Summary
临床直线加速器可用于确定各种剂量率对癌细胞的生物效应。我们讨论如何为癌症干细胞样细胞的测定和测定建立线性加速器,这些细胞在悬浮物中生长为肿瘤球体,细胞系作为附体培养体生长。
Abstract
放射治疗仍然是癌症管理的基石之一。对于大多数癌症,它是最有效的,非手术治疗去散体肿瘤。在这里,我们描述了一种用线性加速器照射癌细胞的方法。直线加速器技术的发展提高了放射治疗的精度和效率。广泛的辐射剂量和剂量率的生物影响仍然是一个紧张的研究领域。使用线性加速器可以促进这些研究使用临床相关的剂量和剂量率。
Introduction
放射治疗是治疗多种癌症的有效手段,治疗1、2、3、4。超高剂量照射在放射治疗中是相对较新的,并且由于线性加速器5的最新技术进步而成为可能。超高剂量率比标准剂量率照射的临床优势包括缩短治疗时间和改善患者体验。线性加速器也为基于细胞培养的辐射生物学研究提供了临床环境。辐射剂量和剂量率的生物和治疗影响一直是放射肿瘤学家和生物学家的兴趣,第6,7,8。但是,超高剂量照射和闪光照射的放射生物学-一个极高的辐射剂量率-还有待彻底调查。
伽马射线照射被广泛应用于基于细胞培养的辐射生物学9、10、11。辐射是通过从衰变的放射性同位素源(通常是Cesium-137)发射的伽马射线来实现的。放射源的使用受到高度管制,而且往往受到限制。使用源辐照,很难测试广泛的剂量率,限制了其在分析临床可实现剂量率12的生物效应的效用。
有几个研究说明剂量和剂量率效应12,13,14,15,16,17。在这些研究中,使用了放射性同位素产生的伽马辐照或线性加速器产生的X射线。使用了代表肺癌、宫颈癌、胶质细胞瘤和黑色素瘤的各种细胞系。辐射对细胞生存、细胞周期抑制、凋亡和DNA损伤的影响被评估为读出12,13,14,15,16,17.在这里,我们描述了一种通过使用线性加速器提供基于 X 射线的辐射来定义临床相关辐射剂量和剂量率的生物效应的方法。这些研究应该由生物学家、放射肿瘤学家和医学物理学家密切合作进行。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 悬浮细胞培养的细胞制备
- 在细胞培养箱中培养的干细胞培养基培养基培养基细胞约5×106细胞/10厘米板,CO2为5%,37°C为95%相对湿度。
注: 细胞培养条件在所有过程中都相同。协议中使用的介质是完整的介质。 - 在预定辐照前两天,用无菌的5mL移液器从培养板收集胶质瘤干细胞,放入培养罩中的15 mL离心管中。
- 在台面离心机中,以 200 x g将收集的细胞离心 3 分钟。
- 在室温下,用1mL的胰蛋白酶-EDTA消化细胞颗粒(约1 x 107细胞),5分钟,在胰蛋白酶-EDTA中进行单细胞悬浮。消化过程中,每2分钟轻轻摇动离心管底部,确保细胞被彻底消化。
- 加入3 mL的干细胞培养基(见材料表)以淬火胰蛋白酶。在台式离心机中,在200 x g下将收集的细胞离心3分钟。丢弃上清液并保存细胞颗粒。
- 用5 mL的细胞培养基重新悬浮细胞,用血细胞计对细胞进行计数。
- 板 5 x 106细胞在两个 10 厘米板中,包含 10 mL 的细胞培养基。
- 在预定的辐照之前,收集细胞,并在离心后丢弃上清液,如步骤1.3所述。用5 mL的细胞培养基重新悬浮细胞颗粒。将1 mL细胞悬浮液转移到含有2 mL细胞培养基的35毫米板中。
注:35 mm 板中的介质总体积为 3 mL,使液体在板中高 1 厘米。 - 将镀层电池转移到二次容器(如塑料或泡沫箱)中,以降低污染风险,并将容器中的电池带到公用推车上的辐照设施。
- 如步骤 4 所述照射细胞。
2. 附着细胞培养的细胞制备
- 辐照前一天,在细胞培养罩中,从附加细胞系(如HEK-293细胞)的细胞培养板上取出DMEM培养基。可以使用连接到真空的巴斯德移液器吸入介质。
- 用5 mL无菌PBS清洗细胞到培养皿中冲洗残留介质。
- 将 1 mL 的胰蛋白酶-EDTA 移入培养皿中,轻轻倾斜培养板,以确保整个培养皿都覆盖在胰蛋白酶-EDTA 上。
- 在室温下将细胞胰蛋白酶化5分钟,用3mL的DMEM介质将胰蛋白酶-EDTA反应淬火,用5mL移液器将细胞收集到培养罩中的15 mL离心管中。
- 在台式离心机中,在200 x g下将收集的细胞离心3分钟。丢弃上清液并保存细胞颗粒。
- 用 5 mL 的 DMEM 介质重新悬浮细胞,用血细胞计对细胞进行计数。
- 板 2 x 105细胞在 35 毫米板中使用 3 mL 的细胞培养培养基,达到 1 厘米的介质高度。
- 在37°C的培养箱中培养24小时后,将二次容器(即绝缘泡沫箱)中的镀层细胞转移到实用车上的辐照设施。
- 如步骤 4 中所述的辐照细胞。
3. 辐照后免疫染色的细胞制备
- 在4°C的冰上解冻商业细胞外蛋白基质过夜。预冷 200 μL 移液器尖端和 1.5 mL 离心管在 4°C 过夜。
- 具有预冷却移液器尖端和 1.5 mL 离心管的等分细胞外蛋白基质,每管 200 μL。
- 在预冷冻20 mL细胞培养基因中稀释200μL的细胞外蛋白基质,以产生1%的细胞外蛋白基质培养基。
- 将消毒盖玻片(22 mm x 22 mm)放入 35 mm 板中。将400μL的1%细胞外蛋白基质培养基培养物放在盖玻片上。
- 将35毫米板放入37°C的细胞培养箱中1小时,使细胞外蛋白基质在盖玻片上聚合。
- 使用悬浮细胞培养时,如步骤 1.1 到 1.5 中所述,进行单个细胞悬浮液。
- 板 5 x 104细胞放在放置在 35 mm 板的细胞外蛋白基质涂层盖玻片上。隔夜将镀层细胞返回到细胞培养箱,以确保细胞由蛋白质基质支撑。盘中介质的总体积应为 3 mL,使培养盘中介质的高度达到 1 厘米。
- 使用 10 倍放大物镜在明亮的场显微镜下观察细胞。细胞应该展开在盖玻上,而不是浮动。将装有镀层电池的培养皿转移到二级容器中,如泡沫箱,以在工具车上的辐照设施,并按照步骤 4 所述照射细胞。
- 当使用附加细胞培养物(例如,HEK-293细胞)时,如步骤2.1至2.6所述,消化细胞。在辐照前一天,将 5 x 104个细胞放在 35 mm 板中的无菌盖玻片上,以确保细胞完全连接到盖玻片表面,如步骤 3.9 中的显微镜观察它们。使用 3 mL 的 DMEM 介质使液体在板中达到 1 厘米高。
- 在盖玻上生长细胞过夜或最多一天后,将培养皿与镀层细胞在二次容器转移到辐照设施。实用工具车可用于降低溢出风险。如步骤 4 中所述的辐照细胞。
4. 用直线加速器(LINAC)照射
- 使用 LINAC 的控制台软件,将加速器龙门和准直器设置为 0°,将 X 和 Y 钳口打开为对称的 20 x 20 cm2字段大小,如果存在,则缩回多叶准直器 (MLCs)。
注: LINACs 可能具有无扁平滤波器 (FFF) 模式,允许非常高的剂量率。顾名思义,这种辐射不均匀(平坦),高剂量率只在光束中心达到。在这种情况下,使用 7 x 7 cm2字段。 - 将至少5厘米的水当量材料放在处理沙发上。将细胞盘以400 MU/min(标准剂量率)照射到水当量材料上,并将其居于LINAC十字线。
- 将最大剂量的细胞置于6MV X射线束中,约1.5厘米,在盘子顶部再放置1厘米的水当量材料。结合细胞悬浮的1厘米介质,将细胞平均深度置于1.5厘米。
- 将前指针固定到 LINAC 的头部。扩展前指针,直到它接触堆积材料的表面并记下距离。调整表格高度,直到从源到堆积表面的距离为 100 厘米。
注:距离可以通过光学距离指示器确认。或者,光学距离指示器可用于代替前指针将源设置为 100 cm。 - 计算适当的监测单元数 (MU), 以向细胞提供所需的辐射剂量,并编程加速器以 400 MU/min 的速度输送。
注: 对于在 LINAC 上校准以在最大剂量深度提供 1 cGy/MU 的源到表面距离 (SSD) 设置,使用 MU = 剂量 (cGy) / (1 cGy/MU) / OF (20x20)计算所需的监视器单位数,其中 OF 代表输出因子。对于使用备用校准设置的 LINAC,必须更改此计算。 - 离开治疗库,并验证所有其他人员已退出。房间里没有其他细胞,否则它们将接受低剂量的辐射。关闭保险库门。
- 在控制台上确认场号、MU 和 MU/min,然后启用光束。
- 重复步骤4.3-4.8,使细胞在更高或更低的剂量率下进行辐照。
- 要使用加速器实现更高的剂量率(例如,2100 MU/min 或更高),请降低 SSD,以便根据反向方定律提高细胞的有效剂量率:剂量率有效 = 剂量率 = (100 厘米 / SSD=New)2。
- 对于低剂量率(例如,20 MU/min),将源增加到表面距离(SSD_New)以降低剂量率。例如,细胞培养皿可以放置在治疗室的地板上。
- 如有必要,使用 MU = 剂量 (cGy) / (1 cGy/MU) / OF (20x20)/ (100 厘米 / SSD_新)2) 重新计算加速器上的监视器单元设置。有关 MU 计算的其他信息,请参阅麦克德莫特和奥顿18的参考。
- 根据剂量率(Gy/min)= 剂量(Gy)*(MU/min)/MU确定以Gy/分钟表示的剂量率。例如,4 Gy 以 400 MU/min 交付需要 380 MU,因此 4*400/380 = 4.2 Gy/min。参见表1。
图 1:在直线加速器上设置细胞培养皿。(A) 显示临床直线加速器.(B) 5厘米的水当量材料放在处理沙发上.(C) 细胞培养皿被放置在材料表面.(D) 在方形光场显示的处理场中,使用加速器十字线将菜形居中。(E) 1 厘米水当量材料放置在细胞培养皿的顶部.使用光学距离指示器(F、G) 或前指针(H、 I) 检查到表面距离 (SSD) 的源。请点击此处查看此图的较大版本。
5. 辐照后的生物测定
- 照射后,以上述方式(步骤1.9、2.8和3.10)将细胞返回到细胞培养箱。
- 根据需要,定制各种生物测定,以适应研究项目。
注:在这里,我们展示了一个代表性的细胞周期分析16作为辐照后生物测定的例子。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了研究标准剂量率和线性加速器照射超高剂量率的细胞周期效应,使用该协议制备了三个胶质瘤干细胞样本,并在辐照17后收集了24小时:一个对照样本未辐照(图2A),一个样品照射400 MU/min(监测单位,4.2 Gy/min标准剂量率,图2B)至4 Gy,另一个样品照射2100 MU/min(21.2 Gy/min超高剂量率,图 2C) 到 4 Gy。细胞周期轮廓与细胞周期不同阶段的细胞百分比一起显示。
图 2:直线加速器4Gy辐照后的细胞周期分析实例。与非辐照对照细胞(A)相比,在光胶质瘤干细胞照射后观察到G2细胞周期抑制,其标准剂量率(400 MU/min)(B)或超高剂量率(2100 MU/min) (C)。请点击此处查看此图的较大版本。
| 剂量率(MU/MIN) | SSD (CM) | 能源 | 木 |
| 20 | 250 | 6X | 2380° |
| 400 | 100 | 6X | 390€ |
| 2100 | 80 | 6FFF | 260° |
表1:假设4Gy剂量,用于实验的剂量率的设定。MU 可以线性缩放用于其他所需剂量。*以下是我们使用的 LINAC 的示例 MU。应使用上述公式为用户的特定 LINAC 计算 MU。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
放射治疗是癌症管理不可分割的一部分。正在进行的努力旨在提高放射治疗的疗效和效率。直线加速器技术的进步为以前所未有的准确性和安全性治疗患者提供了机会。由于大多数患者都使用直线加速器的高能 X 射线进行治疗,因此,在线性加速器上执行大量剂量率的生物学影响的研究可能很容易应用于患者。已经有一些报告将线性加速器应用于辐射生物学研究,但结果好坏参半,还需要进行13、14、15、16、19等研究。
线性加速器相对安全,因为在提供规定的剂量后,将不会产生X射线。这与辐射不断发射的放射性同位素形成鲜明对比。此外,使用直线加速器提供辐射,允许使用精密的光束排列,以大剂量和剂量率控制目标体积的形状。这种方法的缺点是,线性加速器的可用性可能由于患者使用而受到限制,因此需要临床医生和医学物理学家进行高级规划。
在我们的协议中,我们描述了细胞辐照的基本程序。该方法可以定制以满足其他研究需求。例如,它可以与药物治疗相结合,研究联合化疗和放疗的效果。当将此方法应用于特定的细胞系或辐射后的测定时,应进行一些修改。例如,为了研究辐照后生物标志物的早期变化,可以在辐照后不久收集细胞。
由于传递的剂量取决于光束能量,并且沉积的剂量随着穿透深度的函数而变化,因此达到所需剂量所需的介质和水当量的博鲁斯量至关重要。在上述方法中,我们在单个前后梁中使用 6 个 MV 光子,并确保培养盘中的细胞介质高度为 1 厘米。我们在细胞培养皿顶部使用另外1厘米的水当量材料来积累对细胞的剂量。为了达到非常高的剂量率,我们提高放置细胞的沙发。由于当沙发升起时,字段大小变小,我们使用 35 mm 培养盘,并确保整个培养皿在辐照范围内,由光场划分。为了达到低剂量率,我们降低治疗沙发或将细胞培养皿放在房间的地板上,以增加源到表面的距离。动物治疗场的设计,这是更复杂的,超出了本文的范围。这里描述的技术将帮助研究人员了解如何使用线性加速器进行生物测定,其细胞系生长在悬浮物中或附着在盘子上。生物学家、临床医生和医学物理学家之间的密切合作将确保辐射研究的成功执行。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢克利夫兰诊所放射肿瘤学系使用线性加速器。我们感谢杰里米·里奇博士慷慨地赠送了胶质瘤干细胞。这项研究得到了克利夫兰诊所的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| glioma stem-like cell 387 | gift from Dr. Jeremy Rich | ||
| 293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| neuron stem cell culture media | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | NeurobasalTM media |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 4114-TC-01M | |
| B-27™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030164 | |
| Tripsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | |
| extracellular proten matrix | Corning | 354277 | MatrigelTM |
| Ethanol | Fisher chemical | A4094 | |
| Equipment | |||
| 10 cm cell culture dish | Denville | T1110 | |
| 3.5 cm cell culture dish | USA Scientific Inc. | CC7682-3340 | |
| 22x22mm glass cover slip | electron microscopy sciences | 72210-10 | |
| 15 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1159M36 | |
| 50 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1158R10 | |
| 5 ml Pipette | Fisher Scientific | 14-955-233 | |
| pipet aid | Fisher Scientific | 13-681-06 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Linear Accelerator | Varian | n/a | |
| water equivalent material | Sun Nuclear corporation | 557 | Solid waterTM |
| Reagent preparation | |||
| DMEM media | 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml DMEM media | ||
| stem cell culture media | 10 ml B27 supplement, 20 µg hFGF, 20 µg hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml Neurobasal media |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).
- Tao, R., et al. Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).
- Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).
- Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P.
- Hall, E. J. Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy. The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).
- Steel, G. G., et al. The dose-rate effect in human tumour cells. Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).
- Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux. Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).
- Castro, G., et al. Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).
- Gaddini, L., et al. Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses. Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).
- Simara, P., et al. DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73 (2017).
- Wang, Z., et al. A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 10 (8), 0133728 (2015).
- Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).
- Karan, T., et al. Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams. Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).
- Sarojini, S., et al. A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes. Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).
- Hao, J., et al. The effects of extra high on glioma stem-like cells. PLoS One. 13 (8), 0202533 (2018).
- Liu, J., et al. Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells. International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).
- Mcdermott, P., et al. The Physics and Technology of Radiation Therapy. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).
- Lohse, I., et al. Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival. Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).
