Summary
Her presenterer vi en protokoll for effektivt kombinere seriell blokk ansikt og fokusert ion Beam skanning elektron mikroskopi å målrette et område av interesse. Dette gjør det mulig for effektiv søking, i tre dimensjoner, og finne sjeldne hendelser i et stort synsfelt.
Abstract
Denne protokollen gjør det mulig for effektiv avbildning av celle-eller vevsprøver i tre dimensjoner ved oppløsnings nivået av elektron mikroskopi. For mange år elektron mikroskopi (EM) har forblitt en iboende to-dimensjonal teknikk. Med bruk av seriell skanning elektronmikroskop Imaging teknikker (volum EM), ved hjelp av enten en integrert mikrotomen eller fokusert ion strålen å skive deretter vise innebygd vev, den tredje dimensjonen blir lett tilgjengelig. Seriell blokk ansikt skanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) bruker en ultramicrotome vedlagt i SEM kammeret. Den har evnen til å håndtere store prøver (1 000 μm x 1 000 μm) og bilde store felt av syn på små X, Y pixel størrelse, men er begrenset i Z-dimensjonen av diamant kniven. Fokusert ion strålen SEM (LØGN-SEM) er ikke begrenset i 3D-oppløsning, (isotropic voxels av ≤ 5 NM er oppnåelig), men synsfeltet er mye mer begrenset. Denne protokollen demonstrerer en arbeidsflyt for å kombinere de to teknikkene for å tillate å finne individuelle områder av interesse (ROIs) i et stort felt, og deretter Imaging den påfølgende målrettede volum ved høy isotropic Voxel oppløsning. Forbereder faste celler eller vev er mer krevende for volum EM teknikker på grunn av ekstra kontrasterende nødvendig for effektiv signal generasjon i SEM Imaging. Slike protokoller er tidkrevende og arbeidsintensiv. Denne protokollen inneholder også mikrobølgeovn assistert vev prosessering tilrettelegge inntrengning av reagenser, som reduserer tiden som trengs for behandling protokollen fra dager til timer.
Introduction
Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt for effektiv målretting av høyoppløselige, tredimensjonale elektron mikroskopi (EM) til en bestemt region av interesse (ROI). Siden begynnelsen på 1930-tallet, har EM vært en hovedsakelig to-dimensjonal teknikk. De første publiserte bildene var av hele vev eller celler, men som snart banet vei for seksjoner som ble kuttet for hånd ved hjelp av en ultramicrotome og avbildet ved hjelp av et overførings elektronmikroskop (TEM). TEM produserer svært høyoppløselige micrographs der selv de minste cellulære strukturene er klart merkes. Men tynnhet av delen er nødvendig for vevet å bli avbildet av elektron strålen gjort informasjon i Z dimensjon minimal. Ettersom celler er tredimensjonale strukturer, måtte interaksjoner mellom celle strukturer og celle overflater utledes fra begrensede data. Dette hevet potensialet for feil tolkning, spesielt i strukturer som var komplekse. Noen microscopists klarte å få mer nøyaktige 3D-strukturer ved seriell-skjæring celler og vev og deretter møysommelig rekonstruere dem fra individuelle TEM bilder1. Dette var en svært arbeidskrevende prosess og før advent av digital bildebehandling og datamaskinen rendering resultatene var også vanskelig å visualisere. I de senere årene to teknikker har blitt innført som har blitt kollektivt kjent som Volume Electron mikroskopi (volum EM)2 som har gjort dem i tre dimensjoner tilgjengelig for flere laboratorier.
Ideen om å få en stabel med bilder fra en innebygd blokk inne i et elektronmikroskop kan spores tilbake til 1981 når Steve Leighton og Alan Kuzirian bygde en miniatyr mikrotomen og plasserte den i kammeret til en skanning elektronmikroskop3 (SBF-SEM) . Denne prototypen ble til slutt kopiert og forbedret 23 år senere av Denk og Horstmann4 og deretter kommersialisert. På omtrent samme tid biologiske forskere ble oppmerksom på en annen teknologi som brukes hovedsakelig i materialer vitenskap, fokusert ion strålen. Denne teknikken bruker en ion stråle av noe slag (Gallium, plasma) for å fjerne en svært liten mengde av overflate materiale fra en prøve (LØGN-SEM)5. Begge teknikkene benytter snitting etterfulgt av Imaging gir en rekke bilder som kan kombineres til en X, Y, Z, stack. Begge teknikkene gir 3D-informasjon, men med forskjellige oppløsnings vekter. SBF-SEM er begrenset av de fysiske egenskapene til diamant kniven til skiver ikke tynnere enn 50 NM for lang seriell imaging går; men størrelsen på prøveblokken som kan delt, er stor, opptil 1 mm x 1 mm x 1 mm. på grunn av den store digitale oppkjøpet format av ryggen spredt elektron detektor (32k x 32k piksler) som mottar et signal fra blokken ansiktet kan bilde piksel størrelser være så små som 1 NM. Dette resulterer i ikke-isotropic voxels der X-, Y-dimensjonen ofte er mindre enn Z. På grunn av presisjonen av ion strålen, liten LØGN-SEM har evnen til å samle bilder med isotropic voxels ≤ 5 NM. Imidlertid er det totale arealet som kan avbildet ganske liten. En oppsummering tabell over ulike prøver og volumer avbildet med de to teknikkene har blitt publisert tidligere3.
Vevs forberedelser for volum EM er vanskeligere enn for standard TEM eller SEM fordi prøvene må være farget for å gi tilstrekkelig signal generasjon i SEM. ofte må farging optimaliseres ikke bare for den spesielle vevs typen, men også for å legge til kontrast til visse cellulære strukturer for å gjøre identifisering og gjenoppbygging enklere. Protokollen som brukes her er basert på NCMIR standard6. Ytterligere flekker betyr vanligvis flere protokoll trinn. Således for volum EM, standardprotokoller må utvides for å sikre tilstrekkelig tid for reagenser å trenge prøven. Mikrobølgeovn assistert prosessering kan redusere tiden som trengs for farging fra timer til minutter og gjør volum EM prøve forberedelser mer effektiv7. Denne metoden gjelder for alle celle-og vevstyper8 og til forskning spørsmål der inhomogeneity av vevet gjør prøvetaking av et bestemt område avgjørende9.
Når en data stabel er innhentet den kan justeres og strukturer av interesse segmentert fra resten av data og modellert i 3D. Selv om automatisering av Imaging mange skiver av vev har gjort bildet oppkjøpet relativt grei, er prosessen med digitalt rekonstruere og visualisere dataene en tidkrevende oppgave. Programvare for dette formålet er ennå ikke integrert eller helautomatisk. Siden mye av det tidlige arbeidet med volum EM var rettet mot nevrovitenskap, teknikker for farging og digitalt segmentere strukturer som axons er ganske langt avansert i forhold til andre celler og organeller. Mens litteraturen om andre ikke-neuronal vev vokser raskt, ikke-lineære eller uregelmessige strukturer krever mer manuell input.
Bruke både SBF-SEM og liten LØGN-SEM er en nyttig tilnærming for målretting og Imaging spesifikke, nonhomogeneous, vev strukturer i høy oppløsning i 3D. Kombinere det med mikrobølgeovn assistert vev behandling som vesentlig reduserer tiden som trengs for prøven forberedelse. Sammen denne arbeidsflyten vil gjøre generere høyoppløselig isotropic Voxel bildedata sett av fine strukturer en effektiv og raskere prosess.
Protocol
1. prøve fiksering og behandling for elektron mikroskopi
- Fix frøplanter av Arabidopsis thaliana dyrket på agar plater i 0,5% paraformaldehyde, 2,5% glutaraldehyde i 0,1 M fosfat buffer (Pb) pH 6,8 for 2 t ved romtemperatur (RT).
FORSIKTIG: aldehyder er irriterende og etsende og har kreftfremkallende, mutagent og teratogene potensiale. Alle løsninger må håndteres med egnet verneutstyr og i en avtrekksvifte. - Cut root tips av anlegget vokst i trinn 1,1 og sette 2-3 tips i 0,5 mL rør som inneholder samme bindemiddel over natten ved 4 ° c.
Merk: volumet av dette og eventuelle løsninger i de resterende trinnene bestemmes av prøvevolumet; et minimum forhold av prøve til løsningen er 10:1. Prøver som er større enn 1 mm i en hvilken som helst dimensjon vil være vanskelig å flekken, så å arbeide med større vev blokker er vanskeligere. Ikke alle vev har samme egenskaper; for eksempel kan plante blader og stengler være vanskelig å flekken. Hvis større prøver eller vanskelige vevstyper ønskes, må optimaliseringen av prøve behandlingen utføres før du går videre til datainnsamlingen. - Klargjør thiocarbohydrazide-løsningen (TCH), som trengs frisk og tilgjengelig før trinn 1,7. Tilsett 0,1 g thiocarbohydrazide til 10 mL dobbelt destillert vann (ddH2O) og løs opp ved oppvarming til 60 ° c i ovnen i 1 time. Før bruk filtrerer du TCH-løsningen ved hjelp av et sprøyte filter på 0,22 μm.
- Fjern bindemiddel fra rørene og Bytt ut med 0,1 M PB pH 6,8. Sett rørene på en orbital risting bord på 100 RPM og vask i 10 min. Gjenta vask med fersk PBS 5 ganger.
- Post fikse roten tips ved å erstatte PB med 2% Osmium tetroxide (OsO4) og 0,2% ruthenium rødt i 0,1 M PB pH 6,8. Sett rørene i mikrobølgeovnen med lokkene åpne og start program 9 (tabell 1).
FORSIKTIG: Osmium er ekstremt farlig ved inntak, svært farlig ved innånding, og farlig ved hudkontakt. Håndter alltid med egnet verneutstyr og i en avtrekksvifte.
Merk: gjennom hele protokollen, lokkene på rørene er alltid åpne under mikrobølgeovnen trinnene. - Vask rot tuppene to ganger med ddH2O i 5 minutter hver på stasjonære. For tredje og fjerde ddH2O vask bruk program 15 på mikrobølgeovnen (tabell 1). Etter den første 40 andre ddH2o vask, ta prøver ut av mikrobølgeovnen og erstatte buffer med friske ddH2O. sett prøvene tilbake i mikrobølgeovnen og fortsette programmet.
Merk: mikrobølgeovnen vil varsle deg når bufferen må oppdateres. Pass på at lokket til vakuumkammeret skiftes ut riktig hver gang. - Ruge prøver i tidligere forberedt TCH løsning på RT for 2 min på benken og for videre inkubasjons bruke mikrobølgeovn programmet 8 (tabell 1). Ikke Bytt løsning mellom benk og mikrobølgeovn.
- Vask prøvene som beskrevet i trinn 1,6.
- Sett prøver i 1% OsO4 i ddH2O for mikrobølgeovn program 9 (tabell 1).
- Vask prøvene som beskrevet i trinn 1,6.
- Ruge prøver i 1% uranylnitratet acetate i ddH2O ved hjelp av mikrobølgeovn program 16 (tabell 1).
FORSIKTIG: Uranylnitratet acetate er giftig, et irritasjonsmoment og har kreftfremkallende, mutagent og teratogene potensial. Håndter alltid med egnet verneutstyr. - Vask prøvene som beskrevet i trinn 1,6.
- Forbered Walton ' s bly løsning for bruk i trinn 1,14. Først lage en lagerløsning av L-aspartic acid ved å legge 0,998 g av L-aspartic syre til 250 mL ddH2O og justere pH til 3,8 med 1 M Koh. Deretter oppløses 0,066 g bly nitrat i 10 mL av L-aspartic acid lagerløsning og justere pH til 5,5. La oppløsningen stå i ovnen ved 60 ° c i 30 minutter.
Merk: ingen precipitates skal danne. - Ruge prøver i Walton ' s bly løsning i 30 min i ovnen ved 60 ° c.
- Vask prøvene som beskrevet i trinn 1,6.
- Tørke prøver i EtOH i gradert trinn på 50%, 70%, 90% i ddH2O, og deretter 2x i 100% EtOH. Bruk mikrobølgeovn program 10 (tabell 1) og mikrobølgeovn vil be brukerne hver 40 s for å erstatte løsningen med neste EtOH trinn. Dette er det siste trinnet gjort i mikrobølgeovnen.
- Videre tørke i 100% propylenglykol 2x for 10 min hver på RT på benken, erstatte løsningen mellom trinnene.
Merk: propylenglykol kan oppløse noen plaststoffer slik som polystyrenes; enten bruke glass ampuller for dette trinnet eller pre-test plast for motstand.
FORSIKTIG: propylenglykol er svært brannfarlig. Håndter alltid med egnet verneutstyr og i en avtrekksvifte. - Start infiltrasjon av root tips ved incubating i 50% Spurr ' s harpiks i propylenglykol (min 2 h).
FORSIKTIG: Spurr ' s harpiks komponenter er irriterende. Håndter alltid med egnet verneutstyr og i en avtrekksvifte. - Ombytte løsning med 100% Spurr ' og avreise overnight for RT.
- Bytt til fersk 100% Spurr ' s harpiks 2 ganger (min 2 h incubations).
- Plasser prøvene i en innebygging mold, igjen inneholder friske 100% Spurr ' s harpiks og polymeres i en ovn ved 65 ° c for 36-48 h.
Merk: innebygging mold brukes avhenger av type vev og tilnærmingen brukes for Imaging. Her ble en flat silikon embedding mold brukt (figur 1a).
2. klargjør innebygde prøver for bildebehandling
- Fjern prøvene fra ovnen, Fjern harpiks fra byggeformen (figur 1B).
- Ved hjelp av et barberblad, grovt trimme prøven til en blokk med maksimal 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm (figur 1C).
Merk: for å unngå lading i SBF-SEM, er det viktig å trimme bort så mye Bart harpiks som mulig og gjøre prøven så flat/tynn som mulig. Ideelt sett alle sider av blokken inneholder vev allerede, men viktigst av siden som vil bli festet til metall pinnen (se trinn 2,3) har å inneholde eksponert vev slik at vevet er i direkte kontakt med den ledende metall. - Fjern prøven fra overflødig harpiks og fest den til en metallpinne (figur 1d) med ledende epoxy harpiks, noe som gjør at en del av vevet berører metall pinnen. La epoxy kur over natten i ovnen ved 65 ° c.
Merk: Kontroller at prøven er plassert i midten av pinnen, fordi bevegelsen av scenen i SB-SEM er begrenset. Fjerne svært liten harpiks innkapslet prøve fra ekstra harpiks kan være vanskelig som den lille prøven vil ha en tendens til å fly bort når løsrevet. En enkel og effektiv løsning på dette er å dekke prøven med et ark med parafin film som vist i den supplerende film av referanse1. - Fest stativet i holderen for ultramicrotome. Bruk en barberhøvel blad for å fjerne overflødig epoxy og bruke ultramicrotome og en diamant kniv for å glatte ansiktet og sidene av blokken, danner en pyramide. Sørg for at minst noen av vevet er allerede eksponert på blokk-ansikt.
Merk: ekstra trinn for å bruke en diamant kniv er valgfritt, men det gjør den resulterende blokken lettere å nærme seg i SBF-SEM fordi skyggen av kniven på blokken ansiktet er klarere og dermed gjøre estimering avstanden mellom kniv og blokkere ansiktet lettere å bestemme. - Plasser trimmet prøveblokken i frese elektrostatisk og lag prøven med et tynt lag (2 − 5 NM) av platina (PT).
Merk: platina på blokken-ansiktet vil bli kuttet bort under tilnærmingen i SBF-SEM (se nedenfor), men platina på sidene av pyramiden vil gi ytterligere ledningsevne. I dette eksempelet var prøven belagt med platina, men gull eller gull/Palladium er også effektiv; men belegg med gull resulterte i økt rusk på blokk-ansikt under en tenkelig kjøre.
3. Imaging i SBF-SEM
- Sett transportøren i SBF-SEM mikroskop og bringe kniven nær prøven overflaten. Ved hjelp av diamant kniven trim av den øvre delen av prøven slik at PT laget har allerede blitt fjernet og minst en del av vevet er eksponert.
Merk: siden denne prosessen er forskjellig for hver SBF-SEM mikroskop, ikke alle trinn er spesifisert her. Så lenge prøveoverflaten er fri for PT og klar for bildebehandling, vil de neste trinnene være mulige. - Start bildebehandling med lav oppløsning og kortlevetid for å få en oversikt over prøven og finne en region av interesse (figur 1e).
Merk: her, 512 x 512 piksler og 1 μs dvele tid ble brukt for rask skanning og posisjonering av scenen og 2 000 x 2 000 piksler med 1 μs dvele tid ble brukt for å optimalisere bildebehandling vinduet og justere fokus. - Ved hjelp av en akselererende spenning på 1,5-2,0 kV med en strøm på 80 − 100 pA, ta et bilde av vevet.
Merk: eksempelet som vises her, ble avbildet på et høyt vakuumsystem der stråle strømmen må justeres for å minimere ladingen, noe som er svært prøve avhengig. Vanligvis er elektron bjelken satt til 1.5 − 2,0 kV, men dette vil være utvalg avhengig. Ved høyere forstørrelser (vanligvis > 10, 000x) er harpiks for mye påvirket av strålen for å garantere jevn snitting, så vanligvis er pikselstørrelsen satt til 8 − 20 NM ved en bildestørrelse på 8000 − 10000 x 8000 − 10000 piksler med en tilsvarende forstørrelser på 430 – 1, 400x og feltstørrelser på 64 X 64 mm og 200 x 200 mm. - Bestem en region av interesse og bestemme hvor mange seksjoner er nødvendig for å dekke volumet av interesse og starte Imaging kjøre, ved hjelp av tilbake spredt elektron detektor.
Merk: i eksempelet som presenteres her, ble 500 seksjoner av 80 NM avbildet ved 10 NM piksler og 10 000 x 10 000 piksel bilder (botid 1 μs). Mikroskopet ble satt til 1,6 kV og 100 pA. Generelt er antall seksjoner avhengig av prøve og størrelse på AVKASTNINGEN og kan variere fra 100 s til 1 000 s av påfølgende seksjoner. Det resulterende datasettet består av enkeltbilder av hver inndeling. Disse bildene må konverteres til en 3D-stabel.
4. SBF-SEM databehandling
- Bruk Fiji, Velg fil-import-bildesekvens og Finn bildet stabelen å laste bildene. Avhengig av størrelsen på datasettet, merker du av i boksen Bruk virtuell stabel.
Merk: Hvis datasettet er virkelig stort, først konvertere den til 8 bit (hvis samlet inn på 16 bit) og om nødvendig bin dataene til den har en gjennomførbar størrelse. - Bruk avspillingsknappen nederst i bildet til å bla gjennom datasettet for å se om avbildnings kjøringen var vellykket. Sjekk for typiske tenkelig gjenstander for SBF-SEM, for eksempel seksjoner faller av kniven på blokken-ansikt, lading i områder med Bart harpiks, skjære gjenstander av kniven (horisontale linjer på bildet).
- Ved hjelp av kommandoen image-egenskaper justere pikselstørrelsen og Voxel dybde (dvs. snitt tykkelse) som brukes under kjøringen. Hvis dataene allerede er binned, bør du ta dette i betraktning.
- Ved hjelp av kommandoen plugins-registrering-lineær stabel innretting med sile å registrere data.
Merk: registrering av SBF-SEM data er nødvendig fordi det kan være liten prøve bevegelse under bildebehandling på grunn av lading eller drift av prøven. Ettersom dette er bare en minimal bevegelse i XY, bare oversettelse er nødvendig. - Kontroller justeringen ved å bla gjennom datasettet, og hvis OK bruk lagre-kommandoen på Fil-menyen for å lagre det justerte datasettet som en 3D-TIF-fil.
- Analyser datasettet nøye for å se om AVKASTNINGEN er inkludert og inneholder informasjonen som er nødvendig for det biologiske spørsmålet. På det siste bildet av stabelen (= den nåværende blokk-ansikt), velger du en ny avkastning for LØGN-SEM Imaging.
Merk: Hvis det ikke er god region for LØGN-SEM Imaging stede på den nåværende blokk-ansikt, kan flere seksjoner kuttes fra blokken (som fortsatt er i SBF-SEM) til en avkastning vises. Det er en grense for volumet som kan bli avbildet med liten LØGN. AVKASTNINGEN på SBF-SEM-bildet kan være maksimum i X, Y av 30-40 μm X 15-20 μm.
5. Imaging i liten LØGN-SEM
- Ta oversikt bilder av prøven i SBF-SEM, ideelt inkludert en eller flere kanter av prøven som er så gjenkjennelig i liten LØGN-SEM (figur 2a, C).
Merk: i dette eksempelet SBF-SEM oversikt bildene ble tatt på 10 NM pixel størrelse, 8 000 x 8 000 piksler ved 1 μs dvele tid. Mikroskopet ble fortsatt satt til 1,6 kV og 100 pA. - Fjern prøven fra SBF-SEM og plasser i frese elektrostatisk. Coat prøven med ≥ 20 NM platina for liten LØGN-SEM Imaging.
- Last prøven inn i LØGN-SEM og bruke sekundære elektron detektor på 15 kV, 1 nA finne AVKASTNINGEN identifisert i SBF-SEM på blokken-ansikt (figur 2b, D).
Merk: Imaging på 15 kV er nødvendig å se gjennom platina belegg. - Bring AVKASTNINGEN på prøven inn i sammentreff poenget med liten LØGN og SEM bjelker, ved å flytte og vippe scenen (figur 3a).
Merk: liten LØGN-kolonnen er vanligvis montert under en vinkel (figur 3a). Dette betyr at enhver prøve må vippes på en slik måte at overflaten skal avbildet og delt er plassert parallelt med liten LØGN bjelke. Overflaten skal avbildet er nå skråstilt med hensyn til SEM strålen og en grøft av vev må fjernes før SEM er i stand til bildet AVKASTNINGEN (Figur 3E) - Ved hjelp av LØGN strålen og gass injeksjonssystemet, sette inn et 1 mm beskyttende lag med platina på overflaten over AVKASTNINGEN (figur 3c). Deretter bruker en lav fresing strøm (50-100 pA), Mill fine linjer i platina avsetning for autofokus og 3D-sporing under Imaging Run (figur 3D). Bruke liten LØGN kolonne og karbon gass injeksjons, dekke disse linjene med karbon deponering.
Merk: størrelsen på AVKASTNINGEN her tilsvarer størrelsen på AVKASTNINGEN på SBF-SEM bilde og maksimal størrelse kan dermed være 30-40 μm x 15-20 μm. I dette eksempelet ble det avbildet en ROI på 17 μm x 8 μm. Carbon deponering er nødvendig for beskyttelse av linjene og for å skape en svart-hvit kontrast mellom karbon og platina som er ideell for Auto-fokusering. Malings strømmene som brukes for hvert trinn, finner du i tabell 2. - Ved hjelp av en høy fresing strøm, Mill en grøft på 30 μm foran AVKASTNINGEN, skaper Imaging overflaten for SEM strålen (figur 3e).
Merk: liten LØGN strålen er iboende ødeleggende, enda mer ved høye strømninger. Sørg for å holde Imaging ved høy strøm til et minimum og bilde ved lav forstørrelse og rask skanning hastigheter for å unngå smelting av harpiks på AVKASTNINGEN. - Glatt ut bilde flaten med en fresing strøm nærmere den strømmen som brukes under Imaging Run. Stopp polering når alle autofokus og 3D Tracking merker er godt synlig på bilde flaten (figur 3F). Fremdriften av liten LØGN kan etterfølges av Imaging overflaten med EM (ved hjelp av en tilbake spredt elektron detektor) mens polering.
- Bestem området som skal vises på den nyopprettede overflaten, og angi bilde parametrene. Sørg for at elektron bjelken er fokusert på overflaten, sett lysstyrke og kontrast og angi pikselstørrelse og snitt tykkelse. Hold Imaging tid under 1 minutt ved å justere botid og linje gjennomsnittet.
Merk: det er viktig å bruke en lav spenning for bildebehandling med elektron bjelken for å sikre at bare overflaten av blokken er avbildet (dvs. at ingen elektroner fra dypere inn i prøven er avbildet). Dette gjøres ved å holde spenningen under 2 kV og ved hjelp av en tilbake spredt elektron detektor med et nettspenning, slik at bare høy energi elektroner å bli avbildet. I dette eksempelet ble elektron bjelken satt til 1,5 kV og 1 nA med en nettspenning på 1,2 kV på baksiden av den spredte elektron detektoren. Også her, en piksel-størrelse på 5 NM ble brukt med 5NM seksjoner å resultere i et datasett med isotropic voxels. Et område på 17 μm x 10 μm ble avbildet på 6,5 μs bor tid og en linje gjennomsnitt på 1,0. - Angi Vinduer for auto-tuning og 3D-sporing, med samme pikselstørrelse, dvele tid og linje gjennomsnittet som brukes for Imaging.
Merk: denne prosessen vil variere for ulike systemer, derfor bare trinnet er nevnt uten å angi de ulike handlingene. - Start bildebehandlingen og Overvåk stabiliteten til prosessen i løpet av de første 50 − 100 seksjonene. Når systemet kjører problemfritt, forlate rommet og sørge for at det er så lite forstyrrelse til rommet som mulig.
Merk: varigheten av kjøringen og antall seksjoner vil avhenge av størrelsen på AVKASTNINGEN og snitt tykkelsen. I LØGN-SEM Z-aksen er faktisk høyden på AVKASTNINGEN boksen på SBF-SEM-bilde (maks 15 − 20 μm; Figur 3e). - Registrer LØGN-SEM data på samme måte som beskrevet ovenfor for SBF-SEM data.
Representative Results
Bilder fra SBF-SEM gir en oversikt over vevet, noe som gir innsikt i den romlige orienteringen av celler og intercellulære tilkoblinger (figur 4a). Den påfølgende LØGN-SEM Imaging på en ny region, som vanligvis er en region av interesse bestemmes etter inspeksjon av SBF-SEM kjøre, legger høy oppløsning detalj av bestemte celler og/eller strukturer (figur 4b).
Figur 4c , D viser forskjellen i gjengivelsen av de ikke-isotropic VOXELS av SBF-SEM data (figur 4c) og isotropic VOXEL liten løgn-SEM data (figur 4d). Z tykkelse brukes i SBF-SEM betyr at gjengivelsen tydelig viser seksjoner, noe som resulterer i en "trapp" effekt på overflaten. I liten LØGN-SEM data de 5 NM seksjoner sikre at gjengivelsen vises mye jevnere og individuelle seksjoner blandes inn i overflaten helt.
Figur 1: opprettelse av blokken ansiktet fra en harpiks innebygd prøve. (A) en root-tip innebygd i harpiks. (B) ved hjelp av en Razor blad overflødig harpiks er trimmet bort til en blokk med 0,5 mm2 gjenstår. (C, D) Den trimmet blokken er limt på et metall PIN og etter en natt i ovnen, sidene av blokken er trimmet og overflaten glattes med en diamant kniv ved hjelp av en ultramicrotome. (E) inne i SBF-SEM, er prøven orientert slik at BLOCKFACE og avkastningen kan bli gjenkjent, skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: korrelasjon mellom SBF-SEM og liten løgn-SEM. Oversikt bilder av blokken-ansikt ved hjelp av SBF-SEM (A) og liten LØGN-SEM (B), Scale bar = 5 μm. (C, D) Zoom på avkastningen. Rød boks delineates regionen for å bli avbildet med liten LØGN-SEM, skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: løgn-SEM ordningen og forberedelser trinn. (A) skjema viser retningen på liten løgn STRÅLEN, SEM strålen og sample. Prøven må plasseres til sammentreff poenget med liten LØGN og SEM bjelker for å kunne mill og bilde på samme område. (B) skjematisk tegning av grøften som trengs for SEM Imaging av delene fjernet av liten løgn. (C) bilde tatt med liten løgn Beam som viser Platinum AVSETNING på avkastningen, skala bar 5 μm. (D) bilde tatt med løgn bjelken viser linjene som brukes for autofokus og 3D-sporing. Linjene i midten brukes til autofokus og de utvendige linjene gir 3D-sporing. Carbon deponering på toppen av linjene gir den nødvendige kontrasten (platina vs karbon) for å utføre disse oppgavene, scalebar 5 μm. (E) bilde tatt med liten løgn bjelke etter fresing av grøften, scalebar 5 μm. (F) bilde tatt med SEM strålen som viser regionen av interesse avbildet under liten LØGN-SEM kjøre, skala bar 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: SBF-SEM og liten løgn-SEM resultater før og etter segmentering. (A) 3D-visning av SBF-SEM datasett (100 x 100 x 40 μm, skala bar = 10 μm), (B) 3D visning av løgn-SEM datasett (17 x 10 x 5,4 μm, skala bar = 2 μm), (C) GJENGITT vakuoler segmentert fra SBF-SEM dataene ved terskelverdi, skala bar = 2 μm D. gjengitt granulater seg Knopf fra liten LØGN-SEM data ved terskelverdi, skala bar = 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protokoll for bearbeiding av mikrobølger | |||||||||
| Programmet # | Beskrivelse | Bruker ledetekst (på/av) | Klokkeslett (HR: min: sek) | Strøm (watt) | Temp (° c) | Belastnings kjøler (av/Auto/på) | Vakuum/bubbler Pump (av/boblene/VAC syklus/VAC på/VAP) | Jevn temp | |
| Pumpe (på/av) | Temp (° c) | ||||||||
| 8 | Tch | Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 |
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| 9 | OSMIUM | Av | 0:02:00 | 100 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 |
| Av | 0:02:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:02:00 | 100 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:02:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:02:00 | 100 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| 10 | 50% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 |
| 70% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 90% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 100% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 100% EtOH | På | 0:00:40 | 150 | 50 | Av | Av | På | 30 | |
| 15 | 0.1 M CACODYLATE | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 |
| 0.1 M CACODYLATE | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | |
| 15 | ddH2O | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 |
| ddH2O | På | 0:00:40 | 250 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | |
| 16 | Uranylnitratet acetate | Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 |
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 0 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
| Av | 0:01:00 | 150 | 50 | Av | VAKUUM SYKLUS | På | 30 | ||
Tabell 1. Detaljert protokoll for behandling av mikrobølgeovn.
| Trinn | Gjeldende | Anslått tid |
| Deponering Platinum | 3N | 10-15 minutter |
| Fresing av Autotune og sporings merker | 50-100 pA | 4-6 minutter |
| Deponering Carbon | 3 den andre | 5-10 minutter |
| Fresing grov grøft | 15-30-NS på | 30-50 minutter |
| Polering overflate | 1.5-3 nA | 15-20 minutter |
| Imaging Kjør | 700 pA-1,5 nA | Timer-dager |
Tabell 2. Liten LØGN fresing strømmer som brukes for prøven forberedelse og Imaging Run
Discussion
Volume Electron mikroskopi er mer utfordrende og tidkrevende enn konvensjonelle SEM eller TEM. På grunn av behovet for å flekk vev eller celler en blokk, må behandlingstrinnene være lange nok til å sikre inntrengning av reagenser gjennom hele prøven. Ved hjelp av mikrobølgeovn energi for å lette penetrasjon gir kortere, mer effektiv prosessering og forbedrer farging. Fordi forberedelsene til EM er mye strengere enn for lys mikroskopi, må alle oppløsninger og reagenser være kvalitets kontrollerte. Endringer i pH, tonisitet, bruk av urene reagenser, og innføring av forurensninger på grunn av dårlig teknikk kan alle ha skadelige effekter på det endelige bildet.
Volume EM krever også individuelt tilpassede protokoller for hver forskjellige utvalgstype. Pattedyr vev av forskjellige typer: planter, enkeltceller som gjær, trypanosomes, C. elegans, etc., alle trenger sine egne variasjoner for å oppnå optimale resultater. Fiksering og farging må utformes for å bevare strukturell integritet og holde prøven så nær sin in vivo morfologi som mulig. Fiksering av vev ved fysiologisk temperatur, pH og tonisitet er avgjørende for å gjøre prøven som livet-lignende som det kan være. Høytrykks frysing (HPF) av prøvene kan bidra til å bevare en mer liv-lignende situasjon, (eller kanskje bare gi forskjellige gjenstander), men for andre enn celler og svært tynt vev HPF vil mislykkes som glasslegemet isen kan bare genereres i små volumer. Derfor for mange spørsmål kjemisk fiksering er det eneste alternativet. Uansett om fiksering er HPF eller kjemisk, i alle EM eksperimentere de strukturelle resultatene må nøye sammenlignet med lignende resultater fra levende celle eller vev Imaging å se om de er konsekvente. Farging må også optimaliseres mens vurderer konkrete spørsmål som må besvares og protokollen som skal brukes til visualisering av digitale bilder.
Å ha både en SBF-SEM og liten LØGN system i umiddelbar nærhet er en stor fordel i mange eksperimenter. Det store synsfelt og høy X, Y oppløsning av SBF-SEM gjør finne individuelle strukturer/celler/hendelser grei og gir en samlet romlig orientering av celler i vev. I tillegg er dens evne til å tillate Imaging gjennom en prøve i Z svært kraftig; Imidlertid, rekonstruksjoner det forlange fin geometrisk detaljen kanne Fail eller tilvirke artefakter benytter denne teknikk på grunn av det ingen-isotropic voxels den utvikler. Den liten LØGN er begrenset av fysikken i prosessen til en mindre tenkelig felt, men dens 3D-oppløsning er tilstrekkelig for svært nøyaktig rekonstruksjoner. Kombinere de to teknikkene er grei som prøver kan flytte fra SBF-SEM til LØGN uten videre bearbeiding eller forberedelser. Vi erkjenner at bruk av SBF-SEM for å søke gjennom en prøve for å finne et bestemt område er en svært kostbar bruk av en mye mer kapabel verktøy. Men muligheten til å umiddelbart se den nye blockface og avgjøre om AVKASTNINGEN er nådd er en stor fordel. I tillegg alternativene for å bruke seriell semi-tynne (0,5 μm) LM seksjoner kan fjerne små strukturer før de oppdages, og inspisere en blokk med enkelt TEM seksjoner som må kuttes, sette på et rutenett og deretter sett i en like dyre TEM er ikke så effektiv som den metoden som presenteres.
Fordi det finnes mange programmer for å segmentere og gjengi dataene, og behovene til en gitt struktur er kanskje ikke best tjent med et enkelt program, kan ingen standardarbeidsflyt foreslås. Noen enkle strukturer kan være segmentert med en terskelverdi algoritme hvis de faller innenfor svært smale gråskala verdier. Neuronal strukturer kan semi-automatisk segmentert ved hjelp av et program som Ilastik11 , men det vil være mindre nyttig på mer tilfeldig eller komplisert formet ORGANELLER som eh. Mikroskopi image Browser er et svært fleksibelt program som kan justere, segmentere og gjengi volum EM data, men krever betydelig brukermedvirkning12. Som en generell regel hvor mye tid som trengs for å digitalt visualisere resultatene vil i stor grad overstige tiden for å forberede prøven og Imaging.
Volume EM teknikker har åpnet opp den tredje dimensjonen til ultrastructural analyse. Andre metoder for å få 3D EM har begrensninger i sitt volum (TEM tomografi), eller deres effektivitet (seriell del TEM). Selv for det meste volum EM teknikker er for komplisert og kostbart å bli implementert i individuelle laboratorier, antall delte kjernen fasiliteter som tilbyr dem har vokst og antall prøvetyper vellykket avbildet har økt raskt. For de med et bestemt spørsmål og et bestemt vev er det sannsynlig at noen vil være i stand til å gi råd og instruksjoner om sin forberedelse og bildebehandling. Volume EM utstyr kan forbedres til å omfatte kapasitet til å håndtere større prøver i SBF-SEM og evnen til fresing større ROIs med liten LØGN. Programvare som er i stand til å segmentere ut strukturer av interesse i en mer automatisert måte vil vesentlig forenkle prosessen med å analysere data og forbedringer i databehandling hastighet vil redusere tiden det tar å gjøre det. Til tross for sin nåværende begrensninger, er volum EM fortsatt et nyttig verktøy og kombinere SBF-SEM og liten LØGN-SEM gir en effektiv arbeidsflyt for å identifisere sjeldne hendelser og Imaging dem i høy oppløsning.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Utstyret for volum EM ble gitt av en generøs bevilgning fra regjeringen i Flandern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
| Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
| Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
| Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
| Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
| Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
| High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
| Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
| Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
| Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
| Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |
References
- Linberg, K. A., Fisher, S. K. An ultrastructural study of interplexiform cell synapses in the human retina. Journal of Comparative Neurology. 243, 561-576 (1986).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Leighton, S. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – A technical note. Scanning Electron Microscopy. (pt 2), 71-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 11, 329 (2004).
- Heymann, J. A., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR Methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. V7_01_10. , Available from: https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2019).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastructural Pathology. 27 (3), 187-196 (2003).
- Kremer, A., et al. Developing 3D EM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Vanslembrouck, B., Kremer, A., Pavie, B., van Roy, F., Lippens, S., van Hengel, J. Three-dimensional reconstruction of the intercalated disc including the intercellular junctions by applying volume scanning electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cell Biology. 149, 479-490 (2018).
- Russel, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Sommer, C., Strähle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. Eighth IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). Proceedings. , 230-233 (2011).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
