Summary
Les organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) offrent des possibilités passionnantes de modéliser les maladies entériques in vitro. Nous démontrons la différenciation des hiPSCs en organoïdes intestinaux (iHOs), la stimulation de ces iHOs avec des cytokines, et la microinjection de Salmonella Typhimurium dans la lumière de l’OHI, permettant l’étude d’une invasion épithéliale par cette agent.
Abstract
Le système intestinal «organoïde» (OHI), dans lequel les structures 3D représentatives de la muqueuse épithéliale de l’intestin humain peuvent être produites à partir de cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSCs) et maintenues en culture, offre une occasion passionnante de faciliter la modélisation de la réponse épithéliale aux infections entériques. In vivo, les cellules épithéliales intestinales (IECs) jouent un rôle clé dans la régulation de l’homéostasie intestinale et peuvent inhiber directement les agents pathogènes, bien que les mécanismes par lesquels cela se produit ne soient pas complètement élucidés. On a démontré que la cytokine interleukine-22 (IL-22) jouait un rôle dans le maintien et la défense de la barrière épithéliale intestinale, y compris en induisant une libération de peptides antimicrobiens et de chimiokines en réponse à une infection.
Nous décrivons la différenciation des hiPSCs de contrôle sain dans les iHOs par l’addition de combinaisons spécifiques de cytokines à leur milieu de culture avant de les incorporer dans un système de culture prointestinale basé sur une matrice de membrane de sous-sol. Une fois incorporés, les iHOs sont cultivés dans des milieux additionnés de Noggin, R-Spondin-1, facteur de croissance épidermique (EGF), CHIR99021, prostaglandine E2 et Y-27632 de dichlorhydrate monohydraté. Les passages hebdomadaires par perturbation manuelle de l’ultrastructure de l’OHI conduisent à la formation d’iHOs en herbe, certains présentant une structure de crypte/villus. Tous les IHOS démontrent un épithélium différencié composé de cellules de gobelet, de cellules entéroendocrines, de cellules Paneth et d’entérocytes polarisés, qui peuvent être confirmés par immunocoloration pour des marqueurs spécifiques de chaque sous-ensemble de cellules, la microscopie électronique par transmission (TEM) et PCR quantitative (qPCR). Pour modéliser l’infection, Salmonella enterica sérovar Typhimurium SL1344 sont microinjectés dans la lumière des IHOS et incubées pendant 90 min à 37 ° c, et un essai de protection de la gentamicine modifié est effectué pour identifier les niveaux de invasion bactérienne. Certains iHOs sont également prétraités avec l’IL-22 humain recombinant (rhIL-22) avant l’infection pour établir si cette cytokine est protectrice contre l’infection de Salmonella .
Introduction
Au cours des dernières années, l’étude des interactions hôte-pathogène a été renforcée par le développement de modèles «organoïdes», dans lesquels des représentations 3D de l’épithélium intestinal peuvent être produites à partir de divers progéniteurs. Les organoïdes «primaires» peuvent être générés directement à partir de cellules souches intestinales récoltées à partir de biopsies intestinales. En outre, les organoïdes intestinaux peuvent être générés à partir de hiPSCs. La même chose peut être dite de nombreux tissus, avec gastrique1,foie 2, pancréatique3,4, cerveau5,6, poumon7, et la prostate8 organoïdes utilisés par de nombreux chercheurs pour modéliser maladie. Il existe de nombreuses applications passionnantes du système organoïde, y compris la modélisation du cancer9 et le dépistage des drogues10, mais ici nous nous concentrons sur l’utilisation de l’IHOS comme modèle d’infection, en utilisant S. enterica sérovar Typhimurium (S. Typhimurium) comme un pathogène exemplaire et un prétraitement avec l’IL-22 en tant que thérapie.
Dans cette étude, les hiPSCs utilisés pour générer l’OHI sont des IPSC’Kolf2 ', générés à partir d’un individu en bonne santé et disponibles auprès du consortium de l’initiative des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HipSci; www.hipsci.org), un panel de référence à accès ouvert de lignes hiPSC11. L’un des avantages de l’utilisation des hiPSCs comme progéniteurs pour les organoïdes est qu’il existe maintenant de vastes banques de lignes iPSC de donneurs sains disponibles, ce qui signifie que les résultats peuvent être validés dans un certain nombre de lignées cellulaires avec des antécédents génétiques différents. En outre, si les chercheurs souhaitent examiner des polymorphismes de nucléotides uniques associés à une maladie spécifique (SNP), il est possible d’utiliser CRISPR/Cas9 pour concevoir des mutations dans une lignée cellulaire saine, produisant ainsi à la fois une lignée mutante et conservant l’isogénique ligne de contrôle pour la comparaison12. Selon notre expérience, les organoïdes intestinaux dérivés du hiPSC sont de plus grande taille que leurs homologues primaires et plus cohérents dans la culture, ce qui permet une microinjection moins exigeante techniquement et peut potentiellement permettre à une gamme plus diversifiée d’agents pathogènes d’être étudié. les iHOs peuvent être conservés cryogéniques, et nous avons propagé des cultures d’OHI jusqu’à un an pour produire du matériel pour l’expérimentation.
In vivo, les IECs jouent un rôle clé dans la régulation de l’homéostasie intestinale et peuvent inhiber directement les agents pathogènes, bien que les mécanismes par lesquels cela se produit ne soient pas bien compris. La cytokine IL-22 est connue pour avoir un rôle dans le maintien de la barrière épithéliale intestinale13 et est impliquée dans l’induction et la sécrétion de peptides antimicrobiens et de chimiokines en réponse à l’infection14. Il est produit par des lymphocytes T activés (en particulier, des cellules Th17) ainsi que par des cellules tueuses naturelles (NK) et se lie à un récepteur hétérodimère composé de sous-unités IL-22R1 et IL-10R215. Le récepteur pour l’IL-22 est exprimé de façon basale sur les IECs, ce qui signifie que dans le modèle de l’OHI, il est possible de prétraiter les organoïdes avec rhIL-22 simplement par son addition au milieu de culture16. Un inconvénient du système organoïde est qu’il manque la réponse immunitaire associée normalement délivrée par d’autres types de cellules immunitaires; Cependant, des modèles émergent qui tentent de coculture des organoïdes avec des lymphocytes intestinaux pour mieux représenter ce17,18.
L’utilisation du système de microinjection est essentielle pour simuler les infections dans le modèle de l’OHI, car cela permet la transmission directe d’agents pathogènes à la surface apicale de l’épithélium, comme cela se produirait dans le cas d’une infection in vivo. L’addition de phénol rouge à la solution bactérienne injectée dans l’OHI marque celles qui ont été infectées, évitant ainsi les injections répétées de la même OHI. Les organoïdes comme vaisseaux pour la modélisation des infections sont de plus en plus utilisés, avec des agents pathogènes tels que Helicobacter pylori,19 le norovirus,20 le rotavirus,21 Escherichia coliproduisant de la toxine de Shiga22, Cryptosporidium23, et le virus Zika24 ayant été démontré pour survivre et se reproduire au sein de ces systèmes. Cette technologie pourrait être appliquée à un plus large éventail d’agents pathogènes, en particulier aux organismes qui sont difficiles à la culture, tels que les protozoums, ou les agents pathogènes restreints humains, afin d’obtenir des informations directes sur la réponse épithéliale humaine à l’infection.
Protocol
1. culturing et Passaging de cellules souches pluripotentes induites
Remarque: Toutes les méthodes décrites ici utilisent des lignées cellulaires humaines disponibles dans le commerce. Tous les travaux de culture tissulaire détaillés ci-dessous doivent être effectués dans une hotte à écoulement laminaire de classe II. les IPSC sont régulièrement maintenus dans le milieu de culture de cellules souches (voir le tableau des matériaux), conformément aux instructions du fabricant, ce qui permet une culture sans fin de semaine des IPSC. les iPSCs peuvent être adaptés à partir d’autres systèmes de culture iPSC avec une relative facilité.
- Passer les cellules une fois que les colonies couvrent environ 80% – 90% de la surface de la plaque.
- Préparer les plaques pour le passage 1 h avant utilisation en ajoutant de la vitronectine 10 μg/mL diluée dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS; sans calcium [ca] ou magnésium [mg]) aux plaques traitées à la culture tissulaire. Les volumes de revêtement dépendent de la taille de la plaque et peuvent être trouvés dans les instructions du fabricant. Pendant ce temps, la culture de cellules souches chaudes de moyenne à température ambiante (RT).
- Retirez le support des IPSC prêts pour le passage et lavez les cellules 2x avec DPBS (sans ca ou mg).
- Ajouter la solution EDTA (voir le tableau des matériaux) aux plaques, en veillant à ce que toute la surface soit enduite et incuber à RT pendant 5 – 8 min. Lorsque les trous commencent à apparaître au centre des colonies iPSC, aspirer et jeter la solution EDTA.
- Ajouter le milieu de culture de cellules souches aux puits; déloger les IPSC en lavant quelques fois les fluides sur la surface de la plaque. Les IPSC sont repiquées comme des touffes et non comme des cellules simples, ainsi assurez-vous que la solution d’EDTA n’est pas laissée dessus pendant trop longtemps. Déplacez tous les iPSCs délogés dans un tube conique de 15 mL.
- Aspirer la vitronectine des plaques prérevêtues et la remplacer par un milieu de culture de cellules souches. Inversez la suspension iPSC plusieurs fois pour vous assurer que les iPSCs ne se sont pas installés au fond du tube conique, et ajoutez le volume approprié de suspension pour donner une dilution 1:10 des cellules sur une nouvelle plaque. Les ratios de fractionnement peuvent être ajustés en fonction du taux de croissance de l’iPSC, qui peut varier entre les lignes iPSC.
- Bercer la plaque pour disperser les IPSC sur la surface et la placer dans un incubateur à 37 ° c/5% CO2. Nourrissez les IPSC le jour après le passaging.
2. différenciation des IPSC au hindgut
- Le jour 0, diviser les ipscs sur un plat traité à la culture tissulaire de 10 cm, prérevêtu de vitronectine comme décrit à l’étape 1,2, dans 10 ml de milieu de culture de cellules souches additionné d’activine a (10 ng/ml) + facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF; 12 ng/ml). Ajouter les facteurs de croissance aux médias directement avant utilisation; faire dans toutes les étapes suivantes.
- Le jour 1, changez les milieux (10 ml de milieu de culture de cellules souches avec activine A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).
- Le jour 2, commencez la différenciation en changeant les milieux à 10 ml de milieu de culture de cellules souches additionnés des facteurs de croissance suivants: activine A (100 ng/ml), bfgf (100 ng/ml), protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP-4; 10 ng/ml), phosphoinositol 3- inhibiteur de kinase LY294002 (10 μM) et inhibiteur de GSK3 CHIR99021 (3 μM).
- Le jour 3, remplacez les milieux par 10 ml de milieu de culture de cellules souches additionnés d’activine A (100 ng/ml), de bfgf (100 ng/ml), de BMP-4 (10 ng/ml) et de LY294002 (10 μM). La spécification de l’endoderme induite par ce milieu devrait entraîner des changements visibles de la morphologie de la colonie de l’iPSC au cours des 24 heures suivantes.
- Le jour 4, remplacez le support par 10 ml de support RPMI/2, additionné d’activine A (100 ng/ml) et de bfgf (100 ng/ml).
Remarque: Les milieux RPMI/b. b contiennent 500 mL de milieu RPMI avec supplément de L-glutamine (voir le tableau 1), 10 ml de supplément (50x, sans sérum) et 5 ml d’acides aminés non essentiels. Facultatif: ajouter 5 mL de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL). Filtrer-stériliser avant utilisation. - Le jour 5, remplacez le support par 10 ml de support RPMI/B-27 additionné d’activine A (50 ng/ml).
- Le jour 6, pour commencer à modeler l’endoderme postérieur à l’intestin postérieur, changez les milieux à 10 ml de RPMI/2, 6ΜM (CHIR99021) + acide rétinoïque (3 μM).
- Les jours 7, 8et 9, répétez l’étape 2,7. Au cours de ces étapes, les structures 3D visibles de l’intestin postérieur devraient apparaître, couvrant la surface de la plaque.
- Le jour 10, incorporer l’intestin postérieur résultant dans la matrice de membrane de sous-sol (voir le tableau des matériaux).
3. incorporation de l’intestin postérieur dans la matrice de membrane de sous-sol
- Composent les milieux de croissance de base de l’iHO (500 mL du milieu d’aigle modifié de Dulbecco avancé [DMEM]/F12, 10 mL de supplément [50x, sans sérum], 5 ml de supplément de N2 [100X, sans sérum], 5 ml d’acide 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES), et 5 mL de acides aminés non essentiels [100X]. Facultatif: ajouter 5 mL de pénicilline-streptomycine [10 000 U/mL]; filtre-stériliser avant utilisation. Voir tableau 1).
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Retirez le support de la plaque de l’intestin postérieur et lavez la plaque 1x avec DPBS (sans ca ou mg). Ajouter 5 mL de solution de collagénase à la plaque et incuber à 37 ° c pendant 5 min.
- Produire une solution de collagénase en ajoutant 500 mg de collagénase IV en poudre à 400 ml de DMEM avancé/F12. Après cela, ajouter 100 mL de sérum de remplacement (voir le tableau des matériaux), 5 ml de L-glutamine (200 mm), et 3,5 μl de 2-mercaptoéthanol, et agiter la solution à mélanger. Filtrer-stériliser la solution une fois que la poudre de collagénase est complètement dissoute.
Remarque: Ceci peut être stocké à-20 ° c pendant 6 mois dans des aliquots plus petits.
- Produire une solution de collagénase en ajoutant 500 mg de collagénase IV en poudre à 400 ml de DMEM avancé/F12. Après cela, ajouter 100 mL de sérum de remplacement (voir le tableau des matériaux), 5 ml de L-glutamine (200 mm), et 3,5 μl de 2-mercaptoéthanol, et agiter la solution à mélanger. Filtrer-stériliser la solution une fois que la poudre de collagénase est complètement dissoute.
- Inactiver la collagénase en ajoutant 5 mL de support de croissance de base d’OHI à la plaque et gratter les cellules de l’intestin postérieur à l’aide d’un grattoir cellulaire, en collectant la suspension de l’intestin postérieur dans un tube conique de 15 mL.
- Centrifugez à 240 x g pendant 1 min et Pipettez le surnageant.
- Ajouter 10 mL de support, briser l’intestin postérieur en petits morceaux par pipetage doucement, et centrifuger à nouveau à 95 x g pendant 1 min.
- Lavez les cellules 2x dans les milieux de croissance de base d’iHO en répétant l’étape 3,5. Resuspendre les cellules dans un petit volume de milieu de croissance de base (~ 300 – 500 μL) et ajouter environ 100 μL de cette solution à 1,5 mL de matrice membranaire sous-sol. La matrice doit rester sur la glace pendant ce temps car elle commencera à se solidifier rapidement à RT.
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Installer une plaque de 24 puits sur une plaque chauffante à 37 ° c et repérer 60 μL dans un puits de la plaque de 24 puits. Permettez-lui de régler brièvement et de vérifier la densité sous un microscope.
- Si nécessaire, ajouter plus de solution d’intestin postérieur à la matrice de membrane de sous-sol par incréments jusqu’à ce que la concentration désirée soit obtenue, et repérer la solution dans les puits restants.
- Incuber à 37 ° c pendant 10 min; Ensuite, ajouter 800 μL de milieux de croissance de base d’OHI contenant des facteurs de croissance à chaque puits de la plaque de 24 puits aux concentrations suivantes (voir tableau 1): 500 ng/ml R-Spondin-1, 100 ng/ml de Noggin, 100 ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 3 μM CHIR99021, 2,5 μm prostaglandine E2 et 10 μM de dichlorhydrate de Y-27632 monohydraté (inhibiteur de roche).
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Changez le support de croissance de base d’iHO tous les 2 – 3 jours, ou immédiatement si le média commence à se décolorer. Après l’ensemencement initial dans la matrice de membrane de sous-sol, laissez les iHOs se développer pendant 7 jours avant de les diviser. Au jour 3 – 4, des sphères distinctes devraient être visibles dans la culture.
- Pour le changement de média seul, omettez Y-27632, car cela n’est nécessaire que lors du fractionnement/ensemencement.
4. entretien et passage des iHOs
- Pour permettre une décongélation progressive, mettre le volume requis de la matrice de membrane de sous-sol dans un seau de glace couvert à 4 ° c pendant la nuit, 24 h avant la fendage.
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Retirer le support des iHOs et le remplacer par 500 μL de solution de levage cellulaire (voir le tableau des matériaux) par puits. Incuber à 4 ° c pendant 40 – 50 min, à quel point les iHOs devraient flotter dans la solution.
- Facultatif: utilisez un système d’imagerie in-Hood pour sélectionner uniquement les iHOs avec la morphologie souhaitée (voir le tableau des matériaux).
- Pipetter doucement la suspension de la solution de levage d’iHO/Cell dans des tubes coniques de 15 mL, en essayant de ne pas briser les iHOs. Laisser les IHOs se contenter de 3 à 5 min et enlever le surnageant et les cellules individuelles.
- Résuspendez les iHOs dans 5 mL de milieu de croissance de base d’OHI et Pipettez-les doucement pour les laver. Centrifuger à 95 x g pendant 2 min.
- Installer une plaque de 24 puits sur une plaque chauffante à 37 ° c dans la hotte.
- Retirez le surnageant et resuspendez les iHOs dans ~ 300 – 500 μL de milieux de croissance de base, à l’aide d’une pipette P1000 pour décomposer les iHOs en petits morceaux. Notez que la force qui doit être appliquée varie en fonction de la ligne de l’OHI et de l’état de maturation, alors commencez doucement, en augmentant la force si nécessaire.
- Placer ~ 100 μL de l’iHOs (le volume dépend de la densité de la solution) dans 1,5 mL de la matrice de membrane de sous-sol et Pipetter brièvement pour mélanger.
- Repérez 1 x 60 μL de matrice de membrane sous-sol dans un puits de la plaque de 24 puits, laissez-le pour solidifier pendant ~ 30 s, puis vérifiez la densité sous le microscope. Si la densité est trop faible, ajoutez plus d’iHOs à la matrice.
- Répétez l’étape 4,8 jusqu’à ce que la bonne densité soit acquise, puis repérez le reste de la matrice dans une plaque de 24 puits.
- Le placer dans un incubateur à 37 ° c pendant 10 min et, ensuite, le recouvrir avec 800 μL de milieu de croissance de base avec des facteurs de croissance, comme décrit à l’étape 3,7.
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Pour préparer les iHOs à une expérience d’essai d’invasion (décrite ci-dessous), passez les iHOs 4 – 5 jours avant l’expérience comme décrit aux étapes 4.1 à 4.10, mais Placez 120 μL de la solution matricielle d’iHO générée à l’étape 4,7 dans des plats de microinjection à fond de verre de 5 mm.
- Plutôt que de laisser la suspension d’iHO dans une gouttelette comme avec le passaging de routine, étaler la gouttelette sur le fond du plat pour créer une couche mince de matrice. Couvrir avec 2,5 mL de milieu de croissance de base plus les facteurs de croissance.
Remarque: Si des antibiotiques ont été utilisés dans le milieu de culture, ceux-ci doivent être enlevés et remplacés par des milieux non antibiotiques additionnés pour des expériences de microinjection.
- Plutôt que de laisser la suspension d’iHO dans une gouttelette comme avec le passaging de routine, étaler la gouttelette sur le fond du plat pour créer une couche mince de matrice. Couvrir avec 2,5 mL de milieu de croissance de base plus les facteurs de croissance.
5. prestimulation des iHOs avec rhIL-22
- Aspirer les médias des iHOs et les remplacer par de nouveaux milieux de croissance (qui ne doivent pas contenir d’antibiotiques) 18 h avant le test d’invasion.
- Ajouter rhIL-22 aux milieux de culture à une concentration finale de 100 ng/mL.
6. microinjection d’iHOs et d’essais d’invasion intracellulaire
- Le jour précédant l’expérience, configurez S. Typhimurium SL1344 culture dans 10 mL de bouillon Luria-Bertani et incuber à 37 ° c pendant la nuit avec agitation.
- Le jour de l’expérience, si un microscope avec une chambre de chaleur fermée est disponible, allumez-le et laissez la température atteindre 37 ° c avant de commencer le dosage.
- Diluer les cultures bactériennes de nuit dans le DPBS (contenant ca et mg) à une densité optique de 2 à 600 nm (OD600) et, ensuite, mélanger 1:1 avec du phénol rouge.
- Chargez le plat de micro-injection contenant des iHOs sur l’étape du microscope, enlevez le couvercle, et amenez les iHOs dans la mise au point, prêt pour l’injection pour commencer.
- Allumez l’injecteur et les postes de contrôle du bras. Assurez-vous que l’injecteur est réglé à une pression de 600 kPa et une durée d’injection de 0,5 s. Si elle n’est pas déjà éloignée de l’étape du microscope, tournez le bras d’injection pour vous assurer qu’il est.
- Mettre en place une pointe de forage de microinjection de 6 μm en enlevant l’emballage et le cylindre en plastique de l’aiguille. Retirez la tête de préhension du bras d’injection.
- Chargez l’embout de forage avec 10 μL de l’inoculum, en saisissant doucement l’embout de forage à son extrémité émoussée. Placez l’embout de forage dans la tête de préhension et rattachez-le au bras de micro-injection.
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Déplacez doucement le bras en position de façon à ce que l’aiguille se trouve entre 1 et 2 cm au-dessus du plat de micro-injection. Utilisez la commande de bras pour positionner la pointe de l’aiguille au centre du plat et la baisser jusqu’à ce qu’elle soit juste au-dessus de la surface du support.
- Programmer le poste de contrôle du bras pour remettre l’aiguille à ce point après toutes les injections.
- Concentrez le microscope sur les iHOs et sélectionnez la cible à injecter. Positionner l’aiguille juste au-dessus et à droite de l’OHI à injecter et déplacer l’aiguille vers le bas et latéralement dans la lumière de l’OHI.
- Appuyez sur le bouton injecter sur le micro-injecteur; le mélange bactérien teinté de phénol émergera de l’aiguille. Injecter chaque iHO 3x. Injecter au moins 30 iHOs par condition.
Remarque: En raison de l’hétérogénéité de la taille et de la structure de l’OHI dans une culture, il est nécessaire d’injecter un grand nombre d’iHOs pour contrôler la variation. - Lorsque tous les iHOs requis sont injectés, retirez la plaque de microinjection de l’étape, remplacez le couvercle et incubez la plaque à 37 ° c pendant 90 min.
- Après 90 min, aspirer les milieux de croissance et le remplacer par 3 mL de solution de levage cellulaire; Incuber à 4 ° c pendant 45 min.
- Déplacez doucement la solution de levage iHOs/Cell dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de DPBS. S’assurer que tous les iHOs injectés ont été retirés de la plaque (rincer la plaque avec 1 mL du DPBS si nécessaire). Centrifuger à 370 x g pendant 3 min.
- Retirer le surnageant et Resuspendre les iHOs dans les milieux de croissance de base contenant de la gentamicine à 0,1 mg/mL (ajouter 1 mL de support; puis, utiliser une pipette P1000 ~ 50x pour briser les iHOs, et ajouter 4 mL de médias supplémentaires).
- Incuber à 37 ° c pendant 1 h pour tuer les bactéries extracellulaires.
- Centrifuger les iHOs à 370 x g pendant 3 min et aspirer le surnageant, en laissant le moins possible. Lavez les iHOs 1x avec DPBS et Centrifugez à nouveau.
Remarque: Cette étape élimine la gentamicine, ce qui est important car toute gentamicine restante peut tuer les bactéries intracellulaires une fois que les cellules sont lysées. - Résuspendez les iHOs dans 500 μL de tampon de lyse (voir le tableau des matériaux) et dissociez manuellement les organoïdes en pipetant ~ 50x. Laisser ce mélange pendant 5 min à RT.
- Diluer en série la solution résultante 10 fois dans DPBS pour générer 10-1, 10-2, et 10-3 concentrations. Pipetter 3 x 20 μL de gouttelettes des solutions soignées et diluées sur des plaques de gélose LB préchauffées.
- Incuber pendant la nuit à 37 ° c et effectuer le comptage des colonies et le calcul des unités formant colonie (CFU). Les dénombrements des colonies refléteront le nombre de bactéries intracellulaires qui ont été libérées au cours du processus de lyse cellulaire.
7. congélation et récupération des cellules
Remarque: Comme indiqué précédemment, il est possible de préserver cryogéniquement les iHOs et de les reconstituer lorsque désiré. Les processus de congélation et de dégel sont décrits ci-dessous.
- Sélectionnez les puits des iHOs que vous souhaitez geler. Ajouter la solution de levage cellulaire dans les puits et incuber pendant 40 – 50 min à 4 ° c. Les iHOs devraient flotter dans la solution.
- Pipetter délicatement les iHOs dans un tube conique de 15 mL et leur permettre de s’installer. Retirez le support et lavez les iHOs 1x avec des milieux de croissance de base (pas de facteurs de croissance).
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Centrifuger à 95 x g pendant 2 min, retirer le surnageant et le remplacer par un volume approprié de milieu de congélation cellulaire (voir le tableau des matériaux; utiliser le support selon les instructions du fabricant), en décantant les IHOS dans des flacons cryogéniques.
- Entreposer les flacons dans un congélateur de-80 ° c pendant la nuit pour permettre un gel plus progressif; Ensuite, transférez-les vers un stockage d’azote liquide.
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Pour reconstituer les iHOs, décongeler rapidement un flacon cryogénique à 37 ° c à l’aide d’un bain d’eau/perle; puis, Pipetter délicatement son contenu dans 10 mL de milieux de croissance de base (pas de facteurs de croissance). Permettre aux iHOs de s’installer et de remplacer le support avec ~ 300 μL de support de croissance de base fraîche.
- Ne dissociez pas manuellement les iHOs. Ajouter les iHOs à la matrice membranaire du sous-sol et les faire ressortir comme décrit à la section 3.
Representative Results
Après le début du processus de différenciation, les cellules doivent traverser le stade de la formation définitive de l’endoderme suivi d’un modelage de l’intestin postérieur avant l’incorporation dans la matrice membranaire du sous-sol. Les sphéroïdes se formeront et les cultures avec de grandes quantités de matières contaminantes seront claires sur une période de plusieurs semaines que les iHOs matures. Les images exemplaires de la différenciation, de l’incorporation et du processus de passage sont illustrées à la figure 1.
La configuration du système de microinjection est telle que démontrée dans la figure 2. Les iHOs sont microinjectés avec la solution rouge/bactérienne de phénol et conservent leur couleur rouge, permettant l’identification des iHOs infectés pour empêcher les injections en double. Les dénombrements des bactéries intracellulaires plaquées sont effectués à la suite du test de protection de la gentamicine modifié; avec rhIL-22 restreint le S. Infection à Typhimurium, avec moins de bactéries intracellulaires observées suite au traitement par rhIL-22 (figure 3). Nous traitons également systématiquement les iHOs infectés pour immunostaining, ou TEM, afin de faciliter la visualisation des interactions IEC-bactériennes de l’hôte (figure 4).
Figure 1: différenciation dirigée des IPSC aux iHOs. Séquence représentative de différenciation des IPSC aux iHOs, démontrant les changements morphologiques observés et les facteurs de croissance nécessaires pour stimuler ces changements. L’endoderme définitif est formé au jour 4 de la différenciation, après exposition à des concentrations spécifiques de combinaisons d’activine A, FGF, BMP-4, LY294002 et CHIR99021. Après 8 jours, le modelage de cet endoderme définitif avec des concentrations spécifiques de CHIR99021 et d’acide rétinoïque entraîne une formation de l’intestin postérieur. La formation de sphéroïdes est observée. Après un passage prolongé à l’aide d’une matrice de membrane sous-sol de soutien superposée avec un milieu complété par des facteurs de prolifération prointestinale R-Spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021 et prostaglandine E2, les sphéroïdes progressent dans les iHOs en herbe. (Les images ont été prises à un grossissement 4x – 10x). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: microinjection d’une OHI avec S. Typhimurium. (A) le système de microinjection (voir le tableau des matériaux) enfermé dans la chambre de l’environnement; Cela permet l’injection des iHOs dans un environnement contrôlé (37 ° c/5% CO2). (B) l’inoculum bactérien est livré directement dans la lumière de l’OHI à l’aide d’un microcapillaire attaché au système de microinjection. (C) en mélangeant des inoculum bactériens avec du rouge de phénol, il est clair que les IHOS ont été infectés, évitant ainsi les injections dupliquées de la même OHI. Les images ont été prises à un grossissement de 10x. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Le prétraitement des iHOs dérivés de la lignée cellulaire Kolf2 avec rhIL-22 restreint le S. Typhimurium SL1344 invasion dans les cellules épithéliales intestinales. Pour les essais de protection de la gentamicine, les iHOs ont été traités avec 100 ng/mL de rhIL-22 18 h avant l’infection, ou laissés non traités, et incubés pendant 90 min après l’inoculation. Les données sont des moyens de trois réplicats techniques pour trois réplicats biologiques ± SEM. Pour les essais de signification, les tests Mann-Whitney U ont été utilisés; p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: interaction des IECs avec S. typhimurium SL1344. Ces panneaux montrent des iHOs injectés avec S. Typhimurium SL1344 et incubé pendant 3 h, avant la fixation et la transformation pour (A) immunofluorescence ou (B) microscopie électronique à transmission. Dans le panneau A, les bactéries sont observées dans la lumière de l’OHI et interagissent avec l’épithélium. Les noyaux sont colorés avec le squalamine de 4 ′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu), les membranes cellulaires avec la phalloïdine (rouge), et les bactéries avec le CSA-1 (vert). Les images sont prises à un grossissement de 20x. Le panel B démontre trois voies de traitement intracellulaire différentes de Salmonella après l’invasion; les bactéries sont observées (a) dans une vacuole contenant des salmonelles, (b) libre dans le cytoplasme et (c) en cours d’autophagie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Moyen RPMI/ | |
| composant: | quantité: |
| RPMI 1640 média avec supplément de glutamine | 500 mL |
| Supplément sans sérum de 550x | de 10 mL |
| milieu de croissance de base de l’OHI | |
| composant: | quantité: |
| Advanced DMEM/F12 | 500 mL |
| Supplément sans sérum de 550x | de 10 mL |
| N2 sans sérum supplément 100X | de 5 mL |
| HEPES 1 M | de 5 mL |
| L-glutamine 200 mM | de 5 mL |
| Facteurs de croissance du milieu de croissance de base de l’OHI | |
| composant: | quantité: |
| R-spondin1 humain recombinant | 500 ng/mL |
| Noggin humain recombinant | 100 ng/mL |
| Facteur de croissance épidermique (FEM) | 100 ng/mL |
| Prostaglandine E2 | 2,5 μM |
| CHIR99021 | 3 μM |
| Y-27632 dichlorhydrate monohydraté | 10 μM |
Tableau 1: recettes des médias.
Discussion
Ce protocole décrit la différenciation des hiPSCs en iHOs et leur utilité comme un modèle dans lequel simuler des infections entériques. Ci-dessous, nous décrions les étapes critiques du protocole et toutes les modifications ou améliorations que nous avons apportées.
Ce protocole rationalise le processus de différenciation des hiPSCs par rapport aux travaux déjà publiés25. Les méthodes utilisées antérieurement nécessitaient le transfert d’hiPSCs d’autres systèmes de culture hiPSC (p. ex., culture hiPSC dépendante du Feeder) à l’alcool moyen – polyvinylique (CDM-PVA) chimiquement défini. Ce transfert à CDM-PVA prend généralement 2 – 3 semaines et nécessite l’alimentation quotidienne des hiPSCs. Ce protocole n’était pas non plus toujours efficace, certaines différenciations échouant; par conséquent, nous avons trié la différenciation en utilisant les mêmes facteurs de croissance, mais en commençant par les hiPSCs cultivés en milieu de culture de cellules souches (plutôt que CDM-PVA) et le remplacement du MDP-PVA par le milieu de culture des cellules souches pendant les jours de différenciation 0 – 3. Cela a été un succès pour les cinq lignes hipsc indépendantes essai jusqu’à présent, rendant le processus de différenciation beaucoup plus rapide et efficace. Cela permet également de cultiver sans week-end des hiPSCs avant la différenciation, ce qui permet une plus grande souplesse dans la culture hiPSC. les lignées d’OHI produites par cette méthode ont été phénotypées pour les marqueurs de l’épithélium intestinal, comme nous l’avons déjà décrit pour les lignées hiPSC Kolf2, Yemz1 et Lise116 et apparaissent phénotypiquement indiscernable des IHOS produits en utilisant la précédente protocole.
Après l’ensemencement, les iHOs nécessitent au moins 1 mois de passage de routine, avec fractionnement tous les 4 – 7 jours pour faciliter la maturation. Notez qu’il y aura une certaine variation dans le développement de l’OHI en fonction de la ligne iPSC utilisée et de la densité de la culture initiale. Au cours des premiers passages, il y aura visiblement des cellules contaminantes qui ne sont pas des iHOs. Ceux-ci finissent par mourir, laissant une culture propre de sphériques et, après environ 4 semaines, les iHOs en herbe. En outre, un système d’imagerie in-Hood peut être utilisé pour sélectionner et passer uniquement les iHOs avec la morphologie souhaitée. À mesure que les iHOs mûrissent, ils devront se diviser tous les 6 à 7 jours, en fonction du taux de croissance et de la densité. Si l’un des cas suivants se produit, les iHOs doivent être divisés avant ce point: les cavités luminales des iHOs commencent à se remplir avec des cellules mortes, la matrice membranaire du sous-sol commence à se désintégrer, les iHOs commencent à se développer hors de la matrice membranaire du sous-sol, ou la culture est trop dense et les médias commencent à jaunir très rapidement.
Une fois que la culture de l’OHI est établie, si à tout moment l’apparition des iHOs change ou est différente de celle attendue (par exemple, les cultures demeurent sphériques, plutôt que bourgeonnement), le phénotypage par immunohistochimie et la qPCR pour les marqueurs cellulaires doit être répétées pour s’assurer que la différenciation des types de cellules dans les iHOs (p. ex., cellules de gobelet, cellules de Paneth) reste intacte. Si les iHOs ne se différencient plus, alors ils devraient être rejetés et redifférenciés ou un passage antérieur des iHOs devrait être décongelé et reconstitué. Si les iHOs cessent de se différencier, les causes potentielles sont l’âge de la culture (si elle est âgée de plus de 6 mois), l’activité des facteurs de croissance (s’assurer que celles-ci sont reconstituées selon les instructions du fabricant et maintenues congelées dans de petits aliquotes pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel), passages trop fréquents ou violents (en général, le repiquage ne devrait se produire qu’une fois par semaine, et si les IHOS sont dissociés manuellement trop vigoureusement sur une base régulière, ils cesseront de se différencier complètement).
Nous avons établi par le séquençage d’ARN que la stimulation il-22 18 h avant l’infection régule les gènes antimicrobiens et ceux impliqués dans le phénotype de défense de barrière. Avant l’utilisation de nouveaux ihso pour les essais impliquant la préstimulation avec rhIL-22 (ou une cytokine alternative si le système est utilisé pour cela), il est conseillé de vérifier l’activité des gènes connus pour être augmentée par la cytokine (dans le cas de il-22 , nous avons utilisé DUOX2 et Lcn2) via qPCR après la stimulation des IHOS, pour assurer l’expression des récepteurs et la signalisation intacte. Avant la première utilisation de l’il-22, nous avons également procédé à l’immunohistochimie pour localiser le récepteur il-22 sur les IHOS afin d’établir que l’expression du récepteur il-22 était basale, ce qui signifie que la préstimulation pourrait être obtenue simplement en ajoutant rhIL-22 à la culture de l’OHI taille moyenne. Cependant, si un récepteur est exprimé apiquement, ce protocole peut devoir être adapté pour délivrer des ligands apiquement.
Les écueils concernant le système de microinjection sont généralement liés à la délicatesse des aiguilles nécessaires à l’injection. Ici, nous utilisons des pointes de forage disponibles dans le commerce avec une lumière de 6 μM. Il est possible de tirer les aiguilles d’injection des capillaires en verre26 bien que cela puisse être moins uniforme, entraînant des fuites de la pointe de l’aiguille ou des volumes incohérents injectés dans les IHOS. Il est important de s’assurer que l’injection a eu lieu dans la lumière de l’OHI, ce qui est l’une des raisons de l’utilisation du rouge de phénol comme colorant; les iHOs se développiront visiblement et tiendront l’inoculum rouge, ce qui permettra de garantir la certitude des iHOs qui ont été injectés. Occasionnellement, les aiguilles obstrueront les débris du mur de l’OHI; Si c’est le cas, retirez la pointe de l’aiguille de l’intérieur de l’OHI et appuyez sur le bouton Clean (nettoyer ) du système de micro-injection. Cela produira une brève période de pression d’air plus élevée qui devrait dégager le blocage. Il induira également une certaine fuite de l’inoculum bactérien sur la plaque; par conséquent, si cela se produit, l’action propre doit être répétée sur toutes les plaques pour assurer l’égalité de l’inoculum bactérien par plaque. Un grand avantage des iHOs dérivés du hiPSC est leur taille. Les organoïdes intestinaux des souris et des organoïdes humains primaires sont beaucoup plus petits (mesurant jusqu’à ~ 100 μM et 100 – 300 μm, respectivement27, contre 250 – 1500 μm pour les IHOS dérivés du hipsc), ce qui signifie que les injections de grandes quantités d’organoïdes seront plus lentes. Cela permet de trialer des expériences d’injection à plus grande échelle dans les iHOs dérivés du hiPSC. Il est également possible d’étudier le contenu luminal des iHOs en les récoltant après l’infection et en dissociant manuellement les iHOs en DPBS, libérant ainsi leur contenu luminal. Pour la microinjection, nous recommandons d’utiliser une forte concentration de bactéries. Nous avons constaté que les concentrations inférieures n’étaient pas suffisantes pour produire une réponse des PECO qui constituaient les Ohos. En outre, il était difficile de localiser ultérieurement des bactéries internalisées à l’aide de la microscopie. Les inoculums peuvent être optimisés pour différentes souches bactériennes.
En résumé, les iHOs dérivés du hiPSC fournissent un modèle prometteur pour disséter directement la réponse épithéliale aux infections entériques, que ce soit par l’étude des dénombrements intracellulaires, l’imagerie, la mesure des niveaux de cytokines dans les surnageants de l’OHI, ou l’ARN de récolte pour l’étude des changements transcriptionnels après l’exposition aux agents pathogènes. Leur utilité sera encore plus évidente à l’avenir pour établir des modèles d’infection pour les pathogènes à restriction humaine et pour exploiter les possibilités d’utiliser cette technologie pour personnaliser la recherche en étudiant des mutations génétiques spécifiques liées à la maladie et les réponses médicamenteuses.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par le financement du Wellcome Trust, de la Fondation Gates et du Cambridge Biomedical Research Centre. Marine est un étudiant de doctorat clinique soutenu par le Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
References
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