Summary
Um método para estabelecer linhas de pilha da afatinib-resistência das pilhas do adenocarcinoma do pulmão PC-9 foi desenvolvido, e as pilhas resistentes foram caracterizadas. As células resistentes podem ser usadas para investigar mecanismos de resistência a inibidores da tirosina quinase do receptor de fator de crescimento epidérmico, aplicáveis para pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.
Abstract
A resistência adquirida aos inibidores do alvo molecular é um problema severo na terapia de cancro. O câncer de pulmão continua sendo a principal causa de morte relacionada ao câncer na maioria dos países. A descoberta de "mutações do condutor oncogênico", tais como o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)-ativando mutações, e o desenvolvimento subsequente de agentes moleculares alvejados de inibidores da tirosina quinase de EGFR (tkis) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib) modificaram dramaticamente o tratamento do cancro do pulmão nas últimas décadas. No entanto, essas drogas ainda não são eficazes em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) portadoras de Mutações ativadoras de EGFR. Após a resistência adquirida, a progressão sistémica do NSCLC continua a ser um obstáculo significativo no tratamento de doentes com CPNPC com mutação EGFR positiva. Aqui, nós apresentamos um método Stepwise do escalonamento de dose para estabelecer três linhas de pilha de afatinib-resistentes adquiridas independentes das pilhas de NSCLC PC-9 que abrigando mutações EGFR-ativando de deleções do par 15-base em EGFR exon 19. Os métodos para caracterizar as três linhas de pilha independentes do afatinib-resistência são apresentados momentaneamente. Os mecanismos de resistência adquiridos aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Conseqüentemente, as linhas de pilha múltiplas com resistência adquirida a EGFR-TKIs devem ser examinadas. Dez a doze meses são exigidos para obter as linhas de pilha com resistência adquirida usando esta aproximação Stepwise da escalada de dose. A descoberta de novos mecanismos de resistência adquiridos contribuirá para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais efetivas e seguras.
Introduction
Cinco inibidores da tirosina quinase, que visam o receptor do fator de crescimento epidérmico (TFGE), incluindo Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib estão atualmente disponíveis para o tratamento de doentes com pulmão de células não pequenas com mutação EGFR cancro (NSCLC). Durante a década passada, as terapias para tais pacientes sofreram o desenvolvimento dramático com a descoberta de EGFR-TKIs novo potencial. Entre os pacientes com adenocarcinoma de pulmão, mutações somáticas na Tfge são identificadas em aproximadamente 50% da Ásia e 15% dos pacientes caucasianos1. As mutações mais comuns no EGFR são uma mutação de ponto L858R em exon EGFR 21 e 15 eliminações de par base (BP) no exon EGFR 192. Em doentes com mutação positiva EGFR com NSCLC, o EGFR-TKIs melhora as taxas de resposta e os resultados clínicos em comparação com o padrão anterior de quimioterapia de dúvida de platina3.
Gefitinib e erlotinib foram os primeiros inibidores da molécula pequena aprovados e são geralmente referidos como TKIs de primeira geração de EGFR. Esses EGFR TKIs bloqueiam a atividade da tirosina quinase competindo com ATP e vinculando reversivelmente a sites de associação de ATP4. O afatinib é um EGFR de segunda geração TKI que se liga irreversivelmente e covalentemente ao domínio da tirosina quinase do EGFR e é caracterizado como um inibidor da família EGFR Pan-humano5.
Apesar do benefício dramatical destas terapias nos pacientes com NSCLC, a resistência adquirida é inevitável. O mecanismo de resistência mais comum contra a EGFR tkis de primeira e segunda geração é o surgimento da mutação T790M no EGFR exon 20, que está presente em 50-70% das amostras tumorais6,7,8. Outros mecanismos de resistência incluem sinais de bypass (para MET, IGF1R e HER2), transformação para câncer de pulmão de pequenas células e indução de transição epitelial-mesenquimais, que ocorrem pré-clinicamente e clinicamente9. Os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Ao identificar novos mecanismos de resistência em estudos pré-clínicos, pode ser possível desenvolver terapêutica inovadora para superar a resistência. As terapias ideais da seqüência que maximizam o benefício clínico aos pacientes devem considerar os mecanismos da resistência e o alvo terapêutico.
É imperativo escolher a linha de célula parental direita, porque é a base de todos os experimentos subseqüentes. As estratégias de seleção começam com relevância clínica; é necessário escolher uma linha celular ingênua de quimioterapia e radiação. O tratamento quimioterapêutico e/ou radiativo prévio pode induzir a alteração de vias de resistência e alterações da expressão de marcadores de resistência a fármacos. Neste estudo, as células PC-9, que transportam 15 deleções BP no exon 19 do EGFR, são empregadas para o estabelecimento de resistência adquirida ao afatinib. Esta linha de pilha foi derivada de um paciente japonês de NSCLC, que não recebesse a quimioterapia e a radiação prévia.
Uma vez que o afatinib é administrado por via oral numa base diária, o tratamento in vitro contínuo, onde as células são cultivadas constantemente na presença de afatinib, seria clinicamente relevante. A dose de medicamentos utilizados nas várias etapas do experimento deve ser otimizada para a linha celular parental selecionada. Um ensaio de citotoxicidade pode ser utilizado para determinar uma gama de fármacos adequado, que deve ser comparável à informação farmacocinética da droga.
Ao longo do processo de seleção, toda a população de células é mantida como um único grupo; clonagem ou outros métodos de separação não são utilizados. As células são primeiro continuamente expostos a um baixo nível da droga. Subseqüentemente, depois que as pilhas se adaptarem para crescer na presença da droga, a dose da droga é aumentada lentamente à dose óptima final da medicina10,11. Alternativamente, um pulso de administração de drogas ou mutagenese pode ser usado para a seleção de células de resistência, que também são realizadas antes do tratamento medicamentoso 12,13. Infelizmente, casos em que a resistência à droga não se desenvolve geralmente não são relatados. As estratégias de seleção são desenvolvidas com o objetivo de tentar imitar as condições dos pacientes oncológicos para reconstruir a resistência clinicamente relevante. Às vezes, para identificar alterações moleculares associadas a mecanismos de resistência a fármacos, é utilizada uma alta concentração de fármacos. Este modelo torna-se menos clinicamente relevante.
Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independente afatinib-resistentes das pilhas PC-9 que abrigando deleções de 15 BP no exon 19 de EGFR assim como a caracterização inicial das linhas de pilha afatinib-resistentes.
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Protocol
1. criação de três linhas de células PC-9 resistentes ao Afatinib independentes
- Determinação da concentração inicial de exposição de afatinib para células PC-9 utilizando o ensaio de 3-(4, 5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)
- Cultura PC-9 células em meio de crescimento contendo soro fetal bovino (10%), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) em uma célula-cultura tratada 10-cm prato em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 ° c.
- Resuspend PC-9 células em 4 x 104 células/ml em meio de crescimento e, em seguida, semente em 50 μL/bem em uma microplaca de 96 poços. A concentração final de células é 2,0 x 103 células/50 μl/poço. Incubar durante a noite em uma incubadora de 5% CO2 a 37 ° c.
- Adicionar 50 μL de solução de afatinib em diferentes concentrações: 0, 0, 2, 0, 6, 0, 2, 0, 6, 0,2, 0,6, 2, 6 e 20 μM aos poços contendo o meio de crescimento (50 μL). O volume final e as concentrações de afatinib são 100 μL e 0, 0, 1, 0, 3, 0, 1, 0, 3, 0,1, 0,3, 1, 3 e 10 μM, respetivamente.
- Incubar a placa 96-well para 96 h em uma incubadora de 5% CO2 em 37 ° c.
- Adicionar 15 μL da solução corante (ver tabela de materiais) para cada poço e incubar para 4 h em uma incubadora de 5% co2 a 37 ° c, e depois adicionar 100 μl de solubilização/parar-solução (ver tabela de materiais) para cada poço e incubar durante a noite em um 5% co < C10 > 2 incubadora a 37 ° c.
- Meça a densidade ótica em 570 nanômetro (OD570) usando um leitor do microplate (veja a tabela dos materiais). Prepare 6-12 repetições e repita os experimentos pelo menos três vezes.
- Use software estatístico (ver tabela de materiais) para plotar graficamente esses dados como um gráfico de semi-log e calcular o valor IC50 , que é a concentração de drogas que reduz a resposta a 50% do seu máximo (ver tabela de materiais ).
- Exposição contínua de células PC-9 ao EGFR-TKI irreversível, afatinib, por escalonamento de dose Stepwise em três pratos independentes de 10 cm
- Cultura PC-9 células em pratos P100 contendo 10 mL de meio de crescimento. Quando as células PC-9 atingem a fase subconfluente, transfira 1 mL de suspensão celular para três novos pratos P100, com 9 mL de meio de crescimento. As 1:10 células PC-9 diluídas tornam-se subconfluentes em 3-4 dias, com um número de células de aproximadamente 4-5 x 105 células/ml.
- No dia seguinte, adicione 1/10 do valor de IC50 de afatinib em cada um dos três pratos P100.
Nota: O afatinib é reconstituído em DMSO em concentrações de 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM e 5 mM. 1 a 10 μL de solução de afatinib é adicionado em 10 mL de meio de crescimento na cultura, de acordo com as concentrações finais exigidas. - Quando as células nos pratos P100 contendo afatinib se tornarem subconfluentes, misture bem por aspiração com uma pipeta de 1 mL e adicione 1 mL da suspensão celular a 9 mL de meio de crescimento fresco em um novo prato P100. Em seguida, adicione 10-20% maiores concentrações de afatinib à nova cultura.
- Aumente a concentração de afatinib de 0,1 nM para 1 μM no meio pelo agravamento da dose Stepwise com a concentração de afatinib aumentada em 10-20% em cada passo durante o período de 10-12 meses.
Nota: Quando a concentração de afatinib se aproxima do valor do IC50 , o crescimento celular torna-se bastante lento. Se as células forem divididas em 1:9, elas podem não crescer, pois essas células são mortas por concentrações mais elevadas de afatinib. Conseqüentemente, em umas concentrações mais elevadas do afanitib, as pilhas podem ser rachadas em uma relação de 1:2. As células mais resistentes foram cultivadas em meio contido em afatinib por 3-14 dias, e o meio não foi alterado até que as células resistentes precisassem ser passadas. - Cultura das células resistentes ao afatinib durante 2-3 meses em meio de crescimento contendo 1 μM de afatinib. A uma concentração de afatinib de 1 μM, são necessários 10-12 meses para desenvolver resistência ao afatinib neste modelo. Realize o ensaio MTT para confirmar que as células são resistentes ao afatinib. As três linhagens de células de resistência de afatinib, independentemente estabelecidas, foram denominadas AFR1, AFR2 e AFR3.
2. caracterização de três células independentes Afatinib-resistentes
- Determinação da curva de crescimento das células PC-9 parentais e do estabelecimento de células resistentes ao afatinib
- Cultura as células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 em meio de crescimento em uma incubadora de 5% CO2 a 37 ° c.
- Resuspend as pilhas em 5 x 103 Cells/ml com meio de crescimento, e semente 100 μl/poço em um microplate de 96 poços, tais que a concentração final das pilhas é 500 Cells/100 μl/poço.
Nota: O ensaio MTT é realizado para medir os valores de OD570 em 0, 1, 2, 3, 5 e 7 dias. 6 96-bem microplates são necessários para cada dia. - Realize o ensaio MTT a cada 24 h e, em seguida, nos dias 0, 1, 2, 3, 5 e 7. Meça os valores OD570 e prepare 6-12 repetições; Repita os experimentos pelo menos três vezes, e graficamente plotar os resultados usando um software estatístico (ver tabela de materiais).
- Identificação das alterações do DNA genômica na TFGE por PCR em tempo real
Nota: O afatinib é um inibidor da molécula pequena que tem como alvo a tirosina quinase de EGFR. O status da expressão EGFR é determinado nos níveis de DNA e proteína.- O ADN de Genomic é isolado usando um jogo da purificação do ADN (veja a tabela dos materiais) que segue as instruções do fabricante. Meça a concentração do ADN genomic isolado com um espectrofotômetro (veja a tabela de materiais) e ajuste todas as amostras genomic do ADN a 25 ng/μl.
- Amplificar 50 ng de DNA genómico, o que equivale a 2 μL dos estoques de 25 ng/μL, usando uma mistura Master SYBR Green (ver tabela de materiais) e analisar os resultados usando um sistema de detecção de RT-PCR baseado em fluorescência (ver tabela de materiais).
Nota: As condições de ciclagem do PCR começaram com uma etapa inicial da desnaturação em 95 ° c por 20 s, seguidas por 40 ciclos da desnaturação de 95 ° c para 3 s, 60 ° c que recozimento para 30 s. Os conjuntos de primers específicos são os seguintes: EGFR F: 5 ′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3 ′, R: 5 ′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3 ′. Normalização gene linha-1 F: 5 ′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3 ′, R: 5 ′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3 ′.
- Avaliação do efeito de alterações proteicas no nível de EGFR pela análise Western blot
- Trate as células com afatinib continuamente antes de experimentos para 24 h. Lave as células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 duas vezes com PBS e, em seguida, semeá-las em meios de crescimento sem afatinib. Lave as células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3 duas vezes com 5 mL de PBS gelada.
- Lyse as pilhas no tampão de RIPA que contem o cocktail do inibidor de protease de 1% (veja a tabela dos materiais) e o cocktail II e III do inibidor da fosfatase (veja a tabela dos materiais) e incubar esta solução em 4 ° c por 30 minutos. centrifugar os lisados durante 10 min a 100 x g e 4 ° c e recolher os lisados limpos.
- Determinar as concentrações de proteínas utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (ver tabela de materiais), ajustar todas as amostras de proteínas para 0,5 ou 1 μg/μl utilizando um tampão de amostra 4x (500 mm tris (pH 6,8) 40, 1, 8% glicerol, 8% SDS, 20% H2O, 0, 2% bromofenol azul) e ferver a 96 ° c por 5 min. Armazene estas amostras da proteína em-80 ° c até que a análise ocidental do borrão esteja executada.
- Separe as quantidades iguais de amostras da proteína, preferivelmente 20-30 μL, pela SDS-Página de 8% e transfira as proteínas a uma membrana do fluoreto do polyvinylidene (PVDF).
Nota: A electroforese do gel do Dodecil sulfato-Polyacrylamide do sódio (SDS-PAGE) é usada geralmente no laboratório para a separação das proteínas baseadas em seu peso molecular.- Limpe as placas de vidro com etanol e monte a placa de vidro e os espaçadores. Prepare 8% de gel de poli-acrilamida contendo 1,5 M de Tris-HCl, pH 8,8, 40% bis-acrilamida, 10% SDS, 10% APS e TEMED. Polimerize por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Posteriormente, prepare um gel de empilhamento contendo 0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-acrilamida, 10% SDS, 10% APS e TEMED. Adicione a solução de gel de empilhamento, insira o pente e polimerize o gel por 20-30 min à temperatura ambiente.
- Coloque os géis no aparelho de eletroforese e encha o tanque com tampão de corrida (0,25 M Tris, 1,92 M de glicina e 1% SDS). Carregue a quantidade igual de amostras da proteína (20-30 μL) e funcione o gel em 180 V. pare a electroforese uma vez que a parte dianteira do corante flui fora do gel, após aproximadamente 60 minutos.
- Lave o gel por 1-2 min com TBST e, em seguida, transfira as proteínas para uma membrana de PVDF por blotting semiseco (ver tabela de materiais) para 1,5 h a uma corrente constante de 300 ma.
- Bloqueie as membranas com 5% de leite seco não gordo (ver tabela de materiais) diluída com a solução TBST (ver tabela de materiais) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, sonda as membranas com anti-EGFR, anti-fosho-EGFR (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, anti-MET, e anti-Actin anticorpos (diluído 1:3000 em TBST) (ver tabela de materiais) a 4 ° c durante a noite.
- Lave as membranas com TBST três vezes por 10 min e, em seguida, expor as membranas para o anticorpo secundário (diluído 1:200 em TBST) para 1-1.5 h à temperatura ambiente. Lave as membranas cinco vezes com TBST durante 10 min à temperatura ambiente, exponha-as à solução ECL (ver tabela de materiais) e visualize os sinais utilizando filmes.
- Análise das mutações do EGFR por sequenciamento
- Amplificar o DNA genómico usando primers específicos para exões EGFR 19-21. As condições de ciclagem do PCR começam com uma etapa inicial da desnaturação em 94 ° c por 1 minuto, seguidas por 30 ciclos da desnaturação em 98 ° c para 10 s, recozimento a 55 ° c para 30 s, e extensão em 72 ° c por 1 minuto.
Nota: Os primers específicos para EGFR exon 19: F: 5 ′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3 ′ R: 5 ′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3 ′, eXoN 20: F: 5 ′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3 ′, R: 5 ′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3 ′, e exon 21: F: 5 ′-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3 ′, R: 5 ′- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3 ′. - Purify os produtos amplificados do PCR usando um jogo da purificação do PCR (veja a tabela dos materiais) e sequencia os amplicons.
- Amplificar o DNA genómico usando primers específicos para exões EGFR 19-21. As condições de ciclagem do PCR começam com uma etapa inicial da desnaturação em 94 ° c por 1 minuto, seguidas por 30 ciclos da desnaturação em 98 ° c para 10 s, recozimento a 55 ° c para 30 s, e extensão em 72 ° c por 1 minuto.
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Representative Results
O esquema para estabelecer três linhas celulares de resistência à afatinib de células PC-9 usando um procedimento de escalonamento de dose Stepwise é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra uma diminuição da proliferação celular de células PC-9 parentais, pois a concentração de afatinib é aumentada, indicando que as células PC-9 são sensíveis à exposição ao afatinib. A Figura 3 mostra a resistência à afatinib das três linhagens celulares. Nenhuma das três linhagens celulares resistentes ao afatinib, AFR1, AFR2 e AFR3, demonstrou supressão da proliferação celular exposição ao afatinib. A Figura 4 mostra as curvas de proliferação de células para as células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3. As três linhas celulares resistentes ao afatinib exibiram crescimento significativamente mais lento do que as células PC-9 dos pais. A Figura 5 mostra os níveis de expressão de TFG gDNA no PC-9 e as três células resistentes ao afatinib, que indicam que as células resistentes ao afatinib expressaram níveis significativamente mais elevados de TFG gDNA do que as células PC-9 dos pais. A Figura 6 mostra a expressão protéica de EGFR nas células PC-9 e afatinib-resistentes. Em níveis de expressão comparáveis de gDNA, a expressão da proteína de EGFR era mais elevada em pilhas resistentes do que em pilhas do PC-9 parental. A Figura 7 mostra que os resultados de sequenciamento dos exons 19 e 20 do EGFR nas células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3. As pilhas PC-9 mostraram os exclusões de 15 BP no exon 19 de EGFR e o selvagem-tipo EGFR em exon 20. Entretanto, as pilhas AFR1 e AFR2 exibiram a amplificação do selvagem-tipo EGFR exon 19. As células AFR3 continham 15 deleções de PA no exon 19 do EGFR como nas células PC-9, mas a mutação de ponto T790M foi observada em EGFR exon 20.
Figura 1 : Esquema do processo utilizado para estabelecer três linhas celulares resistentes ao afatinib do PC-9. Primeiramente, as pilhas PC-9 foram separadas em três pratos P100 e expor ao afatinib em 1/10 do valor do CI50 . Em seguida, as concentrações de afatinib no meio de crescimento foram aumentadas pelo escalonamento de dose Stepwise para 1 μM. Após 10-12 meses, foram estabelecidas três linhagens celulares resistentes à afatinib independentes e denominadas AFR1, AFR2 e AFR3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : As células PC-9 dos pais são sensíveis à EGFR TKI irreversível, afatinib. As células foram semeadas em uma microplaca de 96 poços em 2 x 103 células/poço/50 μL de meio de crescimento e pré-incubados durante a noite. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de afatinib para 96 h. Um ensaio de MTT foi realizado, os valores de OD570 foram medidos utilizando-se um leitor de microplacas (ver tabela de materiais) e expresso em percentagem do valor obtido para as células de controlo. Os dados são apresentados como média ± SEM de valores de 6-12 replicam poços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : As células estabelecidas apresentaram resistência à EGFR TKI irreversível, afatinib. As células foram semeadas em uma microplaca de 96 poços em 2 x 103 células/poço/50 μL de meio de crescimento e pré-incubados durante a noite. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de afatinib para 96 h. Um ensaio de MTT foi realizado, os valores de OD570 foram medidos utilizando-se um leitor de microplacas (ver tabela de materiais) e expresso em percentagem do valor obtido para as células de controlo. Os dados são apresentados como média ± SEM de valores de 6-12 replicam poços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : As linhas celulares resistentes ao Afatinib mostraram proliferação mais lenta do que as células PC-9 dos pais. As células foram semeadas em microplacas de 96 poços em 5 x 102 células/100 μl/poço. O teste de MTT foi executado, e os valores do OD570 foram medidos nos dias 0, 1, 2, 3, 5, e 7 usando um leitor do microplate (veja a tabela de materiais) e expressado como uma porcentagem do valor obtido para as pilhas de controle. Os dados são apresentados como média ± SEM de valores de 6-12 replicam poços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : O número da cópia do gene de EGFR era elevado em pilhas afatinib-resistentes. A elevação do número da cópia do gene de EGFR foi medida pela PCR quantitativa do ADN genomic isolado das pilhas de PC-9, de AFR1, de AFR2, e de AFR3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : O nível basal da proteína EGFR foi aumentado em células resistentes ao afatinib. Análise de Western blot de fosho-EGFR, EGFR, HER2, HER3, e expressão MET em células PC-9, AFR1, AFR2 e AFR3. a β-actina foi utilizada como controle de carga. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : A seqüência do ADN lê em exons 19 e 20 de EGFR. O ADN de Genomic de PC-9, de AFR1, de AFR2, e de AFR3 foi amplificado com os primers específicos para exon 19 e 21 de EGFR, e purified para arranjar em seqüência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independentes do afatinib-resistentes e caracterizamos estas pilhas por comparação às pilhas PC-9 parentais. Por exposição Stepwise da escalada de dose, as pilhas PC-9 parentais adquiriram a resistência ao afatinib durante um período de 10-12 meses. Clinicamente, os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos e, portanto, após o tratamento inicial com afatinib, as células PC-9 foram divididas em três pratos P100 independentes e expostos ainda mais ao afatinib. Inicialmente, o crescimento celular não foi significativamente retardado, mas como a concentração de drogas abordou o valor de IC50 , a proliferação celular foi retardada. Este é um passo crítico para a obtenção de células com resistência adquirida aos inibidores. As células proliferantes devem ser divididas e transferidas para novos pratos P100 em uma proporção de 1:10 ou 1:5. Quando as células PC-9 foram cultivadas em um prato P100, observou-se alguma aderência, mas a maioria das células cresceu em suspensão. À medida que a concentração de afatinib foi aumentada, as células aderiram ao fundo da cultura dos tecidos tratados pratos. Se a maioria das células são aderentes, eles podem ser destacados com um raspador de células. A concentração final de afatinib foi de 1 μM, que é cerca de 5 vezes a concentração sérica máxima (Cmáx.)14. Para obter diferenças claras entre os clones dos pais e da resistência, a concentração final foi ajustada para ser maior que Cmáx.
Uma séria preocupação durante o procedimento é a contaminação bacteriana, embora o RPMI-1640 contenha penicilina e estreptomicina. Para evitar isso, dois pratos P100 contendo um meio de crescimento fresco podem ser preparados quando as células são divididas. Quando as células atingem o estágio subconfluente, as células em um prato P100 podem ser divididas, enquanto as células no outro prato P100 podem ser armazenadas em-80 ° c em meio de criopreservação (ver tabela de materiais) como um backup, de tal forma que se uma linha estiver contaminada , a linha armazenada pode ser usada.
Seria difícil reproduzir completamente a aquisição da resistência ao afatinib em seres humanos utilizando a cultura celular. A emergência da mutação T790M no exon 20 de EGFR foi relatada como a causa dominante da resistência ao afatinib. Em nosso relatório, um clone resistente continha a mutação T790M11. Além disso, o aumento do EGFR tipo Wild, como nas células AFR1 e AFR2, tem sido relatado por nós e por outros grupos15,16. A perda da mutação EGFR e o aumento do tipo Wild EGFR também são relatados em amostras clínicas de pacientes com resistência adquirida a EGFR-tkis 17,18. Portanto, estudos in vitro de nosso modelo atual podem refletir os perfis moleculares de espécimes clínicos com resistência adquirida.
Este método Stepwise da escalada de dose é considerado o mais de confiança para obter linhas resistentes adquiridas das pilhas. No entanto, a exposição inicial de afatinib em altas doses em células cultivadas provavelmente refletiria melhor os efeitos do tratamento com afatinib em doentes com cancro, embora o estabelecimento de células resistentes seja mais difícil. Não apenas linhas de célula flutuantes, como PC-9, mas também linhas de células aderentes, como HCC827, 11-18 ou HCC4006, podem ser empregadas para este método. Este método Stepwise da escalada da dose é igualmente útil para estabelecer os clones resistentes a outros nervos inibidores, usando outras linhas de pilha, representando outros tipos de cancro.
Foi notificada a exposição de células parentais a agentes mutagênico, como n-etil-n-nitrosourea, seguida de uma selecção de células resistentes ao tratamento com afatinib ou osimertinib, para permitir a rápida aquisição de clones resistentes 19 ,20. No entanto, esse método artificial tende a causar substituições de base específicas, como GC para transições AT e transversões AT para TA. Além disso, o EGFR TKI não é um agente mutagênico em doentes com NSCLC. Portanto, o método de escalonamento de dose Stepwise é mais representativo do que usar agentes mutagênico.
Embora os TKIs do EGFR sejam inicialmente efetivos, as células eventualmente desenvolvem resistência a tais drogas de alvo único, dificultando a cura do câncer. Os inibidores que visam múltiplas moléculas são, portanto, essenciais para desenvolver. Para isso, é necessário obter células com resistência adquirida aos inibidores multialvos e avaliar os mecanismos subjacentes à resistência à droga.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao membro do Instituto avançado de pesquisa translacional de câncer por seus comentários pensativos e Editage para sua assistência com a edição de idioma inglês. Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI (número da subvenção: 16K09590 a
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
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