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Medicine

इन विट्रो रेडियोबायोलॉजी प्रयोगों के संचालन के लिए एक रैखिक त्वरक का उपयोग

Published: May 26, 2019 doi: 10.3791/59514
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Department of Cancer Biology, Cleveland Clinic, 2Department of Radiation Oncology, Cleveland Clinic

Summary

नैदानिक रैखिक त्वरक कैंसर कोशिकाओं पर खुराक दरों की एक विस्तृत श्रृंखला के जीवविज्ञान प्रभाव निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम चर्चा कैसे सेल के लिए एक रैखिक त्वरक स्थापित करने के लिए आधारित assays और कैंसर स्टेम की तरह कोशिकाओं के लिए assays निलंबन और सेल लाइनों में ट्यूमर के रूप में हो अनुयायी संस्कृतियों के रूप में बड़े हो.

Abstract

विकिरण चिकित्सा कैंसर प्रबंधन की आधारशिलाओं में से एक बनी हुई है। अधिकांश कैंसर के लिए, यह ट्यूमर debulk करने के लिए सबसे प्रभावी, nonsurgical चिकित्सा है. यहाँ, हम एक रैखिक त्वरक के साथ कैंसर कोशिकाओं विकिरण करने के लिए एक विधि का वर्णन. रैखिक त्वरक प्रौद्योगिकी की प्रगति सटीक और विकिरण चिकित्सा की दक्षता में सुधार हुआ है. विकिरण खुराक और खुराक दरों की एक विस्तृत श्रृंखला के जैविक प्रभाव जांच के एक गहन क्षेत्र होना जारी है. रैखिक त्वरक का उपयोग नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक और खुराक दरों का उपयोग कर इन अध्ययनों की सुविधा कर सकते हैं.

Introduction

रेडियोथेरेपी कई प्रकार के कैंसर1 ,2,3,4के लिए एक प्रभावी उपचार है . अतिरिक्त उच्च खुराक दर विकिरण विकिरण चिकित्सा में अपेक्षाकृत नया है और रैखिक त्वरक5में हाल ही में तकनीकी प्रगति से संभव बनाया है. मानक खुराक दर विकिरण पर अतिरिक्त उच्च खुराक दर के नैदानिक लाभ छोटा उपचार समय और बेहतर रोगी अनुभव शामिल हैं। रैखिक त्वरक भी सेल संस्कृति आधारित विकिरण जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक नैदानिक सेटिंग प्रदान करते हैं. विकिरण खुराक और खुराक दरों के जैविक और चिकित्सीय प्रभाव दशकों 6,7,8के लिए विकिरण कैंसर विशेषज्ञों और जीवविज्ञानियों के हित पर ध्यान केंद्रित किया गया है . लेकिन, अतिरिक्त उच्च खुराक दर विकिरण और फ्लैश विकिरण के रेडियोबायोलॉजी - विकिरण की एक अत्यंत उच्च खुराक दर - अभी तक अच्छी तरह से जांच की जानी है।

गामा किरण विकिरण का प्रयोग कोशिका संस्कृति आधारित विकिरण जीव विज्ञान9,10,11में व्यापक रूप से किया जाता है . विकिरण क्षय रेडियोधर्मी आइसोटोप स्रोतों से उत्सर्जित गामा-किरणों द्वारा हासिल की है, आम तौर पर Cesium-137. रेडियोधर्मी स्रोतों का उपयोग अत्यधिक विनियमित और अक्सर प्रतिबंधित है. स्रोत आधारित विकिरण के साथ, यह खुराक दरों की एक विस्तृत श्रृंखला का परीक्षण करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, नैदानिक प्राप्त खुराक दरों के जीवविज्ञान प्रभाव के विश्लेषण में अपनी उपयोगिता सीमित12.

ऐसे अनेक अध्ययन हुए हैं जो खुराक और खुराक दर दोनों के प्रभाव12,13,14,15,16,17को दर्शाते हैं . इन अध्ययनों में, रेडियोधर्मी आइसोटोप या रैखिक त्वरक से उत्पन्न एक्स-रे से उत्पन्न गामा विकिरण दोनों का उपयोग किया गया। फेफड़ों के कैंसर, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर, ग्लियोब्लास्टोमा, और मेलेनोमा का प्रतिनिधित्व करने वाली सेल लाइनों की एक किस्म का उपयोग किया गया। सेल अस्तित्व पर विकिरण प्रभाव, सेल चक्र गिरफ्तारी, apoptosis और डीएनए क्षति readouts12,13,14,15,16,17 के रूप में मूल्यांकन किया गया . यहाँ, हम एक रैखिक त्वरक का उपयोग कर एक्स-रे आधारित विकिरण देने के द्वारा नैदानिक रूप से प्रासंगिक विकिरण खुराक और खुराक दरों के जैविक प्रभाव को परिभाषित करने के लिए एक विधि का वर्णन. इन अध्ययनों जीवविज्ञानी, विकिरण oncologist और चिकित्सा भौतिक विज्ञानी के बीच निकट सहयोग के साथ किया जाना चाहिए.

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Protocol

1. निलंबन सेल संस्कृति के लिए सेल की तैयारी

  1. स्टेम सेल संस्कृति मीडिया में संस्कृति ग्लिओमा स्टेम की तरह कोशिकाओं को लगभग 5 x 106 सेल /10 सेमी प्लेटमें एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% सापेक्ष आर्द्रता के साथ।
    नोट: सेल संस्कृति स्थिति सभी प्रक्रियाओं में एक ही है. प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मीडिया पूर्ण मीडिया है.
  2. अनुसूचित विकिरण से दो दिन पहले, एक संस्कृति हुड में एक 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक बाँझ 5 एमएल पिपेट के साथ संस्कृति प्लेट से ग्लिओमा स्टेम की तरह कोशिकाओं को इकट्ठा।
  3. एकत्र कोशिकाओं को एक काउंटरटॉप अपकेंद्रण में 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. supernatant छोड़ें और सेल गोली पचाने (के बारे में 1 x 107 कोशिकाओं) trypsin-EDTA में एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर trypsin-EDTA के 1 एमएल के साथ. पाचन के दौरान हर 2 मिनट में अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे धीरे से हिलाने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से पचा रहे हैं.
  5. स्टेम सेल संस्कृति मीडिया के 3 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) trypsin बुझाने के लिए. एक काउंटर शीर्ष अपकेंद्रित्र में 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर एकत्र कोशिकाओं सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को छोड़ दें और सेल गोली को बचाएं।
  6. सेल संस्कृति मीडिया के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित और एक हीमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गिनती.
  7. प्लेट 5 x 106 कोशिकाओं सेल संस्कृति मीडिया के 10 एमएल युक्त दो 10 सेमी प्लेटों में 6 कोशिकाओं.
  8. अनुसूचित विकिरण से ठीक पहले, कोशिकाओं को इकट्ठा करने और चरण 1.3 में वर्णित के रूप में centrifugation के बाद supernatant त्यागदें। सेल संस्कृति मीडिया के 5 एमएल के साथ सेल गोली फिर से निलंबित. सेल कल्चर मीडिया के 2 एमएल युक्त 35 मिमी प्लेट में सेल निलंबन के 1 एमएल को स्थानांतरित करें।
    नोट: मीडिया की कुल मात्रा 35 मिमी प्लेट में 3 एमएल प्लेट में ऊंचाई में तरल 1 सेमी बनाने के लिए है।
  9. एक माध्यमिक कंटेनर में चढ़ाया कोशिकाओं स्थानांतरण, इस तरह के एक प्लास्टिक या फोम बॉक्स के रूप में, संदूषण के जोखिम को कम करने और उपयोगिता गाड़ी पर विकिरण सुविधा के लिए कंटेनर में कोशिकाओं को लाने के लिए।
  10. चरण 4 में वर्णित कोशिकाओं को विकिरणित करें.

2. संलग्न सेल संस्कृति के लिए सेल की तैयारी

  1. विकिरण से एक दिन पहले, सेल संस्कृति हुड में, ऐसे HEK-293 कोशिकाओं के रूप में संलग्न सेल लाइन की सेल संस्कृति थाली से DMEM मीडिया को हटा दें. मीडिया एक वैक्यूम करने के लिए जुड़ा एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर चूषण किया जा सकता है।
  2. अवशिष्ट मीडिया कुल्ला करने के लिए संस्कृति पकवान करने के लिए बाँझ पीबीएस के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो।
  3. संस्कृति पकवान में trypsin-EDTA के Pipette 1 एमएल और धीरे संस्कृति प्लेट झुकाव सुनिश्चित करें कि पूरे पकवान trypsin-EDTA के साथ कवर किया जाता है.
  4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं की कोशिश ें, DMEM मीडिया के 3 एमएल के साथ trypsin-EDTA प्रतिक्रिया को निचोड़ें और संस्कृति हुड में 15 एमएल पिपट के साथ 5 एमएल पिपेट के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  5. एक काउंटर शीर्ष अपकेंद्रित्र में 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर एकत्र कोशिकाओं सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को छोड़ दें और सेल गोली को बचाएं।
  6. DMEM मीडिया के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित और एक हीमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गिनती.
  7. प्लेट 2 x 105 कोशिकाओं को एक 35 मिमी प्लेट में सेल संस्कृति मीडिया के 3 एमएल का उपयोग कर मीडिया के 1 सेमी की ऊंचाई पर.
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सेल संस्कृति के 24 एच के बाद, एक माध्यमिक कंटेनर में चढ़ाया कोशिकाओं हस्तांतरण (यानी, एक अछूता फोम बॉक्स) एक उपयोगिता गाड़ी पर विकिरण सुविधा के लिए।
  9. चरण 4 में वर्णित के रूप में विकिरण कोशिकाओं.

3. विकिरण के बाद इम्यूनोस्टेनिंग के लिए सेल तैयारी

  1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर वाणिज्यिक extracellular प्रोटीन मैट्रिक्स Thaw. प्री-चिल 200 जेडएल पिपेट टिप्स और 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब्स रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. अलीकोट एक्स्ट्रासेल्यूलर प्रोटीन मैट्रिक्स के साथ पूर्व-चिल्ड पिपेट टिप्स और 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब ों 200 डिग्री एल प्रति ट्यूब पर।
  3. सेल कल्चर मीडिया के पूर्व-चिल्ड 20 एमएल में 200 डिग्री सेल्सियस अतिरिक्त प्रोटीन मैट्रिक्स को 1% अतिरिक्त कोशिकीय प्रोटीन मैट्रिक्स मीडिया बनाने के लिए।
  4. एक 35 मिमी प्लेट में एक बाँझ कवरस्लिप (22 मिमी x 22 मिमी) रखें। कवरस्लिप पर 1% एक्स्ट्रासेल्यूलर प्रोटीन मैट्रिक्स मीडिया के 400 $L रखें।
  5. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 35 मिमी प्लेट को 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि अतिरिक्त कोशिकीय प्रोटीन मैट्रिक्स को कवरस्लिप पर बहुलक बनाने की अनुमति मिल सके।
  6. निलंबन सेल संस्कृति का उपयोग करते समय, चरण 1.1 से 1.5 में वर्णित के रूप में एक एकल सेल निलंबन करें।
  7. प्लेट 5 x 104 कोशिकाओं एक extracellular प्रोटीन मैट्रिक्स लेपित कवरस्लिप पर एक 35 मिमी प्लेट में रखा. कोशिकाओं प्रोटीन मैट्रिक्स द्वारा समर्थित हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए रात भर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए चढ़ाया कोशिकाओं को वापस. थाली में मीडिया की कुल मात्रा 3 एमएल होना चाहिए ताकि संस्कृति डिश में मीडिया की ऊंचाई 1 सेमी तक पहुंच सके।
  8. 10x आवर्धन उद्देश्य लेंस के साथ एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। कोशिकाओं को फ्लोटिंग के बजाय कवरस्लिप पर फैल जाना चाहिए। एक उपयोगिता गाड़ी पर विकिरण सुविधा के लिए एक फोम बॉक्स के रूप में एक माध्यमिक कंटेनर में चढ़ाया कोशिकाओं के साथ संस्कृति पकवान स्थानांतरण और चरण 4 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं विकिरण।
  9. अनुलग्न कक्ष संस्कृतियों (उदाहरण के लिए, HEK-293 कक्षों) का उपयोग करते समय, चरण 2.1 से 2.6 में वर्णित कक्षों को पचाएँ. किरण विकिरण से एक दिन पहले एक 35 मिमी प्लेट में एक बाँझ कवर स्लिप पर 5 x 104 कोशिकाओं को रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं चरण 3.9 के रूप में माइक्रोस्कोप के नीचे उन्हें देख कर पूरी तरह से कवरस्लिप सतह से जुड़ी हुई हैं। प्लेट में तरल 1 सेमी ऊंचाई बनाने के लिए DMEM मीडिया के 3 एमएल का उपयोग करें।
  10. रात भर या एक दिन तक coverslips पर कोशिकाओं को बढ़ने के बाद, विकिरण सुविधा के लिए एक माध्यमिक कंटेनर में चढ़ाया कोशिकाओं के साथ संस्कृति पकवान हस्तांतरण. एक उपयोगिता गाड़ी spillage के जोखिम को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चरण 4 में वर्णित के रूप में विकिरण कोशिकाओं.

4. एक रैखिक त्वरक के साथ विकिरण (LINAC)

  1. LINAC के कंसोल सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, त्वरक गैन्ट्री और कोलिमेटर 0 डिग्री के लिए सेट करें, एक्स और वाई जबड़े को सममित 20 x 20 सेमी2 क्षेत्र आकार के लिए खोलें और यदि मौजूद हो तो बहु-लीफ कोलिमरेटर्स (एमएलसी) को वापस लें।
    नोट: LINACs बहुत उच्च खुराक दरों की अनुमति, एक सपाट फिल्टर मुक्त (FFF) मोड हो सकता है. जैसा कि नाम से पता चलता है, इस विकिरण वर्दी (फ्लैट) नहीं है, और उच्च खुराक दर केवल बीम के केंद्र में हासिल की है. इस स्थिति में 7 x 7 cm2 फ़ील्ड का उपयोग किया जाता है।
  2. उपचार सोफे पर कम से कम 5 सेमी पानी के बराबर सामग्री रखें। सेल डिश को पानी के बराबर सामग्री पर 400 MU/min (मानक खुराक दर) पर विकिरणित होने के लिए रखें और इसे LINAC crosshairs पर केंद्रित करें।
  3. कोशिकाओं को 6 एमवी एक्स-रे बीम में अधिकतम खुराक की गहराई पर विकिरणित होने के लिए रखें, लगभग 1.5 सेमी. डिश के शीर्ष पर एक अतिरिक्त 1 सेमी पानी के बराबर सामग्री रखें। माध्यम के 1 सेमी के साथ संयुक्त, जिसमें कोशिकाओं को निलंबित कर दिया जाता है, यह कोशिकाओं को 1.5 सेमी की औसत गहराई पर रखता है।
  4. LINAC के सिर के सामने सूचक को ठीक करें। सामने सूचक बढ़ाएँ जब तक यह buildup सामग्री की सतह संपर्क और दूरी ध्यान दें. जब तक स्रोत से buildup सतह की दूरी 100 बउ है तालिका ऊँचाई समायोजित करें।
    नोट: दूरी ऑप्टिकल दूरी सूचक के साथ पुष्टि की जा सकती है. वैकल्पिक रूप से, ऑप्टिकल दूरी सूचक 100 सेमी करने के लिए buildup सतह के लिए स्रोत सेट करने के लिए सामने सूचक के बदले में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. कोशिकाओं को विकिरण की वांछित खुराक देने के लिए मॉनीटर इकाइयों (म्यू) की उचित संख्या की गणना करें और 400 मिलियन मिलियन पर वितरित करने के लिए त्वरक प्रोग्राम करें।
    नोट: सतह दूरी के लिए स्रोत के लिए (SSD) सेटअप एक LINAC पर अधिकतम खुराक की गहराई पर 1 cGy/MU वितरित करने के लिए calibrated, मॉनिटर इकाइयों की आवश्यक संख्या MU का उपयोग कर गणना की है - Dose (cGy) / (1 cGy/MU) / OF(OF(20x20), जहां के उत्पादन कारक के लिए खड़ा है. इस परिकलन वैकल्पिक अंशांकन setups का उपयोग LINACs के लिए परिवर्तित किया जा करने के लिए होगा।
  6. उपचार तिजोरी छोड़ दो और सत्यापित करें कि अन्य सभी व्यक्तियों से बाहर निकल गए हैं. Vrify कि कमरे में कोई अन्य कोशिकाओं रहे हैं, या वे विकिरण की कम खुराक प्राप्त होगा. तिजोरी का दरवाजा बंद करें।
  7. कंसोल पर फ़ील्ड आकार, MU और MU/min की पुष्टि करें और फिर बीम को सक्षम करें।
  8. कोशिकाओं को उच्च या निम्न मात्रा दरों पर विकिरणित करने के लिए चरण 4-3-4.8 दोहराएँ.
    1. त्वरक के साथ उच्च खुराक दरों (जैसे, 2100 MU/min या अधिक) को प्राप्त करने के लिए, उलटा वर्ग कानून के अनुसार कोशिकाओं के लिए प्रभावी खुराक दर बढ़ाने के लिए एसएसडी में कमी: DoseRateEffective ] Doserate * (100 सेमी / एसएसडी] नई)2.
    2. कम खुराक दरों के लिए (उदाहरण के लिए, 20 MU/min), खुराक दर को कम करने के लिए सतह दूरी के लिए स्रोत में वृद्धि (SSD]New.) उदाहरण के लिए, सेल संस्कृति पकवान उपचार कक्ष के फर्श पर रखा जा सकता है.
    3. यदि यह सेटअप आवश्यक है तो एक्सीलेटर पर मॉनिटर यूनिट सेटिंग की पुनः गणना करें, म्यू का उपयोग करते हुए - Dose(cGy) /(1 cGy/MU) / OF(20x20) / (100 cm / SSD]New) 2. एमयू गणना के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए, McDermott और Orton18द्वारा संदर्भ देखें.
  9. DoseRate (Gy/Min) द्वारा Gy/मिनट में खुराक दर निर्धारित करें ] Dose(Gy)*(MU/min)/MU. उदा., 4 Gy 400 MU/min पर दिया 380 MU की आवश्यकता है, तो 4 * 400/380 - 4.2 Gy/ तालिका 1देखें.

Figure 1
चित्र 1 : रैखिक त्वरक पर सेल संस्कृति पकवान का सेट अप. (ए) एक नैदानिक रैखिक त्वरक दिखाया गया है। (बी) 5 बउ जल समतुल्य सामग्री उपचार सोफे पर रखी जाती है। (ग) एक सेल कल्चर डिश सामग्री की सतह पर रखा गया है। (घ) डिश वर्ग प्रकाश क्षेत्र द्वारा दिखाए गए उपचार क्षेत्र में त्वरक crosshairs का उपयोग कर केंद्रित है. (ई) 1 सेमी पानी के बराबर सामग्री सेल संस्कृति पकवान के शीर्ष पर रखा गया है। सतह दूरी के लिए स्रोत (एसएसडी) एक ऑप्टिकल दूरी सूचक (एफ, जी) या एक सामने सूचक (एच, मैं) का उपयोग कर जाँच की है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. विकिरण के बाद जैविक परख

  1. विकिरण के बाद, कोशिकाओं को कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर में उसी तरीके से वापस करें जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 1.9, 2.8 और 3.10)।
  2. जरूरत के रूप में, अनुसंधान परियोजना में फिट करने के लिए जैविक assays की एक किस्म दर्जी.
    नोट: यहाँ, हम एक प्रतिनिधि सेल चक्र विश्लेषण16 विकिरण के बाद एक जैविक परख का एक उदाहरण के रूप में दिखाते हैं.

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Representative Results

एक रैखिक त्वरक द्वारा मानक खुराक दर और अतिरिक्त उच्च खुराक दर विकिरण के सेल चक्र प्रभाव की जांच करने के लिए, ग्लियोमा स्टेम की तरह कोशिकाओं के तीन नमूने इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार किए गए थे और विकिरण के बाद 24 एच एकत्र17:एक नियंत्रण नमूना कि विकिरणित नहीं किया गया था (चित्र 2ए), एक नमूना 400 MU/min (मॉनिटर यूनिट, 4.2 Gy/min मानक खुराक दर, चित्र 2बी) के साथ 4 Gy, और एक अन्य नमूना के साथ विकिरणित 2100 MU/min (21.2 Gy/min अतिरिक्त उच्च खुराक दर, चित्र 2 सी) से 4 Gy. सेल चक्र प्रोफाइल सेल चक्र के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ दिखाए जाते हैं.

Figure 2
चित्र 2 : 4 Gy रैखिक त्वरक के विकिरण के बाद सेल चक्र विश्लेषण का उदाहरण. जी2 सेल चक्र गिरफ्तारी या तो एक मानक खुराक दर के साथ ग्लिओमा स्टेम कोशिकाओं के विकिरण के बाद मनाया गया (400 MU/min ) (बी) या एक अतिरिक्त उच्च खुराक दर (2100 MU/min ) (सी) गैर विकिरणित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में (ए) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डोजरेट (एमयू/ एसएसडी (सीएम) ऊर्जा म्यू
20 250 6X 2380*
400 100 6X 390*
2100 80 6एफएफ 260*

तालिका 1: प्रयोगों में इस्तेमाल खुराक दरों के लिए सेटअप, संभालने 4 Gy खुराक. MU अन्य आवश्यक खुराक के लिए रैखिक रूप से बढ़ाया जा सकता है. * ये हम इस्तेमाल LINAC के लिए उदाहरण MU हैं. MU ऊपर समीकरण का उपयोग कर उपयोगकर्ता के विशिष्ट LINAC के लिए परिकलित किया जाना चाहिए।

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Discussion

रेडियोथेरेपी कैंसर प्रबंधन का एक अभिन्न हिस्सा है। चल रहे प्रयासों विकिरण उपचार की प्रभावकारिता और दक्षता में सुधार करना चाहते हैं. रैखिक त्वरक प्रौद्योगिकी में प्रगति अभूतपूर्व सटीकता और सुरक्षा के साथ रोगियों का इलाज करने का अवसर प्रदान किया है. क्योंकि ज्यादातर रोगियों रैखिक त्वरक से उच्च ऊर्जा एक्स-रे के साथ इलाज कर रहे हैं, रैखिक त्वरक पर प्रदर्शन खुराक दरों की एक बड़ी रेंज के जीवविज्ञान प्रभाव की जांच अध्ययन आसानी से रोगियों के लिए लागू किया जा सकता है. विकिरण जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए रैखिक त्वरक लागू करने की कई रिपोर्टें आई हैं , लेकिन परिणाम मिश्रित हैं और अतिरिक्त अध्ययन ों की आवश्यकताहै 13,14,15,16,19.

रैखिक त्वरक इस अर्थ में अपेक्षाकृत सुरक्षित हैं कि निर्धारित खुराक वितरित करने के बाद कोई एक्स-रे का उत्पादन नहीं होगा। यह रेडियोआइसोटोप के विपरीत है जहां विकिरण लगातार उत्सर्जित होता है। इसके अलावा, रैखिक त्वरक का उपयोग विकिरण देने के लिए खुराक और खुराक दरों की एक बड़ी रेंज के साथ लक्ष्य की मात्रा के आकार को नियंत्रित करने के लिए परिष्कृत बीम व्यवस्था के उपयोग की अनुमति देता है। इस विधि का नुकसान यह है कि रैखिक त्वरक की उपलब्धता रोगी के उपयोग के कारण सीमित हो सकती है और इसलिए चिकित्सकों और चिकित्सा भौतिकविदों के साथ उन्नत योजना की आवश्यकता होती है।

हमारे प्रोटोकॉल में हम कोशिकाओं के विकिरण के लिए बुनियादी प्रक्रिया का वर्णन. इस विधि को अन्य शोध आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अनुरूप किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह संयुक्त रसायन चिकित्सा और रेडियोथेरेपी के प्रभाव की जांच करने के लिए दवा उपचार के साथ जोड़ा जा सकता है। एक विशिष्ट सेल लाइन या विकिरण के बाद परख करने के लिए इस विधि को लागू करते हैं, कुछ संशोधनों की उम्मीद की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, विकिरण के बाद biomarkers में जल्दी परिवर्तन की जांच करने के लिए, कोशिकाओं विकिरण के बाद जल्द ही एकत्र किया जा सकता है.

क्योंकि वितरित खुराक बीम ऊर्जा पर निर्भर है और जमा खुराक प्रवेश की गहराई के एक समारोह के रूप में भिन्न होता है, मीडिया और वांछित खुराक प्राप्त करने के लिए आवश्यक पानी के बराबर बोलस की मात्रा महत्वपूर्ण है. ऊपर वर्णित विधि में, हम एक ही पूर्वकाल-पश्च किरण बीम में 6 MV फोटॉनों का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करें कि सेल मीडिया संस्कृति पकवान में ऊंचाई में 1 सेमी पर है. हम कोशिकाओं को खुराक का निर्माण करने के लिए सेल संस्कृति पकवान के शीर्ष पर एक अतिरिक्त 1 सेमी पानी के बराबर सामग्री का उपयोग करें। बहुत उच्च खुराक दरों को प्राप्त करने के लिए, हम सोफे जिस पर कोशिकाओं रखा जाता है बढ़ा. क्योंकि क्षेत्र का आकार सोफे उठाया है के रूप में छोटे हो जाता है, हम एक 35 मिमी संस्कृति पकवान का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि पूरे पकवान विकिरण क्षेत्र के भीतर है, के रूप में प्रकाश क्षेत्र द्वारा सीमांकन. कम खुराक दरों को प्राप्त करने के लिए, हम सतह दूरी के लिए स्रोत बढ़ाने के लिए कमरे के फर्श पर उपचार सोफे या जगह सेल संस्कृति पकवान कम. जानवरों के लिए उपचार क्षेत्रों के डिजाइन, जो अधिक जटिल है, इस लेख के दायरे से परे है. यहाँ वर्णित तकनीक कैसे निलंबन में हो या बर्तन से जुड़ी सेल लाइनों के साथ जीवविज्ञान assays के लिए एक रैखिक त्वरक का उपयोग करने के लिए समझने में शोधकर्ताओं की सहायता करेगा. जीवविज्ञानियों, चिकित्सकों और चिकित्सा भौतिकविदों के बीच घनिष्ठ सहयोग विकिरण अध्ययन के सफल निष्पादन को सुनिश्चित करेगा।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम रैखिक त्वरक के उपयोग के लिए विकिरण कैंसर विज्ञान के क्लीवलैंड क्लिनिक विभाग धन्यवाद. हम ग्लिओमा स्टेम की तरह कोशिकाओं के अपने उदार उपहार के लिए डॉ जेरेमी रिच धन्यवाद. इस शोध क्लीवलैंड क्लिनिक द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
glioma stem-like cell 387 gift from Dr. Jeremy Rich
293 cells ATCC CRL-1573
neuron stem cell culture media Thermo Fisher Scientific 21103049 NeurobasalTM media
DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Recombinant Human EGF Protein R&D Systems 236-EG-01M
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 4114-TC-01M
B-27™ Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030164
Tripsin-EDTA Thermo Fisher 25200056
extracellular proten matrix Corning 354277 MatrigelTM
Ethanol Fisher chemical A4094
Equipment
10 cm cell culture dish Denville T1110
3.5 cm cell culture dish USA Scientific Inc. CC7682-3340
22x22mm glass cover slip electron microscopy sciences 72210-10
15 ml centrifuge tube Thomas Scientific 1159M36
50 ml centrifuge tube Thomas Scientific 1158R10
5 ml Pipette Fisher Scientific 14-955-233
pipet aid Fisher Scientific 13-681-06
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-414
Centrifuge Eppendorf 5810R
Linear Accelerator Varian n/a
water equivalent material Sun Nuclear corporation 557 Solid waterTM
Reagent preparation
DMEM media 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml DMEM media
stem cell culture media 10 ml B27 supplement, 20 µg hFGF, 20 µg hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml Neurobasal media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Hao, J., Magnelli, A., Godley, A.,… More

Hao, J., Magnelli, A., Godley, A., Yu, J. S. Use of a Linear Accelerator for Conducting In Vitro Radiobiology Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59514, doi:10.3791/59514 (2019).

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