Summary
כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.
Abstract
חיידקים צורה מורכבת מיקרו-המוני microbiomes מעוצב על ידי חיידקים אינטראקציה, אורגניזמים גדולים יותר, הסביבה אביוטיים. בתנאי מעבדה, מושבת ריזוספירה באמצעות גידול בקטריה לקידום חיידקים (PGPB) יכול להגביר את הבריאות או פיתוח של צמחים מארחים ביחס לצמחים uncolonized. עם זאת, בהגדרות שדה, טיפולים חיידקיים עם PGPB לעתים קרובות לא מספקים יתרונות משמעותיים יבולים. הסבר אחד הוא כי זה עשוי להיות עקב אובדן של PGPB במהלך האינטראקציות עם חיידקים בקרקע אנדוגניים על תוחלת החיים של הצמח. אפשרות זו הייתה קשה לאישור, מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בקולוניזציה הראשונית ולא בתחזוקת PGPB בתוך קהילות הריון. היפותזה כאן היא כי האסיפה, דו-קיום, ותחזוקה של קהילות חיידקי מעוצבים על ידי תכונות דטרמיניסטיות של הסביבה מיקרוזוספירה, וכי אינטראקציות אלה עלולות להשפיע על הישרדות PGPB בהגדרות מקוריות. כדי ללמוד התנהגויות אלה, הידרופוני צמח-צמיחה ממוטבת באמצעות Arabidopsis thaliana לכמת ולהמחיש את ההתפלגות המרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברת צמיחה שונים סביבות. מערכת זו של המערכת ואת כלי השירות מאומתים אז עם היטב-למד PGPB פסאודומונס simiae. כדי לחקור כיצד נוכחות של מינים חיידקיים מרובים עשויים להשפיע על הקולוניזציה והדינמיקה תחזוקה על שורש הצמח, קהילה מודל משלושה זנים חיידקיים ( Arthrobacter, curtobacterium, ו microbacterium מינים) מבודדים במקור מתוך מבנה הבית . זה מראה כי הנוכחות של מינים אלה חיידקים מגוונים ניתן למדוד באמצעות זה ידרופוני צמח-maintanence שיטת, אשר מספק אלטרנטיבה מבוססי רצף לימודי הקהילה החיידקית. מחקרים עתידיים באמצעות מערכת זו עשויים לשפר את ההבנה של התנהגות חיידקית של microbiomes צמח רב מינים לאורך זמן, בתנאים סביבתיים שינוי.
Introduction
הרס יבול על ידי מחלות חיידקי ופטרייתי תוצאות הוריד מזון והוא יכול לשבש באופן חמור את היציבות הגלובלית1. מבוסס על גילוי כי חיידקים בקרקעות מדכאים אחראים על הגדלת בריאות הצמח2, מדענים שאלו אם מיקרובידום הצמח יכול להיות ממונף כדי לתמוך בצמיחה הצמח על ידי שינוי הנוכחות והשפע של מסוים מין חיידקי3. חיידקים שנמצאו כדי לסייע בצמיחה הצמח או פיתוח הם באופן קולקטיבי הצומח צמיחה-קידום חיידקים (PGPB). לאחרונה, מחקרים השתנו פשוט לזיהוי PGPB פוטנציאלי כדי להבין כיצד אינטראקציה בין הממלכה בקרקע, סביב שורשים, או בתוך הריון (האזור שמסביב ישירות וכולל משטח השורש) עשוי להשפיע PGPB פעילות4.
הקולוניזציה של ריזוספירה על ידי PGPB יכול להגביר את הבריאות או התפתחות של צמחים מארחים בתגובה לשעולים מגוונים ביחס הצמחים לבטל הכובש5. עם זאת, התוצאות הן לעתים קרובות יותר משתנה בתנאי הקרקע הילידים לעומת אלה שנצפו בחממה מבוקרת היטב הגדרות מעבדה6. השערה אחת להבדל זה היא כי הצמיחה או התנהגות של pgpb יכול להיות מעוכבים על ידי חיידקים הקרקע הילידים או פטריות בשדות7,8. השפעות מועילות על ידי חיידקים ריזוספירה תלויים בדרך כלל על היכולת של חיידקים 1) לאתר ולנוע לעבר השורש, 2) ליישב את השורש באמצעות היווצרות ביוilm, ו 3) אינטראקציה עם הצמח המארח או פתוגנים באמצעות ייצור של מולקולה קטנה מטבוליטים7,9. כל אחד מאותם התנהגויות מושבת עשוי להיות מושפע על ידי נוכחות ופעילות של חיידקים שכנים10.
עיצבנו מערכת לכמת ולהמחיש את שלבי הקולוניזציה החיידקית הנפרדים של הריזוספירה (איור 1). גישה זו תסייע למחקרים לחקור מדוע תחזוקה לטווח ארוך PGPB הוא לפעמים לא נצפתה לאחר העברת צמחים לסביבות חדשות, כגון במהלך השתילה של שתילים מחוסנת מראש. Arabidopsis thaliana כפי שנבחרו כמודל צמח בשל השימוש הנרחב שלה לימודי מעבדה, כמו גם נתונים מספיק זמין על אינטראקציות מיקרוביאלית שלה11. ישנם שלושה שלבים במערכת: 1 . thaliana צמיחה, 2) מושבת חיידקים, ו 3) שמירה חיידקית (ראה איור 1). מכיוון ש -thaliana היא צמח יבשתי, היה חשוב להבטיח כי זה לא סבל לחץ מים מופרז במערכת ידרופוני12. בהשראת השיטות בשימוש על ידי Haney et al.13, השתילים גדלים על רשת פלסטיק כדי להפריד את לירות מתוך מדיום הצמיחה נוזל. מערכת זו אינה מהווה פגיעה בבריאות ובפיתוח של מארח הצמח, והיא משפרת את צמיחת ה -thaliana בנוזל משנת11. כמו הצמח לירות צף מעל פני השטח, השורשים חשופים לחלוטין הקולוניזציה על ידי חיידקים מחוסן לתוך בינוני נוזלי הצמיחה חיידקי. זה מתיר חיידקים של עניין להיבדק עבור מושבת חומרים מזינים כי הם התורמת ביותר לצמיחה, בעוד אז הסטה תנאים כדי לאפשר לצמח להמשיך לצמוח במדיום מזינים שנועד לתמוך בצמיחה שלה. שני השלבים כוללים טלטול קבוע כדי למנוע אנאוקאיה של שורש13. חיידקים יכולים להיות מדמיינו או כימות מן השורשים הצמח לאחר העברת מתוך מדיום או מדיום תחזוקה. מערכת ידרופוני זו היא גמישה מאוד, המאפשר תנאים ניסיוניים ומלחצים שהוחלו להשתנות בקלות בהתאם לאינטרסים של החוקרים.
שיטה זו מתוארת חשובה בהקשר של גוף הספרות הגדול יותר על אינטראקציות של חיידק הצמח, משום שהיא מספקת מערכת חזקה לחקר אינטראקציות אלה במשטח השורש, בעוד שניתן להתאמה אישית להעדפות הצמיחה של חיידקים שונים. מעבדות ביולוגיה של הצמח לעתים קרובות ביצוע ניסויים מושבת חיידק המפעל על מוצק אגר, המאפשר תנועה מישורי בלבד (אם זה) של חיידקים תוך דרישה גם מניפולציה הרסנית פוטנציאלי של צמחים במהלך ההעברה הבאה. לעומת זאת, מעבדות מיקרוביולוגיה מעדיפות לעתים קרובות את בריאותם של החיידקים בתוך הניסויים שלהם, לרעת הצמחים14,15. סדרי עדיפויות שונים אלה של מעבדות צמחים ומיקרוביולוגיה ממוקדת היסטורית הפכו את זה קשה להשוות את התוצאות בין קבוצות אלה, מאז כל אחד בדרך כלל מייעל את התנאים הניסיוניים כדי לייעל את האורגניזם שלהם עניין15. מערכת צף-שינוי-צמח-הצמיחה המתואר כאן מונע שרידה צמח מלא, יתרון בולט למחקרים קודמים מונחה מיקרוביולוגיה, תוך שזמנית גם אופטימיזציה של הצמיחה והישרדות של חיידקים כדי להקל על הקולוניזציה. לפיכך, שיטת הטיפול שאנו מציגים כאן עשויה להתייחס לחששות משני הביולוגים של הצמח (על שחות יתר ומניפולציה מישוש של הצמח) תוך סיפוק הקריטריונים של מיקרוביולוגים (המאפשרים התפתחות שונה של הגידול בקטריאלי ומספר אינטראקציות של מינים)7. פרוטוקול זה נועד להיות ישימה לשימוש עם חיידקים שונים, צמחים, ותנאים סביבתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הכיוונון הנסיוני מתואר בבהירות ומשמש להפקת תוצאות הנציג הכלולות בדו ח זה, אך ניתן לשנות את התנאים כרצונך. כל השלבים יש לבצע באמצעות PPE ובעקבות מוסדיים והפדרלי מומלצים עבור בטיחות, על פי מצב BSL של החיידקים בשימוש.
1. אפיון חיידקים
- לקבוע את המבנה של חיידקים על בינונית הצמיחה צלחת אגר. להשעות את התאים בקירוב OD600 = 0.5 וצלחת 1 μl נפח על בינונית אגר של בחירה. הוסף X-גל לוחות אגר לריכוז הסופי של 20 מ"ג/mL כדי להבדיל טוב יותר חברים בודדים של הקהילה חיידקים ספציפיים. לגדול 24 ° צ' או 30 ° צ' עד לטופס המושבות, ואז לצלם תמונות של והערות על מורפולוגיה המושבה.
- הגדר את הקורלציה בין צפיפות אופטית של כל זן חיידקי ומספר CFU (המושבה היוצרים יחידות) לכל mL16. להשעות חיידקים ב 1 מ ל של מים בצלחת 24-הבאר כדי OD600 = 5, ביצוע מדלל סדרתי שני קיפול, הצג OD600 של כל הדילול, וצלחת כל לקבוע את Cfu קיימא/mL בכל מדגם בצפיפויות אופטיות מרובות.
- קבע את העמידות הsonication המירבית עבור כל זן חיידקי. כדי לעשות זאת, תאים סדרת מחלקים לתוך צלחת 24 המכיל בינוני נוזלי, להזמין כמה תאים כמדגם בקרת unsonicated. באמצעות ultrasonicator עם מצורף 24-tip הקרן, להחיל שלושה סיבובים של 12 s של sonication ב 40 amp עם 2 פעימות.
הערה: השימוש של ultrasonicator 24 והוא מומלץ להקל על ריבוב הזרם של דגימות הצמח עיבוד, אבל אם אחד אינו זמין, להשתמש ultrasonicator מצויד מיקרוטיפ ולבצע כל דוגמה sonication באופן עצמאי. ללבוש תמיד אטמי אוזניים מדורגים לפחות 25 nrr הגנה. - לבצע מדלל סדרתי 10 מקפלים של sonicated ו unsonicated דגימות וספוט על צלחות אגר. קבע אם יש הפחתה בתאים קיימא לאחר sonication. אם כן, השתמש במדגם טרי וחזור על צעד sonication באמצעות סכום מופחת sonication זמן או משרעת עד לטיפול אין השפעה על CFU/mL הסופי17.
2. הכנת שתילים מערידרופזיס על רשת פלסטיק
- יצירת דיסקים של רשת פלסטיק באמצעות האגרופן חור רגיל.
- לאסוף את הדיסקים במיכל זכוכית עם כיסוי רופף של רדיד אלומיניום, ולעקר באמצעות החיטוי להגדיר 20 דקות יבש מחזור13.
- באמצעות להבה, מלקחיים מעוקר, להפיץ כ 40 בדיסק רשת שינוי מעוקר בשכבה אחת על פני השטח של הצמח-צמיחה-בינונית הצלחת אגר. השתמש 0.5 x מורראשיג ו Skoog (MS) מלחים, המכיל 500 mg/L של מאגר MES [2-(N-גוורנולינו) ו 1.5% Bacto אגר, כמו גידול בינוני הצמח, עם 50 μg/mL benomyl להגביל זיהום פטרייתי של השתילים.
- הכינו זרעי אקאנמית של א. thaliana כפי שתוארה בעבר17.
- מניחים כ-100 – 300 זרעים כל אחד לצינורות צנטריפוגה בודדים בארון תקשורת ומקום לתוך זכוכית מחדש או מיכל פלסטיק כבד ("צנצנת") בתוך מכסה.
- באמצעות זהירות, במקום גביע של 100 mL של אקונומיקה לתוך הצנצנת, להוסיף 3 מ ל HCl מרוכז ל אקונומיקה, ומיד לאטום את הצנצנת ולאפשר אדים לעקר זרעים לפחות 4 h.
- בזהירות להסיר את הצינורות של זרעים מעוקר מתחת לצנצנת ולאטום.
- מניחים שני זרעים במרכז כל רשת. חותם לוחיות עם סרט כירורגי ו מודלת עבור 2 – 6 ימים ב 4 ° צ' בחשיכה כדי להעניש זרעים.
- כדי לנבוט ולצמוח שתילים, למקם את הצלחת אגר בצד למטה בחדר הצמיחה צמח עבור 8 – 10 ימים תחת הגדרות יום קצר: 9 h של אור ב 21 ° צ' ו 15 h של כהה ב 18 ° צ' (איור 1, שלב 2).
3. מושבת צמחים בינונית-גידול בקטריאלי נוזלי
- הוסף 1 מ ל של בינוני גדילה בקטריאלי לכל באר של צלחת 24-באר סטרילי, למעט מדיה בלבד בקרת בארות. השתמש במרק לוריא (10 גרם של טריטונים, 5 גר' תמצית שמרים, 5 גרם של הנאל) כמדיום הגדילה החיידקי.
- להעביר את השתילים מונבטים מוטבע רשת שינוי מלוחות אגר לנוזל (איור 1, שלב 3a).
- בעדינות לקלף את רשת השינוי המכילה שני שתילים מונבטים למעלה ולמטה את הצלחת אגר באמצעות מלקחיים להבה מעוקר. לבחור רשת עם שתילים בגודל שווה ולא ניזוק.
- אם ההסרה של אגר אינו חלק, למחוק את הרשת ואת הצמח. העבר מצוף אחד לכל באר של נוזלי גדילה בקטריאלי, בצד השורש למטה.
- מחסן חיידקים לבארות המכילים שתילים צפים.
- להשעות את החיידקים מחדש לילה על לוחות אגר כדי OD600 שווה ערך ל 108 cfu/mL בנוזל בינוני הצמיחה חיידקי. הוסף 10 μL של השעיה בקטריאלי לכל טוב עבור ריכוז סופי של 106 בקטריה cfu לכל טוב.
- אם הכנת שילוב של חיידקים, מחדש כל אחד ל-OD600 שווה ל 108 cfu/mL, לערבב בפרופורציות שווה, ולהוסיף 10 μl של המיקס הסופי לכל טוב של נוזל.
- לאטום את הצלחת לצמיחה סטרילית. מבלי לגעת בצד הדביק, לחץ בזהירות על הסרט חדירות הגז על פני הצלחת. ודא כי כל באר נאטם באופן אינדיבידואלי על ידי הפעלת לחץ סביב כל אחת מטבעות שנעשו על ידי הבארות. החלף את מכסה הפלסטיק של הצלחת על הצלחת ועל הסרט חדירות גז (איור 1, שלב 3b).
- מודקת לוחיות עבור 18 h בחדר הגידול צמח, תחת אותם תנאים כמו השתילים היו מונבטים במקור, למעט על שייקר צלחת מסלולית להגדיר 220 rpm.
4. תחזוקת מושבת חיידקים
- כדי לשטוף את כל צף (צמחים על רשת שינוי), להוסיף 1 מ ל של מים סטריליים לבארות של צלחת 24-באר חדש. הסרת סרט חדיר גז. באמצעות מלקחיים סטריליים, העברת צף בארות עם מים (איור 1, שלב 4a). לשטוף על ידי מנוחה 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא עצבנות.
הערה: כדי לקבוע את יעילות הקולוניזציה החיידקית של שורשים ולא את יכולתם לשמור על המושבות לאורך זמן, הצמחים יכולים להיות מוקרבים בשלב זה על ידי לקיחת אותם ישירות לשלב 5.1. - למלא את הבארות של צלחת חדשה 24-באר עם 1 מ ל של גידול בינוני הצמח. העבר שינוי אחד לכל באר. מכסה עם חותם חדיר גז, הדגירה של 72 h על שייקר צלחת המסלול ב 220 rpm בחדר הצמיחה צמח (איור 1, שלב 4b).
- חזור על השטיפה כפי שבוצעה בשלב 4.1 עם צף לאחר תקופת הדגירה 72 h.
5. אוסף של חיידקים עבור ספירות תאים קיימא
הערה: מספר החיידקים לכל שורש שתיל יכול להיקבע בכל נקודת זמן דגירה. ניתן לנטר את הקולוניזציה בין 0 h ל-18 שעות, בעוד שניתן לנטר את התחזוקה מ -18 ואילך. הצמחים המיועדים לדימות יכולים להמשיך ישירות לסעיף 6.
- הסר את השתילים מרשת השינוי (איור 1, שלב 5). מניחים בעדינות מלקחיים מעוקר להבה מתחת לעלים (אבל בצד העלה של הרשת), ולצבוט בקלות את הגבעול. להזיז את השתילים מעלה והרחק מרשת לעקור את השורש מבלי לשבור אותו. אם השורש נשבר, בעדינות לגרד את החלק התחתון של הרשת כדי לאסוף את האורך המלא.
- להסיר חיידקים משורשים הצמח. להעביר את החיידקים כדי בארות של צלחת 24-היטב המכילים 1 מ ל של ddH20. Sonicate את הדגימות כמתואר בשלב 1.3.
הערה: בעזרת מיקרוסקופ, חפשו את כל החיידקים הנותרים על משטח השורש במדגם sonicated. אם החיידק נשאר, להגדיל את הזמן הsonication הכולל או האינטנסיביות עד החיידקים לא להישאר מאוגדים, עד לרמה הגבוהה ביותר של sonication שאינו משפיע על ספירות תאים קיימא כפי שנקבע בסעיף 1. - לכמת את החיידקים על שורשים.
- בצע דילול 10-קיפול סדרתי של דגימות sonicated עד 10-6 דילול במדיום גידול חיידקי. הוסף 50 μL של כל דילול לצלחות אגר בודדים להתפשט עם חרוזי זכוכית סטרילית (או spreader חיידקי). הצלחות דגירה בטמפרטורה אופטימלית עבור חיידקים עד מושבות הפרט הם countable.
- לאחר להבדיל, לספור את מספר כל מורפולוגיה המושבה (כפי שנקבע בסעיף 1), ולחשב CFU של כל זן חיידקי לכל שתיל. להיפטר כל הדגימות מראה זיהום, כמו זיהום במהלך הקולוניזציה או תחזוקה עלול להשפיע על נוכחות חיידקית.
6. אוסף שורשי צמחים שלמים למיקרוסקופיה
- באמצעות מלקחיים, להסיר את השתילים מרשת כמו בסעיף 5.
- העבר כל צמח לשקופיות מיקרוסקופ.
- הצב את קצה השורש בשקופית וגרור הרחק מהקצה כדי להגדיר את הריקון למטה עם השקופית ולהבטיח שורש מיושר עבור הדמיה מיטבית. הוסף טיפת מים או בינונית הצמיחה סטרילי הצמח לדגימות כדי הממשקים מימה בין הכיסויים שקופיות.
- מניחים שמיכות זכוכית בדיוק מעל הכתר השורש (האזור העליון באיור 1) ומתחת העלים לירות כדי למנוע את הנטייה של שמיכות (כדי לאפשר הדמיית השורש), ולחץ למטה בעדינות17.
- אם השימוש בחיידקים פלורסנט, התמונה באמצעות מסנני עירור/פליטה מתאימים כדי להבדיל חיידקים זה מזה ואת שורש הצמח18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PGPB מאופיין ב P. simiae WCS417r ידוע ליישב את שורשיו של א. thaliana בתרבות ידרופוני. זה חיידק פלורסנט באופן טבעי יכול בקלות להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ על שורשי שתילים לאחר הקולוניזציה (איור 2). למרות שניתן לדמות את האורך המלא של אלה שתילים. thaliana (4 – 6 מילימטר אורך) שורשים, עושה זאת עבור צמחים רבים לקחת כמות זמן מאוסרני. מכיוון שרוב הווריאציות על פני נקודות זמן ומינים של חיידקים יכולים להילכד על ידי הדמיה של הכתר, האמצע, ואת קצה של שורש14 (המצוין על ידי תיבות אדומות באיור 1), אזורים אלה היו עדיפות להדמיה ולא הדמיה שורש מלא אורכים. בתמונות השדה הבהיר של P. simiae- הכובש שורש thaliana (איור 2), ניתן לדמיין את קווי המתאר של השורשים ושערות השורש; עם זאת, ב-18 מושבת המושבות, לא ניתן להבדיל בבירור בין הכובש לבין השורשים הבלתי-מאשרשים באמצעות תמונות של שדות בהירים. בעוד P. simiae מציג את הניאון האוטומטית, השתמשנו זן גם מהונדס לבטא חלבון פלורסנט צהוב (yfp)19 עם עירור/פליטת גל של 490-510/520-550 ננומטר18. הגדלה של 100x היה מספיק כדי לזהות בבהירות אגרגטים יחידים וקטנים של תאים P. simiae על שורש. thaliana . כפי שמוצג באיור 2, מעבדות עם גישה או ברזולוציה גבוהה קונפוקלית מיקרוסקופ או פחות יקר שחקן הספסל יכול לדמיין את נוכחות והפצה של חיידקים לאורך השורש.
בעוד אינפורמטיבי במונחים של הפצה מרחבית, תמונות מיקרוסקופית לא מתאים היטב לכמת של תאים חיידקיים. כך אספנו חיידקים מפני השטח של שורשים באמצעות ultrasonication כפי שתוארה בעבר ואומת9,20. שלושה סיבובים של 12 s ultrasonication21 ב משרעת של 40 היו מספיקים כדי לשבש את המשטח החיצוני של שתילי השורש (משלים איור 1) ולהסיר את כל החיידקים בעוד לא להשפיע על הכדאיות החיידקית. Sonication שימש במקום שיטות מכות חרוז9 כדי לקדם את הפיזור של אגרגטים חיידקיים/ביוילאמים. כימות CFU/השורש לאחר 18 h של הקולוניזציה ו 72 h נוספים של תחזוקה הראה כי P. simiae הן הקולוניאלים ומתוחזק על שורשיו של A. thaliana ידרופוני שלנו, שתיל צף מערכת (איור 3). מספר ה-CFU/שתיל בכל אחת מנקודות הזמן הראה מחדש את האפשרות באמצעות שכפול ביולוגי שבוצע בימים שונים (איור 3). הווריאציה נצפתה נפוצה בקרב מושבת השורש מאמר22 והוא צפוי בשל וריאציות מינורי של עיתוי, תנאי הסביבה, או גודל השורש צמח, גם בין השתילים מונבטים באותו זמן ונבחר להיות דומה בגודל. אנו צופים עלייה במספר של CFU/שתיל לאחר 72 h במדיום תחזוקה לעומת המספרים שנצפו בפוסט-מושבת 18 h timepoint (איור 3). זה מצביע על צמיחה פעילה של החיידק הכובש על שורש הצמח התרחשה בשלב התחזוקה.
בנוסף לכלי השירות של הידרופוני הזאת כדי לכמת מושבת חיידקים בודדים ותחזוקה, זה גם ישים לניטור האגודה של מינים מרובים על שורשי הצמח. כדי להדגים זאת, שלושה מינים של חיידקים מבודדים מ -thaliana גדל באדמה טבעית תחת תנאי מעבדה נבחרו20. הבודדת היו זנים של ניקולט Arthrobacter, Microbacterium oלייבוראנים, ו curtobacterium oceanosedimentum23. קהילה פשוטה זו נבחרה בשל יכולתם של מינים אלה להתקיים בתוך מדיה הצמיחה בקטריאלי נוזלי בתרבות רועדת (נתונים שלא פורסמו). בנוסף, ניתן לבדיל בין שלושת המינים האלה בתקשורת המכילה את X-גל בשל הבדלים במבנה המושבה ובצבע (איור 4A). ה-X-gal אינו משפיע על הצמיחה היחסית של כל אחד מזני החיידקים האלה (נתונים שלא פורסמו). הבדלים אלה במבנה מורפולוגיה ובמושבה על X-גל אפשרו לנו לספור את ה-CFU/שתיל של כל מיני מינים ללא בחירה אנטיביוטית, אפילו בתרבות מרובת המינים.
א. ניקולט, מ. אולטוראנים, ו -C. oceanosedimentum היו כולם הקולוניה והחזיקו בשורש, בין אם בלבד או בתרבות הקובית החיידקית (איור 4b). כל מין הראה מגמות דומות בתוך משכפל ביולוגי וטכני שונים, אפילו בקהילות מעורבות. הדבר ממחיש כי ניתן להשתמש בפרוטוקול השימוש כדי למדוד הן את ה-CFU/השורש היחסיים או הכולל של כל מין. מעניין, כאשר גדל לבד, אף מין בודד לא הראה עלייה ניכרת בשפע במהלך הטיפול, אבל הכולל CFU/שורש של הקהילה המשולבת גדל בתרבויות cocultures, המציינת כי חיידקים אלה אינם אוסרים על קולוניזציה של הזנים האחרים.
עבור כל הניסויים, צמחים הגדלים במדיה נוזלית ללא תוספת של חיידקים כמו פקדים שליליים נכללו תמיד. החיידק לא היה גלוי על שורשי שליטה אלה במהלך מיקרוסקופ (איור 2), ולא היו חיידקים שזוהו באמצעות ציפוי עבור cfu (נתונים שלא פורסמו). הדבר מצביע על כך שעיקור של זרעים ושימוש בטכניקות הסטריליות במהלך השיטה הזאת היו מספיקים כדי לשמור על הצמח האקוריק אלא אם כן הייתה הקולוניה.
איור 1: שיטת הקולוניזציה והתחזוקה החיידקית של השורשים. A. thaliana שתילים גדל על רשת פלסטיק מעוקר הועברו בינונית צמיחה אופטימיזציה עבור חיידקים [כאן, 0.1 x LB (לוריא ציר) לנוקס]. חיידקים אז הכובש את שורש מעל 18 h בעוד הצמח צף בטלטול נוזל. בעקבות שטיפה, מצוף הכובש הועבר למדיום צמיחה אופטימיזציה עבור צמחים (0.5 x MS + MES) עבור 72 h כדי לבדוק תחזוקה של חיידקים על השורשים. לאחר מכן שטף הצוף, והמפעל עם כל החיידקים המחוברים הוסר לניתוח (כימות של CFU/שתיל או דימות בעזרת מיקרוסקופ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המחשה של מושבת שורשים עם מיקרוסקופ פלורסנט. P. simiae (שווא בצבע ירוק) הכובש שורש thaliana ונשמר על השורש לאחר העברת צמח-צמיחה בינונית. כתר שורש (משמאל), אורך אמצע (מרכז) וקצה (מימין) בהגדלה של 40x מוצגים מאזורים המצוינים באיור 1. שתי השורות המובילות להראות את השדה בהיר ותמונות פלורסנט של שורשים הכובש על ידי P. simiae (התמונה על ידי המיקרוסצנט מיקרוסקופ). אותם שורשים התמונה גם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (מרכז שתי שורות). השליטה השלילית של החיידק בשתי השורות התחתונות לא הראתה מושבת. סרגלי קנה מידה מייצגים 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קוונפיקציה של P. simiae על א. thaliana שורש . המספר הכולל של התאים הקיימא P. simiae התאושש לכל A. thaliana שתיל הבאים 18 h של הקולוניזציה או 72 h של תחזוקה. שלושה משכפל ביולוגי בודדים מוצגים, כל אחד מהם מכיל שלושה משכפל טכני של שני שתילים לכל ציפה. המספרים המוצגים הם האמצעי מהשכפל הטכני, בעוד שמייצגי הפעילויות מייצגים שגיאות סטנדרטיות של האמצעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קוונפיקציה של הקולוניזציה והתחזוקה של קהילה חיידקית מעורבת על שורש thaliana . (א) מושבות של " ניקולט", מ. אולטוראנים ו -C. Oceanosedimentum ניתן לבדיל על X-גל המכיל אגר בינוני על ידי מורפולוגיה וצבע המושבה. (ב) שורשים של 10 שתילים בן יום חוסנו עם כ 3x105 cfu/mL של כל אחד משלושת הזנים. המוצג הם סך CFU/שתיל ששוחזרו של כל מין אחרי 18 h של הקולוניזציה או 72 h של תחזוקה כאשר הכובש לבדו או בקהילה חיידקים שלושה חברים. שתי משכפל ביולוגי, המורכב משני משכפל טכני של שני שתילים לכל ציפה, מוצגים. המספרים המוצגים הם האמצעי משתי המשכפלת הטכניות, בעוד שמייצגי הפעילויות מייצגים שגיאות סטנדרטיות של האמצעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 1: Ultrasonication משבש את משטח השורש. כדי להוציא חיידקים מפני השטח של השורש, צמחים שלמים היו sonicated, ואת החיידקים שוחרר לתוך הנוזל, אשר היה מדולל באופן סדרתי ומצופה כימות של CFU/שתיל. (א) שתיל שאינו שלם הוא (ב) שיבש מבנית בעקבות ultrasonication. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צמחים בכל הסביבות אינטראקציה עם אלפים למיליוני חיידקים שונים ופטריות5,7. אינטראקציות אלה יכולות להשפיע בצורה שלילית וחיובית על בריאות הצמח, עם השפעות פוטנציאליות על תפוקת יבול וייצור מזון. העבודה האחרונה מרמזת גם כי התיישבות משתנה של יבולים על ידי PGPBs עשוי להסביר את גודל הצמח בלתי צפוי ויבול בניסויים בשדה22. הבנת המנגנונים שמאחורי אינטראקציות אלה עשויה לאפשר לנו לטפל באופן ישיר בקהילות מיקרוביאלית הקשורות לצמחים כדי לסייע בפיתוח צמחים בריאים, אפילו תחת לחץ24.
מכיוון שהקולוניזציה החיידקית של השורשים והתחזוקה שלהם בתוך הגוף הוא קריטי עבור אינטראקציות הצמח-חיידק9, רצינו לבנות מערכת להמחיש באצילות לכמת את התנהגויות אלה חיידקי. זה ידרופוני, צף שתיל מערכת הצמיחה מאפשרת דימות מיקרוסקופיים וכימות של אוכלוסיות חיידקיים על שורשי A. thaliana.
שיטת האינטראקציה המתוארת בחיידק הצמחים משלבת אלמנטים מועילים של פרוטוקולים ניסיוניים קיימים. שיטת רשת צף התבססה על זה מ Haney et al.13, אשר נמדד התיישבות הראשונית של P. simiae WCS417r על סטטי, צף שתילים thaliana . בהערכת מערכת זו, התיישבות חזקה של A. thaliana השורשים על ידי P. simiae היה מאומת, למרות בינונית צמיחה שונה מן haney et al. היה מנוצל וכללה טלטול במהלך המושבות. הכללת לרעוד מסלולית במהלך הקולוניזציה הן ותחזוקה מקלה על אינטראקציות חיידקים שעשויים לא להתרחש בתרבות סטטי, כמו גם להפחית את התנאים אנוקסי שיכולים לעכב הן גידול חיידקי ושורש בריאות הצמח13. כמו כן, אנו משולבים היבטים של מיקרוביולוגיה ממוקדת פרוטוקולים שנועדו לתמוך מושבת שורש הצמח על ידי זנים חיידקיים שונים8,15,25. זה כולל צעד העברה מכרעת מתוך המדיום אופטימיזציה עבור הקולוניזציה חיידקים לתוך בינוני אופטימיזציה לצמיחה הצמח. זו העברה למדיום טרי גם יאפשר את המנגנונים הבסיסיים תחזוקה בקטריאלי על שורשים להתחיל להיות ממוען, גישה שעשויה לספק תובנות לתחזוקה בלתי יציב של PGPB בניסויים בשטח6.
הבדיקה הייתה ממוטבת לעיבוד מהיר של דגימות מרובות כדי לאפשר משתנים סביבתיים וקהילות בקטריות מעורבות להיות מוחלשים בתוך שכפול ביולוגי אחד רב. בעוד ultrasonication כבר הוכח להיות מספיק עבור הפרעה ואוסף של חיידקים ריזוזוספירה, צלחת 24-הבאר ומצורף מרובת הקרן הקובץ מהירות עיבוד לדוגמה. זו יכולת הכדאיות של התא הגישה לכמת נוכחות חיידקית יכול להיות הושלם על ידי, או מורחבת כדי לכלול, qPCR או MiSeq 16S הקהילה גנים פרופיל לקבוע את השפע היחסי של קהילות מגוונות יותר של חיידקים הקולוניגני 20. בנוסף, במהלך הדמיה, השירות של התמקדות בשלושה אזורים בלבד של כל שורש הצמח כדי להאיץ את ההדמיה של נוכחות חיידקית ולוקליזציה על השורשים מודגש. הקולוניזציה של אזורי שורש אלה שונים הוכח להיות שונים בין מינים חיידקיים14. הדמיה ניתן לבצע עם באופן טבעי חיידקים פלורסנט אוטומטית או חיידקים צייתן מהונדסים לבטא חלבון פלורסנט.
המתודולוגיה המתוארת כאן מאפשרת הערכה מהירה והניתנת לייצוא של מושבת השורש על ידי בקטריה PGPB, אבל יש מגבלות על המסקנות שניתן להסיק מן הניסויים האלה. למשל, היכולת של חיידקים כדי כימוסים לעבר השורש ידוע להיות חשוב עבור מינים רבים של המינים חיידקי של שורשי הצמח, אבל התהליך הזה עשוי לא נדרש בתוך זה לרעוד מערכת. לדברי, עבור מחקרים המעוניינים באופן ספציפי כימוטקוניות, צעד הקולוניזציה יכול להתבצע בתרבות נוזלית סטטי או על פני השטח של מדיום באגר רך, שבו חיידקים יכול להיות מצופה מרחוק מהמפעל, המחייב אותם לנוע באופן פעיל לכיוון ה בסיס. בנוסף, מדיום גידול עשיר יחסית במהלך הקולוניזציה נעשה שימוש כדי לקדם את הצמיחה חיידקי ומצורף הצמח; עם זאת, אלה ריכוזים תזונתיים גבוהים יחסית יכול לאסור על בחינת ניצול בקטריאלי של או תחרות של פחמן נגזר הצמח במהלך הקולוניזציה. שוב, בהתאם לדרישות הצמיחה של החיידקים שנחקרו, בינוני מושבת יכול להיות מגוון להתאים ביותר את שאלות המחקר המסוים של חוקרים ספציפיים.
מערכת זו תוכננה להיות קלה בקלות לתנאי גדילה שונים בקטריאלי וצמחים ולתוספת של לחצים סביבתיים שונים ונקודות זמן. עם זאת, השיטות המתוארות כאן מתאימים ביותר למדידת אינטראקציות בקטריאלי עם שורשי שתילי א. thaliana . הקולקציה ממוטבת עבור צמח זה, וצמחים גדולים או רגישים יותר עלול להיות בתוך מערכת הצלחות מרובת היטב צף. לבסוף, בעוד החיידק של העניין המשמש כאן ליישב את שורש הצמח בתרבות הנוזלית, עבור חיידקים אחרים ייתכן שיהיה צורך לחסן את שורשי הצמח על ידי טבילה או ציפוי על מדיום אגר מוצק במקום19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מחקר שסופקו על ידי המחלקה למחקר ביולוגי וסביבתי של אנרגיה (DOE-BER 0000217519 כדי E.A.S.), הקרן הלאומית למדע (השראה IOS-1343020 ל-E. A. S). SLH תמך גם על ידי תוכנית המלגות למחקר בוגרת קרן המדע הלאומית. אנו מודים לד ר ג'פריס דאדל על מתן זנים חיידקיים ותובנה לא יסולא בפז. אנו מודים לד ר אנדרו קליין ומת ג'יי פאוורס להצעות נסיוניות. לבסוף, SLH רוצה להודות לקשרים על מדיה חברתית על שהזכיר לנו כי הפצת המדע היא זכות ואחריות, במיוחד באמצעות אמצעים יצירתיים ונגישים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
