 생물학적 원소 및 플라스 미드 시공이 도 1에 도시 되어 있다. 도 1b 의 곡선 화살표는 분석 물의 존재 하에서 활성화 되는 프로모터 영역을 나타내며, 상기 타원형은 리포터 단백질의 번역을 허용 하는 리보솜 결합 부위 이며, 회색 상자는 rfp 라는 표지는 적색을 표현 하는 유전자 형광 단백질, 및 적색 팔각형은 전사 종결 부위 이다. 세 장치 모두 GSR을 감지 하는 시스템으로 함께 사용 됩니다. 특정 프로모터 (SbRFP, PbRFP 및 TNT RFP)를 가진 각 장치는 시험 되는 샘플과 함께 인큐베이션 되 고 RFP의 형광이 측정 될 것 이다. RFP는 적절 한 화학적 분석 물질이 존재 하 고 프로모터 영역을 활성화 하는 경우에만 발현 될 것 이다. GSR에 존재 하는 일부 화학 물질에 반응 하는 세 가지 장치가 설계 되어이 작품에 제시 된다.
3 개의 microbocop 장치에서 사용 되는 프로모터는 비소 및 안티 몬 계 민감한 프로모터, sbrfp9,10, 리드 민감성 프로모터, pbrfp11,12 및 TNT 민감성 프로모터, TNT-RFP 13. 문헌에서의 검색은 바 륨에 반응 하도록 설계 된 프로모터를 밝혀 내지 않았기 때문에,이 프로모터는 다 수의 구조적으로 관련 된 화합물 (특히, 2, 4-딘 트로 톨루엔 및 dinitrobenzene)는 GSR에 남겨진 유기 화합물의 일부가 되는 것으로 알려져 있다. 이 프로모터는 매 립 지 지뢰13에서 TNT와 2, 4 딘 트로 톨루엔 (2, 4 DNT)의 분 량을 구체적으로 감지 하는 데 성공적으로 사용 되었습니다. 세 가지 장치를 시스템으로 함께 사용 하 여 GSR에 대 한 긍정적 인 테스트는 세 장치 모두에서 형광을 생성 합니다. 1 개 또는 2 개의 장치 에서만 형광 신호는 GSR에 남아 있는 유기 화합물이 아닌 화합물에 의해 활성화 된 분석 물 (들) 또는 TNT 프로모터의 경우에 다른 환경적 공급원을 나타낼 것 이다. 세 대의 장치를 모두 사용 함으로써, 환경 오염 원으로 인 한 거짓 양성 결과의 가능성을 최소화할 수 있습니다. 인기를 얻고 있는 무연 탄약은 여전히 미국에서 탄약 판매의 약 5%만을 나타냅니다. 따라서 납의 부재로 인 한 거짓 부정 결과는 가능성이 있지만 GSR14의 마커로 납을 사용 하는 센서에는 여전히 유틸리티가 있습니다. 이 특정 법의학 응용 프로그램 외에도 각 장치는 환경 오염 물질을 감지 하기 위해 개별적으로 사용할 수 있습니다.
제시 된 프로토콜은 장치의 기능을 확인 하 고 얻어진 형광 신호를 분석 하기 위해 장치 (센서 박테리아) 및 분석 기법을 만드는 데 사용 되는 합성 생물학 기술을 포함 한다. 프로토콜은 또한 표면에서 GSR을 수집 하는 용의자 또는 swabbing의 손에서 GSR을 수집 하는 손 닦는 형태의 법의학 증거의 수집을 포함 한다. 리드 센서 장치의 결과는 사용 된 카트리지 케이스를 사용한 GSR에 대 한 포지티브 테스트의 데모와 함께 예제 결과로 제시 됩니다.
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Protocol
참고: RFP를 발현 하는 대장균 의 합성이 제시 된다.
1. 대장균 에서 플라스 미드 DNA의 제조
- Rfp 유전자와 암 피 실린 저항성 유전자를 갖는 플라스 미드를 포함 하는 대장균을 해 동 하 고, µ를 함유 100 하는 luria 브로스 (LB) 한 천 판에 대장균을 37 ° c에서 24 시간 동안 성장 시켰다. 예를 들어, 합성 생물학에 사용 되는 표준 생물학적 부품의 레지스트리에서 J10060 플라스 미드를 사용 하십시오 ( 재료 표참조). 상기 J10060 플라스 미드는 pBad 프로모터 영역과 암 피 실린 저항성 유전자의 제어 하에 RFP (적색 형광 단백질)에 대 한 유전자를 포함 한다. 대안적으로, 대장균 형질 전환 (3.2 단계 참조) 플라스 미드를 LB 한 천 판에 성장 시키기 전에.
- 표준 미니 준비 프로토콜 ( 재료 표참조)을 따라 J10060 플라스 미드를 포함 하는 대장균 배양 액 1 mL에서 DNA를 분리 합니다. 다음 프로토콜의 목적은 pBad 프로모터를 제거 하 고이를 장치에 대 한 원하는 프로모터로 대체 하는 것 이다.
- 플라스 미드 미니 준비 후, 소화를 위한 준비가 될 때까지 냉동에 DNA를 저장 합니다.
2. 제한 효소 분해
- EcoRI 및 NheI 소화를 위한 마이크로 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 반응을 설정 합니다. J10060 플라스 미드 DNA (단계 1에서 분리 된 10 μ l), 물 8 μ l 및 1 μ l의 각 EcoRI 및 NheI 효소 1 μ l를 완충 액으로 미리 혼합 하였다 ( 물질 표참조).
- 프로모터 DNA의 경우, EcoRI 및 NheI 소화를 위한 마이크로 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 반응을 설정 합니다: 어 닐 링 프로모터 DNA 서 열 10 μ l (물 8 μ l 및 1 μ l 각각의 EcoRI 및 NheI 효소 1 μ l를 완충 액으로 미리 혼합 하였다.
- Sb-, Pb 또는 TNT RFP의 경우 ( 재료 표참조), 올리고 뉴클레오티드를 완충 액 (30MM 헵 스, pH 7.5, 100 mM 칼륨)과 동등한 몰 농도로 배양 하 고, 2 분 동안 94 ° c로가 열 하 고 상 온에서 서서히 냉각 시킨다.
- 파이 펫을 10 μ l로 부드럽게 위아래로 피 펫 팅 하 여 샘플을 섞어 줍니다.
- 37 ° c에서 30 분 동안 배양 합니다.
- 5 분 동안 80 ° c에서 효소를 불 활성화 시킵니다.
- 다음 단계를 준비할 때까지 소화 된 DNA를 냉동 고에 보관 하십시오.
3. 결 찰과 변화
-
결 찰
- 2 단계에서 EcoRI 및 NheI로 이중 소화 된 플라스 미드 및 프로모터 DNA를 사용 하 여, 상기 표 1 에 나타난 반응 혼합물을 미세 원심 분리기 튜브에 얼음으로 설치 하 고; T4 DNA Ligase를 마지막에 추가 합니다.
참고: 표 1 은 표시 된 DNA 크기에 대 한 1:3 벡터의 몰 비를 사용 하 여 결 찰을 나타낸다. - 부드럽게 피 펫 팅 하 고 미세 원심 분리기로 반응을 가볍게 섞는다.
- 실 온에서 10 분간 배양 합니다.
- 10 분 동안 65 ° c에서 열을 비활성화 합니다.
- 2 단계에서 EcoRI 및 NheI로 이중 소화 된 플라스 미드 및 프로모터 DNA를 사용 하 여, 상기 표 1 에 나타난 반응 혼합물을 미세 원심 분리기 튜브에 얼음으로 설치 하 고; T4 DNA Ligase를 마지막에 추가 합니다.
-
변환
- 마지막 얼음 결정이 사라질 때까지 얼음에 DH5-알파 유능한 대장균 세포의 20 µ l와 튜브를 재개.
- 5 µ L의 플라스 미드 DNA를 세포 혼합물에 첨가 한다. 세포와 DNA를 혼합 하기 위해 튜브를 4-5 번 조심 스럽게 넘깁니다.
- 혼합물을 얼음에 2 분간 두십시오.
- 정확히 30 초 동안 정확히 42 ° c의 열 충격. 혼합 하지 마십시오.
- 얼음 위에 2 분간 둡니다. 혼합 하지 마십시오.
- 실 온의 피 펫 380 µ L을 혼합물에 SOC. 앰 피 실린 (100 µ)를 함유 하는 LB 한 천 판에 즉시 펴 바르고 37 ° c에서 밤새 배양 한다.
- 성장을 위해 24 시간 내에 플레이트를 확인 하십시오.
- 밀봉 필름으로 판을 밀봉 하 고 다음 단계를 위해 준비 될 때까지 냉장고에 보관 하십시오.
4. 식민지 PCR
- 반응 혼합물을 PCR 튜브 (4 개의 반응 관 설정)에 추가 하 여 표 2에 나타내 었 다.
- 위아래로 파이 펫 팅 하 여 반응을 부드럽게 섞는다.
- 황색 피 펫 팁을 사용 하 여 형질 전환 된 대장균의 콜로 니 (또는 매우 작은 부위)를 긁어 냅니다. 이 대장균 의 스 와이프를 새로운 LB/암 피 실린/한 천 판으로 옮겨 놓은 다음, 피 펫 팁을 PCR 튜브에 삽입 합니다. 대장균을 PCR mix와 혼합 하기 위해 피 펫 팁을 흔들어 주십시오. 추가 식민지를 위해 세 번 더 반복 합니다. Pcr 튜브를 PCR 기계로 이송 하 고 표 3에 나타난 프로그램을 사용 하 여 온도 순환을 시작 한다.
- 태에서 2% 아가 로스 겔을 이용 하 여 겔 전기 영동을 실행 하 여 플라스 미드에 가장 좋은 결 찰이 있는 콜로 니를 확인 하 고 그 식민지를 새로운 판 상에 서 성장 시켰다.
- 테스트 준비가 될 때까지 접시를 냉장고에 보관 하십시오. 루 리아 브로스의 액상 배양 액을 100 µ의 암 피 실린을 첨가 하 여 화학 시험에 투입 하였다.
5. DNA 염기 서 열 분석
- 각 샘플에 대해 5 µ L의 플라스 미드, 염기 서 열 분석 프라이 머 4 µ L 및 탈 이온 수 3 µ L을 첨가 한다.
- 이 혼합물을 튜브에 넣고 DNA 시퀀싱 ( 재료 표참조)을 위해 보내십시오.
- Dna 서 열 데이터를 분석 하 여 유전자가 정확 하 게 삽입 되었다는 것과 돌연변이가 없는지 확인 하기 위해 dna 서 열의 분석 소프트웨어를 사용 하 여 예상 되 고 관찰 된 DNA 서 열을 비교 한다.
참고: 화학 센서로 대장균을 사용 하는 것은 아래에 제시 되어 있습니다.
6. 대장균 배양 물의 제조
- 액체 배양을 위한 100 µ g/mL 암 피 실린으로 LB를 준비 합니다.
- 양성 대조 군 * 세균과 음성 대조 군 * * 세균의 액체 배양 액을 준비 한다.
참고: * 양성 대조 군 박테리아: 대장균의 제어 하에 RFP 유전자와 함께 플라스 미드를 포함 하는 e. 콜라 이; 합성 생물학에 사용 되는 표준 생물학적 부품의 레지스트리에서 플라스 미드 E1010 ( 재료 표참조)이 작품에 사용 되었다.
* * 음성 대조 군 세균: pBad 프로모터와 같은 상이한 프로모터의 제어 하에 RFP 유전자를 가진 플라스 미드를 포함 하는 대장균 (합성 생물학에 사용 되는 표준 생체 부품의 레지스트리에서 플라스 미드 J10060) ( 또는 rfp 유전자가 없는 플라스 미드를 제공 한다. - 배양 물을 37 ° c 및 220 rpm의 진 탕 인큐베이터에 넣고 최소 8 시간, 최대 18 시간 동안. 흐린 국물은 세균 성장을 나타냅니다.
7. 장치의 기능을 확인 하는 대장균 적정
참고: 센서가 기능을 점검 하기 위해 적정 한 후에는이 단계를 반복할 필요가 없습니다. 납, 안티 몬 및 2, 4 개의 DNT 또는 1, 3 dinitrobenzene (1DNB)의 추가 형태의 포지티브 컨트롤은 전체 적정을 필요로 하지 않고 각 사용에 대 한 장치의 기능을 확인할 수 있습니다.
- 물에 10 ppm의 농도로 관심 대상 물질의 스톡 용액을 제조 한다. 용해성이 문제인 경우, 50/50 물/메탄올 혼합물을 사용 하십시오.
- 표 4 를 가이드로 사용 하 여, 적절 한 수의 멸 균 배양 관에 라벨을 부착 하 고 배양 된 국물의 2 mL를 각 튜브에 넣고 (프로토콜 단계 6에서).
주: 일반적인 분석 범위를 결정 하기 위해서는 센서 박테리아, 네거티브 컨트롤의 한 레벨, 포지티브 제어를 사용 하는 한 레벨의 분석 물질을 적어도 3 가지 수준으로 수행 하십시오. 또한 추가 된 금속 (다른 유형의 음성 제어)이 없는 박테리아의 각각의 하나의 튜브가 있어야 합니다. 분석 범위 및 검출 한계를 보다 정확 하 게 판별 하려면 더 넓은 범위의 분석 물 농도를 사용 하십시오. - 분석 물 스톡 용액을 표 4에서 언급 한 바와 같이 2 mL의 국물을 포함 하는 튜브에 첨가 하 고 배양 튜브에 스냅 캡을 배치 하 여 그들이 느슨한 (튜브로의 공기 흐름을 허용 하기 위해)와 소용돌이 배양 튜브에 놓습니다.
- 스냅 캡을 배양 튜브에 느슨하게 남겨 두고, 220 rpm에서 진 탕 인큐베이터에 넣고 적어도 24 시간 동안 37 ° c로 둡니다.
- 인큐베이터에서 튜브를 제거 하 고, 캡을 튜브에 단단히 끼워 놓고, 형광 분석을 위해 준비가 될 때까지 냉장고에 튜브를 보관 하십시오.
8. GSR 용 화학 센서로 대장균 사용
- 납을 제거 하도록 설계 된 에탄올 기반 와이프를 사용 하 여 ( 재료 표참조) 손가락 사이를 포함 하 여 손의 모든 표면을 닦습니다. 각 손 마다 별도의 와이프를 사용 합니다. 분석 될 때까지 적절 하 게 라벨이 부착 된 밀폐 알코올로에 물티슈를 보관 하십시오.
- 테스트할 표면: 큰 표면에는 알코올 기반 와이프 또는 작은 표면을 위해 에탄올로 적신 면봉을 사용 하십시오.
참고: GSR에 대 한 센서의 응답을 보여주기 위해, 지출의 내부. 40 칼리버 카트리지 케이싱은 에탄올을 적신 면봉으로 입은. - 깨끗 한 장갑을 끼고 알코올로 청소 한가 위를 사용 하 여 와이프의 중앙에서 약 1cm2 섹션을 잘라냅니다.
- 핸드 와이프 또는 면봉의 절단 조각을 센서 박테리아 2 mL이 들어 있는 배양 튜브에 직접 넣어 국물에 잠긴다.
- 7.4 – 7.5 단계에서 위에서 설명한 대로 진행 합니다.
9. 휴대용 분 광 계를 사용한 형광 분석 ( 재료 표참조)
- 소용돌이 믹서를 사용 하 여 튜브를 흔들어.
- 500 nm의 여기 파장을 가진 RFP 변이체에 적합 한 파장에서 형광 방출을 수집 하기 위해 분 광 계를 준비 하십시오.
- Luria 국물을 사용 하 여 빈 스펙트럼을 기록 하십시오.
- 각 상층 액을 낮은 부피의 큐 벳으로 조심 스럽게 전달 하 고 방출 강도를 수집 합니다.
10.96-웰 플레이트 리더기를 사용한 형광 분석 ( 재료 표참조)
- 소용돌이 믹서를 사용 하 여 튜브를 흔들어.
- 웰 플레이트에 국물의 200 mL를 잘 전달 합니다. 플레이트의 각 웰에 들어간 샘플을 기록 합니다.
- RFP 변이체에 대 한 적절 한 파장에서 발광 강도를 수집 하기 위해 fluorimeter를 설정 합니다.
11. 데이터 분석
- 모든 네거티브 컨트롤 (RFP 네거티브 박테리아 또는 센서 박테리아가 추가 되지 않은)에서 얻은 신호를 사용 하 여 배경에 대 한 평균 형광 신호를 계산 합니다.
- 센서 박테리아에 대해 얻어진 각 형광 신호에서 평균 배경 신호를 빼서 배경 보정 된 형광 강도를 얻는다.
- 배경 보정 된 형광 강도를 평균 배경 신호로 나누어 신호 대 잡음 (S/N) 비를 추정 한다. S/N 비율이 3 보다 크면 테스트는 양수입니다.
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Representative Results
이 작품에 사용 된 RFP 변이체에 대 한 형광 스펙트럼은 도 2에 나타내 었 다. 이 데이터는 PbRFP 장치에서 리드 및 TNT-RFP 장치에 응답 하므로 두 개의 분석 물, 2, 4 DNT 및 1, 3 DNB에 응답 합니다. 이 수치는 음성 대조 군 (분석 물이 첨가 되지 않음)의 스펙트럼과 추가 된 두 가지 상이한 분석 물 레벨에서 스펙트럼을 보여줍니다. 사용 된 RFP 변이체에 대 한 최대 형광 신호는 575 nm에서 관찰 되었다 (여기 파장 500 nm). 도 3 의 데이터는 PbRFP 장치의 단일 적정 실험 (따라서 오차 막대가 포함 되지 않음)을 대표 하며, 프로토콜의 7 단계에서와 같이 적정 한다. 도 3a 는 휴대용 분 광 계 로부터 수집 된 데이터를 나타내고, 한편 도 3b 는 (동일한 세트의 용액 으로부터) fluorimeter 로부터 수집 된 데이터를 보여준다. 금속의 농도가 증가 함에 따라 형광을 증가 시키는 일반적인 추세가 있습니다. 높은 농도에서 약 800 ppb 보다 큰 경우, 반응은 높은 농도로 금속의 독성으로 인해 떨어집니다 것을 주목할 필요가 있습니다. 이 최대 응답 수준은 사용 되는 분석 물질에 따라 다를 수 있습니다. SbRFP와의 이전 작업은 박테리아가 비소와 안티 몬10의 높은 수치 (적어도 1000 ppb)를 견딜 수 있음을 보여주었습니다. 핸드 면봉에서 수집 된 이러한 분석 물 수준에 대 한 문헌은 이러한 수준의 납 및 안티 몬이 핸드 면봉 (15)에서 수집 될 수 있는 것과 일치 함을 나타냅니다. 추가적으로, 도 4 에 제시 된 결과는 박테리아가 세포 사 멸 없이 카트리지 케이스 면봉에 존재 하는 분석 물의 양을 견딜 수 있음을 입증 하며,이는 손 면봉 으로부터 수집 되는 것 보다 상당히 높을 것 이다.
이러한 데이터에 대해 계산 된 S/N 값을 사용 하 여 가장 낮은 검출 가능한 레벨의 리드는 12ppb (3 보다 큰 S/N에 의해 정의 된 것으로 감지 가능) 였습니다. 이와 대조적으로, 휴대용 분 광 계 데이터에 대 한 S/N은 테스트 된 최고 수준에서 2 개만입니다. 그러나, 증가 하는 분석 물 농도와 함께 형광을 증가 시키는 경향은 여전히 명확 하 게 지적 된다.
도 4a 는 gsr에 대 한 양성 검정을 나타낸다. 이 결과를 얻기 위해, 에탄올 면봉은 지출의 내부에서 수집 하였다. 40 구경 카트리지 케이싱은 프로토콜의 8 단계에서와 같이 3 개의 센서 박테리아에 추가 된다. 이 그림은 또한 긍정적 인 대조 군 (RFP를 구성 하는 박테리아)과 분석 물이 추가 되지 않은 SbRFP 장치의 형태로 음성 대조를 보여줍니다. 카트리지 케이스 면봉은 원칙적 증명 결과에 사용 되었습니다. 미래의 작업에서, 손 면봉은 센서가 뿐만 아니라 손 면봉에 반응 하는 것을 보여주기 위해 총을 발사 알려진 사람에서 수집 됩니다.
| 구성 요소 | 20 μ l 반응 |
| 10 배 T4 DNA Ligase 버퍼 | 2 μ l |
| 플라스 미드 DNA (3kb) | 3 μ l |
| 프로모터 DNA (0.7 kb) | 10 μ l |
| 뉴 클레 아 제 불포함 물 | 4 μ l |
| T4 DNA Ligase | 1 μ l |
표 1. 결 찰, 프로토콜 단계 3.1.1에 대 한 반응 혼합물.
| 구성 요소 | 25 μ l 반응 |
| 10 µ M 전방 프라이 머 | 0.5 µ L |
| 10 µ M 역방향 프라이 머 | 0.5 µ L |
| 한Taq 2X 마스터 믹스 | 12.5 µ L |
| 뉴 클레 아 제 불포함 물 | 11 µ L |
표 2. 콜로 니 PCR, 프로토콜 단계 4.1에 대 한 반응 혼합물.
| 단계 | 임시 | 시간 |
| 초기 변성 | 94 ° c | 30 초 |
| 30 사이클 | 94 ° c | 30 초 |
| 55 ° c | 45 s | |
| 68 ° c | 60 s | |
| 최종 확장 | 68 ° c | 5 분 |
| 개최 | 4°c |
표 3입니다. 프로토콜 단계 4.3에 대 한 PCR 온도 순환 파라미터.
| 튜브 ID | 박테리아 | 분석 물 용액의 농도 추가 (ppm) | 금속 추가 | 2000 µ L 국물에 추가 된 분석 물 용액 부피 | [분석 물], ppb |
| 1 | PbRFP | 10 | Pb | 2.5 | 12 |
| 2 | PbRFP | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | PbRFP | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | PbRFP | 0 | 없음 | 0 | 0 |
| 5 | RFP neg | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | RFP pos | 10 | Pb | 10 | 50 |
표 4입니다. 바이오 센서의 적정을 위한 일반 실험 설정, 프로토콜 단계 7.2.
그림 1입니다. 마이크로 보 캅 장치의 생물학적 원소. (a) 암 피 실린 저항성 유전자를 갖는 플라스 미드에 있어서의 마이크로 보 캅의 일반 장치에 대 한 도면 이다. (b) 마이크로 bocop 시스템을 생성 하기 위해 결합 된 각 장치의 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 분석 물의 존재 및 부재 하에 PbRFP 및 TNT-RFP 박테리아의 형광 스펙트럼. 데이터를 수집 합니다. (a) 분석 물의 존재 및 부재 하에 PbRFP 박테리아의 형광 스펙트럼 (Pb). (b) 2 개의 분석 물이 존재 하 고 부재 하는 TNT-rfp 박테리아의 형광 스펙트럼 (2, 4 DNT 및 1DNB). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 분석 물의 존재 및 부재 하에 PbRFP 박테리아의 형광 스펙트럼의 검출을 위한 휴대용 분 광 계 시스템 및 플 러 오리 미터의 비교 (lead). (a) 휴대용 분 광 계에서 수집 된 PbRFP 센서 박테리아에 대 한 리드 적정 데이터. (b) 플 루 오 미터에 수집 된 PbRFP 센서 박테리아에 대 한 리드 적정 데이터 (동일한 샘플). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 의 내부에서 찍은 에탄올 면봉. 40 구경 소비 권총 카트리지는 GSR에 세 장치의 응답을 표시합니다. 모든 신호에 대 한 S/N은 3 보다 큰, GSR에 대 한 긍정적인 테스트를 나타내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
수정 및 문제 해결
표 4 에 기재 된 실험은 설계 된 센서에 적합 한 임의의 방식으로 변형 될 수 있다. 화학 센서의 가장 중요 한 측면은 민감도와 특이성을 평가 하는 것입니다. 센서의 유용한 분석 범위를 결정 하기 위해 분석 물의 광범위 한 농도가 분석 되도록 하는 것이 유리 합니다. 또한 세포에 대 한 분석 물의 최대 수준을 결정할 가치가 있습니다. 본 연구에서 사용 된 분석 물 들이 메탄올 용액 (TNT 유도체)에서의 독성 금속 (Pb 및 Sb) 또는 유기 화합물 이기 때문에, 분석 물질 또는 용액의 독성으로 인 한 세포 사 멸이 발생 하는 상위 레벨이 존재 한다 (일반적으로 500-1, 0 보다 높은 지금까지 실시 한 실험을 위한 00 ppb).
기술의 한계
이 작품에서 제시 된 결과는 본질적으로 질적 이지만 RFP 변성 대장균의 정량적 능력을 입증 하기 위한 것입니다. 센서의 민감도는 국물에 있는 세포의 밀도에 따라 배양 된 배치 간에 상당히 다를 수 있습니다. 정량적 인 결과가 요구 되는 경우, 세포 농도는 분석 전에 액체 배양 물의 광학 밀도를 측정 하 여 추정 되어야 한다. 배양 물의 광학 밀도가 결정 되 면, 세포는 실험 간의 가변성을 줄이기 위해 적절 하 게 희석 될 수 있다. 그러나 원하는 분석 물에 대 한 추정 테스트로 서, 여기에서 논의 된 응용 분야에 대 한 질적 "존재/존재 하지 않는" 응답은 허용 됩니다. 한 천 접시에 있는 셀의 수명은 또한 주목 해야한다 – 이전 작업은 플레이트가 최대 2 주 동안 냉장고에 저장 될 수 있음을 표명 하지만, 장치는 그 시간 프레임의 끝을 향해 아주 잘 작동 하지 않습니다.
또 다른 고려 사항은 형광 신호를 분석 하는 데 사용 되는 장비의 선택입니다. 96-웰 플레이트 리더기가 있는 연구용 분 광 광도 계를 사용 하면 정확한 여기 및 방출 파장을 선택 하 여 감도를 높일 수 있습니다. 이 시스템을 사용 하 여 최대 96 실험의 결과를 동시에 수집할 수 있습니다. RFP 형광은 또한 휴대용 분 광 계를 사용 하 여 분석 될 수 있다. 휴대용 계측기는 일반적으로 선택 된 여기 밴드를 허용 하며,이는 사용 되는 RFP 변형의 여기 맥시 마와 일치 하거나 그렇지 않을 수 있습니다. 그러나, 여기 파장은 여기 맥시 마의 적당 한 범위 내에 있는 한, 휴대용 기기는 일반적으로 (비록 감도의 손실로) 서비스할 수 있습니다. 휴대용 시스템의 비용은 연구 등급 분 광 광도 계 보다 현저히 적고 이동성은 확실히 이점이 될 수 있다. 세균의 잠재적인 적용에 기초 하 여, 분석가는 분 광 광도 계 시스템에의 한 추가 비용 및 이동성의 손실이 정당화 되는지 여부를 결정할 수 있다.
기존 방법과 관련 된 중요성
이 작업에서 설명 하는 세 부분 MicRoboCop 시스템은 GSR의 존재에 대 한 질적, 추정 테스트로 사용 하기 위한 것입니다. 현재 GSR에 대 한 "금 표준"에 대 한 증거 시험은 SEM을 통해 전문가 분석이 필요 합니다. SEM을 통해 장비는 비싸고 일반적으로 고도로 전문화 된 분석가에 의해 운영 됩니다. 추가적으로, GSR 증거는 법의학 케이스 워크에서 매우 가변적 이며 많은 변수는 손과 표면에 GSR의 침착에 기여16. GSR에 대 한 추정 시험은 사람 또는 재산의 검색에 대 한 가능한 원인을 제공 하는 조사자에 게 유용할 수 있습니다. 이온 이동성 분광학과 같은 전기 화학적 시험 또는 테스트와 비교 했을 때,이 방법은 대부분의 분석 실험실에서 접근이 가능한 간단 하 고 쉽게 사용할 수 있는 계측을 제공 합니다.
다른 응용 프로그램
이 원고에 설명 된 장치는 GSR의 추정 식별을 위해 세 부분으로 구성 된 시스템으로 결합 되도록 설계 되었습니다. 그러나 MicRoboCop 시스템 (SbRFP, PbRFP 및 TNT-RFP)의 각 장치는 식품, 물 또는 환경 시료의 화학적 오염을 감지 하기 위해 개별적으로 사용할 수도 있습니다. 이전 작업에서는 TNT-rfp 장치를 육상 광산 용 현장 센서 ( 13,17)로 사용할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에 제시 된 결과와 우리의 이전 작업10 에는 Sbrfp 및 pbrfp 장치가 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광학과 같은 보다 고가의 정교한 장비에 충분히 낮은 농도를 감지할 수 있음을 보여주었습니다 ( 원자 흡수 분광학)를 제공 합니다. SbRFP 센서는 비소 뿐만 아니라 안티 몬에 민감합니다. 이러한 장치는 독성 중 금속 오염의 분석을 위한 저비용 옵션을 제공할 수 있다.
여기에 제시 된 대장균을 제조 하기 위한 합성 생물학 프로토콜은 rfp를 발현 하는 대장균을 합성 하기 위해 표준 합성 생물학 유전 부품을 사용 하는 모든 시스템에 적용 가능 하다. 분석 방법은 RFP를 표현 하는 모든 시스템에 적용 가능 하므로 합성 생물학 방법을 사용 하 여 생성 된 모든 세균 바이오 센서 시스템을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개에 대 한 경쟁 금융 이익 또는 기타 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 BIOL 324 (유전학)의 롱 우드 대학에서 학생 들과 화학 403 안티 몬 및 리드 바이오 센서의 초기 준비 및 테스트에 관여 한 (고급 화학 실험실 문제 해결) 학생 들을 인정 하고자 합니다. MicRoboCop에 대 한 아이디어는 GCAT SynBIO 워크샵 (여름 2014)에서 잉태 되었으며,이는 NSF와 하 워드 휴즈 메디컬 인스티튜트가 자금을 지원 하며 메릴랜드 대학교에서 주최 합니다. 저자는 또한 롱 우드 대학의 요리사-콜 예술과 과학의 대학과 GCAT SynBio 동창 보조금에서 받은 자금을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
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