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Immunology and Infection

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग आंतों ऑर्गेनॉइड व्युत्पंन का अध्ययन करने और साल्मोनेला और अंय रोगज़नक़ों के खिलाफ उपकला कोशिका संरक्षण को संशोधित

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59478
Automatic Translation
1,2, 1,3, 2, 1, 1, 1,2
1Wellcome Trust Sanger Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3University of Cardiff

Summary

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC)-व्युत्पन्न आंत्र ऑर्गेनॉइड विट्रो में मॉडल आंत्र रोगों के लिए रोमांचक अवसर प्रदान करते हैं । हम आंतों ऑर्गेनॉइड (iHOs) में hiPSCs के भेदभाव, cytokines के साथ इन iHOs की उत्तेजना प्रदर्शित करता है, और iHO lumen में साल्मोनेला typhimurium के microinjection, इस से एक उपकला के आक्रमण के अध्ययन को सक्षम करने से रोगज़नक़.

Abstract

आंतों ' organoid ' (iHO) प्रणाली है, जिसमें 3-D संरचनाओं के प्रतिनिधि मानव आंत के उपकला अस्तर मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से उत्पादित किया जा सकता है (hiPSCs) और संस्कृति में बनाए रखा, एक रोमांचक अवसर प्रदान करता है की सुविधा आंत्र संक्रमण के लिए उपकला प्रतिक्रिया की मॉडलिंग. Vivo में, आंतों उपकला कोशिकाओं (IECs) आंतों homeostasis को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सीधे रोगजनकों को बाधित कर सकते हैं, हालांकि तंत्र जिसके द्वारा यह होता है पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. Cytokine interleukin-22 (आईएल-22) के रखरखाव और आंत उपकला बाधा के बचाव में एक भूमिका निभाते दिखाया गया है, संक्रमण के जवाब में रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और chemokines की रिहाई उत्प्रेरण भी शामिल है ।

हम एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में उंहें embedding से पहले स्वस्थ नियंत्रण iHOs में विशिष्ट cytokine युग्म के अलावा के माध्यम से hiPSCs के भेदभाव का वर्णन-प्रोआंतों संस्कृति प्रणाली आधारित है । एक बार एंबेडेड, ihos noggin के साथ पूरक मीडिया में बड़े हो रहे हैं, R-spondin-1, एपिडर्मल विकास कारक (egf), CHIR99021, E2 प्रोस्टाग्लैंडीन, और वाई-२७६३२ dihydrochloride मोनोहाइड्रेट. IHO ultrastructure के मैनुअल व्यवधान से साप्ताहिक मार्ग budded iHOs के गठन के लिए सीसा, कुछ एक तहखाना/ सभी ihos एक विभेदित उपकला जाम कोशिकाओं, enteroendocrine कोशिकाओं, paneth कोशिकाओं से मिलकर प्रदर्शित करता है, और polarized enteroendocrine, जो प्रत्येक कोशिका सबसेट के विशिष्ट मार्कर के लिए immunostaining के माध्यम से पुष्टि की जा सकती है, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), और मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) । मॉडल संक्रमण करने के लिए, साल्मोनेला enterica serovar typhimurium SL1344 ihos के लुमेन में microअंतःक्षिप्त रहे हैं और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए इनक्यूबिटेड, और एक संशोधित जेंटॅमाइसिन संरक्षण परख intracellular के स्तर की पहचान करने के लिए किया जाता है बैक्टीरियल आक्रमण । कुछ ihos भी पुनः संयोजक मानव IL-22 (rhil-22) संक्रमण से पहले स्थापित करने के लिए कि क्या इस cytokine साल्मोनेला संक्रमण के खिलाफ सुरक्षात्मक है के साथ pretreated कर रहे हैं ।

Introduction

हाल के वर्षों में, ऑर्गेनोइड मॉडलों के विकास द्वारा मेजबान-रोगज़नक़ अन्योन्य क्रियाओं के अध्ययन को बढ़ाया गया है, जिसमें विभिन्न प्रजनकों से आंत्र उपकला का 3-डी निरूपण किया जा सकता है । ' प्राथमिक ' ऑर्गेनॉयड आंत्र बायोप्सी से काटा आंतों स्टेम कोशिकाओं से सीधे उत्पंन किया जा सकता है । इसके अलावा, hiPSCs से आंतों ऑर्गेनॉयड पैदा किए जा सकते हैं । एक ही कई ऊतकों के बारे में कहा जा सकता है, गैस्ट्रिक1, जिगर2, अग्नाशय3,4, मस्तिष्क5,6, फेफड़े7, और प्रोस्टेट8 ऑर्गेनॉयड मॉडल करने के लिए बहुत से शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया रोग. वहां कई अंगाभ प्रणाली के रोमांचक अनुप्रयोगों मॉडलिंग9 कैंसर और दवा स्क्रीनिंग10सहित, कर रहे हैं, लेकिन यहां हम एक संक्रमण मॉडल के रूप में ihos के उपयोग पर ध्यान केंद्रित, एस का उपयोग कर । एन्टेरिका सेनोवर टाइफिमूरियम (एस. Typhimurium) एक अनुकरणीय रोगज़नक़ और आईएल-22 के साथ एक चिकित्सा के रूप में pretreatment के रूप में ।

इस अध्ययन में, iHO उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया hiPSCs ' Kolf2 ' है iPSCs, एक स्वस्थ व्यक्ति से उत्पंन और मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल पहल कंसोर्टियम (Hipscs; www.hipsci.org), विशेषता का एक खुला उपयोग संदर्भ पैनल से उपलब्ध 7. hiPSC लाइंस11. ऑर्गेनॉयड के लिए progenitors के रूप में hiPSCs का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि अब स्वस्थ दाता iPSC लाइनों उपलब्ध के व्यापक बैंकों रहे हैं, जिसका अर्थ है कि परिणाम विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सेल लाइनों की एक संख्या में मान्य किया जा सकता है. इसके अलावा, शोधकर्ताओं के लिए विशिष्ट रोग से संबंधित एकल न्यूकोटाइड बहुरूपताओं (snps) पर देखने के लिए इच्छा करना चाहिए, यह crispr का उपयोग करने के लिए संभव है/Cas9 एक स्वस्थ कोशिका लाइन में उत्परिवर्तन इंजीनियर, जिससे दोनों एक उत्परिवर्ती लाइन का उत्पादन और समजीनी को बनाए रखने 12तुलना के लिए नियंत्रण रेखा । हमारे अनुभव में, hiPSC-आंत्र ऑर्गेनॉइड व्युत्पंन उनके प्राथमिक समकक्षों की तुलना में आकार में बड़े होते है और संस्कृति में अधिक सुसंगत, एक कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण microinjection के लिए बना रही है और संभावित रोगजनकों की एक और विविध रेंज होने की अनुमति अध्ययन. iHOs cryogenically संरक्षित किया जा सकता है, और हम एक साल तक के लिए iHO संस्कृतियों प्रचारित किया है प्रयोग के लिए सामग्री का उत्पादन ।

Vivo में, IECs आंतों homeostasis के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सीधे रोगजनकों को बाधित कर सकते हैं, हालांकि तंत्र जिसके द्वारा यह होता है अच्छी तरह से समझ में नहीं आता. Cytokine IL-22 आंत उपकला बैरियर13 के रखरखाव में एक भूमिका है और संक्रमण14के जवाब में रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और chemokines के प्रेरण और स्राव में शामिल करने के लिए जाना जाता है । यह सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित है (विशेष रूप से, Th17 कोशिकाओं) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं और एक heterodiभाजक रिसेप्टर il-22r1 और il-10r2 सब यूनिटों15से बना करने के लिए बाइंड कर देता । IL-22 के लिए रिसेप्टर आईईसी पर basally व्यक्त की है, जिसका अर्थ है कि Iecs मॉडल में, यह केवल संस्कृति मध्यम16के लिए इसके अलावा द्वारा rhil-22 के साथ ऑर्गेनॉयड pretreat संभव है । अंगाभ प्रणाली का एक नुकसान यह है कि यह आम तौर पर अंय प्रतिरक्षा सेल प्रकार द्वारा दिया संबंधित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अभाव है; हालांकि, मॉडल उभर रहे है कि करने के लिए कोकल्चर के लिए आंतों लिम्फोसाइटों के साथ ऑर्गेनॉइड का प्रयास बेहतर यह17,18का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Microinjection प्रणाली का उपयोग iHO मॉडल में संक्रमण अनुकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह उपकला की शीर्षस्थ सतह के लिए रोगजनकों के प्रत्यक्ष वितरण की अनुमति देता है, के रूप में vivo में संक्रमण के मामले में हो जाएगा । IHO में इंजेक्शन बैक्टीरियल समाधान के लिए phenol लाल के अलावा कि संक्रमित किया गया है, इस प्रकार एक ही iHO के दोहराया इंजेक्शन से बचने के निशान । संक्रमण मॉडलिंग के लिए जहाजों के रूप में organoids उपयोग में बढ़ रहे हैं, हेलिकोबेक्टर के रूप में रोगजनकों के साथ पायलोरी,19 नोरोवायरस,20 रोटावायरस,21 shiga विष का उत्पादन एचेरीचिया कोलाई22, क्रिप्टोस्पोरीडियम23, और zika वायरस24 जीवित और इन प्रणालियों के भीतर दोहराने के लिए दिखाया गया है. इस तकनीक रोगजनकों की एक व्यापक श्रेणी के लिए लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से जीव है कि संस्कृति के लिए मुश्किल है, जैसे प्रोटोजोआ, या मानव प्रतिबंधित रोगजनकों के लिए, संक्रमण के लिए मानव उपकला प्रतिक्रिया के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्राप्त करने के लिए ।

Protocol

1. प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल की पुलिया और Passaging

नोट: यहां वर्णित सभी पद्धतियां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव कोशिका रेखाओं का उपयोग करती हैं । सभी ऊतक संस्कृति नीचे विस्तृत काम एक वर्ग द्वितीय स्तरीय प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए । iPSCs नियमित रूप से स्टेम सेल संस्कृति मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता के निर्देशों के अनुसार, जो ipscs के एक सप्ताहांत मुक्त संस्कृति की अनुमति देता में बनाए रखा है । iPSCs रिश्तेदार आसानी से अंय Ipscs संस्कृति प्रणाली से अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. एक बार कालोनियों के लगभग 80%-प्लेट सतह के 90% कवर के लिए कक्षों को पारित ।
  2. इस मार्ग के लिए प्लेटों को तैयार करने के लिए 1 घंटे के पहले में vitronectin 10 μg/mL Dulbecco के फॉस्फेट-buffered खारा (DPBS; बिना कैल्शियम [सीए] या मैग्नीशियम [Mg]) में पतला जोड़कर उपयोग करने के लिए ऊतक-संस्कृति का इलाज प्लेटों । कोटिंग के लिए वॉल्यूम प्लेट आकार पर निर्भर हैं और निर्माता के निर्देशों में पाया जा सकता है । इस समय के दौरान, गर्म स्टेम सेल संस्कृति के माध्यम से कमरे के तापमान (आरटी) ।
  3. IPSCs पारित होने के लिए तैयार से मीडिया निकालें और (बिना Ca या Mg) DPBS के साथ 2x कोशिकाओं को धोने ।
  4. EDTA समाधान जोड़ें ( सामग्री की मेज) प्लेटों के लिए, सुनिश्चित करें कि पूरी सतह लेपित है और 5 के लिए आर टी पर सेक्यूबेट-8 मिनट । जब छेद ipsc कालोनियों के केंद्र में प्रकट करने के लिए शुरू, महाप्राण और edta समाधान त्यागें.
  5. स्टेम सेल संस्कृति मध्यम कुओं के लिए जोड़ें; प्लेट सतह पर मीडिया को धीरे से कुछ समय धोने के द्वारा iPSCs बेदखल । IPSCs clumps के रूप में और नहीं एकल कक्षों के रूप में passaged हैं, तो सुनिश्चित करें कि EDTA समाधान पर बहुत लंबे समय के लिए नहीं छोड़ा है । किसी भी विस्थापित iPSCs के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ले जाएँ ।
  6. विट्रोक्टिन को प्रीकोटेड प्लेट्स से महाप्राण लें और इसे स्टेम सेल कल्चर मीडियम से बदलें । IPSC निलंबन पलको यह सुनिश्चित करने के लिए कई बार Ipsc शंक्वाकार ट्यूब के नीचे पर बसे नहीं है, और एक नई थाली पर कोशिकाओं की एक 1:10 कमजोर पड़ने देने के लिए निलंबन की उचित मात्रा में जोड़ें. विभाजन अनुपात iPSC वृद्धि दर के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, जो iPSC लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं.
  7. सतह पर आईपीएससी को फैलाने के लिए प्लेट को रॉक करें और इसे ३७ ° c/5% CO2पर एक इनक्यूबेटर में रखें । Passaging के बाद दिन iPSCs फ़ीड ।

2. iPSCs से हिर्गट के लिए विभेदन

  1. 0 दिन, 10 सेमी ऊतक-संस्कृति का इलाज पकवान, चरण १.२ में वर्णित के रूप में vitronectin के साथ Precoated पर ipscs विभाजन, स्टेम सेल संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर में Activin एक (10 एनजी/एमएल) + बेसिक फाइबरब्लास्ट विकास कारक (bFGF; 12 एनजी/एमएल) । उपयोग करने से पहले सीधे मीडिया में वृद्धि कारक जोड़ें; बाद के सभी चरणों में ऐसा करें ।
  2. 1 दिनमें, मीडिया (स्टेम सेल संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर एक्टिन एक [10 एनजी/एमएल] + bFGF [12 एनजी/एमएल]) के साथ बदलें ।
  3. 2 दिवसपर, मीडिया को बदलने के 10 मिलीलीटर स्टेम सेल संस्कृति मध्यम निंनलिखित वृद्धि कारकों के साथ पूरक शुरू: Activin एक (१०० एनजी/एमएल), bFGF (१०० एनजी/एमएल), अस्थि संरचनाजेनेटिक प्रोटीन 4 (बीएमपी-4; 10 एनजी/एमएल), फ़ॉसफोइनोसिटॉल 3- काइनेज अवरोध करनेवाला LY294002 (10 μm), और GSK3 अवरोध करनेवाला CHIR99021 (3 μm) ।
  4. 3 दिन, मीडिया परिवर्तन स्टेम सेल संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर के लिए Activin एक (१०० एनजी/एमएल), bFGF (१०० एनजी/एमएल), बीएमपी-4 (10 एनजी/एमएल), और LY294002 (10 μm) के साथ पूरक । एंडोडर्म इस मीडिया द्वारा प्रेरित विनिर्देशन अगले 24 घंटे से अधिक ipsc कॉलोनी आकारिकी में दिखाई परिवर्तन में परिणाम चाहिए ।
  5. 4 दिन, Rpmi/B27 मीडिया के 10 मिलीलीटर के लिए मीडिया परिवर्तन एक (१०० एनजी/एमएल) और bFGF (१०० एनजी/एमएल) activin के साथ पूरक ।
    नोट: Rpmi/B27 मीडिया में शामिल है ५०० एमएल के साथ एल glutamine अनुपूरक ( तालिका 1देखें), 10 मिलीलीटर B27 के पूरक (50x, सीरम मुक्त), और 5 मिलीलीटर अनावश्यक अमीनो एसिड की । वैकल्पिक: पेनिसिलिन के 5 मिलीलीटर-स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०,००० U/mL) जोड़ें । उपयोग करने से पहले फ़िल्टर-जीवाणुरहित करें ।
  6. 5 दिन, rpmi के 10 मिलीलीटर के लिए मीडिया को बदलने/बी-27 Activin एक (५० एनजी/एमएल) के साथ पूरक मीडिया ।
  7. 6 दिन, शुरू करने के लिए पीछे अंतश् चर्म के patterning हिर्गट के लिए, मीडिया बदलने के लिए 10 rpmi के मिलीलीटर/B27 मीडिया के साथ पूरक CHIR99021 (6 μm) + रेटिनॉइक एसिड (3 μm) ।
  8. दिन 7, 8, और 9, दोहराएं चरण २.७ । इन चरणों के दौरान, हिस्टगट की दृश्यमान 3-डी संरचनाएं स्पष्ट हो जाती हैं, जो प्लेट की सतह को ढक देती हैं ।
  9. 10 दिन, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में जिसके परिणामस्वरूप hindgut एंबेड ( सामग्री की मेजदेखें) ।

3. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में हिस्टगट के embedding

  1. ऊपर iHO आधार विकास मीडिया बनाओ (उंनत है Dulbecco संशोधित है ईगल मध्यम [DMEM] के ५०० एमएल/10 मिलीलीटर की B27 पूरक [50x, सीरम मुक्त], 5 मिलीलीटर की N2 पूरक [100x, सीरम मुक्त], 5 मिलीलीटर की 1 मीटर 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), और 5 मिलीलीटर की अनावश्यक अमीनो एसिड [100x] । वैकल्पिक: पेनिसिलिन के 5 मिलीलीटर जोड़ें-स्ट्रेप्टोमाइसिन [१०,००० U/एमएल]; उपयोग करने से पहले फ़िल्टर-जीवाणुरहित करें । तालिका 1देखें) ।
  2. मीडिया को हिंदगट प्लेट से निकालें, और प्लेट 1x को DPBS (बिना Ca या Mg) से धोएं । प्लेट के लिए collagenase समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    1. उत्पादन collagenase समाधान ५०० मिलीग्राम collagenase चतुर्थ पाउडर को जोड़कर उंनत DMEM के ४०० मिलीलीटर/ इस के बाद, सीरम प्रतिस्थापन के १०० मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें), एल gluतमीन (२०० mM) के 5 मिलीलीटर, और 2 के ३.५ μl-mercaptoethanol, और भंवर घोल मिश्रण करने के लिए । एक बार कोलेगनेज पाउडर पूरी तरह से घुल जाने के बाद घोल को फ़िल्टर-स्टरसाइज़ करें ।
      नोट: यह छोटे aliquots में अप करने के लिए 6 महीने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. IHO बेस विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर प्लेट को जोड़कर collagenase inactivate और एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करते हुए hindgut कोशिकाओं से परिमार्जन, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हिगगट निलंबन का संग्रह ।
  4. 1 मिनट और supernatant बंद पिपेट के लिए २४० x g पर अपकेंद्रित्र ।
  5. मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे pipetting द्वारा छोटे टुकड़ों में हिस्टगट तोड़, और 1 मिनट के लिए ९५ x g पर फिर से अपकेंद्रित्र ।
  6. चरण ३.५ दोहरा द्वारा iHO बेस विकास मीडिया में 2x कक्ष धो लो । आधार वृद्धि माध्यम (~ 300-500 μL) की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के १.५ मिलीलीटर के लिए इस समाधान के आसपास १०० μL जोड़ें । मैट्रिक्स इस समय के दौरान बर्फ पर रहना चाहिए के रूप में यह तेजी से RT पर जमना शुरू हो जाएगा ।
  7. ३७ ° c पर एक प्लेट हीटर पर एक 24-कूप प्लेट की स्थापना की और 24-कूप प्लेट के एक कुएं में ६० μL बाहर हाजिर । यह संक्षेप में सेट और एक खुर्दबीन के तहत घनत्व की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    1. यदि आवश्यक हो तो, जब तक वांछित एकाग्रता प्राप्त की है, और शेष कुओं में बाहर जगह समाधान की वृद्धि में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के लिए और अधिक हिस्टगट समाधान जोड़ें ।
  8. 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट; फिर, iHO आधार विकास मीडिया के निंनलिखित सांद्रता में 24-well थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए वृद्धि कारक युक्त के ८०० μL जोड़ें ( तालिका 1देखें): ५०० एनजी २.५ १०० १००/ प्रोस्टाग्लैंडीन E2, और 10 μM Y-२७६३२ dihydrochloride मोनोहाइड्रेट (रॉक अवरोध करनेवाला) ।
  9. बदलें iHO आधार विकास मीडिया हर 2-3 दिन, या तुरंत अगर मीडिया को उतरना शुरू होता है । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में प्रारंभिक बोने के बाद, iHOs विभाजन से पहले 7 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं । 3-4 दिन तक, अलग क्षेत्रों संस्कृति में दिखाई जानी चाहिए ।
    1. मीडिया के लिए अकेले परिवर्तन, छोड़ Y-२७६३२, के रूप में यह केवल आवश्यकता है जब विभाजन/

4. iHOs के रखरखाव और पारित होने

  1. क्रमिक thawing अनुमति देने के लिए, एक कवर बर्फ बाल्टी में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की आवश्यक मात्रा से बाहर डाल 4 ° c रात भर, 24 पहले विभाजन के लिए ज ।
  2. IHOs से मीडिया निकालें और यह सेल के ५०० μL-उठाने समाधान के साथ की जगह (सामग्री की तालिका देखें) प्रति अच्छी तरह से । 40 से 50 मिनट के लिए 4 ° c पर सेक्यूबेट, जो बिंदु पर iHOs समाधान में तैर चाहिए ।
    1. वैकल्पिक: एक में हुड इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए वांछित आकारिकी ( सामग्री की मेजदेखें) के साथ केवल ihos का चयन करें ।
  3. धीरे पिपेट iho/सेल उठाने के समाधान के 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में निलंबन, ihos को तोड़ने की कोशिश नहीं की । IHOs 3 के लिए व्यवस्थित करने के लिए-5 मिनट और supernatant और एकल कोशिकाओं को दूर करने की अनुमति दें ।
  4. Iho बेस विकास माध्यम के 5 मिलीलीटर में ihos फिर से निलंबित और उंहें धीरे से धोने के लिए पिपेट । 2 मिनट के लिए ९५ x g पर अपकेंद्रित्र ।
  5. हुड के भीतर ३७ ° c पर एक प्लेट हीटर पर एक 24 कूप प्लेट की स्थापना की ।
  6. Supernatant निकालें और ihos resuspend ~ 300-बेस विकास मीडिया के 500 μl, एक P1000 पिपेट को छोटे खंड में टूट ihos का उपयोग कर । ध्यान दें कि बल है कि जरूरत है iHO लाइन और परिपक्वता राज्य पर निर्भर भिंन हो जाएगा लागू किया जाना है, तो धीरे शुरू, बल बढ़ रही है अगर जरूरत है ।
  7. प्लेस ~ ihos के १०० μl (मात्रा समाधान के घनत्व पर निर्भर है) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और पिपेट संक्षेप के १.५ मिलीलीटर में मिश्रण करने के लिए ।
  8. एक 24-कूप प्लेट के एक कुएं में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 1 एक्स ६० μL बाहर स्पॉट, यह ~ 30 एस के लिए जमना करने के लिए छोड़ दो, और फिर माइक्रोस्कोप के तहत घनत्व की जांच करें । यदि घनत्व बहुत कम है, मैट्रिक्स के लिए और अधिक iHOs जोड़ें ।
  9. दोहराएं चरण ४.८ तक सही घनत्व का अधिग्रहण किया है, और फिर एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में मैट्रिक्स के बाकी बाहर हाजिर ।
  10. यह 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें और फिर, चरण ३.७ में वर्णित के रूप में विकास कारकों के साथ आधार विकास माध्यम के ८०० μL के साथ ओवरले ।
  11. एक आक्रमण परख प्रयोग के लिए iHOs तैयार (नीचे उल्लिखित), पारित iHOs 4-5 दिन पहले प्रयोग के रूप में कदम 4.1-4.10 में वर्णित है, लेकिन इस मैट्रिक्स iHO समाधान के १२० μL 5 मिमी गिलास तली microinjection व्यंजन में ४.७ में उत्पंन ।
    1. बल्कि नियमित passaging के साथ के रूप में एक छोटी बूंद में iHO निलंबन छोड़ने से, पकवान के तल पर छोटी बूंद के लिए मैट्रिक्स की एक पतली परत बनाने के प्रसार । इसे बेस ग्रोथ मीडियम प्लस ग्रोथ फैक्टर्स के २.५ एमएल के साथ कवर कर दें ।
      नोट: यदि एंटीबायोटिक्स संस्कृति माध्यम में इस्तेमाल किया गया है, ये हटाया जाना चाहिए और microinjection प्रयोगों के लिए nonantibiotic पूरक मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया ।

5. rhIL-22 के साथ iHOs के prestimulation

  1. IHOs से मीडिया महाप्राण और यह ताजा आधार विकास मीडिया के साथ की जगह (जो एंटीबायोटिक दवाओं शामिल नहीं होना चाहिए) 18 घंटे पहले आक्रमण परख करने के लिए ।
  2. १०० एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए संस्कृति मीडिया के लिए rhIL-22 जोड़ें ।

6. iHOs और Intracellular आक्रमण के microinjection Assays हैं

  1. प्रयोग से पहले के दिन एससेट अप करें । Typhimurium SL1344 संस्कृति के 10 मिलीलीटर में दुबरिया-Bertani शोरबा और सेते में ३७ ° c झटकों के साथ रात ।
  2. प्रयोग के दिन, यदि एक संलग्न गर्मी चैंबर के साथ एक खुर्दबीन उपलब्ध है, यह मोड़ पर है और तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए अनुमति देने से पहले परख शुरू ।
  3. DPBS में रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृतियों पतला (सीए और एमजी युक्त) 2 के एक ऑप्टिकल घनत्व को ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में और फिर, यह phenol लाल के साथ 1:1 मिश्रण ।
  4. माइक्रोइंजेक्शन डिश iHOs युक्त माइक्रोस्कोप मंच पर लोड, ढक्कन हटाने, और ध्यान में iHOs लाने के लिए, इंजेक्शन शुरू करने के लिए तैयार है ।
  5. इंजेक्टर और हाथ पर नियंत्रण स्टेशनों मुड़ें । सुनिश्चित करें कि इंजेक्टर ६०० kPa का एक दबाव और ०.५ एस के एक इंजेक्शन समय के लिए सेट है । यह पहले से ही माइक्रोस्कोप चरण से दूर समर्थित नहीं है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन बांह घुमाएगी ।
  6. सुई से रैपिंग और प्लास्टिक सिलेंडर हटाकर 6 माइक्रोमीटर माइक्रोइंजेक्शन ड्रिल टिप की स्थापना करें । इंजेक्शन हाथ से पकड़ सिर निकालें ।
  7. ड्रिल टिप के साथ 10 μL inoculum लोड, अपने कुंद अंत में धीरे ड्रिल टिप मनोरंजक । पकड़ सिर में ड्रिल टिप प्लेस और यह microinjection हाथ करने के लिए reattach ।
  8. धीरे से हाथ की स्थिति में कदम है कि सुई 1-2 सेमी microinjection पकवान के ऊपर स्थित है । बांह नियंत्रण का प्रयोग करें डिश के केंद्र में सुई टिप की स्थिति और यह कम है जब तक यह सिर्फ मीडिया की सतह पर है ।
    1. कार्यक्रम एआरएम नियंत्रण स्टेशन सभी इंजेक्शन के बाद इस बिंदु पर सुई लौटने के लिए ।
  9. IHOs पर माइक्रोस्कोप फोकस और सुई के लिए लक्ष्य का चयन करें । बस के ऊपर और iHO के दाईं ओर सुई की स्थिति के लिए इंजेक्शन और iHO lumen में सुई नीचे और laterally चाल ।
  10. माइक्रोइंजेक्टर पर इंजेक्षन बटन दबाएँ; फिनॉल से सना हुआ बैक्टीरियल मिश्रण सुई से निकलेगा । प्रत्येक iHO 3x सुई । शर्त के अनुसार कम से 30 iHOs सुई ।
    नोट: एक संस्कृति के भीतर iHO आकार और संरचना में विषमता के कारण, यह परिवर्तन के लिए नियंत्रण करने के लिए iHOs की एक बड़ी संख्या इंजेक्षन करने के लिए आवश्यक है ।
  11. जब सभी आवश्यक iHOs इंजेक्ट कर रहे हैं, मंच से microinjection थाली हटाने, ढक्कन की जगह है, और ९० मिनट के लिए ३७ ° c पर थाली सेते ।
  12. ९० मिनट के बाद, विकास मीडिया महाप्राण और यह सेल उठाने समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ की जगह; ४५ मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
  13. धीरे से iHOs/सेल उठाने समाधान एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब जो DPBS के 5 मिलीलीटर युक्त है । सुनिश्चित करें कि सभी इंजेक्शन iHOs थाली से हटा दिया गया है (यदि आवश्यक हो तो DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ थाली कुल्ला) । 3 मिनट के लिए ३७० x g पर अपकेंद्रित्र ।
  14. Supernatant निकालें और ०.१ मिलीग्राम/एमएल (मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें; फिर, ihos को तोड़ने के लिए एक P1000 पिपेट ~ 50x का उपयोग करें, और आगे मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ने के आधार विकास मीडिया में ihos resuspend) ।
  15. 1 ज के लिए ३७ ° c में सेक्यूबेट extracellular बैक्टीरिया को मारने के लिए ।
  16. 3 मिनट के लिए ३७० एक्स जी पर iHOs अपकेंद्रित्र और supernatant महाप्राण, के रूप में संभव के रूप में छोटे छोड़ने । IHOs 1x DPBS और अपकेंद्रित्र के साथ फिर से धो लें ।
    नोट: यह चरण जेंटॅमाइलिन को निकालता है, जो किसी भी शेष जेंटॅमाइलिन के रूप में महत्वपूर्ण है एक बार कोशिकाओं lysed intracellular बैक्टीरिया को मार सकता है ।
  17. Ihos के ५०० μl lysis बफर में पुनः स्थगित ( सामग्री की मेजदेखें) और मैंयुअल रूप से pipetting ~ 50x द्वारा ऑर्गेनॉइड अलग करना । इस मिश्रण को 5 मिनट के लिए RT पर छोड़ दें ।
  18. Serially परिणामी समाधान 10-10-1, 10-2, और 10-3 सांद्रता जनरेट करने के लिए dpbs में गुना पतला । Pipette 3 एक्स 20 μL की बूंदों के स्वच्छ और पतला समाधान पर prewarmed पौंड एगार प्लेटें ।
  19. ३७ ° c पर रात भर सेते और कॉलोनी की गिनती और कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की गणना प्रदर्शन करते हैं । कॉलोनी गिनती intracellular बैक्टीरिया है जो सेल lysing प्रक्रिया के दौरान जारी किए गए थे की संख्या को प्रतिबिंबित करेगा ।

7. सेल बर्फ़ीली और वसूली

नोट: जैसा कि पहले उल्लेख किया है, यह cryogenically ihos संरक्षित करने के लिए संभव है और जब इच्छित पुनर्गठन । ठंड और विगलन प्रक्रियाओं नीचे रेखांकित कर रहे हैं ।

  1. IHOs आप फ्रीज करना चाहते है के कुओं का चयन करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 40-50 मिनट के लिए कुओं और सेने के लिए सेल भारोत्तोलन समाधान जोड़ें । समाधान में iHOs तैर चाहिए ।
  2. धीरे से iHOs एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पिपेट और उन्हें बसने के लिए अनुमति देते हैं । मीडिया निकालें और आधार विकास मीडिया (कोई वृद्धि कारक) के साथ iHOs 1x धोने ।
  3. 2 मिनट के लिए ९५ x g पर अपकेंद्रित्र, supernatant निकालें, और यह सेल बर्फ़ीली माध्यम की एक उचित मात्रा के साथ की जगह (सामग्री की तालिका देखें; निर्माता के निर्देशों के अनुसार माध्यम का उपयोग करें), iHOs को क्रायोजेनिक शीशियों में बदलना ।
    1. एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर रात भर में शीशियों की दुकान और अधिक क्रमिक ठंड की अनुमति के लिए; फिर उन्हें लिक्विड नाइट्रोजन स्टोरेज में ट्रांसफर कर देते हैं ।
  4. Ihos पुनर्गठित करने के लिए, तेजी से ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक क्रायोजेनिक शीशी डिफ्रॉस्ट एक पानी/मनका स्नान का उपयोग; फिर, धीरे आधार विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर में अपनी सामग्री पिपेट (कोई वृद्धि कारक) । IHOs बसने और नए आधार विकास मीडिया के ~ ३०० μL के साथ मीडिया की जगह की अनुमति दें ।
    1. IHOs मैंयुअल रूप से अलग नहीं है । IHOs तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में जोड़ें और उंहें बाहर प्लेट के रूप में धारा 3 में वर्णित है ।

Representative Results

भेदभाव की प्रक्रिया के शुरू होने के बाद, कोशिकाओं को निश्चित अंत: स्तर के चरण के माध्यम से पारित करना चाहिए के बाद हिर्गट patterning के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में embedding से पहले । Spheroids फार्म और दूषित सामग्री की बड़ी मात्रा के साथ संस्कृतियों iHOs परिपक्व के रूप में कई हफ्तों की अवधि में स्पष्ट हो जाएगा । विभेदन, embedding, और passaging प्रक्रिया के प्रतिमान छवियों चित्रा 1में दिखाए जाते हैं ।

Microinjection प्रणाली के सेटअप के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है । IHOs phenol लाल/बैक्टीरियल समाधान के साथ microअंतःक्षिप्त और उनके लाल रंग को बनाए रखने, संक्रमित iHOs की पहचान की अनुमति डुप्लिकेट इंजेक्शन को रोकने के लिए कर रहे हैं । मढ़वाया intracellular बैक्टीरिया की गिनती संशोधित जेंटॅमाइसिन संरक्षण परख के बाद किया जाता है; आरआईआईएल-22 के साथ prestimulation एस को प्रतिबंधित करता है । आरआईएल-22 उपचार के बाद कम intracellular बैक्टीरिया के साथ मनाया जा रहा है typhimurium संक्रमण, (चित्रा 3) । हम भी नियमित रूप से immunostaining, या TEM के लिए संक्रमित iHOs प्रक्रिया, आदेश में मेजबान आईईसी के दृश्य की सुविधा के लिए-बैक्टीरियल बातचीत (चित्रा 4).

Figure 1
चित्र 1: आईपीएससी को iHOs में विभेदन का निर्देश दियागया । IPSCs से iHOs के लिए विभेदन के प्रतिनिधि अनुक्रम, रूपात्मक परिवर्तन का प्रदर्शन और इन परिवर्तनों को चलाने के लिए आवश्यक वृद्धि कारकों. निश्चित अंतश् चर्म विभेदन के 4 दिन में निर्मित किया गया है, activin एक, FGF, BMP-4, LY294002, और CHIR99021 के संयोजन के विशिष्ट सांद्रता के लिए जोखिम के बाद । 8 दिनों के बाद, CHIR99021 और रेटिनॉइक एसिड के विशिष्ट सांद्रता के साथ इस निश्चित अंतर्त्वचा के patterning हिर्गट गठन में परिणाम है । पोस्टएंबेडिंग, गोलाभ गठन मनाया जाता है । निरंतर के बाद एक समर्थन तहखाने के साथ एक सहायक बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मढ़ा का उपयोग कर passaging के साथ prointestinal प्रसार कारकों आर-स्पॉडिन 1, noggin, egf, CHIR99021, और प्रोस्टाग्लैंडीन E2, spheroids में प्रगति budded ihos । (छवियां 4x-10x आवर्धन पर ले जाया गया) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एसके साथ एक Iho के microinjection । Typhimurium. (क) माइक्रोइंजेक्शन प्रणाली ( सामग्री तालिकादेखें) पर्यावरण चैंबर में संलग्न; यह एक नियंत्रित वातावरण में iHOs के इंजेक्शन की अनुमति देता है (३७ डिग्री सेल्सियस/ (ख) जीवाणु संरोप को माइक्रोइंजेक्शन प्रणाली से जुड़ी माइक्रोकेशिका का उपयोग करके सीधे ही आईएचओ ल्यूमेन में वितरित कर दिया जाता है । (ग) फीनॉल रेड के साथ बैक्टीरियल इननोकुलम मिलाने से यह स्पष्ट हो जाता है कि कौन-कौन से आईफास संक्रमित हुए हैं, इस प्रकार इहो के डुप्लीकेट इंजेक्शन से परहेज करें । चित्र 10x आवर्धन पर लिया गया था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आरआईएल-22 के साथ Kolf2 कोशिका रेखा से व्युत्पन्न iHOs के Pretreatment एस को प्रतिबंधित करता है । आंत्र उपकला कोशिकाओं में typhimurium SL1344 आक्रमण. के लिए जेंटॅमाइसिन सुरक्षा assays हैं, ihos के साथ इलाज किया गया १०० एनजी/एमएल rhil-२२ १८ एच संक्रमण से पहले, या अनुपचारित छोड़ दिया, और ९० मिनट के बाद संक्रमण के लिए इनक्यूबिटेड । डेटा तीन तकनीकी का मतलब है तीन जैविक के लिए प्रतिकृति ± SEM प्रतिकृति । महत्व परीक्षण के लिए, मान-Whitney यू परीक्षण इस्तेमाल किया गया; पी < ०.०००१ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एस Typhimurium SL1344 के साथ IECs की बातचीत. इन पैनलों iHOs एस के साथ इंजेक्शन का प्रदर्शन Typhimurium SL1344 और 3 एच के लिए, निर्धारण और प्रसंस्करण के लिए पहले (एक) इम्यूनोफ्लोरेसेंस या (ख) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इनक्यूबिटेड । एकपैनल में, बैक्टीरिया iho लुमेन के भीतर देखा और उपकला के साथ बातचीत कर रहे हैं । नाभिक के साथ 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilactate (नीला), कोशिका झिल्ली phalloidin के साथ (लाल), और बैक्टीरिया CSA-1 (हरा) के साथ दाग रहे हैं । चित्र 20x आवर्धन पर लिया जाता है । पैनल बी आक्रमण के बाद साल्मोनेला के तीन अलग intracellular प्रसंस्करण रास्ते को दर्शाता है; जीवाणु (a) साल्मोनेला-युक्त vacuole के भीतर, (ख) कोशिका द्रव्य के भीतर मुक्त, और (ग) autophagy के दौर से गुजर । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

RPMI/B27 मध्यम
घटक: राशि:
ग्लूटेमीन अनुपूरक के साथ RPMI १६४० मीडिया ५०० मिलीलीटर
B27 सीरम-नि: शुल्क अनुपूरक 50x 10 मिलीलीटर
iHO आधार विकास मध्यम
घटक: राशि:
उंनत DMEM/F12 ५०० मिलीलीटर
B27 सीरम-नि: शुल्क अनुपूरक 50x 10 मिलीलीटर
N2 सीरम-नि: शुल्क अनुपूरक 100x 5 मिलीलीटर
1 M HEPES 5 मिलीलीटर
एल-ग्लूटामीन २०० मिमी 5 मिलीलीटर
IHO आधार विकास के लिए विकास कारक मध्यम
घटक: राशि:
पुनः संयोजक मानव R-spondin1 ५०० एनजी/एमएल
पुनर्योगवादी मानव नोगिन १०० एनजी/एमएल
एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF) १०० एनजी/एमएल
प्रोस्टाग्लैलइन E2 २.५ μM
CHIR99021 3 μM
Y-२७६३२ डाइहाइड्रोक्लोराइड मोनोहाइड्रेट 10 μM

तालिका 1: मीडिया रेसिपी ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल ihos में hipscs के भेदभाव और एक मॉडल है जिसमें आंत्र संक्रमण अनुकरण करने के रूप में उनकी उपयोगिता की रूपरेखा । नीचे, हम प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम और किसी भी संशोधन या सुधार हमने बनाया है रूपरेखा ।

यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित कार्य25की तुलना में hipscs की विभेदन प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करता है । पहले इस्तेमाल की गई विधियों में अन्य hiPSC संस्कृति प्रणालियों (उदा., फीडर-निर्भर hiPSC संस्कृति) से hiPSCs का स्थानांतरण रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम-polyvinyl शराब (CDM-PVA) के लिए आवश्यक है । CDM-PVA के लिए यह स्थानांतरण आमतौर पर लेता है 2 – 3 सप्ताह और hiPSCs के दैनिक खिलाने की आवश्यकता है. यह प्रोटोकॉल भी नहीं लगातार प्रभावी था, कुछ भिंनता के साथ असफल; इसलिए, हम एक ही वृद्धि कारकों का उपयोग कर भेदभाव trialed लेकिन स्टेम सेल संस्कृति माध्यम में उगाया hiPSCs के साथ शुरू (बजाय सीडीएम-PVA) और अंतर के दौरान स्टेम सेल संस्कृति माध्यम से CDM-PVA के प्रतिस्थापन 0 – 3. यह पांच स्वतंत्र hiPSC लाइनों के लिए सफल रहा है इस प्रकार अब तक trialed, भेदभाव प्रक्रिया बहुत अधिक तेजी से और कुशल बना । यह भी सप्ताहांत में भेदभाव से पहले hipscs के मुक्त संवर्धन की अनुमति देता है, hipsc संस्कृति में अधिक लचीलापन की अनुमति । इस विधि द्वारा उत्पादित iHO लाइनों के रूप में हम पहले hiPSC लाइनों Kolf2, Yemz1, और Lise116 के लिए वर्णित किया गया है और phenotyped iHOs से अविवेच्य प्रकट का उपयोग करके आंत्र उपकला के मार्कर के लिए phenotyped किया गया है पिछले प्रोटोकॉल.

बोने के बाद, iHOs नियमित passaging के ंयूनतम 1 महीने की आवश्यकता है, बंटवारे के साथ हर 4-7 दिन परिपक्वता की सुविधा के लिए । ध्यान दें कि वहां iHO iPSC लाइन का इस्तेमाल किया और प्रारंभिक संस्कृति के घनत्व के आधार पर विकास में कुछ बदलाव होगा । पहले कुछ पैसेज के दौरान वहां पर दूषित कोशिकाएं दिखाई देगी जो iHOs नहीं हैं । ये अंततः मर जाएगा, गोलाकार की एक स्वच्छ संस्कृति छोड़कर, लगभग 4 सप्ताह के बाद, budded iHOs । इसके अलावा, एक में हुड इमेजिंग प्रणाली का चयन करें और वांछित morphology के साथ केवल iHOs पारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । IHOs परिपक्व के रूप में, वे हर 6-7 दिन विभाजन की आवश्यकता होगी, विकास दर और घनत्व पर निर्भर है । यदि निंन में से कोई भी हो, iHOs इस बिंदु से पहले विभाजित किया जाना चाहिए: iHOs के luminal cavities को मृत कोशिकाओं के साथ भरने के लिए शुरू, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को विघटित करने के लिए शुरू होता है, iHOs तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से बाहर हो जाना शुरू, या संस्कृति भी है घने और मीडिया के लिए बहुत जल्दी पीला जाना शुरू होता है ।

एक बार जब iho संस्कृति की स्थापना की है, अगर किसी भी समय ihos परिवर्तन की उपस्थिति या अपेक्षा से अलग है (उदाहरण के लिए, संस्कृतियों गोलाकार रहते हैं, के बजाय नवोदित), कोशिका मार्कर के लिए immunohistoरसायनशास्त्र और qpcr के माध्यम से फीनोटाइपिंग होना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए दोहराया जाता है कि ihos (जैसे, जाम कोशिकाओं, paneth कोशिकाओं) के भीतर कोशिका प्रकार के विभेदन बरकरार रहता है । यदि iHOs अब फर्क नहीं कर रहे हैं, तो वे छोड़ दिया और फिर से अलग किया जाना चाहिए या iHOs के एक पूर्व पारित होने thawed और पुनर्गठित किया जाना चाहिए । यदि iHOs अंतर करने के लिए संघर्ष, संभावित कारणों संस्कृति की उंर है (यदि यह 6 महीने से अधिक है), विकास कारकों की गतिविधि (यह सुनिश्चित करें कि इन निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठित कर रहे है और छोटे aliquots में जमे हुए रखा से बचने के लिए एकाधिक फ्रीज-thaw के चक्र), भी अक्सर या हिंसक मार्ग (सामान्य में, passaging केवल एक सप्ताह में एक बार होना चाहिए, और ihos मैन्युअल रूप से एक नियमित आधार पर भी सख्ती से वियोजित रहे हैं, तो वे पूरी तरह से अंतर करने के लिए संघर्ष करेंगे).

हम आरएनए अनुक्रमण के माध्यम से स्थापित किया है कि आईएल-22 उत्तेजना 18 एच संक्रमण से पहले रोगाणुरोधी जीन और बाधा रक्षा phenotype में शामिल लोगों Assays है के लिए नए iHsO के प्रयोग से पहले rhIL-22 के साथ prestimulation शामिल (या एक वैकल्पिक cytokine अगर इस प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है), यह cytokine द्वारा upregulated होने के लिए जाना जाता जीन की गतिविधि की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है (IL-22 के मामले में , हम iHOs की उत्तेजना के बाद qPCR के माध्यम से DUOX2 और LCN2) का इस्तेमाल किया, रिसेप्टर अभिव्यक्ति और अक्षुण्ण संकेत सुनिश्चित करने के लिए । पहले IL-22 का उपयोग करने के लिए, हम भी immunohistochemistry iHO संस्कृति के लिए IL-22 रिसेप्टर की अभिव्यक्ति बेसल था स्थापित करने के लिए आईएल 22 रिसेप्टर का पता लगाने के लिए बाहर किया मध्यम. हालांकि, अगर एक रिसेप्टर apically व्यक्त की है, इस प्रोटोकॉल के लिए लिगन्डों apically देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Microinjection प्रणाली के बारे में नुकसान आम तौर पर इंजेक्शन के लिए आवश्यक सुई की विनंरता से संबंधित हैं । यहाँ, हम एक 6 μm लुमेन के साथ वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध ड्रिल सुझावों का उपयोग करें । यह ग्लास केशिकाओं26 से इंजेक्शन सुई खींच संभव है, हालांकि यह कम वर्दी हो सकता है, सुई टिप या असंगत मात्रा ihos में इंजेक्शन किया जा रहा से रिसाव के लिए अग्रणी । यह सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन iHO lumen, जो एक डाई के रूप में phenol लाल के उपयोग के लिए एक कारण है में जगह ले ली है करने के लिए महत्वपूर्ण है; iHOs दिखाई विस्तार और लाल inoculum पकड़, निश्चितता के बारे में जो iHOs इंजेक्शन दिया गया है की अनुमति देगा । कभी कभार सुई iHO दीवार से मलबे के साथ रोकना होगा; यदि यह मामला है, iHO अंदर से सुई टिप निकालें और microinjection प्रणाली पर साफ बटन दबाएँ । यह उच्च हवा का दबाव है जो रुकावट साफ करना चाहिए की एक संक्षिप्त अवधि का उत्पादन होगा । यह भी थाली पर जीवाणु संरोप के कुछ रिसाव प्रेरित करेगा; इसलिए, यदि ऐसा होता है, तो साफ कार्रवाई सभी प्लेटों पर दोहराया जाना चाहिए प्रति थाली बैक्टीरियल संरोप की समानता सुनिश्चित करने के लिए । HiPSC-व्युत्पंन iHOs का एक बड़ा लाभ उनके आकार है । चूहों और प्राथमिक मानव ऑर्गेनॉयड से आंत्र ऑर्गेनॉइड बहुत छोटे होते हैं (~ १०० μm और 100 – 300 μm, क्रमशः27, बनाम 250-1500 μm के लिए hipsc-व्युत्पंन iHOs), जिसका अर्थ है कि ऑर्गेनॉइड की बड़ी मात्रा के इंजेक्शन धीमी हो जाएगा । यह बड़े पैमाने पर इंजेक्शन प्रयोगों hiPSC व्युत्पंन iHOs में trialed किया जा करने के लिए अनुमति देता है । यह भी उन के बाद संक्रमण फसल और मैंयुअल रूप से dpbs में ihos वियोजी, उनके luminal सामग्री जारी द्वारा ihos के luminal सामग्री का अध्ययन करने के लिए संभव है । Microinjection के लिए, हम बैक्टीरिया की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करने की सलाह देते हैं । हमने पाया है कि कम सांद्रता iHOs शामिल IECs से एक प्रतिक्रिया उत्पंन करने के लिए पर्याप्त नहीं थे । इसके अतिरिक्त, यह बाद में भली भांति microscopy का उपयोग कर बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए मुश्किल था । Inoculums के लिए अलग बैक्टीरियल उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

संक्षेप में, hipsc व्युत्पंन ihos सीधे आंत्र संक्रमण के लिए उपकला प्रतिक्रिया विदारक के लिए एक होनहार मॉडल प्रदान करते हैं, चाहे intracellular आक्रमण गिनती, इमेजिंग, iho supernatants में cytokine स्तर को मापने, या कटाई आरएनए का अध्ययन करके रोगजनकों के लिए जोखिम के बाद अध्ययन के ट्रांसक्रिप् शनल परिवर्तन । उनकी उपयोगिता मानव प्रतिबंधित रोगजनकों के लिए संक्रमण मॉडल की स्थापना के लिए भविष्य में और भी स्पष्ट हो जाएगा इस तकनीक का उपयोग करने के लिए विशिष्ट रोग से संबंधित आनुवंशिक परिवर्तन का अध्ययन करके अनुसंधान को निजीकृत करने की संभावनाओं का शोषण और नशीली दवाओं की प्रतिक्रियाएं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को वेलकम ट्रस्ट, गेट्स फाउंडेशन और कैम्ब्रिज बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर से फंडिंग ने सपोर्ट किया । E.A.L. एक नैदानिक पीएचडी छात्र वेलकम ट्रस्ट द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
5 mm glass bottom injection dishes MatTek corporation P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010
Alexa fluor 647 phalloidin Life Technologies A22287 Use at 1:1,000 concentration
B27 serum-free supplement Life Technologies 17504044 Stock concentration 50x, final concentration 1x
BMP-4 recombinant human protein R&D PHC9534 Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL
Cell recovery solution (cell lifting solution) BD 354253
CHIR99021 Abcam  ab120890-5mg Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM
Collagenase, type IV powder Life Technologies 17104019 Reconstitute at 0.1%
Corning cryogenic vials Corning 430487
Costar TC treated 24 well culture plates Corning CLS3527
DAPI dilactate Sigma-Aldrich D9564-10MG Use at 10 nM concentration
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) Life Technologies 14190-144
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662-100ML
Epidermal growth factor R&D 236-EG-200 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) Eppendorf 920000011
Eppendorf Femtojet express  (microinjection system) Eppendorf 5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) Life Technologies A2858501
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272-10ML Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL
Goat anti-Salmonella, CSA-1 Insight Biotechnology 02-91-99 Use at 1:20 concentration
HEPES 1 M Life Technologies 15630056
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) Gibco 10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement ThermoFisher
L-glutamine Life Technologies A2916801 Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
LY294002 Promega UK V1201 Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
MEM non-essential amino acids  solution (100x) Gibco 11140035
N2 serum-free supplement Life Technologies 17502048 Stock concentration 100x, final concentration 1x
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140163 Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL
Phenol red Sigma-Aldrich P0290-100ML
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter Eppendorf 5195000087
Prostaglandin E2 Sigma P0409-1MG Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM
Recombinant human FGF basic R&D 233-FB-025 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human IL-22 R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human Noggin R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL 
Recombinant human R-spondin1 R&D 4645-RS-025 Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL
Recombinant human/mouse/rat Activin A R&D 338-AC-050 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) Gibco 12648010
Retinoic acid Sigma-Aldrich  R2625-50MG Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) Life Technologies 61870010
Triton X-100 (cell lysis buffer) Sigma-Aldrich RES9690T-A101X Use at 1% concentration
Versene (EDTA solution) Life Technologies 15040066
Vitronectin XF Stemcell Technologies  7180
Y-27632 dihydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich Y0503-1MG Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM

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References

  1. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  2. Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  5. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  6. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
  7. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
  8. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  9. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  10. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
  11. Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
  12. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
  14. Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).
  15. Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
  16. Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
  17. Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
  18. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  19. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  20. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  21. Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
  22. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).
  23. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  24. Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  25. Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
  26. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  27. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण इश्यू १४७ ऑर्गेनॉइड आईएल-22 साल्मोनेला आंत्र उपकला hiPSC microinjection
मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग आंतों ऑर्गेनॉइड व्युत्पंन का अध्ययन करने और <em>साल्मोनेला</em> और अंय रोगज़नक़ों के खिलाफ उपकला कोशिका संरक्षण को संशोधित
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Lees, E. A., Forbester, J. L.,… More

Lees, E. A., Forbester, J. L., Forrest, S., Kane, L., Goulding, D., Dougan, G. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens. J. Vis. Exp. (147), e59478, doi:10.3791/59478 (2019).

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