Summary
Kliniska linjära acceleratorer kan användas för att fastställa biologiska effekter av ett brett spektrum av dospriser på cancerceller. Vi diskuterar hur man ställer in en linjär Accelerator för cellbaserade analyser och analyser för cancer Stem-liknande celler som odlas som tumorspheres i fjädring och cellinjer odlas som anhängare kulturer.
Abstract
Strålbehandling är fortfarande en av hörnstenarna i cancer hanteringen. För de flesta cancerformer, det är den mest effektiva, icke-kirurgisk terapi för att debulk tumörer. Här beskriver vi en metod för att bestråla cancerceller med en linjär Accelerator. Utvecklingen av linjär acceleratorteknik har förbättrat precisionen och effektiviteten i strålbehandling. De biologiska effekterna av ett brett spektrum av stråldoser och dospriser fortsätter att vara ett intensivt undersökningsområde. Användning av linjära acceleratorer kan underlätta dessa studier med kliniskt relevanta doser och dospriser.
Introduction
Strålbehandling är en effektiv behandling för många typer av cancer1,2,3,4. Extra hög dosraten bestrålning är relativt ny i strålbehandling och möjliggörs genom nya tekniska framsteg i linjära acceleratorer5. Kliniska fördelar med extra hög doshastighet jämfört med standard dos frekvens bestrålning inkluderar förkortad behandlingstid och förbättrad patient erfarenhet. Linjära acceleratorer ger också en klinisk inställning för cellkulturbaserade strålningsbiologi studier. De biologiska och terapeutiska konsekvenserna av stråldos och dospriser har varit i fokus för strålning onkologer och biologer i årtionden6,7,8. Men, radiobiologi av extra hög dosraten strålning och blixt bestrålning-en extremt hög doshastighet av strålning-har ännu inte grundligt undersökas.
Gamma ray bestrålning används ofta i cellkultur baserad strålningsbiologi9,10,11. Strålning uppnås genom gammastrålar som avges från sönderruttnande radioaktiva isotoper, typiskt cesium-137. Användningen av radioaktiva källor är starkt reglerad och ofta begränsad. Med källbaserad bestrålning, det är utmanande att testa ett brett spektrum av dospriser, begränsa dess nytta i analysen av de biologiska effekterna av kliniska uppnåeliga dos hastigheter12.
Det har förekommit flera studier som illustrerar både dos-och dos frekvens effekter12,13,14,15,16,17. I dessa studier användes både gammastrålning som genererats från radioaktiva isotoper eller röntgenstrålar från linjära acceleratorer. En mängd olika cellinjer som representerar lungcancer, livmoderhalscancer, glioblastom, och melanom användes. Strålningseffekter på cellöverlevnad, cellcykelarrest, apoptos och DNA-skador utvärderades som avläsning12,13,14,15,16,17 . Här beskriver vi en metod för att definiera de biologiska effekterna av kliniskt relevanta strålningsdoser och dospriser genom att leverera röntgenbaserad strålning med hjälp av en linjär Accelerator. Dessa studier bör utföras med nära samarbete mellan biologen, onkolog strålning och medicinsk fysiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell förberedelse för suspension cellkultur
- Kultur gliom Stem-liknande celler i stamceller kultur media på cirka 5 x 106 cell/10 cm plattor i en cellkultur inkubator med 5% Co2, 95% relativ luftfuktighet vid 37 ° c.
Observera: cell odlings villkoret är detsamma i alla procedurer. Media som används i protokollet är kompletta medier. - Två dagar före planerad bestrålning, samla gliom Stem-liknande celler från odlingsplattan med en steril 5 ml-pipett i ett 15 ml centrifugerör i en odlings huva.
- Centrifugera de insamlade cellerna vid 200 x g i 3 min i en bänkskiva centrifug.
- Kassera supernatanten och smälta cellpelleten (ca 1 x 107 celler) med 1 ml trypsin-EDTA i rumstemperatur i 5 minuter för att göra en enda cellsuspension i trypsin-EDTA. Skaka försiktigt botten av Centrifugera röret var 2 minuter under matsmältningen för att se till att cellerna smälts grundligt.
- Tillsätt 3 mL stamcells odlingsmedium (se tabellen med material) för att släcka trypsin. Centrifugera de insamlade cellerna vid 200 x g under 3 min i en bänk centrifug. Kassera supernatanten och spara cellpelleten.
- Omsuspendera cellerna med 5 mL cellodlingsmedium och räkna cellerna med en hemocytometer.
- Tallrik 5 x 106 celler i 2 10 cm tallrikar innehållande 10 ml cellodlingsmedium.
- Precis före planerad bestrålning, samla in cellerna och Kassera supernatanten efter centrifugering enligt beskrivningen i steg 1,3. Återsuspendera cellpelleten med 5 mL cellodlingsmedium. Överför 1 mL cellsuspension till en 35 mm platta innehållande 2 mL cellodlingsmedium.
Obs: den totala volymen av media är 3 mL i 35 mm plattan för att göra vätskan 1 cm i höjd i plattan. - Överför de pläterade cellerna i en sekundär behållare, såsom en plast-eller skum låda, för att minska risken för kontaminering och föra cellerna i behållaren till bestrålningsanläggningen på Utility Cart.
- Bestråla cellerna enligt beskrivningen i steg 4.
2. cell förberedelse för kopplad cellkultur
- En dag före bestrålning, i cell Culture Hood, ta bort DMEM-mediet från cell odlingsplattan i den bifogade cellinken, till exempel HEK-293-celler. Medierna kan bli sugs med hjälp av en Pasteur pipett ansluten till ett vakuum.
- Tvätta celler med 5 mL steril PBS till odlings skålen för att skölja av kvarvarande material.
- Pipettera 1 mL trypsin-EDTA i kultur skålen och luta försiktigt kultur plattan för att se till att hela skålen är täckt med trypsin-EDTA.
- Trypsinize celler vid rumstemperatur i 5 min. släcka trypsin-EDTA-reaktionen med 3 mL DMEM-media och samla in celler med en 5 mL-pipett i 15 mL centrifugertub i odlings huven.
- Centrifugera de insamlade cellerna vid 200 x g under 3 min i en bänk centrifug. Kassera supernatanten och spara cellpelleten.
- Omsuspendera cellerna med 5 mL DMEM-media och räkna cellerna med en hemocytometer.
- Platta 2 x 105 celler i en 35 mm plåt med 3 ml cellkultur media till en höjd av 1 cm av media.
- Efter 24 h cellkultur i inkubatorn vid 37 ° c, överföra de pläterade cellerna i en sekundär behållare (dvs, en isolerad skum låda) till bestrålningsanläggningen på en Utility Cart.
- Bestråla cellerna enligt beskrivningen i steg 4.
3. cell beredning för immunofärgning efter bestrålning
- Tina kommersiell extracellulär protein matris på is vid 4 ° c över natten. Pre-Chill 200 μL pipettspetsar och 1,5 mL centrifugrör vid 4 ° c över natten.
- Alikvot extracellulär protein matris med pre-kylda pipettspetsar och 1,5 mL centrifugrör på 200 μL per tub.
- Späd 200 μL av extracellulära protein Matrix i pre-kyld 20 mL cellkultur media för att göra 1% extracellulära protein Matrix media.
- Placera en steriliserad täckslip (22 mm x 22 mm) i en 35 mm plåt. Placera 400 μL av 1% extracellulära protein Matrix media på täckslip.
- Placera 35 mm plattan i cellkulturen inkubator vid 37 ° c i 1 h så att den extracellulära protein matrisen att polymerisera på täckplattan.
- När du använder suspension cellkultur, göra en enda cellsuspension som beskrivs i steg 1,1 till 1,5.
- Tallrik 5 x 104 celler på en extracellulär protein Matrix-belagd täckslip placerad i en 35 mm tallrik. Returpläterade celler till cellkulturen inkubator över natten för att säkerställa att cellerna stöds av proteinet matrisen. Den totala volymen av mediet i plattan bör vara 3 mL för att göra höjden av media når 1 cm i kultur skålen.
- Observera cellerna under ett ljust fält Mikroskop med 10X förstoring objektiv. Cellerna bör spridas ut på täckslip i stället för flytande. Överför kultur skålen med pläterade celler till en sekundär behållare som en skum låda till bestrålningsanläggningen på en Utility cart och bestråla cellerna som beskrivs i steg 4.
- När du använder kopplade cellkulturer (till exempel HEK-293-celler), sammanfattad celler enligt beskrivningen i steg 2,1 till 2,6. Placera 5 x 104 celler på en steril täckslip i en 35 mm platta en dag före bestrålningen för att se till att cellerna är helt fästa på täckglas ytan genom att observera dem under ett mikroskop som i steg 3,9. Använd 3 mL DMEM-media för att göra vätskan 1 cm i höjd i plattan.
- Efter odling av celler på täckglas över natten eller upp till en dag, överföra kultur skålen med pläterade celler i en sekundär behållare till bestrålningsanläggningen. En nytto vagn kan användas för att minska risken för spill. Bestråla cellerna enligt beskrivningen i steg 4.
4. bestrålning med en linjär Accelerator (LINAC)
- Med hjälp av linac: s konsolprogramvara, Ställ Accelerator Portal och kollimator till 0 °, öppna x-och Y-käftarna till en symmetrisk 20 X 20 cm2 Fältstorlek och dra in flerbladiga kollimatorer (mlcs) om sådana finns.
Obs: LINACs kan ha en plattning filter fri (FFF) läge, vilket ger mycket höga doser. Som namnet antyder är denna strålning inte enhetlig (platt), och den höga dosraten uppnås endast i mitten av balken. I detta fall används ett 7 x 7 cm2 fält. - Placera minst 5 cm vatten ekvivalent material på behandlings soffan. Placera cell skålen som skall bestrålas på 400 me/min (standard doshastighet) på vatten ekvivalent material och centrera den på LINAC hårkorset.
- Placera cellerna som skall bestrålas vid ett djup av maximal dos i en 6 MV röntgenstråle, ca 1,5 cm. Placera ytterligare 1 cm vatten ekvivalent material ovanpå skålen. Kombinerat med 1 cm medium genom vilka cellerna är upphängda, detta placerar cellerna på ett genomsnittligt djup av 1,5 cm.
- Fäst den främre pekaren på LINAC-huvudet. Dra ut den främre pekaren tills den kontaktar ytan på uppbyggd material och anteckna avståndet. Justera bords höjden tills avståndet från källan till uppbyggd yta är 100 cm.
Obs: avståndet kan bekräftas med den optiska avståndsindikatorn. Alternativt kan den optiska avståndsindikatorn användas i stället för den främre pekaren för att ställa in källan till uppbyggd yta till 100 cm. - Beräkna lämpligt antal Monitor enheter (MU) för att leverera den önskade dosen av strålning till cellerna och programmera acceleratorn för att leverera på 400 me/min.
Anmärkning: för källan till ytan avstånd (SSD) setup på en LINAC kalibrerad för att leverera 1 cGy/MU på djupet av maximal dos, det erforderliga antalet Monitor enheter beräknas med hjälp av MU = dos (cGy)/(1 cGy/MU)/av (20x20), där av stativ för utgångs faktorn. Denna beräkning måste ändras för LINACs med hjälp av alternativa Kalibreringsinställningar. - Lämna behandlings valvet och kontrollera att alla andra personer har avslutat sin behandling. Vrify att det inte finns några andra celler i rummet, eller de kommer att få låga doser av strålning. Stäng valv luckan.
- Bekräfta Fältstorlek, MU och MU/min i konsolen och aktivera strålen.
- Upprepa steg 4.3-4.8 för att cellerna ska bestrålas vid högre eller lägre dospriser.
- För att uppnå högre dospriser (t. ex. 2100 me/min eller högre) med acceleratorn, minska SSD för att öka den effektiva dosraten till cellerna enligt omvänd kvadrat lag: DoseRateEffective = Doserate * (100 cm/SSD_New)2.
- För låga dospriser (t. ex. 20 me/min), öka källan till ytavstånd (SSD_New) för att minska dosraten. Till exempel kan cellkultur skålen placeras på golvet i behandlingsrummet.
- Beräkna om bildskärmsenhetens inställning på acceleratorn om denna inställning är nödvändig, med MU = dos (cGy)/(1 cGy/MU)/av (20x20)/(100 cm/SSD_New)2. För ytterligare information om MU beräkningar, hänvisa till referens av McDermott och Orton18.
- Bestäm dosraten i Gy/Minute med doserat (Gy/min) = dos (Gy) * (MU/min)/MU. e.g., 4 Gy levererat på 400 me/min kräver 380 MU, så 4 * 400/380 = 4,2 Gy/min. Se tabell 1.
Figur 1 : Set-up av cellkultur skålen på linjär Accelerator. A) en klinisk linjär Accelerator visas. B) 5 cm vatten ekvivalent material placeras på behandlings soffan. Cen cellkultur rätt placeras på materialets yta. (D) skålen är centrerad med hjälp av Accelerator hårkorset i det behandlings fält som visas av kvadraten ljusfältet. (E) 1 cm vatten ekvivalent material placeras ovanpå cellkultur skålen. Källan till ytavståndet (SSD) kontrolleras med hjälp av en optisk avstånds indikator (F, G) eller en Frampekare (H, I). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. biologiska analyser efter bestrålning
- Efter bestrålning, returnera cellerna till cell odlings inkubatorn på samma sätt som beskrivits ovan (steg 1,9, 2,8 och 3,10).
- Efter behov skräddarsy en mängd olika biologiska analyser för att passa in i forskningsprojektet.
Obs: här visar vi en representativ cell cykel analys16 som ett exempel på en biologisk analys efter bestrålning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka cellcykelns effekt av standard doshastighet och bestrålning med extra hög doshastighet av en linjär Accelerator, utarbetades tre prover av gliom-liknande celler med detta protokoll och samlades in 24 h efter bestrålning17: ett kontrollprov som inte bestrålades (figur 2A), ett prov som bestrålats med 400 me/min (Monitor enhet, 4,2 Gy/min standard doshastighet, figur 2B) till 4 Gy, och ett annat prov som bestrålats med 2100 me/min (21,2 Gy/min extra hög doshastighet, Figur 2 C) till 4 Gy. Cell Cykelprofiler visas med procentandelen celler i olika faser av cellcykeln.
Figur 2 : Exempel på cell cykel analys efter 4 Gy bestrålning av linjär Accelerator. G2 cellcykelarrest observerades efter bestrålning av gliom stamceller med antingen en standard doshastighet (400 me/min) (B) eller en extra hög dosnivå (2100 me/min) (C) jämfört med icke-bestrålade kontrollceller (a). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| DoseRate (MU/MIN) | SSD (CM) | Energi | Mu |
| 20 | 250 | 6X | 2380 * |
| 400 | 100 | 6X | 390 * |
| 2100 | 80 | 6FFF | 260 * |
Tabell 1: inställning för dospriser som används i experiment, förutsatt 4 Gy dos. MU kan skalas linjärt för andra erforderliga doser. * Dessa är exempel MU för LINAC vi använde. MU ska beräknas för användarens specifika LINAC med ekvationen ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strålbehandling är en integrerad del av cancer hanteringen. Pågående insatser syftar till att förbättra strålnings behandlingens effektivitet och effektivitet. Framsteg inom linjär acceleratorteknik har gett möjlighet att behandla patienter med oöverträffad noggrannhet och säkerhet. Eftersom de flesta patienter behandlas med hög energi röntgen från linjära acceleratorer, kan studier som undersöker de biologiska effekterna av ett stort antal dospriser som utförs på linjära acceleratorer lätt appliceras på patienter. Det har förekommit flera rapporter som tillämpar linjära acceleratorer för strålningsbiologi forskning, men resultaten är blandade och ytterligare studier behövs13,14,15,16,19.
Linjära acceleratorer är relativt säkra i den meningen att efter den ordinerade dosen levereras det inte kommer att finnas några röntgenstrålar produceras. Detta är i motsats till radioisotoper där strålning släpps hela tiden. Dessutom kan användning av linjära acceleratorer för att leverera strålning medger användning av sofistikerade balk arrangemang för att kontrollera formen på målvolymen med ett stort antal doser och dospriser. Nackdelen med denna metod är att tillgängligheten av den linjära acceleratorn kan vara begränsad på grund av patientens användning och kräver därför avancerad planering med kliniker och medicinska fysiker.
I vårt protokoll beskriver vi den grundläggande proceduren för bestrålning av celler. Denna metod kan skräddarsys för att möta andra forskningsbehov. Till exempel, det kan kombineras med läkemedelsbehandling för att undersöka effekten av kombinerad kemoterapi och strålbehandling. Vid tillämpning av denna metod på en specifik cellinjer eller assay efter strålningen, bör vissa ändringar förväntas. Till exempel, för att undersöka tidiga förändringar i biomarkörer efter bestrålning, kan celler samlas in strax efter bestrålningen.
Eftersom den levererade dosen är beroende av strålenergi och den deponerade dosen varierar som en funktion av penetrationsdjupet, är mängden media och vatten ekvivalent bolus som behövs för att uppnå den önskade dosen kritisk. I den metod som beskrivs ovan, använder vi 6 MV fotoner i en enda främre bakre balk och se till att cellen media är på 1 cm i höjd i kulturen skålen. Vi använder ytterligare 1 cm vatten ekvivalent material ovanpå cellkultur skålen för att bygga upp dosen till cellerna. För att uppnå mycket höga dospriser höjer vi soffan som cellerna placeras på. Eftersom fältstorleken blir mindre när soffan höjs, använder vi en 35 mm kultur rätt och se till att hela skålen är inom bestrålnings området, som avgränsas av ljusfältet. För att uppnå låga dospriser sänker vi behandlings soffan eller placerar cellkultur skålen på golvet i rummet för att öka källan till ytavstånd. Utformningen av behandlings fält för djur, som är mer komplex, ligger utanför tillämpningsområdet för denna artikel. De tekniker som beskrivs här kommer att hjälpa forskare att förstå hur man använder en linjär Accelerator för biologiska analyser med cellinjer som odlas i suspension eller bifogas rätter. Ett nära samarbete mellan biologer, kliniker och medicinska fysiker kommer att säkerställa ett lyckat genomförande av strålnings studierna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Cleveland Clinic Institutionen för strålning onkologi för användning av linjära acceleratorer. Vi tackar Dr Jeremy Rich för hans generösa gåva gliom Stem-liknande celler. Denna forskning stöddes av Cleveland Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| glioma stem-like cell 387 | gift from Dr. Jeremy Rich | ||
| 293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| neuron stem cell culture media | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | NeurobasalTM media |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 4114-TC-01M | |
| B-27™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030164 | |
| Tripsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | |
| extracellular proten matrix | Corning | 354277 | MatrigelTM |
| Ethanol | Fisher chemical | A4094 | |
| Equipment | |||
| 10 cm cell culture dish | Denville | T1110 | |
| 3.5 cm cell culture dish | USA Scientific Inc. | CC7682-3340 | |
| 22x22mm glass cover slip | electron microscopy sciences | 72210-10 | |
| 15 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1159M36 | |
| 50 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1158R10 | |
| 5 ml Pipette | Fisher Scientific | 14-955-233 | |
| pipet aid | Fisher Scientific | 13-681-06 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Linear Accelerator | Varian | n/a | |
| water equivalent material | Sun Nuclear corporation | 557 | Solid waterTM |
| Reagent preparation | |||
| DMEM media | 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml DMEM media | ||
| stem cell culture media | 10 ml B27 supplement, 20 µg hFGF, 20 µg hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml Neurobasal media |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).
- Tao, R., et al. Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).
- Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).
- Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P. MRI-Linear accelerator raiotherapy systems. Clinical Oncology Journal | The Royal College of Radiologists. 30 (11), 686-691 (2018).
- Hall, E. J. Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy. The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).
- Steel, G. G., et al. The dose-rate effect in human tumour cells. Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).
- Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux. Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).
- Castro, G., et al. Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).
- Gaddini, L., et al. Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses. Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).
- Simara, P., et al. DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73 (2017).
- Wang, Z., et al. A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 10 (8), 0133728 (2015).
- Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).
- Karan, T., et al. Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams. Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).
- Sarojini, S., et al. A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes. Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).
- Hao, J., et al. The effects of extra high on glioma stem-like cells. PLoS One. 13 (8), 0202533 (2018).
- Liu, J., et al. Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells. International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).
- Mcdermott, P., et al. The Physics and Technology of Radiation Therapy. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).
- Lohse, I., et al. Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival. Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).
