Summary
Kliniske lineære akseleratorer kan brukes til å bestemme biologiske effekter av et bredt spekter av dose rater på kreftceller. Vi diskuterer hvordan du setter opp en lineær akselerator for celle-baserte analyser og analyser for kreft stilk-lignende celler dyrket som tumorspheres i suspensjon og cellelinjer vokst som tilhenger kulturer.
Abstract
Strålebehandling er fortsatt en av hjørnesteinene i kreft ledelse. For de fleste kreftformer, er det den mest effektive, nonsurgical terapi til debulk svulster. Her beskriver vi en metode for å irradiate kreftceller med en lineær akselerator. Fremme av lineær akselerator teknologi har forbedret presisjon og effektivitet av strålebehandling. De biologiske virkningene av et bredt spekter av strålingsdoser og dose rater fortsetter å være et intenst undersøkelses område. Bruk av lineære akseleratorer kan forenkle disse studiene ved hjelp av klinisk relevante doser og dose rater.
Introduction
Strålebehandling er en effektiv behandling for mange typer kreft1,2,3,4. Ekstra høy dose rate bestråling er relativt nytt i strålebehandling og er gjort mulig av nyere teknologiske fremskritt i lineære akseleratorer5. Kliniske fordeler med ekstra høy dose rate over standard dose rate bestråling inkluderer forkortet behandlingstid og forbedret pasient opplevelse. Lineære akseleratorer gir også en klinisk innstilling for cellekultur basert stråling biologi studier. Den biologiske og terapeutiske implikasjoner av stråling dose og dose ratene har vært et fokus av interesse for stråling onkologer og biologer i flere ti år6,7,8. Men, radiobiology av ekstra høy dose rate bestråling og blits bestråling-en ekstremt høy dose frekvens av stråling-har ennå ikke grundig undersøkt.
Gamma Ray bestråling er mye brukt i cellekultur basert stråling biologi9,10,11. Stråling oppnås ved gamma stråler som slippes ut fra råtnende radioaktive isotop kilder, typisk cesium-137. Bruk av radioaktive kilder er sterkt regulert og ofte begrenset. Med kildebasert bestråling, er det utfordrende å teste et bredt spekter av dose rater, noe som begrenser nytten i analysen av de biologiske virkningene av kliniske oppnåelige dose rater12.
Det har vært flere studier som illustrerer både dose og dose rate effekter12,13,14,15,16,17. I disse studiene ble både gamma-bestråling generert fra radioaktive isotoper eller røntgenstråler generert fra lineære akseleratorer brukt. En rekke cellelinjer som representerer lungekreft, livmorhalskreft, glioblastom og melanom ble brukt. Stråle effekter på celle overlevelse, celle syklus arrest, apoptose og DNA skade ble evaluert som readouts12,13,14,15,16,17 . Her beskriver vi en metode for å definere de biologiske virkningene av klinisk relevant stråledose og dose rater ved å levere røntgenstråling ved hjelp av en lineær akselerator. Disse studiene bør utføres med nært samarbeid mellom biolog, stråling onkolog og medisinsk fysiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse for suspensjon cellekultur
- Kultur glioma stilk-lignende celler i stilk cellen kultur medier på ca 5 x 106 celle/10 cm plater i en cellekultur inkubator med 5% co2, 95% relativ fuktighet ved 37 ° c.
Merk: cellen kultur tilstand er den samme gjennom alle prosedyrene. Mediet som brukes i protokollen, er komplette medier. - To dager før planlagt bestråling, samle glioma-lignende celler fra kultur platen med en steril 5 mL pipette inn i et 15 mL sentrifugerør i en kultur hette.
- Sentrifuger de innsamlede cellene ved 200 x g for 3 min i en benkeplate sentrifuge.
- Kast supernatanten og fordøye cellen pellet (ca 1 x 107 celler) med 1 ml TRYPSIN-EDTA ved romtemperatur i 5 minutter for å gjøre en enkelt celle suspensjon i TRYPSIN-EDTA. Rist bunnen av sentrifugerør hver 2 minutter under fordøyelsen å sørge for at cellene er fordøyd grundig.
- Tilsett 3 mL Stamcelle kultur medier (se tabell over materialer) for å slukke Trypsin. Sentrifuger de innsamlede cellene ved 200 x g for 3 min i en Counter Top sentrifuger. Kast supernatanten og lagre celle pellet.
- Resuspend cellene med 5 mL cellekultur medier og telle cellene med en hemocytometer.
- Plate 5 x 106 celler i 2 10 cm plater inneholder 10 ml cellekultur medier.
- Rett før den planlagte bestråling, samle cellene og kast supernatanten etter sentrifugering som beskrevet i trinn 1,3. Suspendere celle pellet med 5 mL cellekultur medier. Overfør 1 mL celle fjæring til en 35 mm plate som inneholder 2 mL cellekultur medier.
Merk: det totale medievolumet er 3 mL i 35 mm-platen for å gjøre væsken 1 cm i høyden i platen. - Overfør de belagte cellene i en sekundær beholder, for eksempel en plast-eller skum boks, for å redusere risikoen for forurensning og bringe cellene i beholderen til bestråling anlegget på verktøyet handlevognen.
- Irradiate cellene slik det er beskrevet i trinn 4.
2. celle forberedelse for vedlagt cellekultur
- En dag før bestråling, i cellen kulturen panseret, fjerne DMEM Media fra cellen kulturen plate av den vedlagte cellelinje, for eksempel HEK-293 celler. Mediene kan være suctioned ved hjelp av en Pasteur pipette koblet til et vakuum.
- Vask celler med 5 mL steril PBS til kultur fatet for å skylle av gjenværende utskriftsmateriale.
- Pipetter 1 mL Trypsin-EDTA inn i kulturen parabolen og forsiktig vippe kulturen plate for å sikre at hele parabolen er dekket med Trypsin-EDTA.
- Trypsinize celler ved romtemperatur i 5 min. slukke Trypsin-EDTA reaksjon med 3 mL DMEM Media og samle celler med en 5 mL pipette inn 15 mL sentrifugerør i kulturen panseret.
- Sentrifuger de innsamlede cellene ved 200 x g for 3 min i en Counter Top sentrifuger. Kast supernatanten og lagre celle pellet.
- Resuspend cellene med 5 mL DMEM-medier og Tell cellene med en hemocytometer.
- Plate 2 x 105 celler i en 35 mm plate med 3 ml cellekultur medier til en høyde på 1 cm av Media.
- Etter 24 h av celle kulturen i inkubator ved 37 ° c, overføre de belagte cellene i en sekundær beholder (dvs. en isolert skum boks) til bestråling anlegget på et verktøy cart.
- Irradiate celler som beskrevet i trinn 4.
3. celle forberedelse for immunostaining etter bestråling
- Tin kommersielle ekstracellulære protein matrise på is ved 4 ° c over natten. Pre-chill 200 μL pipette tips og 1,5 mL sentrifugerør ved 4 ° c over natten.
- Alikvot ekstracellulære protein matrise med pre-kjølt pipette tips og 1,5 mL sentrifugerør ved 200 μL per rør.
- Fortynne 200 μL av ekstracellulære protein matrise inne pre-kjølt 20 mL av cellen kulturen Media å lage 1% ekstracellulære protein matrise Media.
- Sett en sterilisert dekkglass (22 mm x 22 mm) i en 35 mm plate. Plasser 400 μL av 1% ekstracellulære protein Matrix Media på dekkglass.
- Plasser 35 mm-platen i cellekultur inkubator ved 37 ° c i 1 time for å la ekstracellulære protein mat risen polymeres på dekkglass.
- Når du bruker suspensjon cellekultur, lage en enkelt celle suspensjon som beskrevet i trinn 1,1 til 1,5.
- Plate 5 x 104 celler på en ekstracellulære protein matrise-belagt dekkglass plassert i en 35 mm plate. Return belagt celler til cellen kultur inkubator over natten for å sikre at cellene er støttet av protein matrise. Det totale volumet av mediene i platen skal være 3 mL for å gjøre høyden av medier nå 1 cm i kultur fatet.
- Observer cellene under et skarpt felt mikroskop med 10x forstørrelse objektiv linse. Cellene skal spre seg ut på dekkglass i stedet for flytende. Overfør kultur parabolen med belagte celler inn i en sekundær beholder som en skum boks til bestråling anlegget på et verktøy Cart og irradiate cellene som beskrevet i trinn 4.
- Når du bruker vedlagte cellekulturer (for eksempel HEK-293-celler), kan du fordøye celler som beskrevet i trinn 2,1 til 2,6. Plasser 5 x 104 celler på en steril deksel slip i en 35 mm plate en dag før bestråling for å sikre at cellene er helt festet til den dekkglass overflaten ved å observere dem under et mikroskop som i trinn 3,9. Bruk 3 mL DMEM-medium for å gjøre væsken 1 cm i høyden i platen.
- Etter voksende celler på coverslips over natten eller opp til en dag, overføre kultur parabolen med belagte celler i en sekundær beholder til bestråling anlegget. En verktøys vogn kan brukes til å redusere risikoen for søl. Irradiate celler som beskrevet i trinn 4.
4. bestråling med en lineær akselerator (LINAC)
- Bruke LINAC ' s konsollprogram vare, sette akseleratoren Portal og parallelliseringsoptikk til 0 °, åpne X og Y kjever til en symmetrisk 20 X 20 cm2 Feltstørrelse og trekke tilbake multi-Leaf Collimators (MLCs) hvis tilstede.
Merk: LINACs kan ha et flatere filter gratis (FFF) modus, slik at svært høye dose rater. Som navnet antyder, er denne strålingen ikke uniform (flat), og den høye dose raten oppnås bare i midten av bjelken. I dette tilfellet brukes et 7 x 7 cm2 felt. - Plasser minst 5 cm vann ekvivalent materiale på behandlingen sofaen. Plasser cellen parabolen skal bestrålt på 400 MU/min (standard dose rate) på vann tilsvarende materiale og midt i den på LINAC trådkorset.
- Plasser cellene som skal bestrålt ved en dybde på maksimal dose i en 6 MV Røntgenstråle, rundt 1,5 cm. Plasser ytterligere 1 cm vann ekvivalent materiale på toppen av fatet. Kombinert med 1 cm av medium hele som cellene er suspendert, dette plasserer cellene på en gjennomsnittlig dybde på 1,5 cm.
- Fest den fremre pekeren til hodet på LINAC. Utvid den fremre pekeren til den kontakter overflaten av buildup materialet og Legg merke til avstanden. Juster bord høyden til avstanden fra kilden til buildup overflaten er 100 cm.
Merk: avstanden kan bekreftes med den optiske avstands indikatoren. Alternativt kan den optiske avstands indikatoren brukes i stedet for den fremre pekeren for å stille inn kilden til å bygge overflaten til 100 cm. - Beregn riktig antall Monitor enheter (MU) for å levere den ønskede dosen av stråling til cellene og programmere gasspedalen for å levere ved 400 MU/min.
Merk: for kilden til overflaten avstand (SSD) oppsett på en LINAC kalibrert til å levere 1 cGy/MU i dybden av maksimal dose, er det nødvendige antall overvåke enheter beregnet ved hjelp av MU = dose (cGy)/(1 cGy/MU)/av (20x20), hvor av står for utgang faktor. Denne beregningen må endres for LINACs ved hjelp av alternative kalibrerings oppsett. - Forlat behandlings hvelvet og kontroller at alle andre personer har gått ut. Vrify at det ikke er noen andre celler i rommet, eller de vil motta lave doser av stråling. Lukk hvelvdøren.
- Bekreft feltstørrelsen, MU og MU/min på konsollen og deretter aktivere strålen.
- Gjenta trinn 4.3-4.8 for at cellene skal bestrålt ved høyere eller lavere dose rater.
- For å oppnå høyere dose rater (f. eks, 2100 MU/min eller høyere) med gasspedalen, Reduser SSD for å øke den effektive dose raten til cellene i henhold til den inverse kvadrat loven: DoseRateEffective = doserings * (100 cm/SSD_New)2.
- For lave dose hastigheter (f. eks 20 MU/min), Øk kilden til overflaten avstand (SSD_New) for å redusere dosen rate. For eksempel kan cellen kultur parabolen plasseres på gulvet i behandlingsrommet.
- Omberegn innstillingen for skjerm enhet på akseleratoren Hvis dette oppsettet er nødvendig, ved hjelp av MU = dose (cGy)/(1 cGy/MU)/av (20x20)/(100 cm/SSD_New)2. For ytterligere informasjon om MU beregninger, se referanse ved McDermott og Orton18.
- Bestem dosehastighet i gy/minutt ved doserings (gy/min) = dose (gy) * (MU/min)/MU. f. eks 4 gy levert på 400 MU/min krever 380 MU, så 4 * 400/380 = 4,2 gy/min. Se tabell 1.
Figur 1 : Oppsett av cellekultur parabolen på lineær akselerator. (A) en klinisk lineær akselerator vises. (B) 5 cm vann ekvivalent materiale er plassert på behandlingen sofaen. (C) en cellekultur parabolen er plassert på overflaten av materialet. (D) parabolen er sentrert ved hjelp av akselerator trådkorset i behandlingen feltet vist av torget lysfeltet. (E) 1 cm vann ekvivalent materiale er plassert på toppen av cellen kultur parabolen. Kilden til overflate avstand (SSD) kontrolleres ved hjelp av en optisk avstandsindikator (F, G) eller en fremre peker (H, I). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. biologiske analyser etter bestråling
- Etter bestråling, returnere cellene til cellen kultur inkubator på samme måte som beskrevet ovenfor (trinn 1,9, 2,8 og 3,10).
- Etter behov skreddersyr du en rekke biologiske analyser som passer inn i forskningsprosjektet.
Merk: her viser vi en representativ celle syklus analyse16 som et eksempel på en biologisk analyse etter bestråling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å undersøke celle syklus effekten av standard dose rate og ekstra høy dose rate bestråling av en lineær akselerator, tre prøver av glioma Stem-lignende celler ble utarbeidet ved hjelp av denne protokollen og samlet 24 h etter bestråling17: en kontroll prøve som ikke var bestrålt (figur 2A), en prøve bestrålt med 400 MU/min (Monitor enhet, 4,2 gy/min standard dose rate, figur 2B) til 4 Gy, og en annen prøve bestrålt med 2100 MU/min (21,2 gy/min ekstra høy dose rate, Figur 2 C) til 4 gy. Celle syklus profiler vises med prosentandelene av celler i forskjellige faser av cellesyklusen.
Figur 2 : Eksempel på celle syklus analyse etter 4 gy bestråling av lineær akselerator. G2 celle syklus arrestasjon ble observert etter bestråling av glioma stamceller med enten en standard dose rate (400 MU/min) (B) eller en ekstra høy dose rate (2100 MU/min) (C) sammenlignet med ikke-bestrålt kontroll celler (a). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Doserings (MU/MIN) | SSD (CM) | Energi | Mu |
| 20 | 250 | 6X | 2380 * |
| 400 | 100 | 6X | 390 * |
| 2100 | 80 | 6FFF | 260 * |
Tabell 1: oppsett for dose rater som brukes i eksperimenter, forutsatt 4 gy dose. MU kan skaleres lineært for andre nødvendige doser. * Dette er eksempel MU for LINAC vi brukte. MU skal beregnes for brukerens spesifikke LINAC ved hjelp av ligningen ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strålebehandling er en integrert del av kreft styring. Pågående arbeidet søker å forbedre effekten og effektiviteten av strålebehandling. Fremskritt innen lineær akselerator teknologi har gitt muligheten til å behandle pasienter med uovertruffen nøyaktighet og sikkerhet. Siden de fleste pasientene behandles med røntgenstråler med høy energi fra lineære akseleratorer, kan studier som undersøker de biologiske virkningene av et stort utvalg av dose rater som utføres på lineære akseleratorer, være lett å bruke på pasientene. Det har vært flere rapporter som gjelder lineære akseleratorer til stråling biologi forskning, men resultatene er blandet og ytterligere studierer nødvendig13,14,15,16,19.
Lineære akseleratorer er relativt trygge i den forstand at etter at foreskrevet dose er levert vil det ikke være røntgenstråler produsert. Dette er i motsetning til radioisotopes hvor stråling er stadig slippes ut. Videre bruk av lineære akseleratorer for å levere stråling tillater bruk av sofistikerte bjelke ordninger for å kontrollere formen på målet volum med et stort utvalg av doser og dose priser. Ulempen med denne metoden er at tilgjengeligheten av den lineære gasspedalen kan være begrenset på grunn av pasient bruk og derfor krever avansert planlegging med klinikere og medisinske fysikere.
I vår protokoll beskriver vi den grunnleggende prosedyren for bestråling av celler. Denne metoden kan skreddersys for å møte andre forskningsbehov. Det kan for eksempel kombineres med behandlingsapparatet for å undersøke effekten av kombinert kjemoterapi og strålebehandling. Når du bruker denne metoden til en bestemt cellelinje eller analysen etter stråling, bør noen modifikasjoner forventes. For eksempel, for å undersøke tidlige endringer i biomarkører etter bestråling, kan celler samles kort tid etter bestråling.
Fordi den leverte dosen er avhengig av stråle energien og innskudds dosen varierer som en funksjon av dybde av penetrasjon, er mengden av media og vann-ekvivalent bolus som trengs for å oppnå ønsket dose kritisk. I metoden beskrevet ovenfor, bruker vi 6 MV fotoner i én fremre bakre bjelke og sikre at cellen Media er på 1 cm i høyden i kultur parabolen. Vi bruker en ekstra 1 cm av vann-ekvivalent materiale på toppen av cellen kultur parabolen å bygge opp dosen til cellene. For å oppnå svært høye dose rater, hever vi sofaen der cellene er plassert. Fordi feltstørrelsen blir mindre når sofaen heves, bruker vi en 35 mm kultur rett og sørger for at hele fatet er innenfor bestråling feltet, som avgrenset av lysfeltet. For å oppnå lave dose priser, senker vi behandlingen sofaen eller plassere cellekultur parabolen på gulvet i rommet for å øke kilden til overflaten avstand. Design av behandlings felt for dyr, som er mer kompleks, er utenfor omfanget av denne artikkelen. Teknikkene som beskrives her, vil hjelpe forskere med å forstå hvordan man bruker en lineær akselerator for biologiske analyser med cellelinjer dyrket i suspensjon eller knyttet til retter. Tett samarbeid mellom biologer, klinikere og medisinske fysikere vil sikre vellykket gjennomføring av stråling studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Cleveland Clinic Department of stråling onkologi for bruk av den lineære akseleratorer. Vi takker Dr. Jeremy Rich for sin sjenerøse gave glioma stilk-lignende celler. Denne forskningen ble støttet av Cleveland Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| glioma stem-like cell 387 | gift from Dr. Jeremy Rich | ||
| 293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| neuron stem cell culture media | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | NeurobasalTM media |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 4114-TC-01M | |
| B-27™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030164 | |
| Tripsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | |
| extracellular proten matrix | Corning | 354277 | MatrigelTM |
| Ethanol | Fisher chemical | A4094 | |
| Equipment | |||
| 10 cm cell culture dish | Denville | T1110 | |
| 3.5 cm cell culture dish | USA Scientific Inc. | CC7682-3340 | |
| 22x22mm glass cover slip | electron microscopy sciences | 72210-10 | |
| 15 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1159M36 | |
| 50 ml centrifuge tube | Thomas Scientific | 1158R10 | |
| 5 ml Pipette | Fisher Scientific | 14-955-233 | |
| pipet aid | Fisher Scientific | 13-681-06 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Linear Accelerator | Varian | n/a | |
| water equivalent material | Sun Nuclear corporation | 557 | Solid waterTM |
| Reagent preparation | |||
| DMEM media | 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml DMEM media | ||
| stem cell culture media | 10 ml B27 supplement, 20 µg hFGF, 20 µg hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin in 500 ml Neurobasal media |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).
- Tao, R., et al. Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).
- Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).
- Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P.
- Hall, E. J. Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy. The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).
- Steel, G. G., et al. The dose-rate effect in human tumour cells. Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).
- Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux. Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).
- Castro, G., et al. Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).
- Gaddini, L., et al. Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses. Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).
- Simara, P., et al. DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73 (2017).
- Wang, Z., et al. A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 10 (8), 0133728 (2015).
- Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).
- Karan, T., et al. Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams. Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).
- Sarojini, S., et al. A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes. Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).
- Hao, J., et al. The effects of extra high on glioma stem-like cells. PLoS One. 13 (8), 0202533 (2018).
- Liu, J., et al. Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells. International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).
- Mcdermott, P., et al. The Physics and Technology of Radiation Therapy. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).
- Lohse, I., et al. Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival. Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).
