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Chemistry

तैयारी और बंदूक की गोली अवशेष का अनुमान लगाने के लिए एक नया बैक्टीरियल Biosensor के आवेदन

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59471
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

Summary

एक प्रोटोकॉल सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर बंदूक की गोली अवशेषों के विश्लेषण के लिए बैक्टीरियल बायोसेंसर का एक सेट synthesize करने के लिए प्रस्तुत किया है, और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर उनके उद्देश्य का उपयोग करने के लिए उपकरणों के कामकाज का परीक्षण करने के लिए.

Abstract

माइक्रोबोकॉप एक बायोसेंसर है जिसे फोरेंसिक केमिस्ट्री में एक अनोखे एप्लीकेशन के लिए डिजाइन किया गया है । माइक्रोबोकॉप एक प्रणाली है, जो तीन उपकरणों से बनी है, जब एक साथ प्रयोग किया जाता है, तीन कुंजी एनालेट्स (ऐन्टिमनी, लेड, और जीएसआर के कार्बनिक घटकों) की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति संकेत के उत्पादन द्वारा गनशॉट अवशेषों (जीएसआर) की उपस्थिति का संकेत दे सकता है । प्रोटोकॉल का वर्णन बायोसेंसर का उपयोग कर escherichia कोलाई (ई. कोलाई), और विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के लिए प्रयोग किया जाता है और सेंसरों की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के तरीके । प्रणाली के कामकाज के एक खर्च कारतूस आवरण के अंदर से एकत्र GSR का उपयोग करके प्रदर्शन किया है । एक बार तैयार है, बायोसेंसर की जरूरत है जब तक संग्रहीत किया जा सकता है और इन कुंजी analytes के लिए एक परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । सभी तीन analytes से एक सकारात्मक प्रतिक्रिया GSR के लिए एक प्रकल्पित सकारात्मक परीक्षण प्रदान करता है, जबकि प्रत्येक व्यक्ति डिवाइस अंय नमूनों में analytes का पता लगाने के लिए आवेदन किया है (उदाहरण के लिए, पीने के पानी में सीसा संदूषण के लिए एक डिटेक्टर) । प्रणाली की मुख्य सीमा एक सकारात्मक संकेत के लिए आवश्यक समय है; भावी कार्य में अनुक्रिया समय को इष्टतम करने के लिए विभिन्न जीवों का अध्ययन शामिल हो सकता है ।

Introduction

एक बायोसेंसर किसी भी विश्लेषणात्मक उपकरण है कि जैविक घटकों (जैसे प्रोटीन, न्यूइक एसिड, या पूरे जीवों) का उपयोग करता है कि एक प्रतिक्रिया है कि एक रासायनिक पदार्थ या analyte का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन है । एक उदाहरण के रूप में, कोयला खनन उद्योग 20 वीं सदी के अधिक के लिए एक बायोसेंसर का इस्तेमाल किया विषाक्त खान गैसों की उपस्थिति का पता लगाने:1कोयला खदान में कनारी । श्रमिकों की सुरक्षा के लिए माइनरों द्वारा जैविक जीव (कैनरी) अनुक्रिया (मृत्यु या कष्ट) को रासायनिक विश्लेषण (कार्बन मोनोऑक्साइड) के रूप में देखा गया । एक और अधिक आधुनिक और परिष्कृत उदाहरण में, बैक्टीरिया एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के रूप में एक विशिष्ट प्रतिक्रिया, प्रदर्शन द्वारा एक निश्चित रासायनिक analyte की उपस्थिति के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर बदला जा सकता है ।

सिंथेटिक जीवविज्ञान एक व्यापक शब्द है कि जैविक उपकरणों और प्रणालियों है कि स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं है, या एक विशिष्ट प्रयोजन के लिए मौजूदा जैविक प्रणालियों के फिर से डिजाइन के निर्माण को संदर्भित करता है2है । सिंथेटिक जीव विज्ञान एक मानक पद्धति और मानकीकृत भागों (मानक सिंथेटिक जीव विज्ञान आनुवंशिक तत्वों) है कि उपकरणों और प्रणालियोंsynthesize करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के अस्तित्व के द्वारा जेनेटिक इंजीनियरिंग से प्रतिष्ठित है । एक अंग को एक उपकरणके जीनोम में पेश किया जाता है, जो एक जीवाणु के रूप में होता है, एक ऐसा लक्षण व्यक्त करने के लिए जो फलन के संकेत के रूप में कार्य करेगा । उदाहरण के लिए, कई सिंथेटिक उपकरणों में, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक एक कोशिकीय जीव में एक रिपोर्टर प्रोटीन के रूप में शुरू की है । कई उपकरणों को एक प्रणालीमें जोड़ा जा सकता है । सूक्ष्मजीवों जैसे जीवाणुओं के जीनोम इस तरीके से हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं । रासायनिक analytes की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विशिष्ट बायोसेंसर के कई उदाहरण के पिछले एक दशक से अधिक साहित्य में रिपोर्ट किया गया है3,4।

इस काम में, माइक्रोबोकॉप प्रणाली एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया है एक बायोसेंसर फोरेंसिक और पर्यावरण रसायन विज्ञान में उपन्यास अनुप्रयोगों के साथ सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर बनाया गया. MicRoboCop तीन अलग उपकरणों की एक प्रणाली है कि, जब संयुक्त, एक व्यक्ति के हाथ या एक सतह से एकत्र किया गया है कि बंदूक की गोली अवशेषों (GSR) की उपस्थिति में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) व्यक्त करने के लिए Escherichia कोलाई की अनुमति देगा । तीन उपकरणों में से प्रत्येक के लिए एक विशिष्ट रासायनिक analyte कि GSR5के एक घटक होने के लिए जाना जाता है का जवाब । तीन analytes जो प्रणाली का जवाब है I .2, 4, 6-trinitrotoluene (टीएनटी) और संबंधित यौगिकों, द्वितीय । सीसा (सीसा आयनों के रूप में), और III । ऐन्टिमनी (आयनों के रूप में भी) ।

जीएसआर में कई विभिन्न रासायनिक पदार्थ होते हैं, लेकिन तीन आम तौर पर जीएसआर के रूप में एक अवशेष की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है बेरियम, सीसा, और ऐन्टिमनी5. जीएसआर की पहचान के लिए मानक evidentiary टेस्ट ऊर्जा परिक्षेपी एक्स-रे प्रतिदीप्ति (edx)5के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करने के लिए है । SEM-edx विश्लेषकों अद्वितीय आकारिकी और gsr के मौलिक घटकों की पहचान करने की अनुमति देता है । वर्तमान में, वहां कुछ व्यापक रूप से इस्तेमाल किया द्विआधारी अनुमान उपलब्ध परीक्षण कर रहे हैं । एक हाल ही में प्रकाशित प्रकल्पित परीक्षण आयन-गतिशीलता स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईएमएस) का उपयोग करता है, जो विशेष उपकरण है कि कई6प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हो सकता है । वहां भी कर रहे है कुछ रंग "स्पॉट" परीक्षण है कि इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि वे आम तौर पर दूरी दृढ़ संकल्प के लिए या गोली छेद और5घाव पर gsr पहचान के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अतिरिक्त, वहां साहित्य में कुछ सीमित ध्यान दिया गया है gsr के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल परीक्षण करने के लिए है कि रोजगार voltammetric विश्लेषण, जो लाभ के संभावित जा रहा है क्षेत्र पोर्टेबल, या ऐनोडी अलग करना voltammetric, जो है एक बहुत धातु तत्वों के लिए संवेदनशील विधि7. Gsr का पता लगाने के उद्देश्य के लिए विशेष रूप से डिजाइन बायोसेंसर के साहित्य में बहुत कम उल्लेख है, हालांकि अन्य फोरेंसिक अनुप्रयोगों के लिए कुछ बायोसेंसर8प्रकाशित किया गया है.

माइक्रोबोकॉप प्रणाली में प्रत्येक उपकरण के लिए जैविक तत्वों, और प्लाज्मिड निर्माण, चित्रा 1में सचित्र हैं. चित्र 1b में वक्र तीर प्रवर्तक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जो एनालेटे की उपस्थिति में सक्रिय होता है, अंडाकार राइबोसोमल बाइंडिंग साइट है जो रिपोर्टर प्रोटीन के अनुवाद की अनुमति देता है, ग्रे बॉक्स लेबल RFP वह जीन है जो लाल रंग को अभिव्यक्त करता है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और लाल अष्टस्थल प्रतिलेखन समाप्ति साइट है । सभी तीन डिवाइस एक साथ एक प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा GSR का पता लगाने के लिए । एक विशिष्ट प्रवर्तक (एसबीआरएफपी, पीबीआरएफपी और टीएनटी-आरएफपी) के साथ प्रत्येक उपकरण का परीक्षण किया जा रहा है और आरएफपी के प्रतिदीप्ति को मापा जाएगा । यदि उपयुक्त रासायनिक विश्लेषण उपस्थित है और प्रवर्तक क्षेत्र को सक्रिय करता है तो आरएफपी ही व्यक्त किया जाएगा । जीएसआर में मौजूद कुछ रासायनिक पदार्थों का जवाब देने वाले तीन उपकरणों को डिजाइन किया गया है और इस काम में प्रस्तुत किया गया है ।

तीन माइक्रोबोकॉप उपकरणों में इस्तेमाल किए जाने वाले प्रमोटर्स में आर्सेनिक और ऐन्टिमनी सेंसिटिव प्रमोटर, एसबीआरएफपी9,10, लेड सेंसिटिव प्रमोटर, पीबीआरएफपी11,12 और टीएनटी सेंसिटिव प्रमोटर है, टीएनटी-आरएफपी 13. क्योंकि साहित्य में एक खोज के लिए बेरियम के जवाब के लिए डिजाइन कोई प्रमोटर नहीं पता चला, tnt प्रमोटर के बजाय चयनित किया गया था क्योंकि यह प्रमोटर संरचनात्मक रूप से संबंधित यौगिकों के एक नंबर के लिए संवेदनशील है (विशेष रूप से, 2, 4-dinitrotoluene और डाइनाइट्रोबेन्जीन) जिसे जीएसआर में पीछे छोड़ कार्बनिक यौगिकों का एक भाग माना जाता है । यह प्रमोटर सफलतापूर्वक टीएनटी की सूक्ष्म मात्रा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) दफन भूमि खानों में13. एक साथ एक प्रणाली के रूप में तीन उपकरणों का उपयोग, जीएसआर के लिए एक सकारात्मक परीक्षण सभी तीन उपकरणों में प्रतिदीप्ति का उत्पादन होगा. केवल एक या दो उपकरणों में एक प्रतिदीप्ति संकेत analyte (ओं) के एक और पर्यावरण के स्रोत का संकेत होगा या टीएनटी प्रमोटर के मामले में, एक यौगिक है कि एक कार्बनिक यौगिक GSR में पीछे छोड़ दिया नहीं है द्वारा सक्रियण. एक साथ सभी तीन उपकरणों का उपयोग करके, पर्यावरण के स्रोतों के कारण एक झूठी सकारात्मक परिणाम की संभावना कम है । नेतृत्व मुक्त गोला बारूद, जो लोकप्रियता में आ रहा है, अभी भी संयुक्त राज्य अमेरिका में गोला बारूद की बिक्री के बारे में केवल 5% का प्रतिनिधित्व करता है; इसलिए, झूठी नकारात्मक परिणाम की अनुपस्थिति के कारण एक संभावना हो सकती है, लेकिन एक संवेदक में अभी भी उपयोगिता है कि GSR14के लिए एक मार्कर के रूप में नेतृत्व का उपयोग करता है. इस विशिष्ट फोरेंसिक आवेदन के अलावा, प्रत्येक डिवाइस पर्यावरण contaminants का पता लगाने के प्रयोजनों के लिए अलग से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सिंथेटिक जीव विज्ञान उपकरणों (सेंसर बैक्टीरिया) और विश्लेषणात्मक तकनीकों उपकरणों के समारोह की जांच करने के लिए और प्रतिदीप्ति प्राप्त संकेतों का विश्लेषण बनाने के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों में शामिल हैं । प्रोटोकॉल भी एक सतह से GSR इकट्ठा करने के लिए एक संदिग्ध या swabbing के हाथों से GSR इकट्ठा करने के लिए हाथ पोंछते के रूप में फोरेंसिक सबूत के संग्रह शामिल है । लीड सेंसर डिवाइस से परिणाम उदाहरण के परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, GSR के लिए एक सकारात्मक परीक्षण के एक प्रदर्शन के साथ एक खर्च कारतूस आवरण का उपयोग.

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Protocol

नोट: ई. कोलाई का संश्लेषण आरएफपी प्रस्तुत किया जाता है ।

1. ई. कोलाई से प्लाज्मिड डीएनए की तैयारी

  1. Thaw ई कोलाई एक RFP जीन और एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन के साथ एक प्लास्मिड युक्त और लुरिया शोरबा (पौंड) आगर प्लेटों पर ई. कोलाई से युक्त हो जाना १०० μg ३७/ उदाहरण के लिए, सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया मानक जैविक भागों की रजिस्ट्री से J10060 प्लाज्मिड का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें). J10060 प्लाज्मिड एक pbad प्रमोटर क्षेत्र और एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन के नियंत्रण के तहत आरएफपी (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के लिए एक जीन भी शामिल है । वैकल्पिक रूप से, ई. कोलाई रूपांतरण (३.२ चरण को देखें) प्लाज्मिड से पहले पौंड एगर प्लेटों पर विकास के लिए ।
  2. एक मानक miniprep प्रोटोकॉल का पालन करें ( सामग्री की तालिकादेखें) एक ई. कोलाई संस्कृति है कि J10060 Plasmid शामिल की 1 मिलीलीटर से डीएनए को अलग करने के लिए । निंनलिखित प्रोटोकॉल का उद्देश्य pBad प्रमोटर को दूर करने और डिवाइस के लिए वांछित प्रमोटर के साथ प्रतिस्थापित करने के लिए है ।
  3. प्लाज्मिड miniprep के बाद, पाचन के लिए तैयार जब तक फ्रीजर में डीएनए की दुकान ।

2. प्रतिबंध एंजाइम पाचन

  1. EcoRI और NheI पाचन के लिए एक माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में निम्नलिखित प्रतिक्रिया सेट: J10060 प्लाज्मिड डीएनए की 10 μL (चरण 1 में अलग), पानी की 8 μL, और EcoRI और NheI एंजाइमों के 1 μL प्रत्येक बफर के 1 μL के साथ पूर्व मिश्रित ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. प्रोमोटर डीएनए के लिए, EcoRI और NheI पाचन के लिए एक माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में निम्नलिखित प्रतिक्रिया की स्थापना: annealed प्रमोटर डीएनए दृश्यों के 10 μL (पानी की 8 μL, और 1 μl EcoRI और NheI एंजाइमों के प्रत्येक 1 μL बफर के साथ मिलाया ।
    1. एसबी-, पीबी-, या टीएनटी-आरएफपी ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए, बफर में ओलिनोन्यूक्लिओटाइड (30 मिमी Hepes, पीएच ७.५; १०० मिमी पोटेशियम एसीटेट) को भंग, बराबर मोलर सांद्रता में, गर्मी ९४ °
  3. धीरे ऊपर और नीचे pipetting 10 μL करने के लिए सेट के साथ pipetting द्वारा नमूनों मिक्स ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेक्यूबेट ।
  5. गर्मी एंजाइमों ८० डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए निष्क्रिय करें सके ।
  6. अगले कदम के लिए तैयार तक फ्रीजर में पचा डीएनए स्टोर ।

3. लिगेशन और परिवर्तन

  1. बंधाव
    1. चरण 2 में EcoRI और NheI के साथ डबल पचा रहे थे कि प्लाज्मिड और प्रमोटर डीएनए का उपयोग कर, बर्फ पर एक माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में तालिका 1 में दिखाया गया प्रतिक्रिया मिश्रण की स्थापना की; T4 डीएनए Ligase अंतिम जोड़ें ।
      नोट: तालिका 1 इंगित डीएनए आकार के लिए सम्मिलित करने के लिए 1:3 वेक्टर के एक मोलर अनुपात का उपयोग कर एक धारणायन से पता चलता है.
    2. धीरे से ऊपर और नीचे और microcentrifuge संक्षेप pipetting द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण ।
    3. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेबेट ।
    4. 10 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रिय करें सके ।
  2. परिवर्तन
    1. DH5 के 20 μL के साथ एक ट्यूब गल-बर्फ पर अल्फा सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं जब तक पिछले बर्फ क्रिस्टल गायब हो जाते हैं ।
    2. कोशिका मिश्रण में 5 μL प्लाज्मिड डीएनए जोड़ें । ध्यान से ट्यूब 4-5 बार झटका कोशिकाओं और डीएनए मिश्रण करने के लिए ।
    3. इस मिश्रण को 2 मिनट के लिये बर्फ पर रखें ।
    4. ठीक 30 एस के लिए ठीक ४२ डिग्री सेल्सियस पर हीट शॉक । मिक्स न करें ।
    5. बर्फ पर 2 मिनट के लिए प्लेस । मिक्स न करें ।
    6. Pipette ३८० μL कमरे के तापमान SOC मिश्रण में । तुरंत एक पौंड आगर प्लेट एम्पीसिलीन युक्त (१०० μg/एमएल) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात को सेते पर फैल गया ।
    7. विकास के लिए 24 घंटे के भीतर प्लेटों की जांच करें ।
    8. सील फिल्म और फ्रिज में स्टोर के साथ प्लेटों को अगले कदम के लिए तैयार तक मुहर ।

4. कॉलोनी पीसीआर

  1. एक पीसीआर ट्यूब में जोड़ें (4 प्रतिक्रिया ट्यूबों सेट) प्रतिक्रिया मिश्रण तालिका 2में दिखाया गया है ।
  2. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा प्रतिक्रियाओं मिश्रण ।
  3. एक पीला पिपेट टिप का उपयोग करना, एक कॉलोनी कुरेदना (या बहुत छोटे क्षेत्र में तब्दील ई. कोलाई) । एक नई LB/एम्पीसिलीन/आगर प्लेट पर इस ई. कोलाई का एक स्वाइप स्थानांतरित करें जिसे बंद कर दिया गया है, और फिर पीसीआर ट्यूब में पिपेट टिप डालें । पिपेट टिप हिला पीसीआर मिक्स के साथ ई कोलाई मिश्रण करने के लिए । अतिरिक्त कॉलोनियों के लिए तीन बार और दोहराएं । पीसीआर ट्यूब एक पीसीआर मशीन के लिए स्थानांतरण और thermocycling शुरू तालिका 3में दिखाया गया है प्रोग्राम का उपयोग कर ।
  4. भागो जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस TAE में 2% एगारोस जेल का उपयोग करके यह निर्धारित करने के लिए कि कौन सी कॉलोनियां प्लाज्मिड में सबसे अच्छा लिगेशन है और एक नई प्लेट पर उन कालोनियों को विकसित करें ।
  5. प्लेटों को परीक्षण के लिए तैयार होने तक फ्रिज में स्टोर कर रखें । रासायनिक परीक्षण के लिए जोड़ा १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन के साथ दुरिया शोरबा में एक तरल संस्कृति तैयार करते हैं ।

5. डीएनए अनुक्रमण

  1. प्रत्येक नमूने के लिए, प्लाज्मिड की 5 μl, अनुक्रमण प्राइमर के 4 μl, और विआयनीकृत पानी की 3 μl जोड़ें ।
  2. एक ट्यूब में इस मिश्रण प्लेस और डीएनए अनुक्रमण के लिए भेज ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  3. डीएनए अनुक्रम डेटा का विश्लेषण करें डीएनए अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए अपेक्षित और मनाया डीएनए अनुक्रम की तुलना करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई परिवर्तन नहीं है और कि जीन सही ढंग से डाला गया था ।
    नोट: एक रासायनिक संवेदक के रूप में ई. कोलाई का उपयोग कर नीचे प्रस्तुत किया है ।

6. ई. कोलाई संस्कृतियों की तैयारी

  1. तरल संस्कृतियों के लिए १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन के साथ LB तैयार करें ।
  2. सेंसर बैक्टीरिया, सकारात्मक नियंत्रण * बैक्टीरिया और नकारात्मक नियंत्रण * * बैक्टीरिया की तरल संस्कृतियों तैयार करते हैं ।
    नोट: * सकारात्मक नियंत्रण बैक्टीरिया: ई. कोलाई जिसमें एक संरचक प्रमोटर के नियंत्रण में RFP जीन के साथ एक प्लाज्मिड युक्त; कृत्रिम जीव विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया मानक जैविक भागों की रजिस्ट्री से प्लाज्मिड E1010 ( सामग्री की तालिकादेखें) इस काम में इस्तेमाल किया गया था ।
    * * नकारात्मक नियंत्रण जीवाणु: ई. कोलाई जिसमें एक अलग प्रमोटर के नियंत्रण में आरएफपी जीन के साथ प्लाज्मिड होता है, जैसे कि pbad प्रमोटर (सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए प्रयुक्त मानक जैविक भागों की रजिस्ट्री से प्लाज्मिड J10060 सामग्री)) या एक प्लाज्मिड है कि आरएफपी जीन नहीं है ।
  3. एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में संस्कृतियों प्लेस ३७ ° c और २२० rpm पर एक ंयूनतम के लिए 8 एच, अधिकतम 18 ज. बादल का शोरबा बैक्टीरियल विकास इंगित करता है ।

7. डिवाइस के समारोह की जांच करने के लिए ई. कोलाई titrating

नोट: एक बार सेंसर समारोह की जांच करने के लिए titrated किया गया है, इस कदम को दोहराया जा करने की आवश्यकता नहीं है । लीड के अलावा के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण, antimony, और 2, 4-DNT या 1, 3-dinitrobenzene (1, 3-DNT) पूर्ण अनुमापन के लिए आवश्यकता के बिना प्रत्येक उपयोग के लिए उपकरणों के समारोह की जांच कर सकते हैं ।

  1. पानी में 10 पीपीएम की सांद्रता पर ब् याज के वैश् लेषिक (ओं) का स् टॉक समाधान तैयार करें । यदि घुलनशीलता एक मुद्दा है, एक 50/50 पानी/मेथनॉल मिश्रण का उपयोग करें ।
  2. एक गाइड के रूप में 4 तालिका का उपयोग करना, बाँझ संस्कृति ट्यूबों के उपयुक्त संख्या लेबल और (प्रोटोकॉल कदम 6 से) प्रत्येक ट्यूब में संवर्धित शोरबा के 2 मिलीलीटर जगह है ।
    नोट: एक सामान्य विश्लेषणात्मक रेंज का निर्धारण करने के लिए, सेंसर बैक्टीरिया, नकारात्मक नियंत्रण के साथ एक स्तर, और सकारात्मक नियंत्रण के साथ एक स्तर के साथ एक analyte के कम से तीन विभिन्न स्तरों करते हैं । वहां भी एक बैक्टीरिया है कि कोई जोड़ा धातु (नकारात्मक नियंत्रण का एक अंय प्रकार) है की एक ट्यूब होना चाहिए । और अधिक सही विश्लेषणात्मक रेंज और पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए, analyte सांद्रता की एक बड़ी रेंज का उपयोग करें ।
  3. विश्लेषणात्मक स्टॉक समाधान जोड़ें के रूप में तालिका 4में उल्लेख किया शोरबा के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों, संस्कृति ट्यूब पर स्नैप कैप्स ताकि वे ढीला कर रहे हैं (ट्यूब में हवा प्रवाह की अनुमति के लिए), और भंवर संस्कृति ट्यूब.
  4. तस्वीर टोपी ढीला संस्कृति ट्यूबों पर छोड़, २२० rpm और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में कम से कम 24 घंटे के लिए जगह है ।
  5. इनक्यूबेटर से ट्यूबों निकालें, ट्यूबों पर टोपियां कसकर स्नैप, और प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए तैयार जब तक फ्रिज में ट्यूब की दुकान ।

8. जीएसआर के लिए रासायनिक संवेदक के रूप में ई. कोलाई का प्रयोग

  1. नेतृत्व को हटाने के लिए डिज़ाइन किया गया एक इथेनॉल आधारित पोंछ का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), उंगलियों के बीच सहित हाथों की सभी सतहों पोंछ । प्रत्येक हाथ के लिए एक अलग पोंछ का उपयोग करें । विश्लेषण जब तक एक उचित लेबल सीलेबल baggie में पोंछे स्टोर ।
  2. सतहों के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए: बड़े सतहों के लिए एक शराब आधारित पोंछ का उपयोग करें या एक कपास झाड़ू छोटी सतहों के लिए इथेनॉल के साथ सिक्त ।
    नोट: ' सेंसर gsr के लिए प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के लिए, एक खर्च के अंदर । ४० कैलिबर काट्रिज आवरण के साथ एक इथेनॉल सिक्त कपास झाड़ू के साथ गिरफ्तार किया गया था ।
  3. साफ दस्ताने पहने हुए है और कैंची है कि शराब के साथ साफ किया गया है का उपयोग कर, एक लगभग 1 सेमी2 काट के केंद्र के बाहर पोंछें ।
  4. हाथ पोंछें या कपास झाड़ू के कटे हुए टुकड़े को सीधे एक संस्कृति ट्यूब में रखें जिसमें 2 मिलीलीटर संवेदक जीवाणु हों, यह सुनिश्चित करना कि यह शोरबा में डूबा हुआ है ।
  5. कदम ७.४-७.५ में ऊपर वर्णित के रूप में आगे बढ़ें ।

9. फ्लोरेसेंस पोर्टेबल स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण ( सामग्री तालिकादेखें)

  1. ट्यूबों हिला करने के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग करें ।
  2. ५०० एनएम के उत्तेजन तरंग दैर्ध्य के साथ अपने आरएफपी वैरिएंट के लिए उपयुक्त तरंगदैर्घ्य पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्रित करने के लिए स्पेक्ट्रोमीटर तैयार करें ।
  3. एक खाली स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करने के लिए दुबरिया शोरबा का उपयोग करें ।
  4. ध्यान से प्रत्येक supernatant एक कम मात्रा द्रोणिका करने के लिए हस्तांतरण और उत्सर्जन की तीव्रता इकट्ठा ।

10 फ्लोरेसेंस विश्लेषण ९६ का उपयोग-अच्छी तरह से थाली रीडर ( सामग्री की तालिकादेखें)

  1. ट्यूबों हिला करने के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग करें ।
  2. कूप की थाली में एक कुएं के लिए २०० मिलीलीटर शोरबा का स्थानांतरण । रिकॉर्ड जो नमूने थाली के प्रत्येक कुएं में चला गया ।
  3. आरएफपी वैरिएंट के लिए उपयुक्त तरंगदैर्घ्य पर उत्सर्जन तीव्रता को एकत्र करने के लिए फ्लुओरीमीटर को सेट करें ।

11. डेटा विश्लेषण

  1. सभी नकारात्मक नियंत्रण से प्राप्त संकेत का उपयोग (आरएफपी नकारात्मक बैक्टीरिया या सेंसर बैक्टीरिया के साथ कोई analyte जोड़ा), पृष्ठभूमि के लिए एक औसत प्रतिदीप्ति संकेत की गणना.
  2. सेंसर बैक्टीरिया के लिए प्राप्त प्रत्येक प्रतिदीप्ति संकेत से औसत पृष्ठभूमि संकेत को घटाना एक पृष्ठभूमि को सही प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए ।
  3. संकेत-से-रव (S/N) अनुपात का आकलन करें पृष्ठभूमि द्वारा संशोधित प्रतिदीप्ति तीव्रता को औसत पृष्ठभूमि संकेत द्वारा विभाजित करके । यदि S/N अनुपात 3 से अधिक है, तो परीक्षण धनात्मक है ।

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Representative Results

इस कार्य में प्रयुक्त आरएफपी परिवर्त के लिए प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा चित्र 2में दर्शाए गए हैं । यह दो analytes, 2, 4-DNT और 1, 3-DNT करने के लिए प्रतिसाद के रूप में यह लीड और TNT-RFP डिवाइस के लिए प्रतिसाद के रूप में ये डेटा PbRFP डिवाइस से हैं । यह आंकड़ा एक नकारात्मक नियंत्रण के स्पेक्ट्रम से पता चलता है (कोई विश्लेषणात्मक जोड़ा), और विश्लेषणात्मक के दो विभिंन स्तरों पर स्पेक्ट्रा जोड़ा । उपयोग किए गए आरएफपी वैरिएंट के लिए अधिकतम प्रतिदीप्ति सिगनल ५७५ एनएम (उत्तेजन तरंगदैर्घ्य ५०० एनएम) पर देखा गया । चित्र 3 में डेटा का प्रतिनिधित्व कर रहे है एक एकल अनुमापन प्रयोग (इसलिए कोई त्रुटि पट्टियां शामिल हैं) PbRFP डिवाइस, के रूप में प्रोटोकॉल के चरण 7 में titrated । चित्र 3बी पोर्टेबल स्पेक्ट्रोमीटर से एकत्रित डेटा को दिखाता है, जबकि चित्रा 3b फ्लुओरीमीटर (समाधानों के एक ही सेट से) से एकत्र किए गए डेटा को दिखाता है । धातु की सांद्रता बढ़ने के साथ प्रतिदीप्ति में वृद्धि की सामान्य प्रवृत्ति होती है । यह ध्यान देने योग्य बात है कि उच्च सांद्रता पर, अधिक से अधिक के बारे में ८०० ppb, प्रतिक्रिया इस तरह के एक उच्च एकाग्रता पर धातु की विषाक्तता के कारण बंद बूंदें । यह अधिकतम प्रतिसाद स्तर विश्लेषण उपयोग के आधार पर भिंन हो सकते हैं । हमारे sbrfp के साथ पिछले काम से पता चला कि बैक्टीरिया उच्च स्तर को बर्दाश्त कर सकता है (कम से १,००० ppb) आर्सेनिक और ऐन्टिमनी के10। हाथ झाड़ू से एकत्र इन analytes के स्तर पर साहित्य इंगित करता है कि सीसा और ऐन्टिमनी के इन स्तरों क्या एक हाथ से15झाड़ू एकत्र किया जा सकता है के साथ संगत कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, 4 चित्रा में प्रस्तुत परिणाम है कि बैक्टीरिया कोशिका मृत्यु, जो काफी क्या एक हाथ झाड़ू से एकत्र किया जाता है से अधिक हो जाएगा बिना एक कारतूस मामले झाड़ू में मौजूद analytes की मात्रा बर्दाश्त कर सकते है प्रदर्शन ।

इन आंकड़ों के लिए परिकलित s/n मानों का उपयोग करते हुए, लीड का निम्नतम detectable स्तर 12 पीपीबी था (3 से अधिक s/n द्वारा परिभाषित के रूप में detectable) । इसके विपरीत, पोर्टेबल स्पेक्ट्रोमीटर डेटा के लिए एस/एन परीक्षण उच्चतम स्तर पर केवल 2 है. हालांकि, विश्लेषणात्मक एकाग्रता बढ़ाने के साथ प्रतिदीप्ति में वृद्धि की प्रवृत्ति अभी भी स्पष्ट रूप से उल्लेख किया है ।

चित्र 4a gsr के लिए एक सकारात्मक परीक्षण दिखाता है । इस परिणाम को प्राप्त करने के लिए, इथेनॉल झाड़ू एक खर्च के अंदर से एकत्र किए गए थे । ४० कैलिबर कारतूस आवरण और तीन संवेदक बैक्टीरिया को जोड़ा, प्रोटोकॉल के चरण 8 में के रूप में । यह आंकड़ा भी एक सकारात्मक नियंत्रण (बैक्टीरिया है कि संवैधानात्मक व्यक्त आरएफपी) और SbRFP डिवाइस के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण से पता चलता है के साथ कोई analyte । कारतूस मामले झाड़ू सबूत के सिद्धांत के रूप में परिणाम का इस्तेमाल किया गया । भविष्य के काम में, हाथ झाड़ू के लिए एक बंदूक निकाल दिया है पता चलता है कि सेंसर हाथ झाड़ू के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए उत्तरदाई है लोगों से एकत्र किया जाएगा ।

घटक 20 μL प्रतिक्रिया
10X T4 डीएनए Ligase बफर 2 μL
प्लाज्मिड डीएनए (3 kb) 3 μL
प्रवर्तक डीएनए (0.7 kb) 10 μL
न्यूक्लेज-मुक् त जल 4 μL
T4 डीएनए लिग्नेस 1 μL

तालिका 1. Ligation के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण, प्रोटोकॉल कदम 3.1.1.

घटक 25 μL प्रतिक्रिया
10 μM आगे प्राइमर ०.५ μL
10 μM रिवर्स प्राइमर ०.५ μL
एक है १२.५ μL
न्यूक्लेज-मुक् त जल 11 μL

तालिका 2 । कॉलोनी पीसीआर, प्रोटोकॉल कदम ४.१ के लिए रिएक्शन मिक्सचर ।

चरण Temp समय
आरंभिक विकर्तीकरण ९४ डिग्री सेल्सियस 30 एस
30 चक्र ९४ डिग्री सेल्सियस 30 एस
५५ डिग्री सेल्सियस ४५ एस
६८ डिग्री सेल्सियस ६० एस
अंतिम विस्तार ६८ डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस

तालिका 3. प्रोटोकॉल चरण ४.३ के लिए पीसीआर थर्मोसायक्लिंग पैरामीटर्स ।

ट्यूब आईडी बैक्टीरिया विश्लेषणात्मक समाधान जोड़ा गया (पीपीएम) का सांद्रण धातु जोड़ा गया Analyte समाधान की मात्रा २,००० μL शोरबा करने के लिए जोड़ा [analyte], पीपीबी
1 PbRFP 10 पंजाब २.५ 12
2 PbRFP 10 पंजाब ७५ ३६१
3 PbRFP 10 पंजाब १५० ६९८
4 PbRFP 0 कोई नहीं 0 0
5 आरएफपी नेग 10 पंजाब 10 ५०
6 आरएफपी पीओएस 10 पंजाब 10 ५०

तालिका 4. सामांय प्रयोग biosensors के अनुमापन के लिए स्थापित, प्रोटोकॉल कदम ७.२ ।

Figure 1
चित्रा 1 । माइक्रोबोकॉप उपकरणों के जैविक तत्वों । (क) एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन के साथ प्लाज्मिड में माइक्रोबोकॉप के लिए सामान्य उपकरण का आरेख (ख) माइक्रोबोकॉप प्रणाली बनाने के लिए संयोजित प्रत्येक डिवाइस का आरेख. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 । की उपस्थिति और अनुपस्थिति में विश्लेषण PbRFP और टीएनटी-आरएफपी बैक्टीरिया का प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा । फ्लुओरीमीटर पर एकत्र किया गया डाटा । (क) विश्लेषण (पीबी) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में पीबीआरएफपी बैक्टीरिया का प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा । (ख) दो एनालेटीज (2, 4-डीएनटी और 1, 3-डीएनबी) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में टीएनटी-आरएफपी बैक्टीरिया का प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 । (लीड) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में PbRFP बैक्टीरिया के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा का पता लगाने के लिए पोर्टेबल स्पेक्ट्रोमीटर प्रणाली और fluorimeter की तुलना. (क) पोर्टेबल स्पेक्ट्रोमीटर प्रणाली पर एकत्रित पीबीआरएफपी संवेदक जीवाणुओं के लिए सीसा अनुमापन डेटा. (ख) पीबीआरएफपी संवेदक जीवाणु के लिए सीसा अनुमापन डेटा (एक ही नमूने) फ्लुओरीमीटर पर एकत्र किया जाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 । इथेनॉल के अंदर से लिया झाड़ू एक. ४० कैलिबर खर्च पिस्तौल कारतूस के लिए तीन उपकरणों की प्रतिक्रिया दिखाने के लिए gsr। S/एन सभी संकेतों के लिए 3 से अधिक था, GSR के लिए एक सकारात्मक परीक्षण का संकेत. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

संशोधन और समस्या निवारण

सारणी 4 में वर्णित प्रयोग को किसी भी तरह से संशोधित किया जा सकता है जो सेंसर को डिजाइन किया गया है । एक रासायनिक संवेदक का सबसे महत्वपूर्ण पहलू अपनी संवेदनशीलता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए है । यह सुनिश्चित करें कि विश्लेषणात्मक की सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संवेदक के उपयोगी विश्लेषणात्मक रेंज का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया है फायदेमंद है । यह भी कोशिकाओं के लिए analyte के एक अधिकतम स्तर का निर्धारण करने के लायक है । क्योंकि इस अध्ययन में इस्तेमाल किया analytes विषाक्त धातुओं (पीबी और एसबी) या एक मेथनॉल समाधान में कार्बनिक यौगिकों (टीएनटी डेरिवेटिव के लिए) कर रहे हैं, वहां एक ऊपरी स्तर पर जो कोशिका मौत analytes या समाधान की विषाक्तता के कारण हो जाएगा (आम तौर पर अधिक से अधिक ५००-1, 0 00 इस प्रकार अब तक आयोजित प्रयोगों के लिए पीपीबी) ।

तकनीक की सीमाएं

इस काम में प्रस्तुत परिणाम प्रकृति में गुणात्मक हैं, लेकिन आरएफपी संशोधित ई. कोलाईकी मात्रात्मक क्षमताओं का प्रदर्शन करने के लिए होती हैं । सेंसर की संवेदनशीलता सभ्य बैचों शोरबा में कोशिकाओं के घनत्व के आधार पर के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं । यदि मात्रात्मक परिणामों की आवश्यकता है, कोशिका एकाग्रता विश्लेषण से पहले तरल संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा अनुमान लगाया जाना चाहिए । यदि संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित किया जाता है, तो कोशिकाओं को उचित रूप से पतला कर सकते है प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता को कम । वांछित analytes के लिए एक प्रकल्पित परीक्षण के रूप में, तथापि, गुणात्मक "वर्तमान में/ ऐगार प्लेट पर कोशिकाओं के जीवनकाल को भी ध्यान में रखना चाहिए-पिछले काम ने संकेत दिया है कि प्लेटों को फ्रिज में 2 सप्ताह तक स्टोर किया जा सकता है, लेकिन उपकरण उस समय सीमा के अंत और उससे आगे की दिशा में बहुत अच्छी तरह से काम नहीं करते हैं ।

एक और विचार प्रतिदीप्ति संकेत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों की पसंद है. एक ९६-well प्लेट रीडर के साथ एक अनुसंधान ग्रेड स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग सटीक उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के चयन की अनुमति देता है, जो संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं । इस प्रणाली का उपयोग कर, अप करने के लिए ९६ प्रयोगों के परिणाम एक साथ एकत्र किया जा सकता है । आरएफपी प्रतिदीप्ति भी एक पोर्टेबल स्पेक्ट्रोमीटर प्रणाली का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । पोर्टेबल उपकरणों आमतौर पर चयनित उत्तेजना बैंड है, जो कर सकते है या एक के साथ मेल नहीं कर सकते है की अनुमति देने के RFP संस्करण का इस्तेमाल किया जा रहा है । हालांकि, जब तक उत्तेजना तरंगदैर्घ्य उत्तेजना में एक उचित सीमा के भीतर है, पोर्टेबल उपकरण आम तौर पर उपयोगी हो जाएगा (हालांकि संवेदनशीलता में एक नुकसान के साथ) । पोर्टेबल सिस्टम की लागत अनुसंधान ग्रेड स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से काफी कम है, और पोर्टेबिलिटी निश्चित रूप से एक फायदा हो सकता है । बैक्टीरिया के संभावित आवेदन के आधार पर, विश्लेषक तय कर सकते है या नहीं अतिरिक्त लागत और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्रणाली के साथ पोर्टेबिलिटी की हानि उचित है ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

इस काम में वर्णित तीन भाग MicRoboCop प्रणाली के लिए एक गुणात्मक, GSR की उपस्थिति के लिए प्रकल्पित परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने का इरादा है । वर्तमान में, GSR के लिए "गोल्ड स्टैंडर्ड" evidentiary टेस्ट SEM-EDX द्वारा विशेषज्ञ विश्लेषण की आवश्यकता है । SEM-EDX उपकरण महंगा है और आम तौर पर अत्यधिक विशिष्ट विश्लेषकों द्वारा संचालित है । इसके अतिरिक्त, GSR सबूत फोरेंसिक casework में अत्यधिक चर रहा है और कई चर GSR के बयान के लिए हाथ पर योगदान और16सतहों. जीएसआर के लिए एक प्रकल्पित परीक्षण व्यक्ति या संपत्ति की खोज के लिए संभावित कारण प्रदान करने के रूप में जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है । जब विद्युत परीक्षण या आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे परीक्षणों की तुलना में, इस विधि सरल, आसानी से उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन जो सबसे विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं का उपयोग किया जाना चाहिए प्रदान करता है ।

अंय अनुप्रयोगों

इस पांडुलिपि में वर्णित उपकरणों GSR के अनुमानित पहचान के लिए एक तीन भाग प्रणाली में संयुक्त करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । हालांकि, MicRoboCop प्रणाली (SbRFP, PbRFP, और टीएनटी-आरएफपी) में प्रत्येक डिवाइस भी व्यक्तिगत रूप से भोजन, पानी, या पर्यावरण के नमूनों में रासायनिक संदूषण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले काम से पता चला है कि टीएनटी-आरएफपी उपकरण भूमि खानों13,17के लिए एक स्वस्थानी संवेदक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । परिणाम यहां और हमारे पिछले काम में प्रस्तुत10 से पता चला है कि sbrfp और pbrfp उपकरणों की सांद्रता कम करने के लिए पर्याप्त का पता लगाने कर सकते है और अधिक महंगी और परिष्कृत उपकरणों जैसे प्रेरणिकत: युग्मित प्लाज्मा परमाणु उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के प्रतिद्वंद्वी के लिए ( आईसीपी-एईएस) और परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (आस) । एसबीआरएफपी सेंसर आर्सेनिक के साथ-साथ ऐन्टिमनी के प्रति संवेदनशील है । इन उपकरणों विषाक्त भारी धातु संदूषण के विश्लेषण के लिए एक कम लागत विकल्प प्रदान कर सकते हैं ।

ई. कोलाई यहां प्रस्तुत की तैयारी के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल किसी भी प्रणाली है कि मानक सिंथेटिक जीव विज्ञान आनुवंशिक भागों का उपयोग करता है के लिए लागू है ई. कोलाई है कि एक्सप्रेस RFP synthesize । विश्लेषणात्मक विधि किसी भी प्रणाली है कि RFP व्यक्त करने के लिए लागू है, और इसलिए किसी भी बैक्टीरियल बायोसेंसर प्रणाली है कि सिंथेटिक जीव विज्ञान के तरीकों का उपयोग कर बनाया गया है का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या ब्याज की अंय संघर्ष के लिए खुलासा किया है ।

Acknowledgments

लेखकों को biol ३२४ (जेनेटिक्स) में longwood विश्वविद्यालय में छात्रों को स्वीकार करना चाहते है और chem ४०३ में छात्रों (उंनत रासायनिक प्रयोगशाला समस्या को हल) जो प्रारंभिक तैयारी और ऐन्टिमनी और सीसा biosensors के परीक्षण में शामिल थे । MicRoboCop के लिए विचार GCAT SynBIO कार्यशाला (ग्रीष्मकालीन २०१४), जो NSF और हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान द्वारा वित्त पोषित है और मैरीलैंड बाल्टिमोर काउंटी के विश्वविद्यालय द्वारा आयोजित में कल्पना की थी । लेखक भी Longwood विश्वविद्यालय के कुक से प्राप्त धन स्वीकार-कला और विज्ञान और GCAT SynBio पूर्व छात्र अनुदान के कोल कॉलेज ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,3-dinitrobenzene, 97% Aldrich D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97% Aldrich 101397-5G
Agar Fisher Scientific BP1423-500
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) Fisher Scientific SA450-100 Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer New England BioLabs B7204S
Duplex Buffer Integrated DNA Technologies 11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme New England BioLabs R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured Acros Organics AC611050040 Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR Integrated DNA Technologies 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing Integrated DNA Technologies 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit IBI Scientific IB47101
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) Fisher Scientific SL21-100 Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes Hygenall 45NRCN Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific A452-4 Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells New England BioLabs C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme New England BioLabs R3131S
Nuclease free water New England BioLabs B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer New England BioLabs M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology Registry of Standard Biological Parts http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences Integrated DNA Technologies Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5’
Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3’
3’-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5’
TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3’
3’CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5’
Reverse primer for colony PCR Integrated DNA Technologies 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing Integrated DNA Technologies 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S

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References

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Barber, A. E., Hodges, H., Porter, S. E. G., Richardson, E., Rowland, K., Soles, A. Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue. J. Vis. Exp. (147), e59471, doi:10.3791/59471 (2019).

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