Summary
인간 유도 만능 줄기 세포 (힙 Sc) 유래 장 소기관은 시험관 내 장 질환을 모델링할 수 있는 흥미로운 기회를 제공 합니다. 우리는 장내 유기 체 (iHOs)로의 분화를 입증 하 고, 이러한 iHOs를 사이토 킨과 함께 자극 하 고,이 호 루멘에 살 모 넬 라 티 피 뮤 리 움의 미세 주입을 가능 하 게 하 여 상피 침입에 대 한 연구를 가능케 합니다. 병원 체.
Abstract
상기 장 오 르가 노이 드 (이 호) 시스템은 인간 직감의 상피 내벽을 대표 하는 3 차원 구조물이 인간 유도 만능 줄기 세포 (힙 스) 로부터 생산 될 수 있고 배양에 유지 되며, 촉진 하는 흥미로운 기회를 제공 한다 장 용 성 감염에 대 한 상피 반응의 모델링. 생체 내에서 장 상피 세포 (IECs)는 장내 항상성 조절에 핵심적인 역할을 하며,이를 통해 발생 하는 메커니즘이 완전히 해명 되지 않더라도 병원 균을 직접적으로 억제할 수 있습니다. 상기 사이토카인 인터 루 킨)는 감염에 반응 하 여 항균 펩 티 드 및 케 모카 인의 방출을 유도 하는 것을 포함 하는, 창 자 상피 장벽의 유지 및 방어에 역할을 하는 것으로 나타났다.
우리는 지 하 막 기질 기지를 둔 장 문화 시스템에 그들을 포함 하기 전에 그들의 배양 매체에 특정 사이토카인 조합을 추가 하 여 iHOs로 건강 한 통제 힙 스 트의 분화를 기술 합니다. 일단 삽입 되 면 iHOs는 Noggin, CHIR99021, 표 피 성장 인자 EGF, 프로 스타 글란 딘 E2 및 Y-27632 디 히드로 클로 라 이드로 보충 된 매체에서 재배 됩니다. 이 호 초고 구조의 수동 중단에의 한 주간 구절은 일부는 크립 트/융 모 구조를 전시와 함께, budded iHOs의 형성에 이르게. 모든 iHOs는 각 세포의 서브셋, 투과 전자 현미경의 특정 마커에 대 한 면역 염색을 통해 확인 될 수 있는 잔 세포, 장 내 분 비 세포, 판 셀 및 편광 세포로 구성 된 분화 된 상피를 입증 (TEM) 및 정량적 PCR (qPCR)을 제공 한다. 감염을 모형 화 하기 위하여, 살 모 넬 라의 Enterica Serovar TYPHIMURIUM SL1344는 ihos의 루멘에 마이크로 주입 되 고 37 ° c에서 90 분 동안 인큐베이션 되며, 변성 겐 타 마이 신 보호 분석 법은 세포내의 수준을 확인 하기 위해 수행 세균 침공. 일부 iHOs는 또한 감염 되기 전에 재조합 인간 IL-22 (rhIL-22)로 전처리 되어이 사이토카인이 살 모 넬 라 감염 으로부터 보호 되는지를 확립 한다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 숙주-병원 체 상호작용에 대 한 연구가 ' 소기관 ' 모델의 개발에 의해 강화 되었고, 이때 장 상피의 3 차원 표현은 다양 한 조상에서 생산 될 수 있다. ' 일차 ' 소기관은 장내 생 검에서 수확 한 장 줄기 세포 로부터 직접 생성 될 수 있습니다. 또한, 장내 소기관은 힙 Scs 로부터 생성 될 수 있다. 동일은 많은 연구자 들이 사용 하는 위1, 간2, 췌 장3,4, 뇌5,6, 폐7및 전립선8 과 함께 수많은 조직 이라고 할 수 있습니다. 질병. 암9 및 약물 스크리닝 모델링을 포함 하 여, 소기관 시스템의 수많은 흥미로운 응용 프로그램이있지만, 여기에서 우리는 S를 사용 하 여 감염 모델로 ihos의 사용에 초점을 맞추고 있습니다 . 에 스 티 카 세르 바르 티 피 뮤 리 움 (s.. Typhimurium) 치료로 서 예시 적인 병원 체로 서 i l-22로 전처리 한다.
본 연구에서,이 호를 생성 하는 데 사용 되는이 호는 ' Kolf2 ' iPSCs로 서, 인간 유도 만능 줄기 세포 이니셔티브 컨소시엄 으로부터 이용 가능한 건강 한 개인 으로부터 생성 되 고 (www.hipsci.org), 특징의 개방 액세스 레퍼런스 패널 힙 라인11. 소기관에 대 한 조상로 서 힙 스를 사용 하는 장점 중 하나는 현재 광범위 한 기증자 iPSC 라인을 사용할 수 있다는 것입니다, 결과는 다른 유전 배경을 가진 세포 라인의 수에서 검증 할 수 있음을 의미. 또한 연구자 들이 특정 질병 관련 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs)를 보고 싶다면, CRISPR/Cas9를 사용 하 여 건강 한 세포 라인에서 돌연변이를 엔지니어 하 여 돌연변이 라인을 모두 생산 하 고 isogenic을 유지 하는 것이 가능 합니다. 비교를 위한 제어 라인12. 우리의 경험에서, 힙 스-유래 장 오 르가 노이 드는 보다 덜 기술적으로 어려운 미세 주입을 위해 만들고 잠재적으로 병원 균의 더 다양 한 범위를 허용, 그들의 주요 대응 보다 더 큰 규모와 문화에 일관성이 공부. iHOs는 극저온으로 보존 될 수 있으며 실험을 위한 재료를 생산 하기 위해이 호 문화를 최대 1 년까지 전파 했습니다.
생체 내에서, IECs는 장내 항상성 조절에 중요 한 역할을 하며,이 발생 하는 메커니즘이 잘 이해 되지 않더라도 병원 균을 직접적으로 억제할 수 있습니다. 사이토 카 인 i l-22는 장 상피 장벽 (13 )의 유지 관리에 역할을 하 고 감염14에 반응 하 여 항균 펩타이드 및 케 모카 인의 유도 및 분 비에 관여 하는 것으로 알려져 있다. 활성 T 세포 (특히, Th17 세포) 뿐만 아니라 천연 킬러 (NK) 세포에 의해 생성 되어, IL-22R1 및 IL-10R2 서브 유닛 (15)으로 구성 된 헤 테로이 성체 수용 체에 결합 한다. I l-22에 대 한 수용 체는 IECs에 basally로 표현 되어,이 호 모델에서 배양 액16에 첨가 하 여 단순하게 rhil-22와 함께 유기 oid를 전처리 할 수 있음을 의미 한다. 유기 체 시스템의 한 가지 단점은 다른 면역 세포 유형에 의해 정상적으로 전달 되는 관련 면역 반응이 결여 된다는 것 이다; 그러나, 모델은이17,18을 보다 잘 나타내기 위해 장 림프 구를 가진 유기 oid를 공동으로 시도 하는 것으로 떠오르고 있습니다.
이 호 모델의 감염을 시뮬레이션 하는 데는 마이크로 주입 시스템의 사용이 중요 하며,이는 생체 내 감염의 경우 발생 하는 바와 같이 상피의 표면에 병원 균을 직접 전달 하는 것을 허용 하기 때문입니다. 이 호에 주입 된 세균 용액에 페 놀 레드를 첨가 하 여 감염 된 것을 표시 하 고, 따라서 동일한이 호에 대 한 반복 주사를 회피 한다. 감염 모델링을 위한 용기로 서의 오 르가 노이 드와 같은 병원 균을 사용 하 여 성장 하 고 있으며, 헬리코박터염 ,19 개의 노로 바이러스,20 개의 시가 독 소 생성 대장균(22), 암호 화폐 (23)와 zika 바이러스 (24 )는 이러한 시스템 내에서 생존 하 고 복제 하는 것으로 나타났다. 이러한 기술은 감염에 대 한 인간 상피 반응에 대 한 직접적인 정보를 얻기 위해, 특히 원생 동물, 또는 인간 제한 병원 균과 같은 배양이 어려운 생물체에 광범위 한 병원 균에 적용 될 수 있다.
Protocol
1. 유도 만능 줄기 세포의 배양 및 패스 에이징
참고: 여기에 설명 된 모든 방법은 상업적으로 이용 가능한 인간 세포 주를 사용 한다. 아래에 자세히 설명 된 모든 조직 배양 작업은 클래스 II 층 류 후드에서 수행 해야 합니다. iPSCs는 정기적으로 줄기 세포 배양 배지 ( 재료 표참조)에서 유지 되며, 제조업체의 지침에 따라 주말에는 ipscs 문화를 허용 합니다. iPSCs는 상대적으로 쉽게 다른 Ipscs 문화 시스템에서 적응 될 수 있습니다.
- 콜로 니가 한 번 세포를 통과 하면 플레이트 표면의 약 80% ~ 90%가 커버 됩니다.
- 사용 하기 전에 통로 1 h에 대 한 플레이트를 준비 하 여, Dulbecco의 인산 완충 식 염 수 (DPBS)에 희석 한 vitronectin를 추가 하 여 조직 배양 처리 접시에 첨가 한다. 코팅에 대 한 볼륨은 플레이트 크기에 따라 다르며 제조업체의 지침에서 찾을 수 있습니다. 이 시간 동안, 줄기 세포 배양 액을 실 온 (RT)로 따뜻하게 한다.
- 통로를 위해 준비 된 iPSCs에서 매체를 제거 하 고 DPBS (Ca 또는 Mg 없이)로 2 배 세포를 씻으십시오.
- 플레이트에 EDTA 용액 ( 재료 표참조)을 추가 하 여 표면 전체를 5 ~ 8 분 동안 RT에서 코팅 하 고 배양 하십시오. 구멍이 iPSC 콜로 니의 중심에 나타나기 시작 하면, EDTA 용액을 흡 인 및 폐기 한다.
- 웰에 줄기 세포 배양 액을 추가 하는 단계; 플레이트 표면을 몇 번 부드럽게 세척 하 여 iPSCs를 분리 합니다. IPSCs는 단일 세포가 아닌 덩어리로 서 통행 하므로 EDTA 용액이 너무 오래 방치 되지 않았는지 확인 하십시오. 모든 분리 된 iPSCs를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
- 미리 코팅 된 플레이트에서 vitronectin를 흡입 하 고 줄기 세포 배양 액으로 대체 합니다. IPSC 현 탁 액을 여러 번 반전 하 여 Ipsc가 원뿔형 튜브의 바닥에 정착 하지 않았는지 확인 하 고 적절 한 서 스 펜 션 부피를 추가 하 여 새 플레이트에 세포의 1:10 희석을 제공 합니다. 분할 비율은 ipsc 성장 속도에 따라 조정 될 수 있으며,이는 iPSC 라인 들 사이에서 변할 수 있다.
- 플레이트를 표면에 분산 시키고 37 ° c/5% CO2의 인큐베이터에 놓습니다. 패스 에이징 후에는 iPSCs에 먹이를 준다.
2. iPSCs에서 후 각으로의 분화
- 제 0 일에는, 1.2 단계에서 기재한 바와 같이 vitronectin로 프리 코팅 된 10 cm 조직 배양 처리 접시에 ipscs를 분할 하 고 액티 빈 (10ng/ml)로 보충 된 줄기 세포 배양 배지를 10ml로 넣고 염기 성 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF; 12 ng/m l). 사용 하기 전에 미디어에 성장 인자를 직접 추가 하십시오. 이후의 모든 단계에서이 작업을 수행 합니다.
- 1 일째에 배지를 변경 하 여 배지 (줄기 세포 배양 액 10ml를 [10Ng/ml] + bFGF [12ng/ml]).
- 2 일째에는 배지를 다음의 성장 인자로 보충 된 10 mL 줄기 세포 배양 액으로 변경 하 여 분화를 시작 한다: 액티 빈 (100), bFGF (100 ng/m l), 골 형성 단백질 410ng/phosphoinositol 키나 제 억제제 LY294002 (10 μ m) 및 GSK3 억제제 CHIR99021 (3 μ m).
- 셋째 날, 액티 빈 (100 ng/ml)으로 보충 된 줄기 세포 배양 액 10 mL를 100 bFGF로 변경 하 고, LY294002 10 μ m) 및 104ng. 이 매체에 의해 유도 된 내 배 엽 사양은 다음 24 시간에 걸쳐 iPSC 콜로 니 형태에 대 한 가시적 변화를 초래 한다.
- 4 일째에는 액티 빈 (100 Ng/ml)과 bFGF (100 Ng/ml)로 보충 되는 10ml의 Rpmi/B27 미디어로 미디어를 변경 합니다.
참고: RPMI/B27 미디어에는 L-글루타민 보충제가 포함 된 500 mL의 RPMI 배지 ( 표 1참조), 10Ml의 B27 보충제 (50 배, 세럼 불포함) 및 5 ml의 불필요 한 아미노산이 들어 있습니다. 선택 사항: 1만의 페니실린-streptomycin를 추가 하십시오. 사용 전에 필터를 소독 하십시오. - 5 일째에는 액티 빈 (50 Ng/mL)으로 보충 된 10Ml/B-27 미디어를 미디어로 변경 합니다.
- 6 일째에, 후부 내 배 엽을 힌 더 트에 패터 닝 하기 시작 하 여, 배지를 CHIR99021 (6 μ m) + 레 틴 산 (3 μ m)으로 보충 된 10ML rpmi/B27 배지로 변경 한다.
- 7, 8및 9 일에 2.7 단계를 반복 합니다. 이 단계 동안, 후 각의 보이는 3 차원 구조는 플레이트의 표면을 덮고, 분명해 진다.
- 10 일째에는 지 하 막 매트릭스에 생성 된 힌 더 트를 포함 시킵니다 ( 재료 표참조).
3. 지하실 막 매트릭스에 힌 더 트의 임베딩
- 이 호 기저 성장 미디어 (500의 고급 Dulbecco의 수정 된 독수리의 배지 [DMEM]/F12, B27 보충제 10ml, 5ml(100x2 에틸) 1, 5 ml의 4, 5 밀리 (혈 청) 및 5ml(10ml)의 제 불필요 한 아미노산 [100 배]. 선택 사항: 페니실린-streptomycin 5 mL를 추가 하십시오 [1만 U/m l]; 사용 전에 필터를 소독 하십시오. 표 1참조).
-
힌 더 트 플레이트에서 미디어를 제거 하 고 DPBS (Ca 또는 Mg 제외)로 플레이트 1x를 씻으십시오. 상기 플레이트에 콜라 게 나 제 용액 5Ml를 넣고 5 분간 37 ° c에서 배양 한다.
- 콜라 게 나아 제 IV 분말 500 mg을 고급 DMEM/F12의 400 mL에 첨가 하 여 콜라 게 나아 제 용액을 생산 합니다. 그 다음에는 100 mL의 세럼 교체 ( 재료 표참조), 5ml(200 mM) 및 진단을의 3.5 μ l를 추가 하 고 용액을 섞어 줍니다. 필터-콜라 게 나아 제 분말이 완전히 용 해 되 면 용액을 멸 균 합니다.
참고: 이는 최대 6 개월 동안-20°c에서 더 작은 분 취에 보관할 수 있습니다.
- 콜라 게 나아 제 IV 분말 500 mg을 고급 DMEM/F12의 400 mL에 첨가 하 여 콜라 게 나아 제 용액을 생산 합니다. 그 다음에는 100 mL의 세럼 교체 ( 재료 표참조), 5ml(200 mM) 및 진단을의 3.5 μ l를 추가 하 고 용액을 섞어 줍니다. 필터-콜라 게 나아 제 분말이 완전히 용 해 되 면 용액을 멸 균 합니다.
- 이 호 염기 성장 매체 5 mL를 플레이트에 첨가 하 고, 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 후 각 세포를 긁어 내어 콜라 게 나아 제를 비활성화 하 고, 15 mL 원뿔형 튜브에서 힌 트 창 자 현 탁 액을 수집 한다.
- 240 x g 에서 1 분간 원심 분리기를 분리 하 고 상층 액을 피 펫 팅 합니다.
- 10 mL의 배지를 넣고, 힌 더를 부드럽게 피 펫 팅 하 여 더 작은 조각으로 분해 하 고, 1 분간 95 x g 에서 원심 분리기를 다시 분리 합니다.
- 3.5 단계를 반복 하 여이 호 염기 성장 매체에서 2 배 세포를 세척 한다. 기저 성장 배지 (~ 300 ~ 500 μ l)의 소량으로 세포를 소생 하 고이 용액의 약 100 μ l를 지 하 막 매트릭스 1.5 mL에 첨가 한다. 매트릭스는 RT에서 급속 하 게 응고 되기 시작할 것 이기 때문에이 시간 동안 얼음에 남아 있어야 합니다.
-
37 ° c에서 플레이트 히터에 24 웰 플레이트를 설치 하 고 24 웰 플레이트의 한 우물에 60 μ l를 발견. 그것을 짧게 설정 하 고 현미경의 밑에 조밀도를 확인 하는 것을 허용 하십시오.
- 필요한 경우, 원하는 농도가 달성 될 때까지 증가 하는 지 하 막 매트릭스에 더 많은 힌 더 트 솔루션을 추가 하 고 나머지 웰에 용액을 발견 하십시오.
- 10 분 동안 37 ° c에서 배양; 이어서, 다음 농도에서 24 웰 플레이트의 각 웰에 성장 인자를 포함 하는이 호 염기 성장 매체의 800 μ l를 첨가 한다 (표 1 참조): 500 ng/m l-100 스 폰 딘, 100 ng/ml CHIR99021, 2.5 μ m 프로 스타 글란 딘 E2 및 10 μ m Y-27632 디 히드로 클로 일 수화물 (락 억제제).
-
2 ~ 3 일에 한 번씩 또는 미디어가 변색 되기 시작 하면 즉시이 호 기본 성장 매체를 변경 하십시오. 기저 막 매트릭스로의 초기 시 딩 후, iHOs를 분할 하기 전에 7 일 동안 개발할 수 있습니다. 3 일째 ~ 4 일에는 문화에서 뚜렷한 구체 들이 보여야 합니다.
- 미디어 변경만을 위해 Y-27632을 생략 하 고 분할/시드에 필요한 경우에만 필요 합니다.
4. iHOs의 유지 및 통과
- 점진적 해 동을 허용 하기 위해, 분할 하기 전에 24 시간 밤에 덮여 얼음 양동이에 지하실 막 매트릭스의 필요한 부피를 넣어.
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IHOs에서 미디어를 제거 하 고 셀 리프팅 솔루션의 500 μ l (재료 표 참조)로 교체 하십시오. 40 ~ 50 분 동안 4°c에서 배양 하 고,이 시점에서 iHOs는 용액에 떠 있어야 합니다.
- 선택 사항: 인-후드 이미징 시스템을 사용 하 여 원하는 형태학을 가진 iHOs만 선택 하십시오 ( 재료 표참조).
- IHOs를 분해 하지 않기 위해이 호/세포 리프팅 솔루션 현 탁 액을 15 mL 원추형 튜브에 부드럽게 파이 펫 합니다. IHOs가 3 ~ 5 분 동안 정착 되도록 하 고 상층 액과 단일 세포를 제거 하십시오.
- 이 호 염기 성장 배지의 5 mL에 iHOs를 소생 시켜 부드럽게 씻어 냅니다. 2 분 동안 95 x g 에서 원심 분리기.
- 후드 내에서 37 ° c의 플레이트 히터에 24 웰 플레이트를 설치 합니다.
- 상층 액을 제거 하 고 P1000 파이 펫을 사용 하 여 기본 성장 매체의 iHOs를 ~ 300 ~ 500 μ l로 분리 하 여 iHOs를 더 작은 덩어리로 나눕니다. 적용 해야 하는 힘은이 호 선과 성숙 상태에 따라 달라 지므로 필요에 따라 부드럽게 시작 하 여 힘을 증가 시켜야 합니다.
- IHOs ~ 100 μ l (부피는 용액의 밀도에 따라 다름)을 지 하 막 매트릭스의 1.5 mL로 넣고 짧게 섞어 줍니다.
- 지하실 막 매트릭스의 1 x 60 μ l을 24 웰 플레이트의 웰에 넣고 30 초 동안 응고 시킨 다음 현미경으로 밀도를 확인 하십시오. 밀도가 너무 낮으면 행렬에 iHOs를 더 추가 합니다.
- 올바른 밀도가 확보 될 때까지 4.8 단계를 반복한 다음 나머지 매트릭스를 24 웰 플레이트에 넣습니다.
- 37 ° c에서 10 분간 배양 기에 넣고, 3.7 단계에서 설명한 바와 같이 성장 인자를 가진 염기 성장 배지의 800 μ l로 오버레이 한다.
-
침략 분석 실험에 대 한 iHOs를 준비 하기 위해 (아래에 요약 됨) 단계 4.1-4.10에 기술 된 바와 같이 실험 전에 iHOs 4-5 일을 통과 시키면서 4.7 단계에서 생성 된 매트릭스이 호 용액의 120 μ l를 유리 바닥에 5 mm의 마이크로 주입 접시에 넣습니다.
- 일상적인 통행과 마찬가지로 액 적으로이 호 현 탁 액을 떠나기 보다는, 접시의 바닥에 물방울을 펼쳐 매트릭스의 얇은 층을 만듭니다. 2.5 mL의 기본 성장 배지와 성장 인자를 포함 합니다.
참고: 항생제가 배양 배지에 사용 된 경우에, 이들은 제거 되 고 마이크로 주입 실험을 위한 비 항생제 보충 한 매체로 대체 되어야 합니다 .
- 일상적인 통행과 마찬가지로 액 적으로이 호 현 탁 액을 떠나기 보다는, 접시의 바닥에 물방울을 펼쳐 매트릭스의 얇은 층을 만듭니다. 2.5 mL의 기본 성장 배지와 성장 인자를 포함 합니다.
5. rhIL-22로 iHOs의 프레스
- IHOs에서 미디어를 흡입 하 고 침략 분석에 18 시간 전에 새로운 기본 성장 매체 (항생제를 포함 하지 않아야 함)로 대체 하십시오.
- 최종 농도 100 ng/mL에 rhIL-22를 배양 배지에 추가 합니다.
6. iHOs 및 세포내 침입 분석의 미세 주입
- 실험 전날에 S를 설정 합니다. 루 리아-베 르 타 니 브로스 10ml의 티 피 뮤 리 움 SL1344 배양을 하 고 밤새 37 ° c에서 진 탕 한다.
- 실험 당일 밀폐 된 열 챔버가 있는 현미경을 사용할 수 있는 경우,이를 켜고 분석을 시작 하기 전에 온도가 37 ° c에 도달 하도록 합니다.
- DPBS (Ca 및 Mg 함유)에서 하룻밤 세균 배양 액을 600 nm (OD600)의 광학 밀도로 희석 하 고, 그 다음에 페 놀 레드와 1:1을 섞어 줍니다.
- 현미경 단계에 iHOs를 포함 하는 마이크로 주입 접시를 로드 하 고, 뚜껑을 제거 하 고, 주입을 시작할 준비가 된 iHOs를 초점으로 가져옵니다.
- 인젝터와 arm 컨트롤 스테이션을 켜십시오. 인젝터가 600 kPa의 압력과 0.5 s의 사출 시간으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 이미 현미경 단계에서 백업 되지 않은 경우, 그것이 있는지 확인 하기 위해 주입 암을 돌립니다.
- 바늘에서 래핑 및 플라스틱 실린더를 제거 하 여 6 μ m 마이크로 인젝션 드릴 팁을 설정 합니다. 주입 암에서 그립 헤드를 제거 합니다.
- 드릴 팁을 접종 물의 10 μ l로 로드 하 고 드릴 팁을 무딘 끝에서 가볍게 파지 합니다. 드릴 팁을 그립 헤드에 넣고 마이크로 주입 암에 다시 부착 합니다.
-
바늘이 마이크로 주입 접시 위의 1 ~ 2cm 위치에 있도록 팔을 부드럽게 움직입니다. Arm 컨트롤을 사용 하 여 바늘 끝을 접시의 중앙에 배치 하 고 미디어 표면 바로 위에 있을 때까지 아래쪽으로 낮춥니다.
- 모든 주사 후이 시점에 바늘을 반환 하는 arm 제어 스테이션을 프로그래밍 합니다.
- IHOs에 현미경을 집중 하 고 주사 대상을 선택 합니다. 주사 되는이 호 바로 위와 오른쪽에 바늘을 위치 시켜이 호 루멘으로 바늘을 아래쪽으로 이동 시킨다.
- 마이크로 인젝터의 주입 버튼을 누릅니다. 페 놀-스테인드 세균 혼합물은 바늘에서 나타날 것입니다. 각이 호 3x를 주입 한다. 조건 당 최소 30 iHOs를 주입 합니다.
참고: 이 호 크기 및 구조 배양 내에서의 이질성으로 인해, 변이를 제어 하기 위해 다 수의 iHOs를 주입할 필요가 있다. - 필요한 모든 iHOs가 주입 되 면, 스테이지에서 마이크로 주입 판을 제거 하 고 뚜껑을 교체 하 고 90 분 동안 37 ° c에서 플레이트를 배양 합니다.
- 90 분 후, 성장 매체를 흡입 하 고 3 mL의 세포 리프팅 용액으로 교체 하십시오. 45 분 동안 4°c에서 배양 합니다.
- IHOs/세포 리프팅 용액을 DPBS 5Ml를 포함 하는 15 mL 원추형 튜브로 부드럽게 이동 시킵니다. 주입 된 모든 iHOs를 플레이트에서 제거 했는지 확인 하십시오 (필요한 경우 DPBS 1 mL로 플레이트를 헹 구 십시오). 3 분 동안 370 x g 에서 원심 분리기.
- 상 등 액을 제거 하 고 0.1에서 겐 타 마이 신을 함유 하는 기저 성장 배지에서 iHOs를 소생 시켰다 (1 mL의 배지를 첨가 하는 단계; 그런 다음 P1000 파이 펫 ~ 50 배를 사용 하 여 iHOs를 깨고 추가 미디어 4 mL를 첨가 하십시오).
- 세포 외 세균을 죽이기 위해 1 시간 동안 37 ° c에서 배양 한다.
- IHOs를 3 분 동안 370 x g 에서 원심 분리 하 고 상층 액을 흡입 하 여 가능한 적게 남겨 둡니다. DPBS로 iHOs 1x를 씻고 다시 원심 분리기.
참고: 이 단계는 겐 타 마 신을 제거 합니다, 어떤 남아 있는 겐 타 마이 신은 일단 세포가 분해 되 면 세포내 박테리아를 죽 일 수 있으므로 중요 하다. - 용 해 완충 액의 500 μ l ( 물질 표참조)에서 ihos를 소생 하 고 ~ 50 배를 피 펫 팅 하 여 유기 oid를 수동으로 해리 합니다. 이 혼합물을 RT에서 5 분간 두십시오.
- 얻어진 용액을 DPBS에서 순차적으로 10 배로 희석 하 여 10-1, 10-2및 10-3 농도를 생성 한다. 피 펫을 3 x 20 μ l의 액 적으로 미리 데워 진 LB 한 천 판에 희석 용액을 첨가 하였다.
- 37 ° c에서 밤새 배양 하 고 식민지 형성 단위 (CFU)의 콜로 니 계산 및 계산을 수행 한다. 식민지 수 세포 일차 과정에서 출시 된 세포내 박테리아의 숫자를 반영 합니다.
7. 세포 동결 및 회복
참고: 앞서 언급 한 바와 같이, iHOs를 극저온으로 보존 하 고 원할 때 다시 구성할 수 있습니다. 동결 및 융해 프로세스는 아래에 설명 되어 있습니다.
- 고정 하려는 iHOs의 우물을 선택 합니다. 웰에 셀 리프팅 솔루션을 추가 하 고 4°c에서 40 ~ 50 분 동안 배양 합니다. IHOs는 솔루션에 떠 있어야 합니다.
- 15 mL 원추형 튜브에 iHOs를 부드럽게 파이 펫 하 고 정착 할 수 있습니다. 매체를 제거 하 고 기본 성장 매체 (성장 인자 없음)로 iHOs 1x를 씻으십시오.
-
95 x g 에서 원심 분리기를 2 분 동안 상층 액을 제거 하 고 적절 한 부피의 세포 동결 배지로 교체 하십시오 (재료 표 참조). ihos를 극저온 바이 알로 데 운 다.
- 더 점진적 동결을 허용 하기 위해 하룻밤-80 ° c 냉동 기에 바이 알을 저장; 그런 다음 액체 질소 저장 장치에 전송 하십시오.
-
IHOs를 재구성 하기 위해, 물/비드 욕조를 사용 하 여 37 ° c에서 극저온 바이 알을 급속 하 게 해 동; 그런 다음 내용물을 기본 성장 배지 10ml로 부드럽게 피 펫 합니다 (성장 인자 없음). IHOs는 신선한 기본 성장 매체의 ~ 300 μ l로 미디어를 정착 하 고 대체할 수 있습니다.
- IHOs를 수동으로 해리 하지 마십시오. 지 하 막 매트릭스에 iHOs를 추가 하 고 섹션 3에 설명 된 대로 그들을 밖으로 접시.
Representative Results
분화 과정의 개시에이 어, 세포는 지 하 막 매트릭스에 매 립 하기 전에 힌 더 트 내 배 엽 형성의 단계를 거쳐 뒤에서 후 각을 패턴화 한다. 구형 체는 iHOs 성숙으로 몇 주에 걸쳐 명확 하 게 오염 물질의 많은 양의 문화와 문화를 형성 할 것 이다. 분화, 임베딩 및 패스 에이징 과정의 본보기 이미지는 그림 1에 나와 있습니다.
마이크로 주입 시스템의 설정은 그림 2에 설명 된 대로입니다. IHOs는 페 놀 레드/세균 용액으로 미세 주입 하 고 붉은 색을 유지 하 여 감염 된 iHOs의 식별을 허용 하 여 중복 주사를 방지 합니다. 도금 된 세포내 박테리아의 카운트는 변형 된 겐 타 마이 신 보호 분석 법에 따라 수행 된다; rhIL-22를 사용한 프레스는 S를 제한 합니다 . Typhimurium 감염, 더 적은 세포내 박테리아는 rhIL-22 치료 후 관찰 되 고 (그림 3). 또한 우리는 호스트의 IEC 세균 상호 작용의 가시화를 용이 하 게 하기 위해 면역 염색 또는 TEM에 대 한 감염 된 iHOs를 일상적으로 처리 합니다 (그림 4).
그림 1: iHOs에 대 한 iPSCs 분화 방향지정 IPSCs에서 iHOs로의 분화의 대표적인 서 열, 관찰 된 형태학 적 변화 및 이러한 변화를 유도 하는 데 필요한 성장 인자를 입증 한다. 결정적인 내 배 엽은 액티 빈 A, FGF, LY294002 및 CHIR99021의 조합의 특정 농도에 노출 된 다음 분화의 4 일째에 형성 된다. 8 일 후, CHIR99021 및 레 틴 산의 특정 농도로이 확실 한 내 배 엽의 패터 닝은 후 장 형성에서 결과. 포 스템 침구, 스 페 로이드 형성이 관찰 된다. 지지 지 하 막 매트릭스를 지 지체를 사용 하 여 지속적인 패스 에이징 후 장 증식 인자 R-스 폰 딘 1, Noggin, EGF, CHIR99021 및 프로 스타 글란 딘 E2를 보충 하는 배지와 중첩 하 여, 구상 된 iHOs로 구형이 진행 된다. (이미지는 4x ~ 10x 배율로 촬영) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:이 호를 S로 마이크로 인젝션 Typhimurium. (A) 환경 챔버 내에 밀폐 된 미세 분사 시스템 ( 재료 표참조); 이를 통해 제어 된 환경에서 iHOs를 사출 할 수 있습니다 (37 ° c/5% co2). (B) 세균 접종은 마이크로 인젝션 시스템에 부착 된 미세 모 세관을 이용 하 여이 호 루멘으로 직접 전달 된다. (C) 페 놀 레드와 세균 접종을 혼합 하 여, ihos가 감염 된 것을 분명 하 게 하 고, 따라서 동일한이 호에 대 한 중복 주사를 회피 한다. 이미지는 10 배 배율로 촬영 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Kolf2 세포 라인에서 유래 된 iHOs의 전처리는 rhIL-22를 사용 하 여 S를 제한 합니다 . Typhimurium SL1344 장 상피 세포에 침략. 겐 타 마이 신 보호 분석을 위해, iHOs는 감염 이전에 100 ng/mL rhIL-22 18 h로 처리 하거나, 치료 되지 않은 방치 하 고, 90 min 감염 증에 대해 인큐베이션 하였다. 데이터는 3 개의 생물학적 복제 ± SEM에 대 한 3 개의 기술 복제의 수단입니다. 중요 한 테스트를 위해,만 휘트니 U 시험은 사용 되었다; p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: IECs와 s. Typhimurium SL1344의 상호 작용 이 패널은 S로 주입 된 iHOs를 보여줍니다 . 티 피 뮤 리 움은 (A) 면역 형광 또는 (B) 투과 전자 현미경을 위해 고정 및 처리 하기 전에 3 시간 동안 인큐베이션 SL1344. 패널 A에서, 박테리아는이 호 루멘 내에서 보이고 상피와 상호 작용 한다. 핵은 4 ', 6didino-2-페니 린 돌 (블루), 세포 막에 phalloidin (빨간색), 그리고 CSA-1 (녹색)을 가진 박테리아로 염색 됩니다. 이미지는 20x 배율로 촬영 됩니다. 패널 B 는 침략 다음 살 모 넬 라의 세 가지 다른 세포내 처리 경로를 보여줍니다; 세균은 살 모 넬라 함유 군은 내에서 (a) 세포질내에서 자유 (c)를가 하는 것을 볼 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| RPMI/B27 매체 | |
| 구성 요소: | 금액: |
| 글루타민 보충이 포함 된 RPMI 1640 미디어 | 500 mL |
| B27 세럼 프리 보충제 50 배 | 10Ml |
| 이 호 기저 성장 배지 | |
| 구성 요소: | 금액: |
| 고급 DMEM/F12 | 500 mL |
| B27 세럼 프리 보충제 50 배 | 10Ml |
| N2 무 혈 청 보충제 100 배 | 5 mL |
| 허 스 1 M | 5 mL |
| L-글루타민 200 mM | 5 mL |
| 이 호 염기 성장 배지의 성장 인자 | |
| 구성 요소: | 금액: |
| 재조합 인간 R-spondin1 | 500 ng/mL |
| 재조합 인간 노 깅 | 100 ng/mL |
| 표 피 성장 인자 (EGF) | 100 ng/mL |
| 프로 스타 글란 딘 E2 | 2.5 µ M |
| CHIR99021 | 3 µ M |
| Y-27632 디 히드로 클로 라 이드 | 10 µ M |
표 1: 미디어 레시피
Discussion
이 프로토콜은 장 감염을 시뮬레이션 하는 모델로 서의 힙 스와 iHOs의 분화를 개략적으로 설명 합니다. 아래에서, 우리는 프로토콜의 중요 한 단계와 우리가 만든 수정 또는 개선 사항을 간략하게 설명 합니다.
이 프로토콜은 이전에 출판 된 작업25에 비해 힙 scs의 차별화 과정을 간소화 합니다. 이전에 사용 된 방법에서는 다른 힙 Sc 배양 시스템 (예: 피더 의존적 힙 시 컬쳐)에서 화학적으로 정의 된 배지-폴 리 비닐 알콜 (CDM-PVA)으로의 힙 Scs를 이전 해야 했습니다. 이 CDM-PVA로의 전달은 전형적으로 2-3 주를 소요 하며 매일 힙 Scs를 공급 해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 일관 되 게 효과적인, 일부 차별화 실패; 따라서 우리는 분화 일 0 ~ 3 시에 줄기 세포 배양 배지 (CDM-PVA가 아님)와 세포 증식 과정 중에 CDM PVA를 교체 하는 것과 동일한 성장 인자 들을 사용 하 여 분화를 시작 하였으나 간세포 배양 배지에서 성장 하였다. 이것은 지금까지 3 개의 독립적인 힙 라인에 성공적으로, 분화 과정을 훨씬 더 신속 하 고 효율적으로 만드는 것을 위해 성공 했습니다. 이는 또한 차별화에 앞서, 주말에는 힙 Scs의 배양을 허용 하 여, 힙 Sc 배양에서 더 많은 유연성을 허용 합니다. 본 방법에 의해 생성 된이 호 선은 우리가 이전에 힙 스 라인 Kolf2, Yemz1 및 Lise116 에 대해 설명 했던 바와 같이 장 상피의 마커에 대 한 표현 형이 고, 이전을 사용 하 여 생성 된 ihos에서 전형적으로 구별할 수가 없는 표현으로 나타난다 프로토콜.
시 딩 후, iHOs는 적어도 1 개월의 일상적인 통행을 필요로 하며, 성숙을 촉진 하기 위해 4 ~ 7 일 마다 분할 합니다. 사용 되는 iPSC 라인과 초기 배양의 밀도에 따라이 호 개발에 약간의 변동이 있을 것 이라는 점에 유의 한다. 처음 몇 구절 동안, iHOs 없는 눈에 띄는 오염 세포가 있을 것입니다. 이들은 결국, 구형의 깨끗 한 문화를 떠나 죽고, 약 4 주 후, budded iHOs. 또한, 인-후드 이미징 시스템은 원하는 형태학을 가진 iHOs만을 선택 하 고 통과 하는 데 사용 될 수 있다. IHOs 성숙으로, 그들은 성장 속도와 밀도에 따라 6 ~ 7 일 마다 분할이 필요 합니다. 다음 중 하나라도 발생 하면 iHOs는이 시점 이전에 분할 되어야 합니다. iHOs의 루미나 캐비티는 죽은 세포로 채우기 시작, 지하실 막 매트릭스는 분해 하기 시작, iHOs는 지하실 막 매트릭스에서 성장 하기 시작 하거나 문화는 너무 밀도가 높고 미디어가 매우 빠르게 노란색으로 이동 하기 시작 합니다.
일단이 호 배양이 확립 되 면, iHOs의 출현이 변경 되거나 예상과 다른 경우 (예를 들어, 배양은 신진 보다 구형으로 유지 됨), 세포 마커에 대 한 면역 조직 화학 및 qPCR을 통한 표현 형이 되어야 한다 iHOs 내의 세포 유형 (예를 들면, 잔 세포, Paneth 세포)의 분화가 그대로 유지 되도록 반복 한다. IHOs가 더 이상 차별화 되지 않으면 삭제 되 고 다시 분화 되거나 iHOs의 이전 통과가 해 동 및 재구성 되어야 합니다. IHOs 분화를 중단 하는 경우, 잠재적인 원인은 문화의 나이 이다 (그것은 6 개월 이상 된 경우), 성장 인자의 활동 (이 제조 업체의 지침에 따라 재구성 되 고 방지 하기 위해 작은 ali쿠오에 냉동 유지 여러 동결-해 동 주기), 너무 자주 또는 폭력적인 통로 (일반적으로, 패스 에이징은 일주일에 한 번만 발생 하며, iHOs가 정기적으로 너무 적극적으로 해리 되 면 완전히 분화가 중단 됩니다).
감염 이전에 i l-22를 자극 하는 RNA 시퀀싱을 통해 확립 된 항 미생물 유전자와 그 장벽 방어 표현 형에 관여 하는 사람들. 새로운 iHsO를 rhIL-22와 관련 된 분석에 사용 하기 전에 (또는 대체 사이토카인이이를 위해 사용 되는 경우), 사이토카인에 의해 상향 조절 되는 것으로 알려진 유전자의 활성을 확인 하는 것이 바람직합니다 (i l-22의 경우 iHOs의 자극 후 qPCR을 통해 DUOX2 및 LCN2)를 사용 하 여 수용 체 발현 및 온전한 신호를 보장 합니다. I l-22의 첫 번째 사용에 앞서, 우리는 또한 i l-22 수용 체의 발현이 기저에 있음을 확립 하기 위해 iHOs에서 i l-22 수용 체를 위치 시키기 위해 면역 조직 화학을 수행 하였으며,이 호 배양에 rhIL-22를 추가 하 여 간단 하 게이를 달성할 수 있음을 의미 매체. 그러나, 수용 체가 apically으로 발현 되는 경우에,이 프로토콜은 리간드를 apically으로 전달 하기 위하여 적응 될 수 있다.
마이크로 주입 시스템에 관한 함정 일반적으로 주사에 필요한 바늘의 진미와 관련. 여기서는 6 μ m 루멘으로 시판 되는 드릴 팁을 사용 합니다. 유리 모세 혈관26 에서 주사 바늘을 당길 수 있지만이는 덜 균일 할 수 있지만 ihos에 주입 되는 바늘 끝 이나 불일치 하는 체적 으로부터 누설을 유도 합니다. 주입이이 호 루멘으로 자리를 차지 하는 것을 확인 하는 것이 중요 하다,이는 염료로 페 놀 레드의 사용을 위한 하나의 이유입니다; iHOs는 붉은 종 균을 눈에 띄게 확장 하 고 유지 하 여 iHOs가 주입 된 것에 대 한 확실성을 허용 합니다. 때때로 바늘은이 호 벽에서 파편으로 막히게 됩니다. 이 경우,이 호 내부에서 바늘 끝을 제거 하 고 마이크로 주입 시스템의 청소 버튼을 누릅니다. 이 막힘을 취소 해야 높은 공기 압력의 짧은 기간을 생산할 예정 이다. 또한 상기 플레이트 상에 세균 접종 물의 일부 누설을 유도할 것 이다; 따라서,이 경우, 깨끗 한 작용은 플레이트 당 세균 접종 량의 평등을 보장 하기 위해 모든 플레이트에 반복 되어야 한다. 힙 Sc에서 파생 된 iHOs의 한 가지 큰 장점은 크기입니다. 마우스와 1 차 인간가 노이 드의 장 소기관은 훨씬 더 작습니다 (힙 Sc 유래 iHOs에 대 한 최대 ~ 100 μ m 및 100-300 μ m, 각각27~ 250 μ m의 측정), 다량의 소기관의 주사가 느릴 것을 의미 합니다. 이를 통해 더 큰 규모의 주입 실험을 힙 Sc 유래 iHOs에 세 배로 할 수 있습니다. 그것은 또한 그들에 게 사후 감염을 수확 하 고 수동으로 DPBS에 iHOs를 해리 하 여 iHOs의 루미나 콘텐츠를 연구 하는 것이 가능 그들의 루미나 콘텐츠를 방출. 마이크로 주입을 위해, 우리는 박테리아의 고 농도를 사용 하는 것이 좋습니다. 우리는 낮은 농도가 Iecs를 포함 하는 IECs 로부터 응답을 생성 하기에 충분 하지 않다는 것을 발견 하였다. 추가적으로, 현미경 검사 법을 사용 하 여 내 면화 한 박테리아를 나중에 찾아내는 것은 어려웠습니다. 접종은 다른 세균 균 주에 최적화 되어야 할 수 있습니다.
요약 하자면, 힙 Sc 유래 iHOs는 세포내 침입 카운트를 연구 하 여, 이미징,이 호 상층 액의 사이토카인 수준을 측정 하는 것이 든 지 장 감염에 대 한 상피 반응을 직접 해 부 하기 위한 유망한 모델을 제공 하며, 또는 수확 된 RNA 병원 균에 노출 된 후 전사 변화를 연구 합니다. 그들의 유틸리티는 인간 제한 병원 체에 대 한 감염 모델을 구축 하 고 특정 질병 관련 유전 변이를 연구 하 여 개인의 조사를 개인화 하기 위해이 기술을 사용 하는 가능성을 악용에 대 한 미래에 더욱 명백 할 것 이다 및 약물 반응.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 웰컴 트러스트, 게이츠 재단 및 캠브리지의 생물 의학 연구 센터의 자금 지원을 통해 지원 되었습니다. E.A.L.는 웰 컴 트러스트에 의해 지원 되는 임상 박사 학생입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
References
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