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Biology

सीरियल ब्लॉक चेहरे और केंद्रित आयन बीम स्कैन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग लक्षित अध्ययन

Published: August 10, 2019 doi: 10.3791/59480
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1VIB Bio Imaging Core, 2VIB Inflammation Research Center, 3Department of Molecular Biomedical Research, UGent

Summary

यहाँ, हम कुशलतापूर्वक सीरियल ब्लॉक चेहरे और ध्यान केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन के लिए ब्याज के एक क्षेत्र को लक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह तीन आयामों में कुशल खोज की अनुमति देता है, और दृश्य के एक बड़े क्षेत्र में दुर्लभ घटनाओं का पता लगाने.

Abstract

इस प्रोटोकॉल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संकल्प स्तर पर तीन आयामों में सेल या ऊतक के नमूने के कुशल और प्रभावी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. कई वर्षों के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) एक स्वाभाविक दो आयामी तकनीक बनी हुई है. सीरियल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इमेजिंग तकनीक (मात्रा EM) के आगमन के साथ, या तो एक एकीकृत microtome या ध्यान केंद्रित आयन बीम का उपयोग करने के लिए टुकड़ा तो एम्बेडेड ऊतकों को देखने, तीसरे आयाम आसानी से सुलभ हो जाता है. सीरियल ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBF-SEM) SEM कक्ष में संलग्न एक ultramicrotome का उपयोग करता है. यह बड़े नमूनों को संभालने की क्षमता है (1,000 डिग्री x 1,000 $m) और छवि छोटे एक्स, वाई पिक्सेल आकार पर देखने के बड़े क्षेत्रों, लेकिन हीरे चाकू द्वारा जेड आयाम में सीमित है. केंद्रित आयन बीम SEM (FIB-SEM) 3 डी संकल्प में सीमित नहीं है, (5 एनएम के isotropic voxels प्राप्त कर रहे हैं), लेकिन देखने के क्षेत्र में बहुत अधिक सीमित है. इस प्रोटोकॉल एक बड़े क्षेत्र में ब्याज (ROIs) के अलग-अलग क्षेत्रों को खोजने के लिए अनुमति देने के लिए दो तकनीकों के संयोजन के लिए एक कार्यप्रवाह को दर्शाता है और फिर उच्च isotropic voxel संकल्प पर बाद में लक्षित मात्रा इमेजिंग. स्थिर कोशिकाओं या ऊतकों की तैयारी SEM इमेजिंग में कुशल संकेत पीढ़ी के लिए आवश्यक अतिरिक्त विषम के कारण मात्रा EM तकनीकों के लिए अधिक मांग है. इस तरह के प्रोटोकॉल समय लेने और श्रम गहन हैं. इस प्रोटोकॉल में माइक्रोवेव सहायता प्राप्त ऊतक प्रसंस्करण अभिकर्मकों के प्रवेश को सुविधाजनक बनाने को भी शामिल किया गया है, जो प्रसंस्करण प्रोटोकॉल के लिए दिन से घंटों के लिए आवश्यक समय को कम करता है।

Introduction

यह प्रोटोकॉल रुचि के किसी विशिष्ट क्षेत्र (ROI) के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन, त्रि-आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के कुशल लक्ष्यीकरण के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है. 1930 के दशक में अपनी शुरुआत के बाद से, EM एक अनिवार्य रूप से दो आयामी तकनीक किया गया है. पहले प्रकाशित छवियों पूरे ऊतकों या कोशिकाओं के थे, लेकिन है कि जल्द ही वर्गों है कि हाथ से एक ultramicrotome का उपयोग कर काट रहे थे और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग कर छवि के लिए रास्ता दे दिया. TEM बहुत उच्च संकल्प micrographs जहां भी सेलुलर संरचनाओं की छोटी स्पष्ट रूप से स्पष्ट कर रहे हैं पैदा करता है. तथापि, ऊतक के लिए आवश्यक अनुभाग की पतलापन इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा छवि किए जाने के लिए $ आयाम न्यूनतम में जानकारी बनाई. चूँकि कोशिकाएँ त्रि-आयामी संरचना होती हैं, इसलिए सेल संरचनाओं और कोशिका सतहों के बीच होने वाली क्रियाओं को सीमित डेटा से अनुमान लगाया जाना था। इसने गलत व्याख्या की क्षमता को बढ़ाया, विशेष रूप से उन संरचनाओं में जो जटिल थे। कुछ microscopists धारावाहिक अनुभाग कोशिकाओं और ऊतकों द्वारा और अधिक सटीक 3 डी संरचनाओं को प्राप्त करने में कामयाब रहे और फिर परिश्रम से उन्हें व्यक्तिगत TEM छवियों1से पुनर्निर्माण. यह एक बहुत ही श्रम गहन प्रक्रिया थी और डिजिटल इमेजिंग और कंप्यूटर प्रतिपादन परिणाम के आगमन से पहले भी कल्पना करना मुश्किल था. हाल के वर्षों में दो तकनीकों जो सामूहिक मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मात्रा EM)2 है कि तीन आयामों में EM अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बना दिया है के रूप में जाना जाता है शुरू किया गया है.

एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंदर एक एम्बेडेड ब्लॉक से छवियों के एक ढेर प्राप्त करने का विचार 1981 को वापस पता लगाया जा सकता है जब स्टीव Leighton और एलन Kuzirian एक लघु microtome का निर्माण किया और यह एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कक्ष में रखा3 (SBF-SEM) . इस प्रोटोटाइप अंततः नकल की और सुधार किया गया था 23 साल बाद Denk और Horstmann4 द्वारा और बाद में commercialized. मोटे तौर पर एक ही समय में जैविक वैज्ञानिकों सामग्री विज्ञान में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया एक और तकनीक के बारे में पता बन गया, ध्यान केंद्रित आयन बीम. इस तकनीक के एक नमूने से सतह सामग्री की एक बहुत छोटी राशि को दूर करने केलिए किसी तरह (गैलियम, प्लाज्मा) के एक आयन बीम का उपयोग करता है (एफआईबी-SEM) 5. दोनों तकनीकों इमेजिंग छवियों जो एक एक्स, वाई, जेड, ढेर में जोड़ा जा सकता है की एक श्रृंखला प्रदान करने के बाद अनुभागीकरण रोजगार. दोनों तकनीकों 3 डी जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन अलग संकल्प तराजू पर. SBF-SEM लंबे सीरियल इमेजिंग रन के लिए कोई पतली से अधिक 50 एनएम स्लाइस करने के लिए हीरे चाकू के भौतिक गुणों द्वारा सीमित है; हालांकि नमूना ब्लॉक आकार है कि अनुभाग किया जा सकता है बड़ा है, अप करने के लिए 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी. वापस बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के बड़े डिजिटल अधिग्रहण प्रारूप के कारण (32k x 32k पिक्सल) कि ब्लॉक चेहरे से एक संकेत प्राप्त करता है , छवि पिक्सेल आकार के रूप में 1 एनएम के रूप में छोटा हो सकता है. यह गैर-isotropic voxels में परिणाम है जहाँ एक्स,Y आयाम अक्सर $ से छोटा है. आयन बीम की शुद्धता की वजह से, FIB-SEM isotropic voxels के साथ छवियों को इकट्ठा करने की क्षमता है $ 5 एनएम. हालांकि, कुल क्षेत्र है कि छवि की जा सकती है काफी छोटा है. दो तकनीकों के साथ छवि किए गए विभिन्न नमूनों और मात्राओं का सारांश तालिका पहले3प्रकाशित किया जा चुका है।

मात्रा EM के लिए ऊतक तैयारी मानक TEM या SEM के लिए की तुलना में अधिक कठिन है क्योंकि नमूने SEM में पर्याप्त संकेत पीढ़ी प्रदान करने के लिए दाग होना चाहिए. अक्सर, sstainings न केवल विशेष ऊतक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी जोड़ने के लिए पहचान और पुनर्निर्माण को आसान बनाने के लिए कुछ सेलुलर संरचनाओं के विपरीत। यहाँ प्रयुक्त प्रोटोकॉल एनसीएमआईआर मानक6पर आधारित है। अतिरिक्त धुंधला आमतौर पर अतिरिक्त प्रोटोकॉल कदम का मतलब है. इस प्रकार मात्रा EM के लिए, मानक प्रोटोकॉल नमूने घुसना करने के लिए अभिकर्मकों के लिए पर्याप्त समय सुनिश्चित करने के लिए बढ़ाया जा करने के लिए की जरूरत है. माइक्रोवेव सहायता प्राप्त प्रसंस्करण घंटे से मिनट के लिए धुंधला करने के लिए आवश्यक समय को कम कर सकते हैं और मात्रा EM नमूना तैयारी अधिक कुशल7बनाता है. यह विधि सभी कोशिकाओं और ऊतकों के प्रकारों पर लागू होती हैऔर अनुसंधान प्रश्नों पर लागू होती है जहां ऊतक की असमांगता किसी विशिष्ट क्षेत्र के नमूने को आवश्यक9बनाती है .

एक बार एक डेटा स्टैक प्राप्त किया जाता है यह गठबंधन किया जा सकता है और ब्याज की संरचनाओं डेटा के बाकी हिस्सों से विभाजित और 3 डी में मॉडलिंग की. हालांकि ऊतक के कई स्लाइस इमेजिंग के स्वचालन छवि अधिग्रहण अपेक्षाकृत सरल बना दिया है, डिजिटल पुनर्निर्माण और डेटा visualizing की प्रक्रिया एक समय लेने वाली काम है. इस उद्देश्य के लिए सॉफ्टवेयर अभी तक एकीकृत और न ही पूरी तरह से स्वचालित नहीं है. मात्रा EM का उपयोग कर जल्दी काम के बहुत से तंत्रिका विज्ञान की ओर निर्देशित किया गया था के बाद से, इस तरह के axons के रूप में दाग और डिजिटल रूप से खंडित संरचनाओं के लिए तकनीक काफी दूर अन्य कोशिकाओं और organelles की तुलना में उन्नत है. जबकि अन्य गैर-न्यूरोनल ऊतकों पर साहित्य तेजी से बढ़ रहा है, nonlinear या अनियमित संरचनाओं और अधिक मैनुअल इनपुट की आवश्यकता है.

दोनों SBF-SEM और FIB-SEM का उपयोग लक्ष्यीकरण और 3 डी में उच्च संकल्प पर विशिष्ट, nonhomogeneous, ऊतक संरचनाओं इमेजिंग के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है. संयोजन है कि माइक्रोवेव के साथ सहायता प्रदान की ऊतक प्रसंस्करण है कि काफी समय नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक कम हो जाती है. एक साथ इस कार्यप्रवाह ठीक संरचनाओं के उच्च संकल्प isotropic voxel छवि डेटासेट एक कुशल और अधिक तेजी से प्रक्रिया पैदा कर देगा.

Protocol

1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना निर्धारण और प्रसंस्करण

  1. 0.5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में आगर प्लेटों पर उगाए गए अरबिडोप्सिस थालियाना के अंकुरों को ठीक करें, 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) पीएच 6.8 में 2 एच के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में 2 5% ग्लूटारैल्डिहाइड।
    चेतावनी: Aldehydes परेशानी और संक्षारक हैं और कैंसरकारी, mutagenic और teratogenic क्षमता है. सभी समाधान उचित सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ और एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  2. कदम 1.1 में उगाए गए पौधे की जड़ युक्तियों को काटें और 0.5 एमएल ट्यूबों में 2-3 टिप्स रखें जिसमें एक ही फिक्सेटिव रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
    नोट:: इस का वॉल्यूम और शेष चरणों में किसी भी समाधान नमूना वॉल्यूम द्वारा निर्धारित किया जाता है; समाधान के लिए नमूने का न्यूनतम अनुपात 10:1 है. किसी भी आयाम में 1 मिमी से बड़े नमूने दाग करने के लिए मुश्किल हो जाएगा, तो बड़ा ऊतक ब्लॉकों के साथ काम करना अधिक कठिन है. सभी ऊतकों में एक ही विशेषताएं नहीं हैं; उदाहरण के लिए, पौधे के पत्तों और तनों को दाग लगाना मुश्किल हो सकता है। बड़ा नमूने या मुश्किल ऊतक प्रकार वांछित हैं, तो डेटा संग्रह पर जाने से पहले नमूना प्रसंस्करण के अनुकूलन किया जाना चाहिए.
  3. थायोकार्बोहाइड्राज़ाइड (टीसीएच) समाधान तैयार करें, चरण 1.7 से पहले ताजा और उपलब्ध की आवश्यकता है। डबल आसुत जल (ddH2O) के 10 एमएल में 0.1 ग्राम थायोकार्बोहाइड्राजाइड जोड़ें और 1 ज के लिए ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस को गर्म करके भंग कर दें। उपयोग करने से पहले, 0.22 डिग्री सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके TCH समाधान फ़िल्टर करें.
  4. ट्यूबों से फिक्सेटिव निकालें और 0.1 M PB pH 6.8 के साथ बदलें। 100 आरपीएम पर एक कक्षीय मिलाते हुए मेज पर ट्यूब रखो और 10 मिनट के लिए धो लें। ताजा पीबीएस 5 बार का उपयोग कर कपड़े धोने दोहराएँ।
  5. पोस्ट 2% osmium tetroxide के साथ पंजाब की जगह द्वारा रूट टिप्स को ठीक (OsO4) और 0.2% रूथीनियम लाल में 0.1 एम पीबी पीएच 6.8. ट्यूबों को माइक्रोवेव में ढक्कनों के साथ खोलें और प्रोग्राम 9 (सारणी 1) प्रारंभ करें।
    चेतावनी: Osmium घूस के मामले में बेहद खतरनाक है, साँस लेना के मामले में बहुत खतरनाक है, और त्वचा से संपर्क के मामले में खतरनाक. हमेशा उचित सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर संभाल और एक धूआं हुड में.
    नोट: प्रोटोकॉल के दौरान, ट्यूबों के lids हमेशा माइक्रोवेव चरणों के दौरान खुले हैं.
  6. बेंचटॉप पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए डीडीएच2ओ के साथ दो बार रूट टिप्स को धोएं। माइक्रोवेव (तालिका1) पर तीसरे और चौथे डीडीएच2हे वॉश यूज प्रोग्राम 15 के लिए। पहले 40 सेकंड डीडीएच2हे धोने के बाद, माइक्रोवेव से बाहर नमूने लें और बफर को ताजा डीडीएच2ओ के साथ बदलें। नमूने को माइक्रोवेव में वापस रखें और प्रोग्राम जारी रखें।
    नोट: बफर ताजा करने की जरूरत है जब माइक्रोवेव एक अलार्म ध्वनि जाएगा. सुनिश्चित करें कि वैक्यूम चैम्बर के लिए ढक्कन सही ढंग से हर बार बदल दिया गया है।
  7. बेंच पर 2 मिनट के लिए आरटी में पहले से तैयार TCH समाधान में इनक्यूबेट नमूने और आगे ऊष्मायन के लिए माइक्रोवेव प्रोग्राम 8 (तालिका 1) का उपयोग करें। बेंच और माइक्रोवेव के बीच समाधान मत बदलो.
  8. चरण 1.6 में वर्णित के रूप में नमूने धोएं.
  9. माइक्रोवेव प्रोग्राम 9 (सारणी 1) के लिए डीडीएच2ओ में 1% OsO4 में नमूने रखें।
  10. चरण 1.6 में वर्णित के रूप में नमूने धोएं.
  11. माइक्रोवेव प्रोग्राम 16 (तालिका 1) का उपयोग करते हुए डीएच2हे में 1% यूरेनिल एसीटेट में इनक्यूबेट नमूने ।
    चेतावनी: यूरेनिल एसीटेट विषाक्त, एक परेशानी है और कैंसरकारी, म्यूटाजेनिक और टेरेटोजेनिक क्षमता है। हमेशा उचित सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर संभाल.
  12. चरण 1.6 में वर्णित के रूप में नमूने धोएं.
  13. चरण 1.14 में उपयोग के लिए वाल्टन का नेतृत्व समाधान तैयार करें। सबसे पहले डीडीएच2ओ के 250 एमएल में एल-एसपार्टिक एसिड के 0.998 ग्राम जोड़कर एल-एसपार्टिक एसिड का स्टॉक समाधान करें और 1 एम KOH के साथ 3.8 में पीएच को समायोजित करें। इसके बाद, एल-एस्पार्टिक एसिड स्टॉक समाधान के 10 एमएल में 0ण्066 ह लेड नाइट्रेट को भंग करें और पीएच को 5ण्5 में समायोजित करें। 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में समाधान छोड़ दें।
    नोट: कोई वेग रूप से होना चाहिए।
  14. 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में 30 मिनट के लिए वाल्टन के नेतृत्व समाधान में इनक्यूबेट नमूने।
  15. चरण 1.6 में वर्णित के रूप में नमूने धोएं.
  16. 50%, 70%, 90% डीडीएच2हे में, और फिर 100% EtOH में 2x के वर्गीकृत चरणों में EtOH में निर्जलीकरण नमूने। माइक्रोवेव प्रोग्राम 10 (तालिका1) का उपयोग करें और माइक्रोवेव उपयोगकर्ताओं को हर 40 s अगले EtOH कदम के साथ समाधान की जगह के लिए संकेत देगा. यह माइक्रोवेव में किया गया अंतिम चरण है।
  17. इसके अलावा 100% प्रोपलीन ऑक्साइड 2x में 10 मिनट प्रत्येक के लिए बेंच पर आरटी पर निर्जलित, कदम के बीच समाधान की जगह.
    नोट: प्रोपलीन ऑक्साइड कुछ प्लास्टिक जैसे पॉलीस्टाइरेन्स को भंग कर सकता है; या तो इस कदम के लिए कांच की शीशियों का उपयोग करें या प्रतिरोध के लिए पूर्व परीक्षण प्लास्टिक.
    चेतावनी: प्रोपलीन ऑक्साइड अत्यधिक ज्वलनशील है। हमेशा उचित सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर संभाल और एक धूआं हुड में.
  18. प्रोपलीन ऑक्साइड (न्यूनतम 2 ज) में 50% स्पर रल में इनक्यूबेट करके रूट टिप्स की घुसपैठ शुरू करें।
    चेतावनी: Spurr राल घटक परेशानी कर रहे हैं. हमेशा उचित सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर संभाल और एक धूआं हुड में.
  19. 100% Spurr के साथ समाधान बदलें और आरटी पर रात भर छोड़ दें।
  20. ताजा 100% Spurr के राल 2 बार (मिनट 2 एच इनक्यूबेशन) में बदलें।
  21. एक embedding मोल्ड में नमूने रखें, फिर से ताजा 100% Spurr के राल युक्त और 36 डिग्री 48 एच के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में बहुलक.
    नोट: इस्तेमाल किया embedding मोल्ड ऊतक के प्रकार और इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण पर निर्भर करता है. यहाँ, एक समतल सिलिकॉन एम्बेडिंग मोल्ड का उपयोग किया गया था (चित्र 1A)।

2. इमेजिंग के लिए एम्बेडेड नमूने तैयार करें

  1. ओवन से नमूने निकालें, embedding मोल्ड से राल निकालें (चित्र 1B).
  2. एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करना, मोटे तौर पर अधिकतम 0.5 मिमी x 0.5 मिमी x 0.5 मिमी (चित्र 1C)के एक ब्लॉक करने के लिए नमूना ट्रिम।
    नोट: SBF-SEM में चार्ज को रोकने के लिए, यह जितना संभव हो उतना नंगे राल दूर ट्रिम और संभव के रूप में फ्लैट / आदर्श रूप में ब्लॉक के सभी पक्षों में पहले से ही ऊतक होते हैं, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि पक्ष जो धातु पिन से जुड़ा होगा (चरण 2.3 देखें) को उजागर ऊतक को शामिल करना होगा ताकि ऊतक प्रवाहकीय धातु के साथ सीधे संपर्क में हो।
  3. बाहरी राल से नमूना निकालें और यह एक धातु पिन करने के लिए देते हैं (चित्र 1 D) प्रवाहकीय epoxy राल के साथ, सुनिश्चित करें कि ऊतक का हिस्सा धातु पिन छू रहा है. 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में epoxy इलाज रात भर करते हैं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना पिन के केंद्र में स्थित है, क्योंकि SB-SEM में चरण के आंदोलन सीमित है. अतिरिक्त राल से बहुत छोटे राल encased नमूना निकालना मुश्किल हो सकता है के रूप में छोटे नमूने दूर उड़ जब अलग करने के लिए एक प्रवृत्ति होगी. इसका एक सरल और प्रभावी समाधान यह है कि नमूने को पैराफिन फिल्म की शीट के साथ कवर किया जाए जैसा कि संदर्भ1की अनुपूरक फिल्म में दिखाया गया है .
  4. अल्ट्रामाइक्रोटोम के लिए धारक में वाहक को तेज करें। किसी भी अतिरिक्त epoxy को हटाने के लिए एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करें और एक पिरामिड बनाने, ब्लॉक के चेहरे और पक्षों को चिकनी करने के लिए अल्ट्रामाइक्रोटोम और एक हीरे की चाकू का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कम से कम ऊतक के कुछ पहले से ही ब्लॉक चेहरे पर उजागर है.
    नोट: एक हीरे की चाकू का उपयोग करने का अतिरिक्त कदम वैकल्पिक है, लेकिन यह जिसके परिणामस्वरूप ब्लॉक SBF-SEM में दृष्टिकोण करने के लिए आसान बनाता है क्योंकि ब्लॉक चेहरे पर चाकू की छाया स्पष्ट है इस प्रकार चाकू और ब्लॉक चेहरे के बीच की दूरी का आकलन करने के लिए आसान निर्धारित करने के लिए.
  5. छंटनी किए गए नमूना ब्लॉक को स्पर कोटर में रखें और प्लैटिनम (Pt) की एक पतली परत (2 डिग्री 5 एनएम) के साथ नमूने को कोट करें।
    नोट: ब्लॉक चेहरे पर प्लैटिनम दूर SBF-SEM में दृष्टिकोण के दौरान काट दिया जाएगा (नीचे देखें), लेकिन पिरामिड के पक्षों पर प्लैटिनम अतिरिक्त चालकता प्रदान करेगा. इस उदाहरण में, नमूना प्लैटिनम के साथ लेपित किया गया था, लेकिन सोना, या सोने / पैलेडियम भी प्रभावी है; हालांकि, सोने के साथ कोटिंग एक इमेजिंग रन के दौरान ब्लॉक चेहरे पर मलबे में वृद्धि हुई है.

3. एसबीएफ-सेम में इमेजिंग

  1. वाहक SBF-SEM माइक्रोस्कोप में डालें और नमूना सतह के करीब चाकू ले आओ. हीरा चाकू का उपयोग कर के नमूने के ऊपरी हिस्से से ट्रिम इतना है कि पीटी परत पहले से ही हटा दिया गया है और ऊतक के कम से कम हिस्सा उजागर है.
    नोट: चूंकि यह प्रक्रिया प्रत्येक SBF-SEM माइक्रोस्कोप के लिए अलग है, हर कदम यहाँ निर्दिष्ट नहीं है. जब तक नमूना सतह पीटी से मुक्त है और इमेजिंग के लिए तैयार है, अगले कदम संभव हो जाएगा.
  2. नमूने का अवलोकन प्राप्त करने और ब्याज के किसी क्षेत्र का पता लगाने के लिए कम रिज़ॉल्यूशन और कम निवास समय पर इमेजिंग प्रारंभ करें (चित्र 1E)।
    नोट: यहाँ, 512 x 512 पिक्सल और 1 ]s रहने के समय जल्दी स्कैनिंग और मंच की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया गया और 2,000 x 2,000 पिक्सल के साथ 1 $s निवास समय इमेजिंग विंडो के अनुकूलन और ध्यान समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
  3. 80-100 pA की धारा में 1.5-2.0 केवी की एक त्वरित वोल्टता का उपयोग करके, ऊतक की एक छवि पर कब्जा.
    नोट: यहाँ दिखाया उदाहरण एक उच्च वैक्यूम प्रणाली जहां बीम वर्तमान चार्ज, जो बहुत नमूना निर्भर है कम से कम करने के लिए समायोजित करने की जरूरत पर छवि थी. आमतौर पर, इलेक्ट्रॉन बीम 1.5 डिग्री 2ण्0 प्रति वर्ष पर सेट किया जाता है लेकिन यह नमूना निर्भर होगा। उच्च आवर्धन पर (आमतौर पर gt; 10,000x) राल बहुत ज्यादा बीम से प्रभावित करने के लिए चिकनी अनुभागकी गारंटी है, तो आम तौर पर पिक्सेल आकार 8,000 के एक छवि आकार में 8,000 डिग्री 10,000 x 8,000 -10,000 पिक्सेल के लिए सेट किया गया है 430 - 1,400x और क्षेत्र के आकार के 64 एक्स 64 मिमी और 200 x 200 मिमी क्रमशः.
  4. ब्याज के एक क्षेत्र का निर्धारण और तय कितने वर्गों ब्याज की मात्रा को कवर और इमेजिंग रन शुरू करने के लिए आवश्यक हैं, वापस बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग कर.
    नोट: यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, 80 एनएम के 500 वर्गों 10 एनएम पिक्सल और 10,000 x 10,000 पिक्सेल छवियों पर छवि थे (रहने का समय 1 $s). माइक्रोस्कोप 1.6 केवी और 100 पीए के लिए सेट किया गया था। सामान्य तौर पर, अनुभागों की संख्या नमूना और ROI के आकार पर निर्भर करती है और 100 s से 1,000 s करने के लिए लगातार वर्गों के भिन्न हो सकते हैं। परिणामस्वरूप डेटासेट में प्रत्येक अनुभाग की एकल छवियाँ होती हैं. इन छवियों को एक 3 डी स्टैक में कनवर्ट करने की आवश्यकता है।

4. SBF-SEM डेटा प्रसंस्करण

  1. फिजी का उपयोग करके, फ़ाइल-आयात-छवि अनुक्रम का चयन करें और छवियों को लोड करने के लिए छवि स्टैक की स्थिति जानें. डेटासेट के आकार के आधार पर, 'वर्चुअल स्टैक का उपयोग करें' बॉक्स चेक करें।
    नोट: यदि डेटासेट वास्तव में बड़ा है, तो पहले इसे 8 बिट में कनवर्ट करें (यदि 16 बिट पर एकत्र किया गया हो) और यदि आवश्यक हो तो डेटा को तब तक परिवर्तित करें जब तक कि इसका आकार व्यावहारिक न हो.
  2. इमेजिंग रन सफल रहा था, तो यह देखने के लिए डेटासेट के माध्यम से छवि स्क्रॉल के निचले भाग पर खेलने के बटन का उपयोग करना. एसबीएफ-एसईएम के लिए विशिष्ट इमेजिंग कलाकृतियों की जांच करें, जैसे ब्लॉक-फेस पर चाकू से गिरने वाले अनुभाग, नंगे राल के क्षेत्रों में चार्ज करना, चाकू की कलाकृतियों को काटने (छवि पर क्षैतिज रेखाएं)।
  3. आदेश छवि गुण का उपयोग कर पिक्सेल आकार और voxel गहराई (यानी, अनुभाग thickness) रन के दौरान इस्तेमाल समायोजित करें. यदि डेटा पहले से ही बाइंड है, तो इसे ध्यान में रखें.
  4. आदेश plugins-पंजीकरण रेखीय स्टैक संरेखण के साथ SIFT का उपयोग करने के लिए डेटा रजिस्टर.
    नोट: SBF-SEM डेटा के पंजीकरण की जरूरत है क्योंकि वहाँ चार्ज या नमूना के बहाव के कारण इमेजिंग के दौरान थोड़ा नमूना आंदोलन हो सकता है. इस XY में केवल एक न्यूनतम आंदोलन है के रूप में, केवल अनुवाद की जरूरत है।
  5. डेटासेट के माध्यम से स्क्रॉल करके संरेखण की जाँच करें और यदि ठीक है, तो संरेखित डेटासेट को 3D-tif फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए फ़ाइल मेनू के अंतर्गत सहेजें आदेश का उपयोग करें.
  6. ROI शामिल है या नहीं यह देखने के लिए डेटासेट का सावधानीपूर्वक विश्लेषण करें और उसमें वह जानकारी शामिल है जो जैविक प्रश्न के लिए आवश्यक है. स्टैक की अंतिम छवि पर ($ वर्तमान ब्लॉक-फ़ेस), FIB-SEM इमेजिंग के लिए एक नया ROI का चयन करें.
    नोट: यदि वर्तमान ब्लॉक-फ़ेस पर मौजूद FIB-SEM इमेजिंग के लिए कोई अच्छा क्षेत्र नहीं है, तो अधिक अनुभागों को ब्लॉक (जो अभी भी SBF-SEM में है) से काटा जा सकता है जब तक कि ROI प्रकट नहीं होता है. वहाँ वॉल्यूम है कि FIB के साथ छवि की जा सकती करने के लिए एक सीमा है. SBF-SEM छवि पर ROI X, 30-40 डिग्री x 15-20 m के X, Y में अधिकतम हो सकता है।

5. एफआईबी-सेम में इमेजिंग

  1. SBF-SEM में नमूने की अवलोकन छवियों को लें, जिसमें आदर्श रूप से नमूने के एक या अधिक किनारे शामिल हैं, जो तब FIB-SEM में पहचानने योग्य हैं (चित्र 2A, C) में पहचाने जासकते हैं।
    नोट: इस उदाहरण में SBF-SEM ओवरव्यू छवियों 10 एनएम पिक्सेल आकार पर लिया गया, 8,000 x 8,000 पिक्सेल पर 1 $s रहने के समय. माइक्रोस्कोप अभी भी 1.6 केवी और 100 पीए पर सेट किया गया था।
  2. SBF-SEM से नमूना निकालें और sputter कोटर में जगह है. FIB-SEM इमेजिंग के लिए $ 20 एनएम प्लैटिनम के साथ नमूना कोट.
  3. एफआईबी-सेम में लोड नमूना और 15 केवी पर द्वितीयक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके, 1 एन ए ब्लॉक-फेस पर एसबीएफ-सेम में पहचाने गए आरओआई का पता लगाता है (चित्र 2ठ,D)।
    नोट: 15 केवी पर इमेजिंग प्लैटिनम कोटिंग के माध्यम से देखने के लिए आवश्यक है।
  4. मंच को हिलाकर (चित्र 3क)को ले जाकर FIB और SEM बीम के संयोग बिंदु पर ROI को ले आओ।
    नोट: FIB स्तंभ आमतौर पर एक कोण के अंतर्गत माउंट किया गया है (चित्र 3A). इसका मतलब यह है कि किसी भी नमूने को इस तरह से झुकाया जाना चाहिए कि सतह को छविबद्ध और अनुभागित किया जा सके, एफआईबी बीम के समानांतर स्थित है। छवि के लिए सतह अब SEM बीम के संबंध में झुका हुआ है और ऊतक की एक खाई को हटाने की जरूरत है इससे पहले कि SEM ROI छवि में सक्षम है (चित्र 3ई)
  5. एफआईबी बीम और गैस इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग करके, आरओआई के ऊपर की सतह पर प्लैटिनम की 1 मिमी सुरक्षात्मक परत जमा करें (चित्र 3C)। इसके बाद, एक कम मिलिंग वर्तमान (50-100 पीए) का उपयोग करते हुए, इमेजिंग रन के दौरान ऑटो फोकसिंग और 3 डी ट्रैकिंग के लिए प्लैटिनम जमाव में ठीक लाइनों को मिल (चित्र3डी)। FIB स्तंभ और कार्बन गैस इंजेक्टर का उपयोग करना, कार्बन जमाव के साथ इन पंक्तियों को कवर.
    नोट: यहाँ ROI का आकार SBF-SEM छवि पर ROI के आकार से मेल खाती है और अधिकतम आकार इस प्रकार हो सकता है 30-40 डिग्री x 15-20 $m. इस उदाहरण में 17 डिग्री x 8 उ का ROI प्रतिबिंबित था। कार्बन जमाव लाइनों की सुरक्षा के लिए और कार्बन और प्लैटिनम जो ऑटो फोकस के लिए आदर्श है के बीच एक काले सफेद विपरीत बनाने के लिए आवश्यक है. प्रत्येक चरण के लिए प्रयुक्त मिलिंग धाराएँ सारणी 2में पाई जा सकती हैं।
  6. एक उच्च मिलिंग वर्तमान का उपयोग करना, ROI के सामने 30 डिग्री मीटर की एक खाई मिल, SEM बीम के लिए इमेजिंग सतह बनाने (चित्र 3E).
    नोट: FIB बीम स्वाभाविक विनाशकारी है, और भी अधिक तो उच्च धाराओं में. ROI पर राल पिघलने से बचने के लिए कम आवर्धन और तेजी से स्कैन गति पर एक न्यूनतम और छवि के लिए उच्च धाराओं पर इमेजिंग रखने के लिए सुनिश्चित करें।
  7. इमेजिंग रन के दौरान इस्तेमाल की जाने वाली करंट के करीब एक मिलिंग करंट के साथ इमेजिंग सतह को चिकना करें। जब सभी ऑटो फोकस और 3 डी ट्रैकिंग के निशान इमेजिंग सतह पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं पॉलिश करना बंद करो (चित्र 3 F)। FIB की प्रगति EM के साथ सतह इमेजिंग द्वारा पीछा किया जा सकता है (एक वापस बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके) जबकि चमकाने.
  8. नए बनाए गए सतह पर छवि बनाने के लिए क्षेत्र निर्धारित करें और इमेजिंग पैरामीटर सेट करें. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रॉन बीम सतह पर ध्यान केंद्रित किया है, चमक और इसके विपरीत सेट और पिक्सेल आकार और अनुभाग मोटाई सेट. रहने के समय और लाइन औसत का समायोजन करके इमेजिंग समय 1 मिनट से नीचे रखें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल ब्लॉक की सतह पर ही छवि है यह सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग के लिए एक कम वोल्टेज का उपयोग करना महत्वपूर्ण है (अर्थात, नमूना में गहराई से कोई इलेक्ट्रॉन छवि बनाई गई है)। यह वोल्टेज को 2 केवी से नीचे रखकर और ग्रिड वोल्टेज के साथ एक बैक बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करके किया जाता है, जिससे केवल उच्च ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों की छवि हो सकती है। इस उदाहरण में, इलेक्ट्रॉन किरण पुंज को 1ण्5 टट तथा 1 ए ए पर सेट किया गया था, जिसकी पीठ पर 1ण्2 टट का ग्रिड वोल्टता थी। इसके अलावा यहाँ, 5 एनएम के एक पिक्सेल आकार 5nm वर्गों के साथ इस्तेमाल किया गया था isotropic voxels के साथ एक डेटासेट में परिणाम. 17 डिग्री x 10 डिग्री का क्षेत्र6ण्5 डिग्री पर छवि बनाए गए थे और 1ण्0 का एक पंक्ति औसत है।
  9. एक ही पिक्सेल आकार का उपयोग कर, ऑटो ट्यूनिंग और 3 डी ट्रैकिंग के लिए खिड़कियों सेट, इमेजिंग के लिए इस्तेमाल के रूप में समय और लाइन औसत रहते हैं.
    नोट: यह प्रक्रिया भिन्न सिस्टम के लिए अलग-अलग होगा, इसलिए केवल चरण भिन्न क्रियाएँ निर्दिष्ट किए बिना बताया गया है।
  10. इमेजिंग रन प्रारंभ करें और पहले 50 डिग्री 100 अनुभागों के दौरान प्रक्रिया की स्थिरता की निगरानी करें। एक बार जब सिस्टम सुचारू रूप से चल रहा है, तो कमरे को छोड़ दें और सुनिश्चित करें कि कमरे में जितना संभव हो उतना कम अशांति हो।
    नोट: चलाने की अवधि और वर्गों की संख्या ROI और अनुभाग मोटाई के आकार पर निर्भर करेगा। FIB-SEM में $ अक्ष वास्तव में SBF-SEM छवि पर ROI बॉक्स की ऊँचाई है (अधिकतम 15 डिग्री 20 डिग्री मी; चित्र 3E) .
  11. FiB-SEM डेटा SBF-SEM डेटा के लिए ऊपर वर्णित के रूप में उसी तरह पंजीकृत करें।

Representative Results

एसबीएफ-सेम की छवियां ऊतक का अवलोकन प्रदान करती हैं, जो कोशिकाओं के स्थानिक अभिविन्यास और अंतरकोशिकीय कनेक्शनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं (चित्र 4क)। एक नए क्षेत्र पर बाद में FIB-SEM इमेजिंग, जो आमतौर पर SBF-SEM रन के निरीक्षण के बाद निर्धारितब्याज का एक क्षेत्र है, विशिष्ट कोशिकाओं और /

चित्र 4C ,D SBF-SEM डेटा के गैर-आइसोट्रोपिक वोक्सल्स के रेंडरिंग में अंतर दिखाता है (चित्र 4C) और समस्थानिक वोसेल एफआईबी-SEM डेटा (चित्र 4D) . SBF-SEM में प्रयुक्त z मोटाई का अर्थ है कि प्रतिपादन स्पष्ट रूप से वर्गों को दिखाता है, जिसके परिणामस्वरूप सतह पर एक 'सीढ़ी' प्रभाव होता है। FIB-SEM डेटा में 5 एनएम वर्गों सुनिश्चित करें कि प्रतिपादन बहुत चिकनी और व्यक्तिगत वर्गों पूरी तरह से सतह में मिश्रण प्रकट होता है.

Figure 1
चित्र 1: एक राल एम्बेडेड नमूने से ब्लॉक चेहरे का निर्माण. (ए) राल में एम्बेडेड रूट-टिप। (बी) एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग अतिरिक्त राल दूर छंटनी की है जब तक 0.5 मिमी2 के एक ब्लॉक रहता है. (सी, डी) छंटनी ब्लॉक एक धातु पिन पर चिपके हुए है और ओवन में एक रात के बाद, ब्लॉक के पक्षों छंटनी कर रहे हैं और सतह एक अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग कर एक हीरे चाकू के साथ smoothened। (ई) एसबीएफ-एसईएम के अंदर, नमूना उन्मुख होता है ताकि ब्लॉकफेस और आरओआई को पहचाना जा सके, स्केल बार ] 20 उ. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: SBF-SEM और FIB-SEM के बीच सहसंबंध. SBF-SEM (A) और FIB-SEM (B), स्केलबार $ 5 $m. (C,D) ROI पर ज़ूम का उपयोग करके ब्लॉक-फ़ेस की अवलोकन छवियों का अवलोकन करें. लाल बॉक्स FIB-SEM, स्केल बार $ 5 m के साथ छवि बनाने के लिए क्षेत्र को रेखांकित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: FIB-SEM योजना और तैयारी कदम. (क) योजना में एफआईबी बीम, SEM बीम और नमूने के अभिविन्यास को दर्शाने की गई है। नमूना एक ही क्षेत्र पर मिल और छवि करने में सक्षम होने के लिए FIB और SEM बीम के संयोग बिंदु पर तैनात होने की जरूरत है. (बी) एफआईबी द्वारा हटाए गए खंडों के SEM इमेजिंग के लिए आवश्यक ट्रेंच की योजना ड्राइंग। (सी) आरओआई पर प्लेटिनम जमा दिखा एफआईबी बीम के साथ ली गई छवि, स्केल बार 5 डिग्री (डी) छवि ऑटो फोकस और 3 डी ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया लाइनों दिखा एफआईबी बीम के साथ लिया. बीच में लाइनों ऑटो फोकस के लिए उपयोग किया जाता है और बाहर लाइनों 3 डी ट्रैकिंग प्रदान करते हैं. लाइनों के शीर्ष पर कार्बन जमाव इन कार्यों को करने के लिए आवश्यक विपरीत (प्लेटिनम बनाम कार्बन) प्रदान करता है, स्केलबार 5 डिग्री मी . (ई) खाई की मिलिंग के बाद एफआईबी बीम के साथ ली गई छवि, स्केलबार 5 डिग्री मी. (एफ) छवि SEM बीम के साथ ली गई है जो SEM बीम के साथ ली गई है FIB-SEM रन के दौरान छवि ब्याज का क्षेत्र, स्केल बार 2 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: SBF-SEM और FIB-SEM परिणाम से पहले और विभाजन के बाद. (ए) एसबीएफ-सेम डेटासेट का 3डी दृश्य (100 x 100 x 40 मीटर, स्केल बार ] 10 $m ), (B ) FIB-SEM डेटासेट का 3D दृश्य (17 x 10 x 5.4 m , स्केल बार ] 2 $m ), (सी) रेंडेड धानी को एसबीएफ-सेम डेटा से विभाजित किया गया है। फिबी-SEM डेटा से थ्रेशोल्डिंग, स्केल बार $ 2 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

माइक्रोवेव प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल
प्रोग्राम # विवरण उपयोगकर्ता प्रॉम्प्ट (ऑन/ समय (hr:min:sec) बिजली (वाट्स) अस्थायी (जेडसी) लोड कूलर (ऑफ/ वैक्यूम/बबलर पम्प (ऑफ/बब्ब/वैक चक्र/वैक ऑन/वैप) स्टेडी टेम्प
पम्प (ऑन/ऑफ) अस्थायी (जेडसी)
8 टीएचएच बंद 0:01:00 150 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 0 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 150 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
9 OSMIUM बंद 0:02:00 100 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:02:00 0 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:02:00 100 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:02:00 0 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:02:00 100 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
10 50% EtOH पर 0:00:40 150 50 बंद बंद पर 30
70% EtOH पर 0:00:40 150 50 बंद बंद पर 30
90% EtOH पर 0:00:40 150 50 बंद बंद पर 30
100% EtOH पर 0:00:40 150 50 बंद बंद पर 30
100% EtOH पर 0:00:40 150 50 बंद बंद पर 30
15 0.1एम काकोडाइलेट पर 0:00:40 250 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
0.1एम काकोडाइलेट पर 0:00:40 250 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
15 डीडीएच2हे पर 0:00:40 250 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
डीडीएच2हे पर 0:00:40 250 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
16 यूरेनिल ऐसीटेट बंद 0:01:00 150 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 0 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 150 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 0 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 150 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 0 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30
बंद 0:01:00 150 50 बंद वैक्यूम साइकिल पर 30

तालिका 1. माइक्रोवेव प्रसंस्करण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल.

चरण वर्तमान अनुमानित समय
निक्षेप प्लेटिनम 3n ए 10-15 मिनट
मिलिंग ऑटोट्यून और ट्रैकिंग मार्क्स 50-100 पीए 4-6 मिनट
निक्षेप कार्बन 3 एन ए 5-10 मिनट
मिलिंग मोटे खाई 15-30 एनए 30-50 मिनट
पॉलिश सतह 1.5-3 एन.ए. 15-20 मिनट
इमेजिंग रन 700 पीए-1.5 एनए घंटे-दिन

तालिका 2. नमूना तैयारी और इमेजिंग रन के लिए इस्तेमाल किया FIB मिलिंग धाराओं

Discussion

वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पारंपरिक SEM या TEM की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली है। क्योंकि ऊतकों या कोशिकाओं एन ब्लॉक दाग की जरूरत है, प्रसंस्करण कदम काफी लंबे समय के लिए नमूना भर में अभिकर्मकों के प्रवेश सुनिश्चित होना चाहिए. माइक्रोवेव ऊर्जा का उपयोग प्रवेश की सुविधा के लिए कम, अधिक कुशल प्रसंस्करण के लिए बनाता है और धुंधला सुधार. क्योंकि EM के लिए तैयारी प्रकाश माइक्रोस्कोपी सभी समाधानऔर अभिकर्मकों के लिए की तुलना में अधिक कठोर है गुणवत्ता कड़ाई से नियंत्रित किया जाना चाहिए. पीएच, टॉनिसिटी, अशुद्ध अभिकर्मकों के उपयोग, और खराब तकनीक के कारण contaminants की शुरूआत में परिवर्तन सभी अंतिम छवि पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है.

वॉल्यूम EM भी प्रत्येक भिन्न नमूना प्रकार के लिए अलग-अलग अनुरूप प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। विभिन्न प्रकार के स्तन के ऊतक: पौधे, एकल कोशिकाएं जैसे खमीर, ट्रिपेनोसोम, सी एलिगनआदि, सभी को इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए अपनी विविधताओं की आवश्यकता होती है। फिक्सिंग और धुंधला संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने और संभव के रूप में विवो आकृति विज्ञान में इसके करीब के रूप में नमूना रखने के लिए इतनी के रूप में डिजाइन किया जाना चाहिए। शारीरिक तापमान, पीएच और टॉनिकता पर ऊतकों का निर्धारण जीवन की तरह के रूप में नमूना बनाने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह हो सकता है. उच्च दबाव ठंड (HPF) नमूनों की एक और अधिक जीवन की तरह स्थिति को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं, (या शायद सिर्फ अलग कलाकृतियों उपज), लेकिन कोशिकाओं और बहुत पतली ऊतकों HPF के रूप में विफल हो जाएगा के अलावा अन्य के लिए केवल छोटे संस्करणों में उत्पन्न किया जा सकता है. इसलिए कई सवालों के लिए रासायनिक निर्धारण ही एकमात्र विकल्प है. कोई फर्क नहीं पड़ता अगर निर्धारण HPF या रासायनिक है, किसी भी EM प्रयोग में संरचनात्मक परिणाम ध्यान से लाइव सेल या ऊतक इमेजिंग से इसी तरह के परिणामों की तुलना में अगर वे संगत कर रहे हैं देखने की जरूरत है. दाग भी अनुकूलित किया जाना चाहिए, जबकि विशिष्ट सवाल है कि जवाब दिया जा करने की जरूरत है और प्रोटोकॉल है कि डिजिटल छवियों के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पर विचार.

दोनों एक SBF-SEM और निकट निकटता में FIB प्रणाली होने के कई प्रयोगों में एक महान लाभ है. देखने के बड़े क्षेत्र और उच्च एक्स, SBF-SEM के वाई संकल्प व्यक्तिगत संरचनाओं / कोशिकाओं / घटनाओं सरल खोजने बनाता है और ऊतकों में कोशिकाओं की एक समग्र स्थानिक अभिविन्यास प्रदान करता है. इसके अलावा, $ में एक नमूना के माध्यम से इमेजिंग की अनुमति देने की क्षमता बहुत शक्तिशाली है; हालांकि, पुनर्निर्माण है कि ठीक ज्यामितीय विस्तार की आवश्यकता विफल या गैर-isotropic voxels यह उत्पन्न करता है के कारण इस तकनीक का उपयोग कर कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं. FIB एक छोटे इमेजिंग क्षेत्र के लिए प्रक्रिया के भौतिकी द्वारा सीमित है, लेकिन इसके 3 डी संकल्प बहुत सटीक पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त है. दो तकनीकों के संयोजन के रूप में नमूने आगे प्रसंस्करण या तैयारी के बिना FIB करने के लिए SBF-SEM से स्थानांतरित कर सकते हैं सरल है. हम स्वीकार करते हैं कि एक विशेष क्षेत्र को खोजने के लिए एक नमूना के माध्यम से खोज के लिए SBF-SEM का उपयोग कर एक बहुत अधिक सक्षम उपकरण का एक बहुत महंगा उपयोग है. हालांकि, तुरंत नए blockface देखने और ROI तक पहुँच गया है कि क्या यह निर्धारित करने की क्षमता एक बड़ा लाभ है। इसके अतिरिक्त, सीरियल अर्द्ध-thin (0.5 डिग्री) LM वर्गों का उपयोग करने के विकल्प छोटे संरचनाओं को दूर कर सकते हैं इससे पहले कि वे पता लगाया है, और एक एकल TEM वर्गों जो काट दिया जाना है का उपयोग कर एक ब्लॉक का निरीक्षण, एक ग्रिड पर डाल दिया और फिर एक समान रूप से महंगा TEM में देखा के रूप में नहीं है प्रस्तुत विधि के रूप में कुशल.

चूँकि कई प्रोग्राम डेटा को सेगमेंट और रेंडर करने के लिए मौजूद हैं, और किसी दिए गए संरचना की आवश्यकताओं को किसी एकल अनुप्रयोग द्वारा श्रेष्ठ रूप से कार्य नहीं किया जा सकता है, इसलिए कोई मानक वर्कफ़्लो प्रस्तावित नहीं किया जा सकता. कुछ सरल संरचनाएँ एक दहलीज एल्गोरिथ्म के साथ विभाजित किया जा सकता है अगर वे बहुत संकीर्ण ग्रे पैमाने मूल्यों के भीतर आते हैं. न्यूरोनल संरचनाओं अर्द्ध स्वचालित रूप से इस तरह के Ilastik11 के रूप में एक कार्यक्रम का उपयोग कर विभाजित किया जा सकता है, लेकिन यह इस तरह के ईआर के रूप में अधिक यादृच्छिक या जटिल आकार organelles पर कम उपयोगी हो जाएगा। माइक्रोस्कोपी छवि ब्राउज़र एक बहुत लचीला प्रोग्राम है जो वॉल्यूम EM डेटा को संरेखित, सेगमेंट और रेंडर कर सकता है, लेकिन इसके लिए महत्वपूर्ण उपयोगकर्ता इंटरैक्शन12की आवश्यकता होती है। एक सामान्य नियम के रूप में परिणामों को डिजिटल रूप से विज़ुअलाइज़ करने के लिए आवश्यक समय बहुत नमूना और इमेजिंग तैयार करने के लिए समय से अधिक हो जाएगा।

वॉल्यूम EM तकनीक ultrastructural विश्लेषण करने के लिए तीसरे आयाम खोल दिया है. 3 D EM प्राप्त करने की अन्य विधियों में उनके वॉल्यूम (TEM टोमोग्राफी), या उनकी दक्षता (सीरियल अनुभाग TEM) की सीमाएँ हैं। हालांकि सबसे अधिक भाग मात्रा EM तकनीक के लिए भी जटिल और महंगा करने के लिए व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में लागू किया जा रहे हैं, साझा कोर उन्हें पेशकश सुविधाओं की संख्या बढ़ रही है और नमूना प्रकार की संख्या सफलतापूर्वक छवि तेजी से बढ़ गया है. एक विशिष्ट प्रश्न और एक विशेष ऊतक के साथ उन लोगों के लिए यह संभावना है कि किसी को सलाह और इसकी तैयारी और इमेजिंग पर निर्देश की पेशकश करने में सक्षम हो जाएगा. वॉल्यूम EM उपकरण SBF-SEM में बड़े नमूने और एफआईबी के साथ बड़ा ROIs मिलिंग की क्षमता को संभालने की क्षमता शामिल करने के लिए सुधार किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर है जो एक और अधिक स्वचालित तरीके से ब्याज की संरचनाओं को विभाजित करने में सक्षम है काफी डेटा का विश्लेषण करने की प्रक्रिया को सरल और कंप्यूटिंग गति में सुधार ऐसा करने के लिए आवश्यक समय कम हो जाएगा. अपनी वर्तमान सीमाओं के बावजूद, मात्रा EM अभी भी एक उपयोगी उपकरण है और SBF-SEM और FIB-SEM के संयोजन दुर्लभ घटनाओं की पहचान करने और उन्हें उच्च संकल्प पर इमेजिंग के लिए एक कुशल कार्यप्रवाह प्रदान करता है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

मात्रा EM के लिए उपकरण Flanders की सरकार से एक उदार अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3View 2XP Gatan NA In chamber ultramicrotome for SBFI
Cacodylate buffer 0.2M solution EM Sciences 11652
Conductive epoxy resin (circuit works) RS components 496-265
Diatome Histo 4.0mm diamond knife EM Sciences 40-HIS
Digitizing tablet Wacom DTV-1200W No longer available
Eppendorf tubes Eppendorf 0030 120.094
Flat Embedding Mold EM Sciences 70900
Gluteraldehyde 25% solution EM Sciences 16220
High MW Weight Tannic Acid EM Sciences 21700
Lead Citrate Sigma-Aldrich 22861
NaCl Sigma-Aldrich 746398
Osmium Tetroxide 4% solution EM Sciences 19170
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Pelco Biowave Pro + Ted Pella 36700
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P3289
Quorum Q150T ES sputter coater Quorum Technologies 27645
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome NA NA No longer available
Sodium Cacodylate 0.2M EM Sciences 11653
Spurrs Resin kit EM Sciences 14300
Uranyl Acetate EM Sciences 22400

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References

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जीव विज्ञान अंक 150 मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माइक्रोवेव सहायता नमूना तैयारी सीरियल ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी.
सीरियल ब्लॉक चेहरे और केंद्रित आयन बीम स्कैन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग लक्षित अध्ययन
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Guérin, C. J., Kremer, A.,… More

Guérin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e59480, doi:10.3791/59480 (2019).

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