Summary
Her præsenterer vi en protokol for effektivt at kombinere seriel blok ansigt og fokuseret ion Beam scanning elektronmikroskopi til at målrette et område af interesse. Dette giver mulighed for effektiv søgning, i tre dimensioner, og lokalisering af sjældne begivenheder i et stort synsfelt.
Abstract
Denne protokol giver mulighed for effektiv og effektiv billeddannelse af celle-eller vævsprøver i tre dimensioner på opløsnings niveauet for elektronmikroskopi. Elektronmikroskopi (EM) har i mange år været en naturlig todimensional teknik. Med fremkomsten af seriel scanning elektronmikroskop Imaging teknikker (Volume EM), ved hjælp af enten en integreret mikrotom eller fokuseret ion stråle til skive derefter se indlejret væv, den tredje dimension bliver let tilgængelig. Seriel blok ansigtsscanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) anvender en ultramicrotome, som er omsluttet af SEM-kammeret. Det har evnen til at håndtere store prøver (1.000 μm x 1.000 μm) og billede store synsfelter på små X, Y pixelstørrelse, men er begrænset i Z-dimensionen af diamant kniven. Fokuseret ion Beam SEM (FIB-SEM) er ikke begrænset i 3D-opløsning, (isotropisk voxels på ≤ 5 nm er opnåelige), men synsfeltet er meget mere begrænset. Denne protokol demonstrerer en arbejdsgang for at kombinere de to teknikker for at gøre det muligt at finde individuelle regioner af interesse (Rois) i et stort felt og derefter Imaging den efterfølgende målrettede volumen ved høj isotropisk voxel opløsning. Klargøring af faste celler eller væv er mere krævende for volumen EM teknikker på grund af den ekstra kontrast nødvendig for effektiv signal generering i SEM Imaging. Sådanne protokoller er tidskrævende og arbejdskraftintensive. Denne protokol inkorporerer også mikrobølge assisteret vævs behandling, der letter indtrængningen af reagenser, hvilket reducerer den tid, det kræver at behandle protokollen fra dage til timer.
Introduction
Denne protokol beskriver en arbejdsgang for effektiv målretning af høj opløsning, tredimensionel elektronmikroskopi (EM) til en specifik interesseregion (ROI). Siden starten i 1930 ' erne har EM været en overvejende todimensional teknik. De første offentliggjorte billeder var af hele væv eller celler, men det gav sig hurtigt til sektioner, der blev skåret i hånden ved hjælp af en ultramicrotome og afbildet ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM producerer mikrografer med meget høj opløsning, hvor selv de mindste cellulære strukturer tydeligt kan skelne. Men den tyndere sektion er nødvendig for væv, der skal afbildet af elektronstrålen gjort oplysninger i Z-dimensionen minimal. Da cellerne er tredimensionale strukturer, måtte interaktioner mellem cellestrukturer og celle flader udledes af begrænsede data. Dette rejste potentialet for fejlfortolkninger, især i strukturer, der var komplekse. Nogle microscopists formået at opnå mere præcise 3D-strukturer ved serie-skæring celler og væv og derefter omhyggeligt rekonstruere dem fra individuelle TEM billeder1. Dette var en meget arbejdskraftintensiv proces, og før fremkomsten af Digital Imaging og computer rendering resultaterne var også vanskeligt at visualisere. I de seneste år to teknikker er blevet indført, som er blevet kollektivt kendt som Volume elektronmikroskopi (Volume EM)2 , der har gjort EM i tre dimensioner tilgængelige for flere laboratorier.
Ideen om at få en stak billeder fra en indlejret blok inde i et elektronmikroskop kan spores tilbage til 1981, da Steve Leighton og Alan Kuzirian byggede en miniature mikrotom og placerede den i kammeret på et scannings elektronmikroskop3 (SBF-SEM) . Denne prototype blev til sidst kopieret og forbedret 23 år senere af Denk og Horstmann4 og efterfølgende kommercialiseret. På nogenlunde samme tid biologiske videnskabsfolk blev opmærksom på en anden teknologi, der primært anvendes i materialevidenskab, den fokuserede ion stråle. Denne teknik bruger en ionstråle af en slags (gallium, plasma) til at fjerne en meget lille mængde overflademateriale fra en prøve (FIB-SEM)5. Begge teknikker ansætte skæring efterfulgt af billeddannelse giver en række billeder, som kan kombineres i en X, Y, Z, stak. Begge teknikker giver 3D-oplysninger, men på forskellige opløsnings skalaer. SBF-SEM er begrænset af de fysiske egenskaber af diamant kniven til skiver ikke tyndere end 50 nm for lange serielle Imaging kørsler; men prøve blokken størrelse, der kan opdeles er stor, op til 1 mm x 1 mm x 1 mm. på grund af den store digitale erhvervelse format af back scattered elektron detektor (32K x 32K pixels), der modtager et signal fra blokken ansigt kan billedpixel størrelser være så små som 1 nm. Dette resulterer i ikke-isotropic voxels, hvor X, Y-dimensionen ofte er mindre end Z. På grund af ionstrålens præcision har FIB-SEM evnen til at indsamle billeder med isotropisk voxels ≤ 5 nm. Men det samlede areal, der kan afbildet er ganske lille. En sammenfattende oversigt over forskellige prøver og volumener, der er inddelt i de to teknikker, er blevet offentliggjort tidligere3.
Vævs forberedelse til volumen EM er vanskeligere end for standard TEM eller SEM, fordi prøverne skal farves for at give tilstrækkelig signal generering i SEM. ofte skal der optimeres ikke kun for den pågældende vævstype, men også for at tilføje kontrast til visse cellulære strukturer til at gøre identifikation og genopbygning lettere. Den protokol, der anvendes her, er baseret på NCMIR standard6. Yderligere farvning betyder normalt yderligere protokol trin. For volumen EM skal standardprotokollerne derfor udvides for at sikre tilstrækkelig tid til, at reagenserne trænger ind i prøven. Mikrobølge assisteret behandling kan reducere den tid, der er nødvendig til farvning fra timer til minutter, og gør prøveforberedelsen af volumen EM mere effektiv7. Denne metode gælder for alle celle-og vævstyper8 og for forskningsspørgsmål, hvor vævs inhomogeniteten gør prøvetagning af et bestemt område væsentligt9.
Når en data stak er opnået det kan justeres og de strukturer af interesse segmenteret fra resten af data og modelleret i 3D. Selv om automatisering af billeddannelse mange skiver af væv har gjort billedet erhvervelse relativt ligetil, processen med at Digital rekonstruere og visualisere data er en tidskrævende opgave. Software til dette formål er endnu ikke integreret eller fuldt automatiseret. Da meget af det tidlige arbejde med Volume EM var rettet mod neurovidenskab, er teknikker til farvning og digitalt segmentering strukturer som axoner forholdsvis langt fremme i forhold til andre celler og organeller. Mens litteraturen om andre ikke-neuronal væv vokser hurtigt, ikke-lineære eller uregelmæssige strukturer kræver mere manuel input.
Ved hjælp af både SBF-SEM og FIB-SEM er en nyttig tilgang til målretning og Imaging specifikke, nonhomogene, væv strukturer ved høj opløsning i 3D. Kombinere det med mikrobølge assisteret vævs behandling, der kraftigt nedsætter den tid, der kræves til prøveforberedelse. Sammen denne arbejdsgang vil gøre genererer høj opløsning isotropisk voxel billed datasæt af fine strukturer en effektiv og hurtigere proces.
Protocol
1. prøve fiksering og behandling til elektronmikroskopi
- Fix frøplanter af Arabidopsis thaliana dyrket på agar plader i 0,5% PARAFORMALDEHYD, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB) pH 6,8 for 2 h ved stuetemperatur (RT).
Forsigtig: aldehyder er irriterende og ætsende og har karcinogent, mutagent og teratogent potentiale. Alle opløsninger skal håndteres med passende beskyttelsesudstyr og i en udsugnings hætte. - Skær root tips af planten dyrket i trin 1,1 og sætte 2-3 tips i 0,5 mL rør, der indeholder den samme fikativ natten over ved 4 °C.
Bemærk: volumen af denne og eventuelle løsninger i de resterende trin bestemmes af prøvevolumen; et minimumsforhold mellem prøven og opløsningen er 10:1. Prøver, der er større end 1 mm i enhver dimension, vil være svære at plette, så det er vanskeligere at arbejde med større vævs blokke. Ikke alle væv har samme egenskaber; for eksempel kan plante blade og stilke være svære at plette. Hvis der ønskes større prøver eller svære vævstyper, skal der udføres optimering af prøve behandlingen, før du går videre til dataindsamlingen. - Forbered thiocarbohydrazid (TCH)-opløsningen, der er nødvendig frisk og tilgængelig før trin 1,7. Tilsæt 0,1 g thiocarbohydrazid til 10 mL dobbeltdestilleret vand (ddH2O), og Opløs ved opvarmning til 60 °c i ovnen i 1 time. Før brug filtreres TCH-opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm sprøjte filter.
- Fjern fixativ fra rørene og Udskift med 0,1 M PB pH 6,8. Sæt rørene på en orbital rystebord på 100 rpm og vask i 10 min. Gentag vask med frisk PBS 5 gange.
- Post Fix root tips ved at erstatte PB med 2% osmium dinitrogentetraoxid (OsO4) og 0,2% ruthenium rød i 0,1 M PB pH 6,8. Sæt rørene i mikrobølgeovnen med låg åbne og start program 9 (tabel 1).
Forsigtig: osmium er ekstremt farlig i tilfælde af indtagelse, meget farlig i tilfælde af indånding, og farlig i tilfælde af hudkontakt. Brug altid passende beskyttelsesudstyr og i en udsugnings hætte.
Bemærk: under hele protokollen er lågene på rørene altid åbne under mikrobølge trinene. - Vask root tips to gange med ddH2O i 5 min hver på bordpladen. For den tredje og fjerde ddH2O vask brug program 15 på mikrobølgeovnen (tabel 1). Efter den første 40 sekunder ddH2o vask, tage prøver ud af mikrobølgeovnen og udskifte bufferen med frisk DDH2o. sæt prøverne tilbage i mikrobølgeovnen og Fortsæt programmet.
Bemærk: mikrobølgeovnen vil lyde en alarm, når bufferen skal opdateres. Sørg for, at låget til vakuumkammeret udskiftes korrekt hver gang. - Inkubér prøver i tidligere forberedt TCH-opløsning ved RT i 2 min på bænken og til yderligere inkubatation brug mikrobølge programmet 8 (tabel 1). Opløsningen må ikke skiftes mellem bænk og mikroovn.
- Vask prøverne som beskrevet i trin 1,6.
- Prøverne placeres i 1% OsO4 i DDH2O for mikrobølge program 9 (tabel 1).
- Vask prøverne som beskrevet i trin 1,6.
- Incubate prøver i 1% uranylacetat i ddH2O ved brug af mikrobølge programmet 16 (tabel 1).
Forsigtig: uranyl acetat er giftigt, irriterende og har karcinogent, mutagent og teratogent potentiale. Altid håndteres ved hjælp af passende beskyttelsesudstyr. - Vask prøverne som beskrevet i trin 1,6.
- Forbered Walton hoved løsning til brug i trin 1,14. Først lave en bestand opløsning af L-aspartinsyre ved at tilføje 0,998 g L-aspartinsyre til 250 mL ddH2O og justere pH til 3,8 med 1 M Koh. Derefter opløses 0,066 g blynitrat i 10 mL L-aspartinsyrestam opløsning og justeres pH til 5,5. Opløsningen efterlades i ovnen ved 60 °C i 30 minutter.
Bemærk: der må ikke dannes bundfald. - Incubate prøver i Walton bly opløsning i 30 min i ovnen ved 60 °C.
- Vask prøverne som beskrevet i trin 1,6.
- Dehydrat prøver i EtOH i graduerede trin på 50%, 70%, 90% i ddH2O, og derefter 2x i 100% EtOH. Brug mikrobølge program 10 (tabel 1) og mikrobølgeovnen vil bede brugere hver 40 s til at erstatte løsning med det næste EtOH trin. Dette er det sidste skridt gjort i mikrobølgeovnen.
- Yderligere dehydrat i 100% propylenoxid 2x for 10 min hver på RT på bænken, udskiftning af opløsningen mellem trin.
Bemærk: propylenoxid kan opløse nogle plasttyper såsom polystyrenes; Brug enten glasflasker til dette trin eller pre-test plast for resistens.
Forsigtig: propylenoxid er meget brandfarlig. Brug altid passende beskyttelsesudstyr og i en udsugnings hætte. - Start infiltration af rodspidser ved at inkuberere i 50% Spurr's harpiks i propylenoxid (min. 2 h).
Forsigtig: Spurr's harpiks komponenter er irritationsmomenter. Brug altid passende beskyttelsesudstyr og i en udsugnings hætte. - Udskift løsning med 100% Spurr og lad natten over på RT.
- Skift til frisk 100% Spurr's resin 2 gange (min 2 h inkubationer).
- Placer prøverne i en indlejrings skimmel, igen indeholdende frisk 100% Spurr harpiks og polymeriserer i en ovn ved 65 °C i 36 − 48 timer.
Bemærk: indlejrings formen anvendes afhænger af typen af væv og den metode, der anvendes til billeddannelse. Her blev en flad silikone indlejrings skimmel brugt (figur 1a).
2. Forbered indlejrede prøver til billeddannelse
- Fjern prøverne fra ovnen, Fjern harpiks fra indlejrings formen (figur 1b).
- Ved hjælp af en barberkniv, groft Trim prøven til en blok af maksimum 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm (figur 1c).
Bemærk: for at forhindre opladning i SBF-SEM, er det vigtigt at trimme væk så meget nøgne harpiks som muligt og gøre prøven så flad/tynd som muligt. Ideelt set alle sider af blokken indeholder væv allerede, men vigtigst af siden, som vil blive knyttet til metalstift (Se trin 2,3) skal indeholde eksponerede væv, således at vævet er i direkte kontakt med ledende metal. - Fjern prøven fra den fremmede harpiks, og fastgør den til en metalstift (figur 1d) med konduktiv epoxyharpiks, og sørg for, at en del af vævet rører ved metal nålen. Lad epoxy hærde natten over i ovnen ved 65 °C.
Bemærk: Sørg for, at prøven er placeret i midten af nålen, fordi bevægelsen af scenen i SB-SEM er begrænset. Fjernelse af meget lille harpiks indkapslet prøve fra ekstra harpiks kan være vanskeligt, da den lille prøve vil have en tendens til at flyve væk, når løsrevet. En enkel og effektiv løsning på dette er at dække prøven med et ark paraffin folie som vist i den supplerende film af reference1. - Fastgør bæreren i holderen til ultramicrotomen. Brug en barberkniv til at fjerne overskydende epoxy og bruge ultramicrotome og en diamant kniv til at glatte ansigtet og siderne af blokken, der danner en pyramide. Sørg for, at i det mindste nogle af vævet er allerede eksponeret på blokken-ansigt.
Bemærk: det ekstra trin i at bruge en diamant kniv er valgfri, men det gør den resulterende blok lettere at nærme sig i SBF-SEM, fordi skyggen af kniven på blokken ansigt er klarere og dermed gøre anslå afstanden mellem kniv og blok ansigt lettere at bestemme. - Placer den trimmede prøve blok i sputter-Coater, og stikprøven med et tyndt lag (2 − 5 nm) platin (PT).
Bemærk: platin på blok-ansigtet vil blive skåret væk under tilgangen i SBF-SEM (se nedenfor), men platin på siderne af pyramiden vil give yderligere ledningsevne. I dette eksempel blev prøven belagt med platin, men guld, eller guld/Palladium er også effektiv; Men, belægning med guld resulterede i øget snavs på blokken-ansigt under en Imaging Run.
3. billeddannelse i SBF-SEM
- Indsæt bæreren i SBF-SEM mikroskop og Bring kniven tæt på prøveoverfladen. Ved hjælp af diamant kniven trim den øvre del af prøven, således at PT lag allerede er blevet fjernet, og i det mindste en del af vævet er eksponeret.
Bemærk: da denne proces er forskellig for hvert SBF-SEM-mikroskop, er ikke alle trin angivet her. Så længe prøveoverfladen er fri for PT og klar til billeddannelse, vil de næste skridt være mulige. - Start billeddannelse ved lav opløsning og korte hviletider for at få et overblik over prøven og finde en interesseregion (figur 1E).
Bemærk: her blev 512 x 512 pixels og 1 μs opholdstid brugt til hurtig scanning og positionering af scenen og 2.000 x 2.000 pixels med 1 μs opholdstid blev brugt til optimering af billedbehandlings vinduet og justering af fokus. - Ved hjælp af en accelererende spænding på 1,5-2,0 kV ved en strøm på 80 − 100 pA, fange et billede af vævet.
Bemærk: eksemplet vist her blev afbildet på et højt vakuumsystem, hvor stråle strømmen skal justeres for at minimere opladningen, hvilket er meget prøve afhængigt. Elektronstrålen er typisk indstillet til 1,5 − 2,0 kV, men vil være prøve afhængig. Ved højere forstørrelser (normalt > 10.000 x) er harpiksen for meget påvirket af strålen for at garantere jævn skæring, så typisk er pixelstørrelse indstillet til 8 − 20 Nm ved en billedstørrelse på 8000 − 10000 x 8000 − 10000 pixels med en tilsvarende forstørrelse på 430 – 1, 400x og feltstørrelser på henholdsvis 64 X 64 mm og 200 x 200 mm. - Bestem en region af interesse og beslutte, hvor mange sektioner er nødvendige for at dække mængden af interesse og starte Imaging Run, ved hjælp af back scattered elektron detektor.
Bemærk: i eksemplet præsenteret her, 500 sektioner af 80 nm blev afbildet ved 10 nm pixels og 10.000 x 10.000 pixel billeder (opholdstid 1 μs). Mikroskopet blev sat til 1,6 kV og 100 pA. Generelt er antallet af sektioner afhængig af prøve og størrelse af ROI og kan variere fra 100 s til 1.000 s af fortløbende sektioner. Det resulterende datasæt består af enkelte billeder af hver sektion. Disse billeder skal konverteres til en 3D-stak.
4. SBF-SEM databehandling
- Ved hjælp af Fiji skal du vælge fil-Importer-billedsekvens og finde billed stakken for at indlæse billederne. Afhængigt af størrelsen på datasættet skal du markere afkrydsningsfeltet ' brug virtuel stak '.
Bemærk: Hvis datasættet er virkelig stort, skal du først konvertere det til 8 bit (hvis indsamlet ved 16 bit) og om nødvendigt bin dataene, indtil det har en brugbar størrelse. - Hvis du bruger knappen Afspil nederst i billedet, skal du rulle gennem datasættet for at se, om billedbehandlings kørslen lykkedes. Se efter typiske billedartefakter for SBF-SEM, såsom sektioner, der falder af kniven på blok ansigtet, opladning i områder med bare harpiks, skære artefakter af kniven (vandrette linjer på billedet).
- Ved hjælp af kommandoen billede-egenskaber justere pixelstørrelse og voxel dybde (dvs., sektion-tykkelse), der anvendes under kørslen. Hvis dataene allerede er binned, skal du tage højde for dette.
- Ved hjælp af kommandoen plugins-registrering-lineær stak justering med SIFT at registrere data.
Bemærk: registrering af SBF-SEM data er nødvendig, fordi der kan være en lille prøve bevægelse under billeddannelse på grund af opladning eller drift af prøven. Da dette er kun en minimal bevægelse i XY, kun oversættelse er nødvendig. - Kontroller justeringen ved at rulle gennem datasættet, og hvis OK Brug kommandoen Gem i menuen filer til at gemme det justerede datasæt som en 3D-tif-fil.
- Analysér datasættet omhyggeligt for at se, om ROI er inkluderet, og indeholder de oplysninger, der er nødvendige for det biologiske spørgsmål. På det sidste billede af stakken (= den aktuelle blok-ansigt), skal du vælge en ny ROI for FIB-SEM Imaging.
Bemærk: Hvis der ikke er nogen god region for FIB-SEM Imaging til stede på den aktuelle blok-ansigt, kan flere sektioner skæres fra blokken (som stadig er i SBF-SEM), indtil en ROI vises. Der er en grænse for den mængde, der kan afbildet med FIB. AFKASTET på SBF-SEM-billedet kan være maksimum i X, Y på 30-40 μm X 15-20 μm.
5. billeddannelse i FIB-SEM
- Tag oversigten billeder af prøven i SBF-SEM, ideelt indbefattet en eller flere kanter af prøven, der derefter genkendes i FIB-SEM (figur 2a, C).
Bemærk: i dette eksempel blev SBF-SEM oversigt billeder taget ved 10 nm pixelstørrelse, 8.000 x 8.000 pixels ved 1 μs opholdstid. Mikroskopet blev stadig sat til 1,6 kV og 100 pA. - Fjern prøven fra SBF-SEM, og Placer den i sputter-Coater. Stikprøven med ≥ 20 Nm platin til FIB-SEM-billeddannelse.
- Indlæs prøven i FIB-SEM, og brug sekundær elektron detektor ved 15 kV, 1 nA Find det ROI, der er identificeret i SBF-SEM på blok ansigtet (figur 2b, D).
Bemærk: billeddannelse ved 15 kV er nødvendigt for at se gennem platin belægningen. - Bring ROI på prøven ind i sammentræf punkt af FIB og SEM bjælker, ved at flytte og vippe scenen (figur 3a).
Bemærk: FIB-søjlen er normalt monteret under en vinkel (figur 3a). Det betyder, at enhver prøve skal vippes på en sådan måde, at den overflade, der skal opdeles og sektioneres, placeres parallelt med FIB-strålen. Den overflade, der skal afbildes, er nu vippes med hensyn til SEM stråle og en grøft af væv skal fjernes, før SEM er i stand til at billedet ROI (figur 3E) - Brug FIB stråle-og gasindsprøjtnings systemet til at deponere et 1 mm beskyttende lag platin på overfladen over ROI (figur 3c). Dernæst ved hjælp af en lav fræsning strøm (50-100 pA), mølle fine linjer i platin deposition for auto-fokusering og 3D tracking under Imaging Run (figur 3D). Ved hjælp af FIB kolonne og Carbon gas injektor, dække disse linjer med kulstof deposition.
Bemærk: størrelsen af ROI her svarer til størrelsen af ROI på SBF-SEM billede og den maksimale størrelse kan således være 30-40 μm x 15-20 μm. I dette eksempel blev et ROI på 17 μm x 8 μm imaged. Kulstof aflejring er nødvendig for beskyttelse af linjerne og for at skabe en sort-hvid kontrast mellem kulstof og platin, som er ideel til Auto-fokusering. De fræse strømme, der anvendes til hvert trin, kan findes i tabel 2. - Ved hjælp af en høj fræse strøm, fræser en grøft på 30 μm foran ROI, hvilket skaber billedbehandlings overfladen for SEM Beam (figur 3E).
Bemærk: FIB strålen er i sagens natur destruktiv, endnu mere ved høje strømninger. Sørg for at holde Imaging ved høje strømme til et minimum og billede ved lav forstørrelse og hurtige scanningshastigheder for at undgå at smelte harpiks ved ROI. - Glat billedbehandlings overfladen med en fræse strøm tættere på den strøm, der bruges under billedbehandlings kørslen. Stop polering, når alle autofokus-og 3D-sporingsmærker er tydeligt synlige på billed overfladen (figur 3F). Fremskridtene i FIB kan efterfølges af billeddannelse overfladen med EM (ved hjælp af en tilbage spredt elektron detektor) mens polering.
- Bestem det område, der skal afbildes på den nyoprettede Surface, og Indstil billedbehandlings parametrene. Sørg for, at elektronstrålen er fokuseret på overfladen, Indstil lysstyrke og kontrast, og Indstil pixelstørrelse og snittykkelse. Hold billedbehandlings tiden under 1 minut ved at justere hviletiden og linje gennemsnittet.
Bemærk: det er vigtigt at bruge en lav spænding til billeddannelse med elektronstrålen for at sikre, at kun overfladen af blokken er afbildet (dvs. at ingen elektroner fra dybere ind i prøven er afbildet). Dette gøres ved at holde spændingen under 2 kV og ved hjælp af en tilbage spredt elektron detektor med en netspænding, så kun høje energi elektroner til at blive imaged. I dette eksempel blev elektronstrålen sat til 1,5 kV og 1 nA med en netspænding på 1,2 kV på den bageste spredte elektron detektor. Også her, en pixel-størrelse på 5 nm blev brugt med 5nm sektioner til at resultere i et datasæt med isotropisk voxels. Et areal på 17 μm x 10 μm blev afbildet ved 6,5 μs opholdstid og et linje gennemsnit på 1,0. - Indstil vinduerne til auto-tuning og 3D tracking, ved hjælp af den samme pixelstørrelse, dvæle tid og linje gennemsnit som bruges til Imaging.
Bemærk: denne proces vil variere for forskellige systemer, derfor kun det trin er nævnt uden at specificere de forskellige handlinger. - Start billedbehandlings kørslen, og Overvåg processens stabilitet i de første 50 − 100 sektioner. Når systemet kører glat, forlade rummet og sikre, at der er så lidt forstyrrelse i rummet som muligt.
Bemærk: varigheden af kørslen og antallet af sektioner vil afhænge af størrelsen af ROI og sektions tykkelsen. I FIB-SEM er Z-aksen faktisk højden af ROI-boksen på SBF-SEM-billedet (maks. 15 − 20 μm; Figur 3E). - Registrer FIB-SEM-dataene på samme måde som beskrevet ovenfor for SBF-SEM-data.
Representative Results
Billeder fra SBF-SEM giver et overblik over vævet, hvilket giver indsigt i cellernes rumlige orientering og intercellulære forbindelser (figur 4a). Den efterfølgende FIB-SEM-afbildning på en ny region, som sædvanligvis er en region af interesse, der bestemmes efter inspektion af SBF-SEM-kørslen, tilføjer detaljer i høj opløsning af specifikke celler og/eller strukturer (figur 4b).
Figur 4c , D vise forskellen i gengivelse af ikke-isotropisk voxels af SBF-SEM data (figur 4c) og isotropisk voxel FIB-SEM data (figur 4d). Z-tykkelsen, der anvendes i SBF-SEM, betyder, at gengivelsen tydeligt viser sektionerne, hvilket resulterer i en ' trappe '-effekt på overfladen. I FIB-SEM-data sikrer 5 nm-afsnittene, at gengivelsen ser meget glattere ud, og at de enkelte sektioner blandes helt ind i overfladen.
Figur 1: oprettelse af blokken ansigt fra en harpiks indlejret prøve. A) en rodspids, der er indlejret i harpiks. B) ved hjælp af en barberkniv er den overskydende harpiks trimmet væk, indtil en blok på 0,5 mm2 er tilbage. (C, D) Den trimmede blok klæbes fast på en metalstift, og efter en nat i ovnen trimmes blokkens sider, og overfladen glatter med en diamant kniv ved hjælp af en ultramicrotome. (E) inde i SBF-SEM, er prøven orienteret, således at blockface og ROI kan genkendes, skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: korrelation mellem SBF-SEM og FIB-SEM. Oversigt billeder af blok-Face ved hjælp af SBF-SEM (A) og FIB-SEM (B), Scale bar = 5 μm. (C, D) Zoom på Roi. Rød boks afgrænset den region, der skal afbildet med FIB-SEM, skala bar = 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: FIB-SEM-ordning og forberedelsestrin. A) enordning, der viser FIB-strålens, SEM-strålens og prøvens retning. Prøven skal placeres på FIB-og SEM-bjælkerne sammentræf for at kunne fræses og afbilde på samme region. B) skematisk tegning af den grøft, der er nødvendig for SEM-billeddannelse af de sektioner, der er fjernet fra FIB. (C) billede taget med FIB stråle, der viser platin AFLEJRING på ROI, skala bar 5 μm. (D) billede taget med FIB stråle, der viser linjerne bruges til auto-fokus og 3D tracking. Linjerne i midten bruges til autofokus, og de udvendige linjer giver 3D-sporing. Carbon deposition på toppen af linjerne giver den nødvendige kontrast (platin vs Carbon) til at udføre disse opgaver, scalebar 5 μm. (E) billede taget med FIB stråle efter fræsning af grøften, scalebar 5 μm. (F) billede taget med SEM Beam, der viser region af interesse afbildet under FIB-SEM løb, skala bar 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: SBF-SEM og FIB-SEM resultater før og efter segmentering. (A) 3D-visning af SBF-SEM-datasæt (100 x 100 x 40 μm, Scale bar = 10 μm), (B) 3D-visning af FIB-SEM datasæt (17 x 10 x 5,4 μm, Scale bar = 2 μm), (C) afsmeltet VAKUOLER segmenteret fra SBF-SEM data ved thresholding, Scale bar = 2 μm D. gengivet granulat Seg fra FIB-SEM data af thresholding, Scale bar = 2 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protokol til mikrobølge behandling | |||||||||
| Program # | Beskrivelse | Bruger prompt (til/fra) | Tid (hr: min: sek) | Strøm (watt) | Temp (°C) | Belastning køler (slukket/Auto/on) | Vakuum-/bubbler-pumpe (fra/bubb/VAC-cyklus/VAC on/VAP) | Stabil Temp | |
| Pumpe (til/fra) | Temp (°C) | ||||||||
| 8 | Tch | Ud | 0:01:00 | 150 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 |
| Ud | 0:01:00 | 0 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:01:00 | 150 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| 9 | OSMIUM | Ud | 0:02:00 | 100 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 |
| Ud | 0:02:00 | 0 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:02:00 | 100 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:02:00 | 0 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:02:00 | 100 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| 10 | 50% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Ud | Ud | På | 30 |
| 70% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Ud | Ud | På | 30 | |
| 90% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Ud | Ud | På | 30 | |
| 100% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Ud | Ud | På | 30 | |
| 100% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Ud | Ud | På | 30 | |
| 15 | 0.1 M CACODYLATE | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 |
| 0.1 M CACODYLATE | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | |
| 15 | ddH2O | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 |
| ddH2O | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | |
| 16 | Uranyl acetat | Ud | 0:01:00 | 150 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 |
| Ud | 0:01:00 | 0 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:01:00 | 150 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:01:00 | 0 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:01:00 | 150 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:01:00 | 0 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
| Ud | 0:01:00 | 150 | 50 | Ud | VAKUUM CYKLUS | På | 30 | ||
Tabel 1. Detaljeret protokol til mikrobølge behandling.
| Trin | Nuværende | Anslået tid |
| Deposition Platinum | 3N A | 10-15 minutter |
| Fræsning af auto tune og Sporingsmærker | 50-100 pA | 4-6 minutter |
| Deposition Carbon | 3 nA | 5-10 minutter |
| Fræsning grov grøft | 15-30 nA | 30-50 minutter |
| Polering overflade | 1.5-3 nA | 15-20 minutter |
| Imaging Run | 700 pA-1,5 nA | Timer-dage |
Tabel 2. FIB fræsning strømme anvendes til prøveforberedelse og Imaging Run
Discussion
Volume elektronmikroskopi er mere udfordrende og tidskrævende end konventionel SEM eller TEM. På grund af behovet for at plette væv eller celler en bloc, skal forarbejdnings trinene være lange nok til at sikre indtrængning af reagenser i hele prøven. Ved hjælp af mikrobølgeenergi til at lette penetration gør for kortere, mere effektiv behandling og forbedrer farvning. Fordi forberedelse til EM er meget strengere end for lys mikroskopi alle opløsninger og reagenser skal være kvalitetskontrol strengt. Ændringer i pH, tonicitet, brug af urene reagenser, og indførelse af forurenende stoffer på grund af dårlig teknik kan alle have skadelige virkninger på det endelige billede.
Volume EM kræver også individuelt skræddersyede protokoller for hver af de forskellige prøvetyper. Pattedyr væv af forskellige typer: planter, enkeltceller såsom gær, trypanosomer, C. elegans, etc., alle har brug for deres egne variationer for at opnå optimale resultater. Fiksering og farvning skal udformes således, at den bevarer den strukturelle integritet og holder prøven så tæt på sin in vivo morfologi som muligt. Fiksering af væv ved fysiologisk temperatur, pH og tonicitet er afgørende for at gøre prøven som livs lignende, som den kan være. Højtryks frysning (HPF) af prøver kan bidrage til at bevare en mere livlignende situation, (eller måske bare give forskellige artefakter), men for andre end celler og meget tynde væv HPF vil mislykkes som glasfri is kan kun genereres i små mængder. Derfor for mange spørgsmål kemisk fiksering er den eneste mulighed. Uanset om fikset er HPF eller kemisk, skal de strukturelle resultater i ethvert EM-eksperiment nøje sammenlignes med lignende resultater fra levende celle-eller vævs Imaging for at se, om de er konsistente. Farvning skal også optimeres under hensyntagen til det specifikke spørgsmål, der skal besvares, og den protokol, der vil blive brugt til visualisering af de digitale billeder.
At have både en SBF-SEM og FIB system i nærheden er en stor fordel i mange eksperimenter. Det store synsfelt og høje X, Y opløsning af SBF-SEM gør at finde individuelle strukturer/celler/begivenheder ligetil og giver en generel rumlig orientering af celler i væv. Desuden er dens evne til at tillade billeddannelse gennem en prøve i Z meget kraftfuld; men rekonstruktioner, der kræver fine geometriske detaljer kan mislykkes eller producere artefakter ved hjælp af denne teknik på grund af den ikke-isotropic voxels det genererer. FIB er begrænset af fysikken i processen til et mindre billedfelt, men dens 3D-opløsning er tilstrækkelig til meget præcise rekonstruktioner. Kombinationen af de to teknikker er ligetil, da prøverne kan flyttes fra SBF-SEM til FIB uden yderligere forarbejdning eller tilberedning. Vi erkender, at brug af SBF-SEM til at søge gennem en prøve for at finde et bestemt område er en meget kostbar brug af et meget mere egnet værktøj. Men evnen til straks at se den nye Block Face og afgøre, om ROI er nået, er en stor fordel. Desuden kan alternativerne ved at bruge serielle semi-tynde (0,5 μm) LM sektioner fjerne små strukturer, før de opdages, og inspicere en blok ved hjælp af enkelt TEM sektioner, der skal skæres, sat på et gitter og derefter ses i en lige så dyrt TEM er ikke så effektiv som den præsenterede metode.
Da der findes mange programmer til at segmentere og gengive data, og behovene i en given struktur ikke kan være bedst tjent med en enkelt applikation, kan ingen standard workflow foreslås. Nogle enkle strukturer kan segmenteret med en tærskel algoritme, hvis de falder inden for meget smalle gråskala værdier. Neuronal strukturer kan semi-automatisk segmenteret ved hjælp af et program som Ilastik11 , men det vil være mindre nyttigt på mere tilfældige eller komplekse formede ORGANELLER såsom er. Microscopy Image browser er et meget fleksibelt program, der kan justere, segmentere og gengive Volume EM-data, men kræver betydelig brugerinteraktion12. Som hovedregel vil den tid, det kræver at visualisere resultaterne digitalt, i høj grad overskride tiden for klargøring af prøven og billeddannelse.
Volumen EM teknikker har åbnet den tredje dimension til ultrastrukturel analyse. Andre metoder til opnåelse af 3D EM har begrænsninger i deres volumen (TEM tomografi), eller deres effektivitet (seriel sektion TEM). Selv om mængde EM-teknikker for det meste er for komplicerede og dyre at gennemføre i de enkelte laboratorier, er antallet af fælles kernefaciliteter, der tilbyder dem, vokset, og antallet af stikprøve typer med succes er steget hastigt. For dem med et specifikt spørgsmål og et bestemt væv er det sandsynligt, at nogen vil være i stand til at tilbyde rådgivning og instruktioner om dens forberedelse og billeddannelse. Volumen EM udstyr kan forbedres til at omfatte kapacitet til at håndtere større prøver i SBF-SEM og evnen til fræsning større ROIs med FIB. Software, der er i stand til at segmentere ud strukturer af interesse i en mere automatiseret måde vil langt forenkle processen med at analysere data og forbedringer i computing hastighed vil reducere den nødvendige tid til at gøre det. På trods af de nuværende begrænsninger er Volume EM stadig et nyttigt værktøj, og kombinationen af SBF-SEM og FIB-SEM giver en effektiv arbejdsgang til at identificere sjældne hændelser og afbilde dem ved høj opløsning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Udstyret til volumen EM blev leveret af et gavmildt tilskud fra den flamske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
| Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
| Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
| Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
| Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
| Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
| High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
| Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
| Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
| Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
| Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |
References
- Linberg, K. A., Fisher, S. K. An ultrastructural study of interplexiform cell synapses in the human retina. Journal of Comparative Neurology. 243, 561-576 (1986).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Leighton, S. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – A technical note. Scanning Electron Microscopy. (pt 2), 71-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 11, 329 (2004).
- Heymann, J. A., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR Methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. V7_01_10. , Available from: https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2019).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastructural Pathology. 27 (3), 187-196 (2003).
- Kremer, A., et al. Developing 3D EM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Vanslembrouck, B., Kremer, A., Pavie, B., van Roy, F., Lippens, S., van Hengel, J. Three-dimensional reconstruction of the intercalated disc including the intercellular junctions by applying volume scanning electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cell Biology. 149, 479-490 (2018).
- Russel, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Sommer, C., Strähle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. Eighth IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). Proceedings. , 230-233 (2011).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
