Summary
Human inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)-härledda intestinala organoider erbjuder spännande möjligheter att modellera enteriska sjukdomar in vitro. Vi visar differentiering av hiPSCs i intestinal organoider (iHOs), stimulering av dessa iHOs med cytokiner, och mikroinjektion av salmonella typhimurium i iho lumen, möjliggör studiet av en epitelial invasion av denna Patogen.
Abstract
Den intestinala "organoid" (iHO) system, där 3-D strukturer representativa för epitelial slem hinnan i den mänskliga tarmen kan framställas från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och upprätthålls i kulturen, ger en spännande möjlighet att under lätta av epitelial respons på enteriska infektioner. In vivo, intestinal epitelceller (IECs) spelar en viktig roll i regleringen av intestinal homeostas och kan direkt hämma patogener, även om de mekanismer som detta sker inte är helt klarlagd. Den cytokin interleukin-22 (Il-22) har visat sig spela en roll i upprätthållandet och försvaret av tarmen epitelial barriär, inklusive inducera en frisättning av antimikrobiella peptider och chemokiner som svar på infektion.
Vi beskriver differentiering av friska kontroll hiPSCs i iHOs via tillsats av specifika cytokin kombinationer till deras odlings substrat innan bädda in dem i en källare membran Matrix-baserade prointestinal kultur system. När inbäddade, den iHOs odlas i media kompletteras med noggin, R-spondin-1, Epidermal tillväxtfaktor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, och Y-27632 dihydroklorid monohydrat. Veckovis passager av manuella störningar i iHO ultrastruktur leda till bildandet av spirade iHOs, med vissa uppvisar en krypta/villus struktur. Alla iHOs Visa ett differentierat epitel bestående av bägare celler, enteroendokrina celler, Paneth celler, och polariserade enterocyter, som kan bekräftas via immunofärgning för specifika markörer för varje cell delmängd, transmission elektronmikroskopi (TEM) och kvantitativ PCR (qPCR). För att modellera infektion, salmonella enterica serovar TYPHIMURIUM SL1344 är microinjected in i lumen av ihos och inkuberas för 90 min vid 37 ° c, och en modifierad gentamicin skydds analys utförs för att identifiera nivåerna av intracellulära bakterie invasion. Vissa iHOs är också förbehandlade med rekombinant humant IL-22 (rhIL-22) före infektion för att fastställa om detta cytokin är skyddande mot salmonella infektion.
Introduction
Under de senaste åren, studiet av Host-patogen interaktioner har förbättrats genom utvecklingen av "organoid" modeller, vari 3-D representationer av intestinal epitel kan framställas från olika stamceller. "Primära" organoider kan genereras direkt från intestinala stamceller som skördas från intestinal biopsier. Dessutom kan intestinal organoider genereras från hiPSCs. Samma kan sägas om många vävnader, med gastric1, lever2, bukspottskörteln3,4, hjärnan5,6, lung7, och prostata8 organoider som används av många forskare för att modellera Sjukdom. Det finns många spännande tillämpningar av organoid-systemet, inklusive modellering cancer9 och drog screening10, men här fokuserar vi på användningen av ihos som en infektions modell, med hjälp av S. enterica serovar typhimurium (S. Typhimurium) som en exemplarisk patogen och förbehandling med IL-22 som en terapi.
I denna studie, den hiPSCs som används för att generera iHO är "Kolf2" iPSCs, genereras från en frisk individ och tillgänglig från den mänskliga inducerad Pluripotent Stem Cells initiativ Consortium (HipSci; www.hipsci.org), en öppen till gång referens panel av kännetecknas hiPSC-linjerna11. En fördel med att använda hiPSCs som progenitorer för organoider är att det nu finns omfattande banker av friska givare iPSC linjer tillgängliga, vilket innebär att resultaten kan val IDE ras i ett antal cellinjer med olika genetiska bakgrunder. Dessutom, om forskarna vill titta på specifika sjukdomsassocierade enstaka nukleotid polymorfismer (SNP), är det möjligt att använda CRISPR/Cas9 att iscensätta mutationer i en hälsosam cellinjen, vilket ger både en mutant linje och behålla den isogena kontroll ledning för jämförelse12. Enligt vår erfarenhet är hipsc-härledda intestinal organoider större i storlek än sina primära motsvarigheter och mer konsekvent i kulturen, vilket gör för en mindre tekniskt utmanande Mikroskop och potentiellt tillåta ett mer varierat spektrum av patogener som ska Studerade. iHOs kan vara krygeniskt bevaras, och vi har propagerat iHO kulturer för upp till ett år att producera material för experiment.
In vivo, IECs spelar en viktig roll i regleringen av intestinal homeostas och kan direkt hämma patogener, även om de mekanismer som detta sker inte är väl förstått. Den cytokin Il-22 är känd för att ha en roll i upprätthållandet av tarmen epitelial barriär13 och är involverad i induktion och utsöndring av antimikrobiella peptider och chemokiner som svar på infektion14. Det produceras av aktiverade T-celler (särskilt Th17 celler) samt av naturliga Killer (nk) celler och binder till en heterodimeriskt receptor som består av Il-22r1 och Il-10r2 subenheter15. Receptorn för IL-22 uttrycks basalt på IECs, vilket innebär att i iHO-modellen är det möjligt att förbehandla organoider med rhIL-22 helt enkelt genom sitt tillägg till kultur medium16. En nackdel med det organoid systemet är att det saknar tillhör ande immun svar normalt levereras av andra immun celler typer; emellertid, modeller växer fram som försöker coculture organoider med intestinala lymfocyter för att bättre representera detta17,18.
Användningen av Mikroskop systemet är nyckeln till att simulera infektioner i iho modellen, eftersom detta möjliggör direkt leverans av patogener till apikala ytan av epitelet, som skulle inträffa i fallet med in vivo infektion. Tillsatsen av fenol röd till bakteriell lösning injiceras i iHO markerar de som har smittats, därmed undvika upprepade injektioner av samma iHO. Organoider som fartyg för infektions modellering växer i användning, med patogener såsom Helicobacter pylori,19 den Norovirus,20 rot AVI Rus,21 Shiga toxin-producerande Escherichia coli22, Cryptosporidium23, och Zika virus24 har visat sig överleva och replikera inom dessa system. Denna teknik skulle kunna tillämpas på ett bredare spektrum av patogener, särskilt till organismer som är svåra att odla, såsom protozoer, eller mänskliga begränsade patogener, för att få direkt information om det mänskliga epiteliala svaret på infektionen.
Protocol
1. odling och passning av inducerade pluripotenta stamceller
Anmärkning: Alla metoder som beskrivs här använder kommersiellt tillgängliga mänskliga cellinjer. All vävnad kultur arbete beskrivs nedan bör göras i en klass II laminärt flöde huva. iPSCs upprätthålls rutinmässigt i stamceller odlings substrat (se material tabell), enligt tillverkarens instruktioner, vilket gör en helg-fri kultur ipscs. iPSCs kan anpassas från andra iPSC kultur system med relativ lätthet.
- Passage cellerna när kolonierna täcker cirka 80% – 90% av plattytan.
- Förbered plattorna för passagen 1 h före användning genom att tillsätta vitronectin 10 μg/mL utspädd i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS; utan kalcium [ca] eller magnesium [mg]) till vävnads-kulturbehandlade plattor. Beläggnings volymerna är beroende av plattans storlek och finns i tillverkarens anvisningar. Under denna tid, varm stamcells odlings medium till rums temperatur (RT).
- Ta bort media från iPSCs redo för passage och tvätta cellerna 2x med DPBS (utan ca eller mg).
- Tillsätt EDTA-lösning (se material tabellen) till plattorna och se till att hela ytan är belagd och INKUBERA vid rt i 5 – 8 min. När hålen börjar dyka upp i mitten av iPSC-kolonierna, aspirera och kassera EDTA-lösningen.
- Tillsätt stamcells odlings substrat till brunnarna. ta bort de iPSCs genom att försiktigt tvätta media över plattytan några gånger. Ipscs är passe som klumpar och inte som enstaka celler, så se till att EDTA-lösningen inte är kvar för länge. Flytta eventuella avlämnade iPSCs till en 15 mL konisk tub.
- Aspirera vitronectin från de förbelagts plattorna och ersätt det med stamceller odlings substrat. Invertera iPSC SUS pensionen ett antal gånger för att se till att iPSCs inte har fast på botten av den koniska röret, och tillsätt lämplig volym av SUS pensionen för att ge en 1:10 utspädning av celler på en ny tallrik. Delnings kvoterna kan justeras beroende på den iPSC tillväxt takten, som kan variera mellan iPSC linjer.
- Häll plattan för att skingra iPSCs över ytan och placera den i en inkubator på 37 ° c/5% CO2. Mata iPSCs dagen efter passage.
2. differentiering från iPSCs till hindgut
- På dag 0, dela ipscs på en 10 cm vävnad-kulturbehandlad mat rätt, förbelagts med vitronectin som beskrivs i steg 1,2, i 10 ml stamceller odlings substrat kompletteras med Activin a (10 ng/ml) + grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bfgf; 12 ng/ml). Tillsätt tillväxtfaktorerna till mediet direkt före användning. göra detta i alla efterföljande steg.
- På dag 1, ändra media (10 ml stamceller odlings substrat med Activin A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).
- På dag 2, börja differentieringen genom att ändra media till 10 ml stamcells odlings medium kompletterat med följande tillväxtfaktorer: Activin a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), benmorfogent protein 4 (BMP-4; 10 ng/ml), fosfoinositol 3- kinashämmare LY294002 (10 μM) och GSK3-hämmare CHIR99021 (3 μM).
- På dag 3, ändra media till 10 ml stamcells odlings medium kompletterat med Activin a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) och LY294002 (10 μM). Endoderm specifikation inducerad av denna Media bör resultera i synliga förändringar i iPSC kolonin morfologi under de närmaste 24 h.
- På dag 4, ändra media till 10 ml RPMI/B27 Media kompletteras med Activin a (100 ng/ml) och bFGF (100 ng/ml).
Anmärkning: RPMI/B27 media innehåller 500 mL RPMI medium med L-glutamin tillägg (se tabell 1), 10 ml av B27 tillägg (50x, serum fritt), och 5 ml icke-essentiella aminosyror. Tillval: Tillsätt 5 mL penicillin-streptomycin (10 000 U/mL). Filter-sterilisera före användning. - På dag 5, ändra media till 10 ml RPMI/B-27 Media kompletteras med Activin a (50 ng/ml).
- På dag 6, att börja möngra den bakre endoderm till hindgut, ändra media till 10 ml av RPMI/B27 Media kompletteras med CHIR99021 (6 μm) + retinoinsyra syra (3 μm).
- På dag 7, 8och 9upprepar du steg 2,7. Under dessa steg, synliga 3-D strukturer av hindgut bör bli uppenbara, täcker ytan av plattan.
- På dag 10, bädda in den resulterande hindgut i källaren membran matris (se material tabell).
3. inbäddning av hindgut i Basement membran Matrix
- Make up iHO base Growth media (500 mL av Advanced Dulbecco modifierade Eagle ' s medium [DMEM]/F12, 10 mL B27-tillägg [50x, serum fritt], 5 mL N2-tillägg [100x, serum fritt], 5 mL 1 M 4-(2-hydroxyeyl) -1-piperazineetylsulfonsyra (HEPES) och 5 mL icke-essentiella aminosyror [100x]. Tillval: Tillsätt 5 mL penicillin-streptomycin [10 000 U/mL]; filtersterilisera före användning. Se tabell 1).
-
Ta bort mediet från hindgut plattan och tvätta plattan 1x med DPBS (utan ca eller mg). Tillsätt 5 mL kollagenaslösning till plattan och inkubera vid 37 ° c i 5 minuter.
- Producera kollagenaslösning genom att tillsätta 500 mg kollagenas IV pulver till 400 mL avancerad DMEM/F12. Efter detta, tillsätt 100 mL av serum ersättning (se material tabell), 5 ml L-glutamin (200 mm), och 3,5 μl av 2-merkaptoetanol, och snurra lösningen för att blanda. Filtrera-sterilisera lösningen när kollagenaspulvret är helt upplöst.
Anmärkning: Detta kan förvaras vid-20 ° c i upp till 6 månader i mindre Ali kvoter.
- Producera kollagenaslösning genom att tillsätta 500 mg kollagenas IV pulver till 400 mL avancerad DMEM/F12. Efter detta, tillsätt 100 mL av serum ersättning (se material tabell), 5 ml L-glutamin (200 mm), och 3,5 μl av 2-merkaptoetanol, och snurra lösningen för att blanda. Filtrera-sterilisera lösningen när kollagenaspulvret är helt upplöst.
- Inaktivera kollagenasen genom att tillsätta 5 mL av iHO: s bas tillväxtmedia till plattan och skrapa av hindgut-cellerna med hjälp av en cell skrapa och samla upp hindgut-SUS pensionen i ett 15 mL koniskt rör.
- Centrifugera vid 240 x g i 1 min och Pipettera av supernatanten.
- Tillsätt 10 mL media, Bryt upp hindgut i mindre bitar genom att Pipettera försiktigt och centrifugera igen vid 95 x g i 1 min.
- Tvätta cellerna 2x i iHO bas tillväxtmedia genom att upprepa steg 3,5. Omsuspendera cellerna i en liten volym av bas odlings substrat (~ 300 – 500 μL) och tillsätt runt 100 μL av denna lösning till 1,5 mL av källaren membran matris. Matrisen måste förbli på isen under denna tid eftersom det kommer att börja stelna snabbt vid RT.
-
Ställ upp en 24-brunn platta på en plattvärmare vid 37 ° c och spot ut 60 μL i en brunn av 24-well plattan. Låt den ställa in kort och kontrol lera densiteten under ett Mikroskop.
- Om det behövs, tillsätt mer hindgut lösning till källaren membran matris i steg tills önskad koncentration uppnås, och spot ut lösningen i de återstående brunnarna.
- Inkubera vid 37 ° c i 10 min; Tillsätt sedan 800 μL av iHO bas tillväxtmedia som innehåller tillväxtfaktorer till varje brunn av 24-brunnen plattan vid följande koncentrationer (se tabell 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml noggin, 100 ng/ml Epidermal tillväxtfaktor (EGF), 3 μM CHIR99021, 2,5 μM prostaglandin E2 och 10 μM Y-27632 dihydrokloridmonohydrat (ROCK-hämmare).
-
Ändra iHO bas tillväxtmedia var 2 – 3 dagar, eller omedelbart om mediet börjar missfärgar. Efter den första sådd i källaren membran matris, låt iHOs att utveckla för 7 dagar innan dela dem. På dag 3 – 4 ska distinkta sfärer synas i kulturen.
- För Media förändring ensam, utelämna Y-27632, eftersom detta endast krävs vid uppdelning/seedning.
4. underhåll och passage av iHOs
- För att möjliggöra gradvis upptining, lägga ut den erforderliga volymen av källaren membran matris i en täckt ishink vid 4 ° c över natten, 24 h före uppdelning.
-
Ta bort media från iHOs och ersätta den med 500 μL av cell-lyft lösning (se material tabell) per brunn. Inkubera vid 4 ° c i 40 – 50 min, vid vilken punkt iHOs bör sväva i lösningen.
- Tillval: Använd en in-Hood Imaging system för att välja endast iHOs med önskad morfologi (se material tabell).
- Pipettera försiktigt iHO/cell lyft lösning SUS pensionen i 15 mL koniska rör, försöker att inte bryta upp iHOs. Låt IHOs att nöja sig med 3-5 min och ta bort supernatanten och enstaka celler.
- Omsuspendera iHOs i 5 mL av iHO bas tillväxt medium och Pipettera dem försiktigt för att tvätta. Centrifugera vid 95 x g i 2 min.
- Ställ upp en 24-well skylt på en plattvärmare vid 37 ° c i huven.
- Ta bort supernatanten och omsuspendera iHOs i ~ 300-500 μL av bas tillväxtmedia, med hjälp av en P1000 pipett att bryta upp iHOs i mindre bitar. Observera att den kraft som måste tillämpas kommer att variera beroende på iHO linje och mognads läge, så börja försiktigt, öka kraften om det behövs.
- Placera ~ 100 μL av iHOs (volymen är beroende av densiteten av lösningen) i 1,5 mL av källaren membran matris och Pipettera kort för att blanda.
- Spot out 1 x 60 μL av källaren membran matris i en brunn av 24-well plattan, låt den stelna för ~ 30 s, och sedan kontrol lera tätheten under Mikroskop. Om densiteten är för låg, tillsätt fler iHOs till matrisen.
- Upprepa steg 4,8 tills rätt densitet förvärvas, och sedan Spot ut resten av matrisen i en 24-well tallrik.
- Placera den i en inkubator vid 37 ° c i 10 min och överlägg den sedan med 800 μL bas odlings substrat med tillväxtfaktorer, enligt beskrivningen i steg 3,7.
-
För att förbereda ihos för en invasion assay experiment (som beskrivs nedan), passage ihos 4-5 dagar före försöket som beskrivs i steg 4.1-4.10, men placera 120 μl av matrisen iho lösning som genereras i steg 4,7 i 5 mm glas botten Mikroskop rätter.
- Hellre än att lämna iHO SUS pensionen i en droppe som med rutinmässig passaging, sprida droplet över botten av skålen för att skapa ett tunt lager av matris. Täck det med 2,5 mL bas tillväxt medium plus tillväxtfaktorer.
Anmärkning: Om antibiotika har använts i odlings substrat, måste dessa avlägsnas och ersättas med icke-antibiotikum kompletterad media för Mikroskop experiment.
- Hellre än att lämna iHO SUS pensionen i en droppe som med rutinmässig passaging, sprida droplet över botten av skålen för att skapa ett tunt lager av matris. Täck det med 2,5 mL bas tillväxt medium plus tillväxtfaktorer.
5. prestimulering av iHOs med rhIL-22
- Aspirera media från iHOs och ersätta den med färska bas tillväxtmedia (som inte får innehålla antibiotika) 18 h före invasionen analysen.
- Tillsätt rhIL-22 till odlings mediet till en slutlig koncentration av 100 ng/mL.
6. mikroinjektion av iHOs och intracellulära invasion assays
- På dagen före experimentet, Ställ in S. Typhimurium SL1344 kultur i 10 mL av Luria-Bertani buljong och inkubera vid 37 ° c över natten med skakning.
- På dagen för experimentet, om ett Mikroskop med en sluten värme kammare finns, slå på den och låt temperaturen nå 37 ° c innan analysen påbörjas.
- Späd över natten bakterie kulturer i DPBS (som innehåller ca och mg) till en optisk densitet på 2 vid 600 Nm (OD600) och sedan blanda den 1:1 med fenol röd.
- Ladda Mikroskop skålen innehåller ihos på Mikroskop scenen, ta bort locket, och föra ihos i fokus, redo för injektionen att börja.
- Vrid på injektorn och arm kontroll stationerna. Se till att injektorn är inställd på ett tryck på 600 kPa och en insprutnings tid på 0,5 s. Om det inte redan backas bort från Mikroskop scenen, rotera injektions armen för att se till att den är.
- Ställ upp en 6 μm Mikroskop borr spets genom att ta bort omslaget och plast cylindern från nålen. Ta bort grepp huvudet från injektions armen.
- Fyll på borr spetsen med 10 μL av inokulatet och greppa borr spetsen försiktigt vid dess trubbiga ände. Placera borr spetsen i grepp huvudet och sätt tillbaka den i mikroinjektions armen.
-
Flytta armen försiktigt så att nålen ligger 1 – 2 cm ovanför mikroinjektions skålen. Använd armen kontroll för att placera nålen spetsen i mitten av skålen och Sänk den tills den är precis över ytan av media.
- Program mera armen kontroll stationen för att returnera nålen till denna punkt efter alla injektioner.
- Fokusera mikroskopet på iHOs och välj målet att injicera. Placera nålen precis ovanför och till höger om iHO att injiceras och flytta nålen nedåt och sidled i iHO lumen.
- Tryck på injicera knappen på microinjektorn; den fenol-färgade bakterie blandningen kommer ut ur nålen. Injicera varje iHO 3x. Injicera minst 30 iHOs per tillstånd.
Anmärkning: På grund av heterogenitet i iHO storlek och struktur inom en kultur, är det nödvändigt att injicera ett stort antal iHOs att kontrol lera för variation. - När alla erforderliga iHOs injiceras, ta bort mikroinjektions plattan från scenen, Byt ut locket, och inkubera plattan vid 37 ° c för 90 min.
- Efter 90 min, aspirera tillväxten median och sätta tillbaka den med 3 mL av cell lyftande lösande; Inkubera vid 4 ° c i 45 min.
- Flytta försiktigt iHOs/cells lyft lösning till ett 15 mL koniskt rör som innehåller 5 mL DPBS. Se till att alla injicerade iHOs har avlägsnats från plattan (skölj plattan med 1 mL av DPBS om det behövs). Centrifugera vid 370 x g i 3 min.
- Ta bort supernatanten och omsuspendera iHOs i bas tillväxt medier som innehåller gentamicin vid 0,1 mg/mL (tillsätt 1 mL av media, Använd sedan en P1000 pipett ~ 50x för att bryta upp iHOs, och tillsätt 4 mL ytterligare media).
- Inkubera vid 37 ° c i 1 h för att döda extracellulära bakterier.
- Centrifugera iHOs vid 370 x g i 3 min och aspirera supernatanten och lämna så lite som möjligt. Tvätta iHOs 1x med DPBS och centrifugera igen.
Anmärkning: Detta steg tar bort gentamicin, vilket är viktigt eftersom kvarvarande gentamicin kan döda intracellulära bakterier när cellerna lyseras. - Omsuspendera iHOs i 500 μL lyseringsbuffert (se material tabellen) och separera organoider manuellt genom att Pipettera ~ 50x. Lämna denna blandning i 5 min vid RT.
- Späda ut den resulterande lösningen 10 gånger i DPBS för att generera 10-1-, 10-2-och 10-3- koncentrationer. Pipettera 3 x 20 μL droppar av de snygga och utspädda lösningarna på förvärmda LB-agar-plåtar.
- Inkubera över natten vid 37 ° c och utför koloniräkning och beräkning av kolonibildande enheter (CFU). Colony räknar kommer att återspegla antalet intracellulära bakterier som släpptes under cell lyseringslösning processen.
7. cell frysning och återhämtning
Anmärkning: Som nämnts tidigare, det är möjligt att krygeniskt bevara iHOs och rekonstruera dem när så önskas. Frys-och upptinnings processerna beskrivs nedan.
- Välj brunnar av iHOs du vill frysa. Tillsätt cell lyft lösning till brunnarna och inkubera i 40 – 50 min vid 4 ° c. Den iHOs bör vara flytande i lösningen.
- Pipettera försiktigt in iHOs i ett 15 mL koniskt rör och låt dem bosätta sig. Ta bort mediet och tvätta iHOs 1x med bas tillväxtmedia (inga tillväxtfaktorer).
-
Centrifugera vid 95 x g i 2 min, avlägsna supernatanten och Ersätt den med en lämplig volym cell frys medium (se material tabell; Använd mediet enligt tillverkarens anvisningar), dekantering av ihos i kryogena injektions flaskor.
- Förvara flaskorna i frys i en-80 ° c över natten för att möjliggöra mer gradvis frysning. sedan, överföra dem till lagring av flytande kväve.
-
För att bereda iHOs, snabbt Tina en Kryogen injektions flaska vid 37 ° c med hjälp av en vatten/pärla bad; Pipettera därefter försiktigt in innehållet i 10 mL bas tillväxtmedia (inga tillväxtfaktorer). Låt iHOs att reglera och ersätta media med ~ 300 μL av färska bas tillväxtmedia.
- Inte manuellt dissociera iHOs. Tillsätt iHOs till källaren membran matris och platta ut dem som beskrivs i avsnitt 3.
Representative Results
Efter inledandet av differentierings processen, cellerna bör passera genom stadiet av definitiva endoderm formation följt av hindgut mönster innan bädda in i källaren membran matris. Sfäroider kommer att bilda och kulturer med stora mängder av kontaminerande material kommer att klara över en period av flera veckor som iHOs mogna. Föredöme bilder av differentiering, inbäddning och passaging processen visas i figur 1.
Inställningen av mikroinjektions systemet visas i figur 2. Den iHOs är microinjected med fenol röd/bakteriell lösning och behålla sin röda färg, vilket gör det möjligt att identifiera infekterade iHOs att förhindra dubbla injektioner. Räkningar av pläterade intracellulära bakterier utförs efter den modifierade gentamicin skydds analysen; prestimulering med rhIL-22 begränsar S. Typhimurium infektion, med färre intracellulära bakterier observeras efter rhIL-22 behandling (figur 3). Vi bearbetar också rutinmässigt infekterade iHOs för immunofärgning, eller TEM, för att under lätta visualisering av värden IEC-bakteriella interaktioner (figur 4).
Figur 1: riktad differentiering av iPSCs till iHOs. Representativ sekvens av differentiering från iPSCs till iHOs, vilket visar de morfologiska förändringar som observerats och de tillväxtfaktorer som krävs för att driva dessa förändringar. Definitiv endoderm bildas vid dag 4 av differentieringen, efter exponering för specifika koncentrationer av kombinationer av Activin A, FGF, BMP-4, LY294002 och CHIR99021. Efter 8 dagar, mönstret av denna definitiva endoderm med specifika koncentrationer av CHIR99021 och retinoinsyra resulterar i hindgut formation. Postembedding, spheroidbildande observeras. Efter ihållande passaging med hjälp av en stödjande källare membran matris överlagras med medium kompletteras med prointestinal proliferation faktorer R-spondin 1, noggin, EGF, CHIR99021, och prostaglandin E2, den sfäroider framsteg i spirade ihos. (Bilderna togs med 4x – 10x förstoring). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mikroinjektion av en iHO med S. Typhimurium. (A) mikroinjektions systemet (se material tabellen) innesluten i miljö kammaren. Detta möjliggör injektion av iHOs i en kontrollerad miljö (37 ° c/5% CO2). Bbakterien inokulatet levereras direkt till iho lumen med hjälp av en mikrokapillär ansluten till Mikroskop systemet. (C) genom att blanda bakteriella inoculums med fenol röd, är det klart vilka ihos har smittats, och därmed undvika dubbla injektioner av samma iHo. Bilderna togs med 10x förstoring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förbehandling av iHOs härrör från Kolf2 cellinjen med rhIL-22 begränsar S. Typhimurium SL1344 invasion i intestinal epitelceller. För gentamicin skydds analyser, behandlades iHOs med 100 ng/mL rhIL-22 18 h före infektion, eller lämnades obehandlad, och inkuberas för 90 min post infektion. Uppgifterna är medel för tre tekniska replikat för tre biologiska replikat ± SEM. För signifikanstester användes Mann-Whitney U-tester; p < 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: interaktion mellan iecs och S. typhimurium SL1344. Dessa paneler visar iHOs injiceras med S. Typhimurium SL1344 och inkuberas i 3 timmar före fixering och bearbetning för a)immunofluorescens eller (B) transmissionselektronmikroskopi. I panel A, bakterier ses inom iho lumen och interagera med epitelet. Kärnor är färgade med 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) dilactate (blå), cell membran med phalloidin (röd), och bakterier med CSA-1 (grön). Bilderna är tagna vid 20x förstoring. Panel B visar tre olika intracellulära behandlings vägar av salmonella efter invasion; bakterier ses (a) inom en salmonella-innehållande vacuole, (b) fritt inom cytoplasman, och (c) genomgår autophagy. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| RPMI/B27 medel | |
| Komponent: | Belopp: |
| RPMI 1640-media med glutamintillskott | 500-100 mL |
| B27 serum fritt tillägg 50x | 10 mL |
| iHO bas tillväxt medium | |
| Komponent: | Belopp: |
| Avancerad DMEM/F12 | 500-100 mL |
| B27 serum fritt tillägg 50x | 10 mL |
| N2 serum fritt tillägg 100x | 5 mL |
| HEPES 1 M | 5 mL |
| L-glutamin 200 mM | 5 mL |
| Tillväxtfaktorer för iHO bas tillväxt medium | |
| Komponent: | Belopp: |
| Rekombinant humant R-spondin1 | 500 ng/mL |
| Rekombinant humant noggin | 100 ng/mL |
| Epidermal tillväxtfaktor (EGF) | 100 ng/mL |
| Prostaglandin E2 | 2,5 μM |
| CHIR99021 | 3 μM |
| Y-27632 dihydrokloridmonohydrat | 10 μM |
Tabell 1: medie recept.
Discussion
Detta protokoll beskriver differentiering av hiPSCs i iHOs och deras nytta som en modell för att simulera enteriska infektioner. Nedan beskriver vi de kritiska stegen i protokollet och eventuella modifieringar eller förbättringar som vi har gjort.
Detta protokoll effektiviserar differentierings processen för hiPSCs jämfört med tidigare publicerat arbete25. Tidigare använda metoder krävde överföring av hiPSCs från andra hiPSC kultur system (t. ex. feeder-beroende hiPSC kultur) till kemiskt definierade medium-polyvinylalkohol (CDM-PVA). Denna överföring till CDM-PVA tar vanligt vis 2 – 3 veckor och kräver daglig utfodring av hiPSCs. Detta protokoll var inte heller konsekvent effektivt, och vissa differentieringar misslyckades. Därför har vi trialed differentiering med samma tillväxtfaktorer men börjar med hiPSCs odlas i stamceller odlings substrat (snarare än CDM-PVA) och utbyte av CDM-PVA med stamceller odlings substrat under differentiering dagar 0 – 3. Detta har varit framgångs rikt för de fem oberoende hiPSC linjer trialed hittills, vilket gör differentierings processen mycket snabbare och effektivare. Detta gör också helg-fri odling av hiPSCs före differentiering, vilket möjliggör mer flexibilitet i hiPSC kulturen. iHO linjer som produceras av denna metod har fenotypats för markörer för intestinal epitel som vi tidigare har beskrivit för hiPSC linjerna Kolf2, Yemz1, och Lise116 och visas fenotypiskt omöjlig att skilja från ihos produceras med hjälp av tidigare Protokollet.
Efter seedning, iHOs kräver minst 1 månad av rutinmässig passaging, med uppdelning var 4 – 7 dagar för att under lätta mognad. Observera att det kommer att finnas en viss variation i iHO utveckling beroende på iPSC linje som används och tätheten av den ursprungliga kulturen. Under de första avsnitten, kommer det att finnas synligt kontaminerande celler som inte är iHOs. Dessa kommer så småningom att dö, lämnar en ren kultur av sfäriska och efter cirka 4 veckor, spirade iHOs. Dessutom kan ett in-Hood bild system användas för att välja och passage endast iHOs med önskad morfologi. Som iHOs mogna, de kommer att kräva uppdelning var 6 – 7 dagar, beroende på tillväxt takten och densitet. Om något av följande inträffar, iHOs bör delas före denna punkt: den Luminal kaviteter av iHOs börjar att fylla upp med döda celler, källaren membran matris börjar upplösas, den iHOs börja växa ur källaren membran matris, eller kulturen är för tät och mediet börjar gå gult mycket snabbt.
När iHO kulturen är etablerad, om när som helst utseendet på iHOs förändringar eller är annorlunda än väntat (till exempel, kulturerna förblir sfäriska, snarare än spirande), fenotypning via immunhistokemi och qPCR för cell markörer bör vara upprepas för att säkerställa att differentieringen av cell typerna inom iHOs (t. ex. bägare celler, Paneth celler) förblir intakt. Om iHOs inte längre differentierar, då de bör kasseras och redifferentiated eller en tidigare passage av iHOs bör Tinas och rekonstitueras. Om iHOs upphöra att differentiera, de potentiella orsakerna är ålder av kulturen (om det är över 6 månader gamla), aktiviteten av tillväxtfaktorerna (se till att dessa rekonstitueras enligt tillverkarens instruktioner och hålls frysta i små Ali kvoter för att undvika flera frys-tö cykler), alltför frekventa eller våldsamma passager (i allmänhet, passaging bör endast ske en gång i veckan, och om iHOs är manuellt separerade alltför kraftigt på en regelbunden basis, kommer de att upphöra att helt differentiera).
Vi etablerade via RNA-sekvensering som Il-22 stimulering 18 h före infektion uppreglerar antimikrobiella gener och de som är inblandade i barriären försvar fenotyp. Innan användning av nya iHsO för analyser som involverar prestimulering med rhIL-22 (eller en alternativ cytokin om systemet används för detta), är det tillrådligt att kontrol lera aktiviteten av gener som är kända för att vara uppreglerad av cytokin (i fallet med IL-22 , vi använde DUOX2 och LCN2) via QPCR efter stimulering av ihos, för att säkerställa receptor uttryck och intakt signalering. Före den första användningen av IL-22, vi också genomfört immunhistokemi att lokalisera IL-22-receptorn på iHOs att fastställa att uttrycket av IL-22 receptorn var basal, vilket innebär att prestimulering kan uppnås genom att lägga rhIL-22 till iHO kulturen Medium. Men om en receptor är apically uttryckt, kan detta protokoll måste anpassas för att leverera ligander apically.
Fall gro par avseende mikroinjektions systemet är i allmänhet relaterade till delikatess av de nålar som krävs för injektionen. Här använder vi kommersiellt tillgängliga borr spetsar med 6 μm lumen. Det är möjligt att dra injektionsnålar från kapillärer i glas26 även om detta kan vara mindre enhetliga, vilket leder till läckage från nålspetsen eller inkonsekvent volymer injiceras i ihos. Det är viktigt att vara säker på att injektionen har ägt rum i iHO lumen, vilket är en orsak till användningen av fenol röd som ett färg ämne; den iHOs kommer synligt expandera och hålla den röda inoculum, vilket gör att säkerhet om vilka iHOs har injicerats. Ibland nålar kommer att täppa med skräp från iHO väggen; om så är fallet, ta bort nålspetsen inifrån iho och tryck på Clean -knappen på Mikroskop systemet. Detta kommer att producera en kort period av högre luft tryck som bör rensa blockeringen. Det kommer också att framkalla ett läckage av bakterien inokulatet på plattan; Därför, om detta inträffar, bör den rena åtgärden upprepas på alla plattor för att säkerställa lika behandling av bakteriefinoculum per platta. En stor fördel med hiPSC-derived iHOs är deras storlek. Intestinal organoider från möss och primära mänskliga organoider är mycket mindre (mätning upp till ~ 100 μm och 100-300 μm, respektive27, jämfört med 250-1500 μm för hipsc-derived ihos), vilket innebär att injektioner av stora mängder organoider kommer att bli långsammare. Detta gör att större skala injektion experiment som skall trialed i hiPSC-derived iHOs. Det är också möjligt att studera Luminal innehållet i iHOs genom skörd dem post infektion och manuellt dissociera iHOs i DPBS, släppa deras Luminal innehåll. För mikroinjektion, rekommenderar vi att du använder en hög koncentration av bakterier. Vi konstaterade att lägre koncentrationer inte var tillräckliga för att generera ett svar från IECs bestående av iHOs. Dessutom var det svårt att senare lokalisera internaliserade bakterier med hjälp av mikroskopi. Inoculums kan behöva optimeras för olika bakterie stammar.
Sammanfattnings vis, hiPSC-derived iHOs ge en lovande modell för direkt dissekera epitelial svar på enteriska infektioner, antingen genom att studera intracellulära invasion räknas, avbildning, mäta cytokin nivåer i iHO supernatanter, eller skörd RNA till transkriptionella förändringar efter exponering för patogener. Deras nytta kommer att bli ännu tydligare i framtiden för att fastställa infektions modeller för människo-begränsade patogener och för att utnyttja möjligheterna att använda denna teknik för att anpassa forskningen genom att studera specifika sjukdomsrelaterade genetiska mutationer och drog svar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från The Wellcome Trust, The Gates Foundation, och Cambridge biomedicinska forsknings centret. E.A.L. är en klinisk doktorand som stöds av Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
References
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
- Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
- Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).
- Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
- Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
- Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
