Summary
Een protocol wordt gepresenteerd met behulp van synthetische biologietechnieken om een set van bacteriële biosensoren voor de analyse van schot residu te synthetiseren, en om de werking van de apparaten te testen voor het beoogde gebruik met behulp van fluorescentiespectroscopie.
Abstract
MicRoboCop is een biosensor die is ontworpen voor een unieke toepassing in de forensische Chemie. MicRoboCop is een systeem bestaande uit drie apparaten die, wanneer samen gebruikt, kan de aanwezigheid van schot residu (GSR) te geven door het produceren van een fluorescentie signaal in de aanwezigheid van drie belangrijke analyten (antimoon, lood, en organische componenten van GSR). Het protocol beschrijft de synthese van de biosensoren met behulp van Escherichia coli (E. coli), en de analytische chemie methoden die worden gebruikt om de selectiviteit en de gevoeligheid van de sensoren te evalueren. De werking van het systeem wordt aangetoond door het gebruik van GSR verzameld van de binnenkant van een gebruikte cartridge behuizing. Eenmaal voorbereid, kunnen de biosensoren worden opgeslagen tot ze nodig zijn en kunnen worden gebruikt als een test voor deze belangrijke analyten. Een positieve reactie van alle drie de analyten biedt een vermoedelijke positieve test voor GSR, terwijl elk afzonderlijk apparaat toepassingen heeft voor het opsporen van de analyten in andere monsters (bijv. een detector voor lood contaminatie in drinkwater). De belangrijkste beperking van het systeem is de tijd die nodig is voor een positief signaal; toekomstige werkzaamheden kunnen betrekken het bestuderen van verschillende organismen om de responstijd te optimaliseren.
Introduction
Een biosensor is een analytisch apparaat dat gebruikmaakt van biologische componenten (zoals eiwitten, nucleïnezuren of hele organismen) die een reactie produceren die kan worden gebruikt voor het opsporen van een chemische stof of analyt. Als voorbeeld, de kolenmijn industrie gebruikt een biosensor voor een groot deel van de 20e eeuw om de aanwezigheid van giftige mijn gassen te detecteren: de kanarie in de kolenmijn1. De (de) reactie van het biologische organisme (de dood of de nood) aan een chemische analyt (koolmonoxide) werd waargenomen door de mijnwerkers om de arbeiders te beschermen. In een meer moderne en verfijnde voorbeeld, bacteriën kunnen worden veranderd met behulp van synthetische biologietechnieken om te reageren op de aanwezigheid van een bepaalde chemische analyt door het tentoonstellen van een specifieke reactie, zoals de expressie van een fluorescerende eiwit.
Synthetische biologie is een brede term die verwijst naar de bouw van biologische apparaten en systemen die niet van nature bestaan, of het herontwerp van bestaande biologische systemen voor een specifiek doel2. Synthetische biologie onderscheidt zich van genetische manipulatie door een standaard methodologie en het bestaan van gestandaardiseerde onderdelen (standaard synthetische biologie genetische elementen) die kunnen worden gebruikt om apparaten en systemente synthetiseren. Een deel wordt geïntroduceerd in het genoom van een apparaat, een organisme zoals een bacterie, om een bepaalde eigenschap uit te drukken die als aanwijzing van functie zal dienen. Bijvoorbeeld, in vele synthetische apparaten, wordt de uitdrukking van een fluorescente proteïne geïntroduceerd in één eencellige organisme als verslaggever proteïne. Meerdere apparaten kunnen worden gecombineerd in een systeem. Het genoom van micro-organismen zoals bacteriën zijn gemakkelijk te manipuleren op deze manier. Talrijke voorbeelden van biosensoren die specifiek zijn voor een breed scala van chemische analyten zijn gerapporteerd in de literatuur over de laatste tien jaar3,4.
In dit werk wordt het MicRoboCop systeem gepresenteerd als een voorbeeld van een biosensor ontworpen met behulp van synthetische biologietechnieken met nieuwe toepassingen in de forensische en milieu-chemie. MicRoboCop is een systeem van drie afzonderlijke apparaten die, wanneer gecombineerd, zal Escherichia coli om rode fluorescerende eiwit (offerte) uit te drukken in de aanwezigheid van schot residu (GSR) die is verzameld uit handen van een persoon of een oppervlak. Elk van de drie apparaten reageert op een specifieke chemische analyt waarvan bekend is dat het een onderdeel van GSR5. De drie analyten waarop het systeem reageert zijn I. 2, 4, 6-trinitrotolueen (TNT) en aanverwante verbindingen, II. lood (in de vorm van lood ionen), en III. Antimoon (ook in de vorm van ionen).
GSR bestaat uit veel verschillende chemische stoffen, maar de drie meestal gebruikt om een residu te identificeren als GSR zijn barium, lood, en antimoon5. De standaard evidentiary test voor de identificatie van GSR is het gebruik van Scanning Electron microscopie (SEM) met energie Dispersive X-Ray fluorescentie (EDX)5. SEM-EDX staat analisten toe om de unieke morfologie en de elementaire componenten van GSR te identificeren. Momenteel zijn er weinig gebruikte binaire vermoedelijke tests beschikbaar. Een onlangs gepubliceerde vermoedelijke test maakt gebruik van Ion-Mobility spectroscopie (IMS), dat is gespecialiseerd apparatuur die misschien niet beschikbaar zijn in vele Labs6. Er zijn ook een paar kleur "spot" tests die kunnen worden gebruikt, hoewel ze meestal worden gebruikt voor afstand bepaling of voor GSR identificatie op kogelgaten en wonden5. Bovendien, er is enige beperkte aandacht in de literatuur aan elektrochemische tests voor GSR die voltammetric analyse, die het voordeel van potentieel wordt gebied draagbare, of anodische strippen voltammetry, dat is een uiterst gevoelige methode voor metallic elementen7. Er is zeer weinig vermelding in de literatuur van biosensoren speciaal ontworpen voor het doel van het opsporen van GSR, hoewel sommige biosensoren voor andere forensische toepassingen zijn gepubliceerd8.
De biologische elementen voor elk apparaat in het MicRoboCop systeem, en de plasmide constructie, worden geïllustreerd in Figuur 1. De gebogen pijl in Figuur 1b vertegenwoordigt de promotor regio die wordt geactiveerd in de aanwezigheid van de analyt, de ovaal is de ribosomale bindende site die het mogelijk maakt de vertaling van de verslaggever eiwit, de grijze doos met het label offerte is het gen dat rood uitdrukt fluorescerende eiwitten, en de rode Octagon is de transcriptie beëindiging site. Alle drie de apparaten zullen samen worden gebruikt als een systeem om GSR te detecteren. Elk apparaat met een specifieke promotor (SbRFP, PbRFP, en TNT-offerte) zal worden uitgebroed met het monster dat wordt getest en fluorescentie van offerte zal worden gemeten. OFFERTE zal alleen worden uitgedrukt als de juiste chemische analyt aanwezig is en de promotor regio activeert. Drie apparaten die reageren op een aantal van de chemische stoffen die aanwezig zijn in GSR zijn ontworpen en worden gepresenteerd in dit werk.
De promotors gebruikt in de drie MicRoboCop apparaten zijn een arseen en antimoon Sensitive promotor , SbRFP9,10, een lead Sensitive promotor, PbRFP11,12 en een TNT Sensitive promotor, TNT-offerte 13. omdat een zoekopdracht in de literatuur geen promotor ontwierp om te reageren op barium, werd de TNT promotor in plaats daarvan geselecteerd omdat deze promotor gevoelig is voor een aantal structureel verwante verbindingen (met name 2, 4-dinitrotoluene en dinitrobenzeen) waarvan bekend is dat ze deel uitmaken van de organische verbindingen die achterblijven in GSR. Deze promotor is met succes gebruikt om de minieme hoeveelheden TNT en dinitrotoluene (2, 4-DNT) in begraven landmijnen13specifiek te ontdekken. Met behulp van de drie apparaten samen als een systeem, een positieve test voor GSR zal produceren fluorescentie in alle drie de apparaten. Een fluorescentie signaal in slechts één of twee apparaten zal een andere milieu bron van de analyt (en) of in het geval van de promotor van TNT aangeven, activering door een verbinding die geen organische samenstelling is die achter in GSR wordt verlaten. Door alle drie de apparaten samen te gebruiken, wordt de mogelijkheid van een vals positieve resultaten toe te schrijven aan milieubronnen geminimaliseerd. Loodvrije munitie, die in populariteit wint, vertegenwoordigt nog slechts ongeveer 5% van de munitie verkoop in de Verenigde Staten; Vandaar, kunnen de valse negatieve resultaten toe te schrijven aan de afwezigheid van lood een mogelijkheid zijn maar er is nog nut in een sensor die lood als teller voor GSR14gebruikt. In aanvulling op deze specifieke forensische toepassing, kan elk apparaat afzonderlijk worden gebruikt voor het opsporen van milieuverontreinigingen.
De gepresenteerde protocollen omvatten de synthetische biologietechnieken gebruikt om de apparaten te maken (sensor bacteriën) en de analytische technieken om de functie van de apparaten te controleren en analyseren van de fluorescentie signalen verkregen. Het protocol omvat ook de verzameling van forensisch bewijs in de vorm van de hand af te vegen om GSR te verzamelen uit de handen van een verdachte of zwabberen om GSR te verzamelen van een oppervlak. Resultaten van de lead sensor apparaat worden gepresenteerd als voorbeeld resultaten, samen met een demonstratie van een positieve test voor GSR met behulp van een gebruikte cartridge behuizing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: de synthese van E. coli die offerte uitdrukt wordt voorgesteld.
1. voorbereiding van plasmide DNA van E. coli
- Dooi e. coli bevattend een plasmide met een gen van de offerte en het bestand van de weerstand AMPICILLIN en kweken e. coli op Luria Bouillon (lb) agar platen die 100 µ g/ml AMPICILLIN bij 37 °c voor 24 h bevatten. Gebruik bijvoorbeeld de J10060 plasmide uit het register van standaard biologische onderdelen die worden gebruikt voor synthetische biologie (Zie tabel van materialen). De J10060 plasmide omvat een gen voor offerte (rode fluorescente proteïne) onder de controle van een pBad promotor gebied en een AMPICILLIN weerstands gen. Alternatief, Transform E. coli (zie stap 3,2) met de plasmide voorafgaand aan de groei op de LB agar platen.
- Volg een standaard miniprep Protocol (Zie de lijst van materialen) om DNA te isoleren van 1 ml van een E. coli cultuur die de J10060 plasmide bevat. Het doel van het volgende protocol is om de pBad promotor te verwijderen en te vervangen door de gewenste promotor voor het apparaat.
- Na de plasmide miniprep, op te slaan DNA in de vriezer tot klaar voor de spijsvertering.
2. beperking enzym spijsvertering
- Stel de volgende reactie in een micro centrifugebuis voor EcoRI en NheI spijsvertering: 10 l van J10060 plasmide DNA (geïsoleerd in stap 1), 8 l water, en 1 l elk van EcoRI en NheI enzymen voorgemengd met 1 l buffer (Zie tabel van materialen).
- Voor de promotor DNA, het opzetten van de volgende reactie in een micro centrifugebuis voor EcoRI en NheI spijsvertering: 10 l van gegloeid promotor DNA-sequenties (8 l water, en 1 l elk van EcoRI en NheI enzymen pre-gemengd met 1 l buffer.
- Voor SB-, PB-, of TNT-offerte (Zie de lijst van materialen), Los de oligonucleotides in buffer op (30 mm Hepes, pH 7,5; 100 mm Kaliumacetaat), incubeer in gelijke molaren concentraties, hitte aan 94 °c voor 2 min, en geleidelijk aan koel bij kamertemperatuur).
- Meng de samples door voorzichtig op en neer te pipetteren met de pipet die is ingesteld op 10 l.
- Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
- Warmte Inactiveer de enzymen bij 80 °C voor 5 min.
- Bewaar de verteerd DNA in de vriezer tot klaar voor de volgende stap.
3. afbinding en transformatie
-
Afbinding
- Met behulp van de plasmide en promotor DNA die werden dubbel verteerd met EcoRI en NheI in stap 2, het opzetten van de reactiemengsel weergegeven in tabel 1 in een micro centrifugebuis op ijs; Voeg de T4 DNA ligase laatste.
Nota: de lijst 1 toont een afbinding gebruikend een molaren verhouding van 1:3 vector om voor de vermelde grootte van DNA te plaatsen. - Meng de reactie zachtjes door op en neer te pipetteren en kort te centrifugeren.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Warmte inactief bij 65 °C gedurende 10 min.
- Met behulp van de plasmide en promotor DNA die werden dubbel verteerd met EcoRI en NheI in stap 2, het opzetten van de reactiemengsel weergegeven in tabel 1 in een micro centrifugebuis op ijs; Voeg de T4 DNA ligase laatste.
-
Transformatie
- Dooi een buis met 20 µ L van DH5-Alfa-bevoegde E. coli -cellen op het ijs tot de laatste ijs kristallen verdwijnen.
- Voeg 5 µ L van plasmide DNA aan het cel mengsel toe. Voorzichtig flick de buis 4-5 keer om de cellen en DNA te mengen.
- Plaats het mengsel op ijs voor 2 min.
- De schok van de hitte bij precies 42 °C voor precies 30 s. Niet mengen.
- Plaats op ijs voor 2 min. Niet mengen.
- Pipetteer 380 µ L van kamertemperatuur SOC in het mengsel. Onmiddellijk verspreid op een LB agar plaat met AMPICILLIN (100 µ g/mL) en incubeer overnachting bij 37 ° c.
- Controleer de platen binnen 24 uur voor de groei.
- Seal de platen met afdichting film en op te slaan in de koelkast tot klaar voor de volgende stap.
4. PCR van de kolonie
- Voeg aan een PCR buis (opstelling 4 reactie buizen) de reactie mengsels toe die in tabel 2worden getoond.
- Meng de reacties zachtjes door op en neer te pipetteren.
- Met behulp van een gele pipet tip, schraap een kolonie (of zeer kleine regio) van de getransformeerde E. coli. Breng een swipe van deze E. coli op een nieuwe lb/AMPICILLIN/agar plaat die is afgezet, en steek de pipet tip in de PCR-buis. Schud de pipet tip om de E. coli te mengen met de PCR mix. Herhaal nog drie keer voor extra kolonies. Breng de PCR buizen naar een PCR machine over en begin thermocycling gebruikend het programma dat in lijst 3wordt getoond.
- De Elektroforese van het gel van de looppas gebruikend een 2% agarose gel in TAE om te bepalen welke kolonies de beste afbinding in de plasmide hebben en die kolonies op een nieuwe plaat kweken.
- Bewaar de platen in de koelkast tot ze klaar zijn voor het testen. Bereid een vloeibare cultuur in Luria bouillon met 100 µ g/mL AMPICILLIN toegevoegd voor chemische testen.
5. DNA sequencing
- Voeg voor elk monster 5 µ L plasmide, 4 µ L van de sequencing primer, en 3 µ L van deioniseerde water toe.
- Plaats dit mengsel in een buis en stuur het voor DNA sequencing (Zie tabel van materialen).
- Analyseer DNA-sequentiegegevens om de verwachte en waargenomen DNA-sequenties met behulp van DNA-sequentie analyse software te vergelijken om ervoor te zorgen dat er geen mutatie en dat de genen correct zijn geplaatst.
Opmerking: het gebruik van E. coli als een chemische sensor wordt hieronder weergegeven.
6. voorbereiding van de culturen van E. coli
- Bereid LB met 100 µ g/mL AMPICILLIN voor vloeibare culturen.
- Bereid vloeibare culturen van de sensor bacteriën, de positieve controle * bacteriën en de negatieve controle * * bacteriën.
Opmerking: * positieve controle bacteriën: E. coli met een plasmide met het offerte-gen onder controle van een constitutieve promotor; plasmide E1010 van het register van standaard biologische onderdelen gebruikt voor synthetische biologie (Zie tabel van materialen) werd gebruikt in dit werk.
* * Negatieve controle bacteriën: E. coli bevattend een plasmide met het gen van de offerte onder controle van een verschillende promotor, zoals de pBad promotor (plasmide J10060 van de registratie van standaard biologische delen die voor synthetische biologie worden gebruikt (Zie lijst van Materialen)) of een plasmide die niet het offerte-gen heeft. - Plaats de culturen in een schuddende incubator bij 37 °C en 220 rpm voor een minimum van 8 uur, maximaal 18 h. bewolkte Bouillon geeft aan bacteriële groei.
7. het betitelen van E. coli om functie van apparaat te controleren
Opmerking: zodra de sensoren zijn getitratied om de functie te controleren, deze stap hoeft niet te worden herhaald. Een positieve controle in de vorm van toevoeging van lood, antimoon, en 2, 4-DNT of 1, 3-dinitrobenzeen (1, 3-DNB) kan de functie van de apparaten voor elk gebruik controleren zonder de noodzaak van de volledige titratie.
- Bereid een stockoplossing voor van de analyt (en) van belang bij een concentratie van 10 ppm in water. Als de oplosbaarheid is een probleem, gebruik dan een 50/50 water/methanol mengsel.
- Met behulp van tabel 4 als leidraad, het etiket het juiste aantal steriele cultuurbuizen en plaats 2 ml van de gekweekte Bouillon (van protocol stap 6) in elke buis.
Opmerking: om een algemeen analytisch bereik te bepalen, moet u ten minste drie verschillende niveaus van een analyt met de sensor bacteriën, een niveau met de negatieve controle, en een niveau met de positieve controle. Er moet ook een buis van elk van de bacteriën die geen toegevoegde metaal heeft (een ander type van negatieve controle). Om het analytisch bereik en de detectiegrenzen nauwkeuriger te bepalen, gebruikt u een groter bereik van de concentraties van de analyt. - Voeg de analyt voorraad oplossing om de buizen met 2 mL Bouillon zoals vermeld in tabel 4, plaats de snap caps op de cultuur buis, zodat ze los (om de luchtstroom in de buis), en draai de cultuur buis.
- Het verlaten van de snap caps losjes op de cultuurbuizen, plaats in een schudden incubator op 220 rpm en 37 ° c voor ten minste 24 uur.
- Verwijder de buizen van de incubator, snap de doppen stevig op de buizen, en bewaar de buizen in de koelkast tot klaar voor fluorescentie analyse.
8. E. coli gebruiken als chemische sensor voor GSR
- Met behulp van een ethanol-gebaseerde wipe ontworpen voor het verwijderen van lood (Zie tabel van materialen), veeg alle oppervlakken van de handen, met inbegrip van tussen de vingers. Gebruik een aparte veeg voor elke hand. Bewaar de doekjes in een passend geëtiketteerde afsluitbare zakje tot de analyse.
- Voor te testen oppervlakken: gebruik een op alcohol gebaseerde veeg voor grote oppervlakken of een wattenstaafje bevochtigd met ethanol voor kleine oppervlakken.
Opmerking: om aan te tonen van de sensoren ' reactie op GSR, de binnenkant van een bestede. 40 kaliber cartridge behuizing was afgestreken met een ethanol bevochtigd wattenstaafje. - Het dragen van schone handschoenen en het gebruik van een schaar die zijn gereinigd met alcohol, snijd een ongeveer 1 cm2 sectie uit het midden van de veeg.
- Plaats het snij stuk van de hand veeg of het wattenstaafje direct in een cultuur buis die 2 mL van de sensor bacteriën bevat, ervoor te zorgen dat het wordt ondergedompeld in de Bouillon.
- Ga verder zoals hierboven beschreven in stap 7,4 – 7,5.
9. de analyse van de fluorescentie gebruikend draagbare spectrometer (Zie lijst van materialen)
- Gebruik een Vortex mixer om de buizen te schudden.
- Bereid de spectrometer voor om fluorescentie emissie te verzamelen op de juiste golflengte voor uw offerte variant met een excitatie golflengte van 500 nm.
- Gebruik de Luria Bouillon om een leeg spectrum op te nemen.
- Breng elke bovendrijvende voorzichtig over naar een laag volume cuvette en verzamel de emissie-intensiteit.
10. de analyse van de fluorescentie gebruikend 96-goed plaat lezer (Zie lijst van materialen)
- Gebruik een Vortex mixer om de buizen te schudden.
- Breng 200 mL van de Bouillon naar een put in de put plaat. Record welke monsters ging in elk goed van de plaat.
- Stel de Fluorimeter in om de emissie intensiteit te verzamelen op de juiste golflengte voor de variant van de offerte.
11. gegevensanalyse
- Met behulp van het signaal verkregen uit alle negatieve controles (offerte negatieve bacteriën of sensor bacteriën zonder analyt toegevoegd), bereken een gemiddelde fluorescentie signaal voor de achtergrond.
- Trek het gemiddelde achtergrond signaal van elk fluorescentie signaal af dat voor de sensor bacteriën wordt verkregen om een achtergrond gecorrigeerde fluorescentie intensiteit te krijgen.
- Bereken de signaal-ruisverhouding (S/N) door de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie intensiteit te delen door het gemiddelde achtergrond signaal. Als de S/N-ratio groter is dan 3, is de test positief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescentie Spectra voor de in dit werk gebruikte offerte variant worden weergegeven in Figuur 2. Deze gegevens zijn afkomstig van het PbRFP-apparaat als het reageert op lead en de TNT-offerte apparaat als het reageert op twee analyten, 2, 4-DNT en 1, 3-DNB. Dit cijfer toont het spectrum van een negatieve controle (geen analyt toegevoegd), en de spectra op twee verschillende niveaus van analyt toegevoegd. Het maximum fluorescentie signaal voor de gebruikte offerte variant werd waargenomen bij 575 nm (excitatie golflengte 500 nm). De gegevens in Figuur 3 zijn representatief voor een enkele titratie experiment (dus geen foutbalken zijn opgenomen) van de PbRFP apparaat, zoals beschreven in stap 7 van het protocol. Figuur 3a toont gegevens verzameld uit de draagbare spectrometer, terwijl Figuur 3b gegevens uit de Fluorimeter (uit dezelfde reeks oplossingen) weergeeft. Er is een algemene tendens van stijgende fluorescentie aangezien de concentratie van metaal stijgt. Vermeldenswaard is dat bij hoge concentraties, groter dan ongeveer 800 ppb, de reactie daalt als gevolg van de toxiciteit van het metaal op een dergelijke hoge concentratie. Dit maximale respons niveau kan variëren, afhankelijk van de gebruikte analyt. Ons vorige werk met de SbRFP toonde aan dat de bacterie een hoger niveau kon tolereren (tenminste tot 1.000 ppb) van arseen en antimoon10. Literatuur over de niveaus van deze analyten verzameld uit handdoekje geeft aan dat deze niveaus van lood en antimoon in overeenstemming zijn met wat kan worden verzameld uit een handdoekje15. Bovendien, de resultaten gepresenteerd in Figuur 4 aantonen dat de bacteriën kunnen tolereren de hoeveelheden analyten aanwezig in een patroon geval doekje zonder celdood, die aanzienlijk hoger zal zijn dan wat wordt verzameld uit een handdoekje.
Met behulp van de berekende S/N-waarden voor deze gegevens was het laagste aantoonbare niveau van lood 12 ppb (detecteerbaar als gedefinieerd door een S/N groter dan 3). In tegenstelling, de S/N voor de draagbare spectrometer gegevens is slechts 2 op het hoogste niveau getest. Echter, de trend van toenemende fluorescentie met toenemende concentratie analyt is nog steeds duidelijk vermeld.
Figuur 4a toont een positieve test voor GSR. Om dit resultaat te verkrijgen, werden ethanol doekjes verzameld van de binnenkant van een bestede. 40 kaliber cartridge behuizing en toegevoegd aan de drie sensor bacteriën, zoals in stap 8 van het protocol. Dit cijfer toont ook een positieve controle (bacteriën die constitutief uitdrukt offerte) en een negatieve controle in de vorm van het SbRFP apparaat zonder analyt toegevoegd. De patroon koker wissers werden gebruikt als bewijs-van-principe resultaten. In de toekomst werken, zullen de handdoekjes worden verzameld van personen die bekend zijn te hebben ontslagen een pistool aan te tonen dat de sensoren zijn ontvankelijk voor de handdoekjes ook.
| Component | 20 l reactie |
| 10X T4 DNA ligase buffer | 2 l |
| Het DNA van de plasmide (3 KB) | 3 l |
| Promotor DNA (0.7 KB) | 10 l |
| Nuclease-vrij water | 4 l |
| T4 DNA ligase | 1 l |
Tabel 1. Het mengsel van de reactie voor afbinding, protocol stap 3.1.1.
| Component | 25 l reactie |
| 10 µ M voorwaartse primer | 0,5 µ L |
| 10 µ M omgekeerde primer | 0,5 µ L |
| EenTaq 2X Master Mix | 12,5 µ L |
| Nuclease-vrij water | 11 µ L |
Tabel 2. De mengsels van de reactie voor PCR van de kolonie, protocol stap 4,1.
| Stap | Temp | Tijd |
| Eerste denaturatie | 94 °C | 30 s |
| 30 cycli | 94 °C | 30 s |
| 55 °C | 45 s | |
| 68 °C | 60 s | |
| Definitieve uitbreiding | 68 °C | 5 min |
| Houden | 4 °C |
Tabel 3. PCR thermocycling parameters voor protocol stap 4,3.
| Tube-ID | Bacteriën | Concentratie van de analyt oplossing toegevoegd (ppm) | Metaal toegevoegd | Volume van de analyt oplossing toegevoegd aan 2.000 µ L Bouillon | [analyt], PPB |
| 1 | PbRFP | 10 | PB | 2,5 | 12 |
| 2 | PbRFP | 10 | PB | 75 | 361 |
| 3 | PbRFP | 10 | PB | 150 | 698 |
| 4 | PbRFP | 0 | Geen | 0 | 0 |
| 5 | OFFERTE NEG | 10 | PB | 10 | 50 |
| 6 | OFFERTE POS | 10 | PB | 10 | 50 |
Tabel 4. Algemeen experiment opgezet voor titratie van biosensoren, protocol stap 7,2.
Figuur 1. Biologische elementen van de MicRoboCop apparaten. (a) diagram van het algemene apparaat voor MicRoboCop in een plasmide met een AMPICILLIN weerstands gen. (b) schema van elk apparaat dat wordt gecombineerd om het MicRoboCop systeem te creëren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Fluorescentie spectra van PbRFP en TNT-offerte-bacterie in aanwezigheid en afwezigheid van analyt. Gegevens verzameld op Fluorimeter. afluorescentie spectra van PbRFP bacteriën in aanwezigheid en afwezigheid van analyt (PB). bfluorescentie spectra van TNT-offerte-bacteriën in aanwezigheid en afwezigheid van twee analyten (2, 4-DNT en 1, 3-DNB). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van het draagbare spectrometer systeem en Fluorimeter voor de detectie van de fluorescentie spectra van PbRFP bacteriën in aanwezigheid en afwezigheid van analyt (lood). (a) lood titratie gegevens voor PbRFP sensor bacteriën verzameld op draagbare spectrometer systeem. (b) lood titratie gegevens (dezelfde monsters) voor PbRFP sensor bacteriën verzameld op Fluorimeter. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Ethanol zwabber genomen van de binnenkant van a. 40 kaliber bestede pistool patroon om de reactie van de drie apparaten aan GSR te tonen. S/N voor alle signalen was groter dan 3, met vermelding van een positieve test voor GSR. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wijzigingen en probleemoplossing
Het in tabel 4 beschreven experiment kan op welke manier dan ook aangepast worden aan de ontworpen sensoren. Het belangrijkste aspect van een chemische sensor is het evalueren van de gevoeligheid en specificiteit. Het is nuttig om ervoor te zorgen dat een breed scala van concentraties van de analyt wordt geanalyseerd om de nuttige analytische bereik van de sensor te bepalen. Het is ook de moeite waard het bepalen van een maximumgehalte aan analyt voor de cellen. Omdat de analyten die in deze studie worden gebruikt toxische metalen (PB en SB) of organische verbindingen in een methanol oplossing (voor de TNT derivaten) zijn, is er een hoger niveau waarbij celdood als gevolg van de toxiciteit van de analyt of de oplossing zal optreden (over het algemeen hoger dan 500 – 1,0 00 ppb voor de tot nu toe uitgevoerde experimenten).
Beperkingen van de techniek
De resultaten die in dit werk worden gepresenteerd zijn kwalitatief van aard, maar zijn bedoeld om de kwantitatieve mogelijkheden van offerte gewijzigd E. coliaan te tonen. De gevoeligheid van de sensor kan sterk variëren tussen gekweekte partijen afhankelijk van de dichtheid van de cellen in de Bouillon. Als kwantitatieve resultaten nodig zijn, moet de concentratie van de cellen worden geschat door de optische dichtheid van de vloeibare culturen vóór analyse te meten. Als de optische dichtheid van de culturen wordt bepaald, dan kunnen de cellen geschikt worden verdund om veranderlijkheid tussen experimenten te verminderen. Als een vermoedelijke test voor de gewenste analyten, is de kwalitatieve "huidige/niet aanwezige" respons aanvaardbaar voor de hier besproken toepassingen. De levensduur van de cellen op de agar-plaat moet ook worden opgemerkt-vorige werk heeft aangegeven dat de platen kunnen worden opgeslagen in de koelkast voor maximaal 2 weken, maar de apparaten werken niet erg goed tegen het einde van die tijd frame en daarbuiten.
Een andere overweging is de keus van materiaal dat wordt gebruikt om het fluorescentie signaal te analyseren. Met behulp van een onderzoek rang spectrofotometer met een 96-well plaat lezer maakt de selectie van exacte excitatie en emissie golflengten, die kan verhogen gevoeligheid. Met behulp van dit systeem kunnen de resultaten van maximaal 96 experimenten gelijktijdig worden verzameld. OFFERTE fluorescentie kan ook worden geanalyseerd met behulp van een draagbaar spectrometer systeem. Draagbare instrumenten meestal mogelijk geselecteerde excitatie bands, die al dan niet kan samenvallen met de excitatie maxima van de offerte variant wordt gebruikt. Nochtans, zolang de opwindings golflengte binnen een redelijke waaier van de opwindings maxima is, zal het draagbare instrument over het algemeen (niettemin met een verlies in gevoeligheid) te onderhouden zijn. De kosten van de draagbare systemen is beduidend minder dan de onderzoek rang spectrofotometer, en de portabiliteit kan zeker een voordeel zijn. Op basis van de mogelijke toepassing van de bacterie, kan de analist beslissen of de extra kosten en het verlies van portabiliteit met het spectrofotometer systeem gerechtvaardigd is.
Betekenis met betrekking tot bestaande methoden
Het driedelige MicRoboCop systeem dat in dit werk wordt beschreven, is bedoeld om te worden gebruikt als kwalitatieve, vermoedelijke test voor de aanwezigheid van GSR. Momenteel is de "Gold Standard" evidentiary test voor GSR vereist deskundige analyse door SEM-EDX. SEM-EDX apparatuur is duur en meestal geëxploiteerd door zeer gespecialiseerde analisten. Bovendien, GSR bewijs is zeer variabel in de forensische zaken en vele variabelen bijdragen aan de afzetting van GSR op handen en oppervlakken16. Een vermoedelijke test voor GSR kan nuttig zijn om onderzoekers als het verstrekken van waarschijnlijke oorzaak voor een zoekopdracht van persoon of eigendom. In vergelijking met elektrochemische tests of tests zoals ionen mobiliteits spectroscopie, biedt deze methode eenvoudige, gemakkelijk beschikbare instrumentatie aan die de meeste analytische laboratoria toegang zouden moeten hebben.
Andere toepassingen
De in dit manuscript beschreven apparaten zijn ontworpen om te worden gecombineerd in een driedelige systeem voor de vermoedelijke identificatie van GSR. Elk apparaat in het MicRoboCop-systeem (SbRFP, PbRFP en TNT-offerte) kan echter ook afzonderlijk worden gebruikt om chemische verontreiniging in voedsel-, water-of milieumonsters te detecteren. Uit eerdere werkzaamheden is gebleken dat het TNT-offerte apparaat kan worden gebruikt als een in-situ sensor voor landmijnen13,17. Resultaten gepresenteerd hier en in onze vorige werk10 hebben aangetoond dat de SbRFP en PbRFP apparaten kunnen detecteren concentraties laag genoeg om te concurreren duurdere en geavanceerde apparatuur, zoals inductief gekoppeld plasma atomaire emissie spectroscopie ( ICP-AES) en atoomabsorptiespectroscopie (AAS). De SbRFP sensor is gevoelig voor arseen en antimoon. Deze apparaten kunnen een goedkope optie voor de analyse van toxische zware metalen verontreiniging.
De synthetische biologie protocol voor de voorbereiding van de e. coli gepresenteerd hier is van toepassing op elk systeem dat gebruik maakt van standaard synthetische biologie genetische onderdelen te synthetiseren E. coli dat uitdrukkelijke offerte. De analytische methode is van toepassing op elk systeem dat uitdrukt offerte, en dus kan worden gebruikt om een bacteriële biosensor systeem dat is gemaakt met behulp van synthetische biologie methoden te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere conflicten van belang te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de studenten te erkennen aan de Longwood Universiteit in BIOL 324 (genetica) en de studenten in CHEM 403 (Advanced Chemical Lab problem solving) die betrokken waren bij de initiële voorbereiding en het testen van de antimoon en lood biosensoren. Het idee voor MicRoboCop werd bedacht op de GCAT SynBIO workshop (zomer 2014), die wordt gefinancierd door NSF en Howard Hughes Medical Institute en gehost door de Universiteit van Maryland Baltimore County. De auteurs erkennen ook de financiering ontvangen van Longwood Universiteit Cook-Cole College of Arts and Sciences en de GCAT SynBio alumni Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
