Summary
שיטה להקמת קווי ההתנגדות afatinib מ-ריאה אדנוקרצינומה PC-9 תאים פותחה, תאים עמידים היו מאופיין. התאים עמידים ניתן להשתמש כדי לחקור את הגידול באפידרמיס קולטן גורם טירולה קינאז מעכב-התנגדות מנגנונים, ישים עבור חולים עם סרטן ריאות תא לא קטן.
Abstract
התנגדות נרכש מעכבי היעד המולקולרי היא בעיה חמורה בטיפול בסרטן. סרטן ריאות נשאר הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן ברוב המדינות. גילוי של "מוטציות מנהלי התקן אונגניים", כגון קולטן באפידרמיס גורם גדילה (egfr)-הפעלת מוטציות, ובעקבות פיתוח של סוכנים ממוקדים מולקולריים של egfr טירוצין קינאז מעכבי (tkis) (gefitinib, ארסבה, הטיפול בסרטן ריאות שונה באופן דרמטי בעשורים האחרונים. עם זאת, תרופות אלה עדיין לא יעיל בחולים עם סרטן ריאות תא לא קטן (NSCLC) נושאת Egfr-הפעלת מוטציות. לאחר התנגדות נרכש, ההתקדמות מערכתית של NSCLC נשאר מכשול משמעותי בטיפול בחולים עם EGFR מוטציה חיובית NSCLC. כאן, אנו מציגים שיטת הסלמה מינון חורג להקמת שלושה עצמאיים afatinib שנרכשו קווי תאים מתוך nsclc PC-9 תאים מחסה egfr-הפעלת מוטציות של 15 בסיס זוג מחיקות ב egfr אקסון 19. שיטות לאפיון שלושת קווי הצינוק העצמאיים של afatinib מוצגים לזמן קצר. מנגנוני ההתנגדות הנרכשים ל-EGFR TKIs הם הטרוגנית. לכן, יש לבדוק קווי תאים מרובים עם עמידות בפני EGFR-TKIs. 10 עד 12 חודשים נדרשים להשיג קווי תאים עם התנגדות נרכש באמצעות הגישה הזאת הסלמה מינון חורג. הגילוי של מנגנוני ההתנגדות החדשניים יתרום לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות ובטוחות יותר.
Introduction
חמש טירולך קינאז מעכבי, מיקוד קולטן באפידרמיס גורם הצמיחה (EGFR), כולל gefitinib, erlotinib, החוליה, דקאומוטיניב, ו osimertinib זמינים כרגע לטיפול בחולים עם מוטציה EGFR-חיובי התא לא קטן סרטן (NSCLC). במהלך העשור האחרון, טיפולים עבור חולים כאלה עברו התפתחות דרמטית עם התגלית של EGFR פוטנציאל חדש-TKIs. בין חולים עם אדנוקרצינומה ריאה, מוטציות סומתיות ב Egfr מזוהים כ 50% של אסיה ו 15% של החולים הקווקזי1. המוטציות הנפוצות ביותר ב-egfr הן מוטציה של L858R point ב-egfr אקסון 21 ו -15 בסיס זוג (bp) מחיקות ב-egfr אקסון 192. ב-EGFR מוטציה-חולים חיוביים עם NSCLC, EGFR-TKIs לשפר את שיעורי התגובה ואת התוצאות הקליניות בהשוואה לתקן הקודם של פלטינה כימותרפיה3.
Gefitinib ו טרסבה היו מעכבי המולקולה הראשונה קטנה ומכונים בדרך כלל egfr tkis הדור הראשון. אלה EGFR TKIs לחסום את פעילות טירוצין קינאז על ידי מתחרה עם ATP וכריכה הפיכה הפיך לאתרי כריכת ATP4. Afatinib הוא הדור השני EGFR TKI, כי מאוגד הפיך והרב נקשר לתחום טירוצין קינאז של EGFR והוא מאופיין מעכבי משפחה הפאן-אנושיים5.
למרות התועלת הרבה של טיפולים אלה בחולים עם NSCLC, התנגדות נרכש הוא בלתי נמנע. מנגנון ההתנגדות השכיח ביותר נגד הדור הראשון והשני של egfr tkis הוא הופעתה של המוטציה T790M ב-egfr אקסון 20, אשר קיים 50-70% של דגימות הגידול6,7,8. מנגנוני התנגדות אחרים כוללים אותות עוקפים (כדי MET, IGF1R, ו HER2), טרנספורמציה לסרטן ריאות תא קטן, ו אינדוקציה של המעבר אפיתל-to-mesenchal, אשר מתרחשים מראש קלינית קלינית. מנגנוני ההתנגדות ל-EGFR TKIs הם הטרוגנית. על-ידי זיהוי מנגנוני ההתנגדות החדשניים במחקרים קדם-קליניים, ייתכן שניתן יהיה לפתח therapeutics הרומן כדי להתגבר על התנגדות. טיפולים אופטימליים הרצף המקסם את התועלת הקלינית לחולים חייבים לשקול את מנגנוני ההתנגדות המטרה הטיפולית.
זה הכרחי לבחור את קו התא ההורה הנכון, כפי שהוא בסיס של כל הניסויים הבאים. אסטרטגיות הבחירה מתחילות ברלוונטיות קלינית; יש צורך לבחור כימותרפיה וקרינה קו התא נאיבי. הטיפול כימותרפיות הקודם ו/או רדיוטיבי עלול לגרום לשינוי של מסלולים התנגדות ושינויים של הביטוי של סמנים התנגדות התרופה. במחקר זה, PC-9 תאים, נשיאת 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19, מועסקים להקמת התנגדות נרכש afatinib. קו תא זה נגזר מחולה NSCLC יפני, אשר לא קיבל כימותרפיה והקרנות קודמות.
מכיוון afatinib מנוהל דרך הפה על בסיס יומי, רציף טיפול מחוץ למים, שבו התאים הם מתורבתים כל הזמן בנוכחות afatinib יהיה רלוונטי קלינית. המינון של תרופות המשמשות בשלבים השונים של הניסוי חייב להיות ממוטב עבור קו התא הורים נבחר. ניתן להשתמש באפשרות לקביעת טווח תרופות מתאים, שאמור להיות דומה למידע הפרמקוקינטי של הסם.
בכל תהליך הבחירה, כל אוכלוסיית התאים נשמרת כקבוצה אחת; לא נעשה שימוש בשכפול או בשיטות הפרדה אחרות. התאים הראשונים נחשפים ברציפות לרמה נמוכה של הסם. לאחר מכן, לאחר שהתאים להסתגל לצמוח בנוכחות הסם, המינון של הסם עלה לאט למינון האופטימלי הסופי של התרופה10,11. לחילופין, ניתן להשתמש בטיפול בסמים או במוטגנזה לצורך בחירת תאי התנגדות, המבוצעים גם לפני טיפול תרופתי 12,13. למרבה הצער, מקרים בהם התנגדות לסמים אינה מצליחה להתפתח בדרך כלל לא מדווחת. אסטרטגיות הבחירה מפותחות במטרה לנסות לחקות את התנאים של חולי סרטן לבנייה מחדש של ההתנגדות הרלוונטית קלינית. לעיתים, כדי לזהות שינויים מולקולריים הקשורים במנגנונים של עמידות לסמים, נעשה שימוש בריכוז סמים גבוה. המודל הזה הופך להיות. פחות רלוונטי מבחינה קלינית
כאן, אנו מתארים שיטה להקמת שלושה קווי afatinib עצמאיים עמידים מפני PC -9 תאים מחסה 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19, כמו גם את האפיון הראשוני של קווי התאים העמידים afatinib.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת שלושה מחשבים עצמאיים Afatinib עמידים בפני 9 שורות תאים
- קביעת ריכוז החשיפה הראשונית של afatinib עבור מחשב-9 תאים באמצעות 3-(4, 5-diמתילטיק-2-yl)-2, 5-דיפנילטיזויום ברומיד (MTT) הגדרה
- תרבות PC-9 תאים בינונית צמיחה המכילה סרום של שור עוברי (10%), פניצילין (100 U/mL), ו סטרפטומיצין (100 μg/mL) בתרבות התא שטופלו בצלחת 10% בחממה 5% CO2 ב 37 ° c.
- השהה מחדש את PC-9 תאים בגודל 4 x 104 תאים/mL בתווך צמיחה ולאחר מכן הזרע ב 50 μl/טוב ב 96-ובכן microplate. הריכוז הסופי של תאים הוא 2.0 x 103 תאים/50 μl/ובכן. דגירה לילה בחממה 5% CO2 ב 37 ° c.
- הוסף 50 μL של הפתרון afatinib בריכוזים שונים: 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, ו -20 μM לבארות המכילות את מדיום הצמיחה (50 μL). אמצעי האחסון הסופי וריכוזי afatinib הם 100 μL ו-0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, ו-10 μM, בהתאמה.
- מודאת 96-צלחת לוח עבור 96 h בחממה 5% CO2 ב 37 ° c.
- להוסיף 15 μL של פתרון לצבוע ( לראות את הטבלה של חומרים) לכל טוב ומארג עבור 4 h בחממה 5% CO2 ב 37 ° c, ולאחר מכן להוסיף 100 μl של מסיסות/stop-פתרון (ראה טבלת חומרים) על כל היטב ומארג לילה ב 5% co < c10 > 2 חממה ב 37 ° c.
- מדוד את הדחיסות האופטית ב 570 ננומטר (OD570) באמצעות קורא מיקרולוח (ראה טבלת חומרים). הכינו 6-12 משכפל וחזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים.
- השתמש בתוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים) כדי להתוות באופן גרפי נתונים אלה כגרף למחצה ולחשב את ערך ה-IC50 , שהוא ריכוז התרופה המפחית את התגובה ל 50% מהמקסימום (ראה טבלת חומרים ).
- חשיפה רציפה של מחשב-9 תאים ל-EGFR-TKI בלתי הפיך, afatinib, על ידי הסלמה מינון החמיר בשלוש מנות עצמאיות 10 ס מ
- התרבות PC-9 תאים במנות p100 המכיל 10 מ ל של בינוני גדילה. כאשר התאים PC-9 להגיע לשלב משנה-confluent, להעביר 1 mL של השעיית התא לשלוש מנות p100 חדש, עם 9 מ ל של מדיום הצמיחה. 1:10 מדולל PC-9 תאים להפוך sub-confluent ב 3-4 ימים, עם מספר טלפון של כ 4-5 x 105 תאים/mL.
- ביום שלמחרת, הוסיפו 1/10 של הערך ה-IC50 של afatinib לכל אחת משלוש המנות הp100.
הערה: Afatinib הוא מחדש ב DMSO ב ריכוזי מניות של 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 מ"מ, ו 5 מ"מ. 1 עד 10 μL של afatinib-פתרון מתווסף לתוך 10 מ ל של מדיום צמיחה בתרבות, לפי ריכוזי הסופי הנדרשים. - כאשר התאים בתוך afatinib מכיל מנות p100 להיות sub-confluent, מערבבים היטב על ידי שאיפה עם פיפטה 1 מ ל ולהוסיף 1 מ ל של השעיית התא ל 9 מ ל של מדיום צמיחה טריים בצלחת p100 חדשה. הבא, להוסיף 10-20% ריכוזים גבוהים יותר של afatinib לתרבות החדשה.
- הגדל את הריכוז afatinib של 0.1 nM כדי 1 μM במדיום על ידי הסלמה המינון הפסיעה עם הריכוז afatinib גדל על ידי 10-20% בכל שלב על פני תקופה של 10-12 חודשים.
הערה: כאשר הריכוז afatinib מתקרב הערך IC50 , צמיחת התא הופך להיות איטי למדי. אם התאים מתחלקים 1:9, הם לא יכולים לגדול, כמו תאים אלה נהרגים על ידי ריכוזים גבוהים יותר של afatinib. לכן, בריכוזים גבוהים afanitib, התאים ניתן לפצל ביחס של 1:2. התאים העמידים ביותר גדלו ב afatinib-הכלול בינוני עבור 3-14 ימים, והמדיום לא השתנה עד התאים העמידים הדרושים כדי להיות passaged. - תרבות התאים העמידים afatinib עבור 2-3 חודשים ב 1 μM afatinib המכיל בינונית צמיחה. בריכוז afatinib של 1 μM, 10-12 חודשים נדרשים לפתח עמידות afatinib במודל זה. בצע את השיטת MTT כדי לוודא שהתאים עמידים בפני afatinib. שלושה קווי התנגדות afatinib הוקמה באופן עצמאי נקראו בשם AFR1, AFR2, ו AFR3.
2. אפיון של שלושה תאים בלתי תלויים
- קביעת עקומת הצמיחה של הורים PC-9 תאים והקמת תאים afatinib עמידים
- התרבות PC-9, AFR1, AFR2, ו AFR3 תאים בינוני בצמיחה של 5% CO2 חממה ב 37 ° c.
- השהה מחדש את התאים בגודל 5 x 103 תאים/mL עם בינוני גדילה, ואת הזרע 100 μl/גם לתוך 96-ובכן microplate, כך הריכוז הסופי של תאים הוא 500 תאים/100 μl/ובכן.
הערה: שיטת MTT מבוצעת כדי למדוד את ה-OD570 ערכים ב -0, 1, 2, 3, 5, ו -7 ימים. 6 96-מיקרופלטות נדרשות בכל יום. - בצע את השיטת MTT כל 24 שעות ולאחר מכן בימים 0, 1, 2, 3, 5, ו -7. למדוד את ה-OD570 ערכים ולהכין 6-12 משכפל; חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים, והתווה באופן גרפי את התוצאות באמצעות תוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים).
- זיהוי של שינויים DNA גנומית ב-EGFR על ידי ה-PCR בזמן אמת
הערה: Afatinib הוא מדכא קטן מולקולה המכוונת EGFR טירולך קינאז. מצב ביטוי EGFR נקבע ברמות ה-DNA והחלבון.- דנ א גנומית מבודדת באמצעות ערכת טיהור DNA (ראה טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן. למדוד את הריכוז של ה-DNA גנומית מבודדת עם ספקטרוסקופיה (לראות את שולחן החומרים) ולהתאים את כל דגימות ה-DNA גנומית ל 25 Ng/μl.
- הגבר 50 ng של דנ א גנומית, אשר שווה ל 2 μL של 25 ng/μL מניות, באמצעות מיקס מאסטר ירוק SYBR (לראות את הטבלה חומרים) ולנתח את התוצאות באמצעות מערכת מבוססת-על-ידי-פלואורסצנטית-PCR לזיהוי (ראה טבלת חומרים).
הערה: תנאי האופניים של ה-PCR החלו עם צעד התחלתי הראשוני ב 95 ° c עבור 20 s, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° c הדנטורציה עבור 3 s, 60 ° צלזיוס עבור 30 s. מערכות התחל הספציפיות הן כדלקמן: egfr F: 5 ′-כמוסות-3 ′, R: 5 ′-ctggaatgaggtgegeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeet שורת גן של נורמליזציה-1 F: 5 ′-AAAGCCGCTACGG-3 ′, R: 5 ′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3 ′.
- הערכת ההשפעה של שינויים בחלבונים ברמת ה-EGFR על-ידי ניתוח כתמי אבן מערבית
- לטפל בתאים עם afatinib ברציפות לפני ניסויים עבור 24 h. לשטוף את PC-9, AFR1, AFR2, ו AFR3 תאים פעמיים עם PBS ולאחר מכן זרע אותם במדיית הצמיחה ללא afatinib. לשטוף את PC-9, AFR1, AFR2, ו AFR3 תאים פעמיים עם 5 מ ל של הקרח קר PBS.
- Lyse התאים במאגר ריפה המכיל 1% מעכב פרוטאז קוקטייל (ראה טבלת חומרים) ו פוספספטאז קוקטייל מעכבי II ו III (לראות את לוח החומרים) ואת הפתרון הזה ב 4 ° c עבור 30 דקות. צנטריפוגה את lysates עבור 10 דקות ב 100 x ו 4 ° צ' ולאסוף את lysates נקי.
- קביעת ריכוזי חלבון באמצעות שיטת החומצה הבינוקסימית (ראה טבלת חומרים), להתאים את כל דגימות חלבונים כדי 0.5 או 1 μg/μl באמצעות מאגר לדוגמה 4x (500 mM TRIS (PH 6.8), 40% גליצרול, 8% sds, 20% H2O, 0.02% ברומאופנול כחול) ו מרתיחים ב 96 ° c עבור 5 דקות. אחסן את דגימות החלבון ב-80 ° צ' עד שמתבצע ניתוח כתמי האבן המערבי.
- הפרדה כמויות שוות של דגימות חלבון, בעדיפות 20-30 μL, על ידי 8% SDS-עמוד ולהעביר את החלבונים לקרום polyvinylidene (PVDF).
הערה: Dodecyl גופרתי-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) משמשת בדרך כלל במעבדה להפרדת החלבונים המבוססים על המשקל המולקולרי שלהם.- לנקות צלחות זכוכית עם אתנול ולהרכיב את צלחת הזכוכית מרווחים. הכינו 8% פולי אקרילמיד ג'ל המכיל 1.5 M טריס-HCl, pH 8.8, 40% Bis-אקרילאמיד, 10% SDS, 10% APS ו-TEMED. . לטמפרטורה של 30 דקות בטמפרטורת החדר
- לאחר מכן, להכין את הערימה ג'ל המכיל 0.5 M טריס-HCl, pH 6.8, 40% bis-אקרילאמיד, 10% SDS, 10% APS, ו TEMED. הוסיפו את התמיסה לערימה, הכניסו את המסרק, ופולימו את הג ל20-30 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הג במנגנון האלקטרופורזה וממלאים את המיכל עם מאגר פועל (0.25 M Tris, 1.92 M גליצין, ו 1% SDS). טען כמות שווה של דגימות חלבון (20-30 μL) ולהפעיל את ג'ל ב 180 V. לעצור את האלקטרופורזה פעם חזית הצבע זורם מתוך הג, לאחר כ 60 דקות.
- לשטוף את הג עבור 1-2 דקות עם TBST ולאחר מכן להעביר את החלבונים על קרום PVDF על ידי חצי יבש למחצה (ראה טבלת חומרים) עבור 1.5 h בזרם קבוע של 300 mA.
- לחסום את הקרומים עם 5% של חלב יבש ללא שומן (ראה טבלת חומרים) מדולל עם הפתרון tbst (ראה טבלת חומרים) עבור 1 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לחקור את הקרומים עם אנטי egfr, anti-פוספהו-egfr (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, אנטי-MET, ו אנטי actin נוגדנים (מדולל 1:3000 ב TBST) (ראה טבלת חומרים) ב 4 ° c הלילה.
- רוחצים את הקרומים בעזרת TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות, ולאחר מכן חושפים את הקרומים לנוגדן המשני (מדולל 1:200 ברחוב TBST) עבור 1-1.5 h בטמפרטורת החדר. רוחצים את הקרומים חמש פעמים עם TBST במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, חושפים אותם לפתרון ECL (ראו טבלת חומרים), ודמיינו את האותות באמצעות סרטים.
- ניתוח מוטציות EGFR לפי רצף
- ההגביר DNA גנומית באמצעות התחל ספציפיים עבור EGFR exons 19-21. תנאי הרכיבה של ה-PCR מתחילים בצעד התחלתי בשלב הראשון ב-94 ° c עבור 1 דקות, ואחריו 30 מחזורים של דנטורציה ב-98 ° c במשך 10 ס מ, מרועננים ב-55 ° c עבור 30, והארכה ב-72 ° c עבור 1 דקות.
הערה: התחל הספציפי עבור egfr אקסון 19: F: 5 ′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3 ′ R: 5 ′-catagaaeteeateeacg-3 ′, אקסון 20: F: 5 ′-ccatggatgcat_caaca-3 ′, R: 5 ′ '-catatccacגנול-3 ′, ו אקסון 21: F: 5 ′-הגנה על-ידי שלושה ′- מוסך-3 ′. - לטהר את מוצרי ה-PCR המוגבר באמצעות ערכת טיהור PCR (ראה טבלת חומרים) והסדרת הגברה.
- ההגביר DNA גנומית באמצעות התחל ספציפיים עבור EGFR exons 19-21. תנאי הרכיבה של ה-PCR מתחילים בצעד התחלתי בשלב הראשון ב-94 ° c עבור 1 דקות, ואחריו 30 מחזורים של דנטורציה ב-98 ° c במשך 10 ס מ, מרועננים ב-55 ° c עבור 30, והארכה ב-72 ° c עבור 1 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הסכימה להקמת שלושה קווי תא התנגדות afatinib מתוך PC-9 תאים באמצעות מינון צעד-הסלמה ההליך מוצג באיור 1. איור 2 מראה ירידה התפשטות התא של תאים pc-9 הורים כמו ריכוז afatinib הוא גדל, המציין כי התאים pc -9 רגישים לחשיפה afatinib. איור 3 מראה התנגדות afatinib של שלושה קווי התא. אף אחד משלושת קווי התאים העמידים בפני afatinib, AFR1, AFR2 וAFR3, הראו דיכוי של הפצת תאים תחת חשיפה afatinib. איור 4 מציג את עקומות הפצת התאים עבור תאים PC-9, AFR1, AFR2 וAFR3. שלושת הקווים העמידים בפני afatinib הציגו צמיחה איטית יותר באופן משמעותי מאשר תאי PC-9 של הורים. איור 5 מציג את רמות הביטוי של Egfr GDNA ב PC-9 ואת שלושת התאים העמידים afatinib, אשר מציינים כי התאים העמידים afatinib הביעו רמות גבוהות באופן משמעותי של Egfr gdna מאשר הורים PC-9 תאים. איור 6 מראה את ביטוי החלבון של egfr ב PC-9 ו afatinib-תאים עמידים. ברמות דומות gDNA ביטוי, ביטוי חלבון EGFR היה גבוה יותר תאים עמידים מאשר בתאי PC-9 הורים. איור 7 מראה כי התוצאות ברצף של egfr exons 19 ו 20 ב PC-9, AFR1, AFR2, ו AFR3 תאים. PC-9 תאים הראה 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19 ופראי-סוג egfr ב אקסון 20. עם זאת, תאים AFR1 ו AFR2 הציגו הגברה של מסוג פראי egfr אקסון 19. תאים AFR3 הכיל 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19 כמו PC-9 תאים, אבל מוטציה הנקודה T790M נצפתה egfr אקסון 20.
איור 1 : סכימת התהליך המשמש לקביעת שלושה קווי תא עמידים בפני afatinib מ-PC-9. ראשון, PC-9 תאים הופרדו לשלוש מנות p100 ונחשפו afatinib ב 1/10 של IC50 ערך. לאחר מכן, ריכוזי afatinib במדיום הצמיחה גדלו על ידי הסלמה מינון מחמיר ל 1 μM. לאחר 10-12 חודשים, שלושה קווים עצמאיים afatinib עמידים בפני הוקמו ונקרא AFR1, AFR2, ו AFR3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הורים PC-9 תאים רגישים לגבי EGFR TKI בלתי הפיך, afatinib. התאים שופרה לתוך מיקרוצלחת 96-ובכן ב 2 x 103 תאים/טוב/50 μl של גידול בינוני, ו-preדגירה לילה. התאים טופלו עם הריכוזים המצוין של afatinib עבור 96 h. בוצע שיטת MTT, OD570 ערכים נמדדו באמצעות קורא מיקרולוח (ראה טבלת חומרים) ומבוטא כאחוז מהערך שהושג עבור תאי הבקרה. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של ערכים מ 6-12 שכפול בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : התאים הקבועים הציגו עמידות בפני EGFR TKI בלתי הפיך, afatinib. תאים שופרה לתוך מיקרוצלחת 96-ובכן ב 2 x 103 תאים/טוב/50 μl של גידול בינוני ו טרום מודעד בן לילה. התאים טופלו עם הריכוזים המצוין של afatinib עבור 96 h. בוצע שיטת MTT, OD570 ערכים נמדדו באמצעות קורא מיקרולוח (ראה טבלת חומרים) ומבוטא כאחוז מהערך שהושג עבור תאי הבקרה. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של ערכים מ 6-12 שכפול בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : קווי התאים העמידים Afatinib הראו התפשטות איטית יותר מאשר הורים PC-9 תאים. תאים שופרה לתוך 96-ובכן מיקרופלטות ב 5 x 102 תאים/100 μl/ובכן. שיטת MTT בוצעה, ו-OD570 ערכים נמדדו בימים 0, 1, 2, 3, 5, ו -7 באמצעות קורא מיקרופלייט (ראה טבלת חומרים) והביע אחוז מהערך שהתקבל עבור תאי הבקרה. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של ערכים מ 6-12 שכפול בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : מספר העתק ג'ין של EGFR היה מוגבה בתאים afatinib עמידים. העלאת הגובה של EGFR מספר העתק נמדד על ידי ה-PCR כמותי של DNA גנומית מבודדים מ PC-9, AFR1, AFR2, ו AFR3 תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : הרמה הבזתית של חלבון EGFR הוגדלה בתאים עמידים afatinib. ניתוח כתמי מערבי של פוספהו-EGFR, EGFR, HER2, HER3, ו-MET ביטוי ב PC-9, AFR1, AFR2, ו AFR3 תאים. β-Actin שימש בקרת העמסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7 : רצף דנ א קורא ב-EGFR exons 19 ו -20. DNA גנומית של PC-9, AFR1, AFR2, ו AFR3 היה מוגבר עם התחל הספציפי של egfr אקסון 19 ו -21, ומטוהר לרצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, תיארנו שיטה להקמת שלושה קווים עצמאיים afatinib עמידים ומאופיין תאים אלה על ידי השוואה לתאי PC-9 הורים. על ידי חשיפה מינון הסלמה החורגת, ההורים PC-9 תאים רכשה עמידות afatinib לאורך תקופה של 10-12 חודשים. מבחינה קלינית, מנגנוני ההתנגדות של EGFR TKIs הם הטרוגנית, ולכן, לאחר הטיפול הראשוני עם afatinib, PC-9 תאים חולקו שלוש מנות p100 עצמאיות נחשף יותר afatinib. בתחילה, צמיחת תאים לא הואטה באופן משמעותי, אך ככל שריכוז התרופה התקרב לערך ה-IC50 , התפשטות התא הואטה. זהו צעד קריטי להשגת תאים עם התנגדות נרכש מעכבי. התאים מתרבים צריך להיות מפוצל להעביר מנות p100 חדש ביחס של 1:10 או 1:5. כאשר PC-9 תאים היו מתורבתים בצלחת p100, כמה הדבקות נצפתה, אבל רוב התאים גדלו בהשעיה. כאשר הריכוז של afatinib הוגדל, התאים דבק לתחתית התרבות רקמה התייחס כלים. אם רוב התאים הם חסיד, הם יכולים להיות מנותקים עם מגרד התא. הריכוז הסופי של afatinib היה 1 μM, שהוא כ 5 פעמים ריכוז הסרום המקסימלי (Cmax)14. כדי לקבל הבדלים ברורים בין שיבוטים הורים והתנגדות, הריכוז הסופי נקבע להיות גבוה יותר מאשר Cmax.
דאגה אחת רצינית במהלך ההליך הוא זיהום חיידקי, אף על פי RPMI-1640 מכיל פניצילין ו סטרפטומיצין. כדי למנוע זאת, ניתן להכין שתי מנות p100 המכילות בינוני גדילה טרי כאשר התאים מפוצלים. כאשר התאים מגיעים לשלב sub-confluent, התאים במנה אחת p100 יכול להיות מפוצל עוד יותר, בעוד התאים בצלחת p100 האחרים ניתן לאחסן ב-80 ° c ב הקפאה קריוגנית בינונית (ראה טבלת חומרים) כגיבוי, כך שאם קו אחד מזוהם , ניתן להשתמש בשורה המאוחסנת.
זה יהיה קשה לשחזר לחלוטין את הרכישה של התנגדות afatinib בבני אדם באמצעות תרבות התא. הופעתה של מוטציה T790M ב egfr אקסון 20 דווח כגורם הדומיננטי של התנגדות afatinib. בדו ח שלנו, שיבוט עמיד אחד. הכיל את מוטציה T790M11 יתרה מזו, הגידול בAFR1 ובתאי הAFR2, דווח על ידינו ועל קבוצות אחרות15,16. הפסד של מוטציה egfr ולהגדיל בטבע מסוג egfr מדווחים גם בדגימות קליניות מחולים עם התנגדות רכשה egfr-tkis 17,18. לכן, במחקרים מחוץ לגופית של המודל הנוכחי שלנו עשוי לשקף את הפרופילים המולקולריים של דגימות קליניות עם התנגדות נרכש.
זו שיטת הסלמה מינון חורגות נחשב האמין ביותר להשגת שורות תאים עמידים לרכוש. עם זאת, הראשונית מינון גבוה החשיפה afatinib בתאים מתורבתים סביר להניח טוב יותר לשקף את ההשפעות של הטיפול afatinib בחולים עם סרטן, למרות הקמת תאים עמידים קשה יותר. לא רק קווי תאים צפים, כגון PC -9, אך גם קווי תאים מחסיד, כגון HCC827, 11-18 או HCC4006, יכולים להיות מועסקים עבור שיטה זו. זו שיטת הסלמה מינון חורגות גם שימושי עבור הקמת שיבוטים עמידים מעכבי אחרים, באמצעות קווי תאים אחרים, המייצגים סוגים אחרים של סרטן.
חשיפה של תאי הורים לסוכני מוטאריים, כגון n-אתיל-n-ניטרוסוראה, ואחריו מבחר של תאים עמידים afatinib או טיפול אוסימרטיב, דווח כדי לאפשר רכישה מהירה של שיבוטים עמידים 19 ,20. עם זאת, שיטה מלאכותית זו נוטה לגרום לתחליפים בסיסיים מסוימים, כגון GC למעברים AT ו-at לגירסאות של TA. יתר על כן, EGFR TKI אינו סוכן מוטאנמית בחולים עם NSCLC. לכן, שיטת הסלמה המינון החורג היא נציגה יותר מאשר שימוש בסוכני מוטאריים.
למרות EGFR TKIs הם יעילים בתחילה, תאים בסופו של דבר לפתח עמידות לסמים כגון יעד יחיד, מה שמקשה על ריפוי סרטן. מעכבי כי היעד מולקולות מרובות הם ולכן חיוני לפתח. לשם כך, יש צורך להשיג תאים עם עמידות שנרכשו מעכבי רב תכליתי ולהעריך את המנגנונים הבסיסיים התנגדות הסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לחבר במכון לחקר הסרטן המתקדם של מכון המחקר לקבלת הערות מתחשבות ועריכה עבור עזרתם בעריכת השפה האנגלית. עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI (מספר מענק: 16K09590 to T.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
