Summary
Här beskriver vi en hydroponiska växttillväxt analys för att kvantifiera Art närvaro och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter deras överföring till olika tillväxt miljöer.
Abstract
Bakterier bildar komplexa rhizosfären mikrobiomes formad av samverkande mikrober, större organismer, och den abiotiska miljön. Under laboratorieförhållanden, rhizosfären kolonisering av växttillväxt främjande bakterier (pgpb) kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter i förhållande till okoloniserade växter. Men i Fältinställningar, bakteriella behandlingar med PGPB ger ofta inte betydande fördelar för grödor. En förklaring är att detta kan bero på förlust av PGPB under interaktioner med endogena jord mikrober över livslängden på växten. Denna möjlighet har varit svårt att bekräfta, eftersom de flesta studier fokuserar på den initiala koloniseringen snarare än underhåll av pgpb inom rhizosfären samhällen. Det är en hypotes här att församlingen, samexistens, och underhåll av bakteriesamhällen formas av deterministiska funktioner i rhizosfären microenvironment, och att dessa interaktioner kan påverka pgpb överlevnad i inhemska inställningar. För att studera dessa beteenden, en hydroponiska växt-Tillväxtanalys är optimerad med Arabidopsis thaliana att kvantifiera och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter överföring till olika tillväxt Miljöer. Detta Systems reproducerbarhet och nytta är sedan valideras med den väl studerade PGPB Pseudomonas simiae. För att undersöka hur närvaron av flera bakteriearter kan påverka kolonisering och underhåll dynamik på växten roten, en modell gemenskap från tre bakteriestammar (en Arthrobacter, Curtobacterium, och microbacterium arter) som ursprungligen isolerats från A. thaliana rhizosfären är konstruerad. Det visas att närvaron av dessa olika bakteriearter kan mätas med hjälp av denna hydroponiska Plant-maintanence assay, som ger ett alternativ till sekvenserings-baserade bakteriella samhällsstudier. Framtida studier med detta system kan förbättra förståelsen av bakterie beteende i flerartsbaserade växt mikrobiomer över tid och i förändrade miljöförhållanden.
Introduction
Gröda förstörelse av bakterie-och svampsjukdomar resulterar i sänkt livsmedelsproduktion och kan allvarligt störa den globala stabiliteten1. Baserat på upptäckten att mikrober i suppressiva jordar är ansvariga för att öka växthälsan2, forskare har frågat om växten mikrobiomet kan utnyttjas för att stödja växternas tillväxt genom att ändra förekomst och överflöd av särskilda bakteriearter3. Bakterier som finns till stöd i växternas tillväxt eller utveckling benämns kollektivt växttillväxt främjande bakterier (PGPB). På senare tid har studier skiftat från att bara identifiera potentiella pgpb att förstå hur interkingdom interaktioner i jorden, runt rötter, eller i rhizosfären (området direkt omgivande och inklusive roten ytan) kan påverka pgpb verksamhet4.
Rhizosphere kolonisering av PGPB kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter som svar på olika stressorer i förhållande till okoloniserade växter5. Emellertid, resultaten är ofta mer varierande i inhemska markförhållanden jämfört med de som observerats i den nära kontrollerade växthus-och laboratorie inställningar6. En hypotes för denna skillnad är att tillväxten eller beteendet hos pgpb kan hämmas av infödda jordbakterier eller svampar i fälten7,8. Gynnsamma effekter av rhizosfären bakterier beror i allmänhet på förmågan hos bakterierna att 1) lokalisera och gå mot roten, 2) kolonisera roten genom biofilm formation, och 3) interagera med värd växten eller patogener via produktion av små molekyl metaboliter7,9. Någon av dessa kolonisering beteenden kan påverkas av närvaron och aktiviteten av angränsande mikrober10.
Vi designade ett system för att kvantifiera och visualisera dessa distinkta bakteriella koloniseringsstadier av rhizosfären (figur 1). Detta tillvägagångssätt kommer att underlätta studier som undersöker varför långsiktigt PGPB underhåll ibland inte observeras efter överföring av växter till nya miljöer, såsom vid plantering av pre-inokulerade plantor. Arabidopsis thaliana som valdes som en växt modell på grund av dess omfattande användning i laboratoriestudier samt de rikliga data som finns om dess mikrobiella interaktioner11. Det finns tre stadier i systemet: 1) A. thaliana Growth, 2) bakteriell kolonisering, och 3) bakterie underhåll (se figur 1). Eftersom a. thaliana är en markbunden anläggning, var det viktigt att se till att det inte var lidande onödig vattenstress i hydroponiska systemet12. Inspirerad av de metoder som används av Haney et al.13, plantorna odlas på plast mesh för att separera skott från flytande odlingssubstrat. Detta system verkar inte äventyra hälsan och utvecklingen av anläggningen värd, och det förbättrar en. thaliana tillväxt i flytande11. När anläggningen skjuter flyter över ytan, rötterna är fullt utsatta för kolonisering av bakterier inokuleras i flytande bakterietillväxt medium. Detta tillåter bakterier av intresse som skall undersökas för kolonisering i näringsämnen som är mest gynnsam för tillväxt, medan sedan skiftande förhållanden för att tillåta växten att fortsätta växa i ett näringsämne medium som utformats för att stödja dess tillväxt. Båda stegen inkluderar stadig skakning för att förhindra anoxia av roten13. Bakterier kan visualiseras eller kvantifieras från växternas rötter efter överföring från antingen koloniseringsmediet eller underhålls mediet. Detta hydroponiska systemet är mycket flexibelt, vilket gör att experimentella förhållanden och tillämpade spänningar lätt kan ändras beroende på intressen av forskarna.
Denna beskrivna metod är viktig i samband med den större kroppen av litteratur om växt-Microbe interaktioner eftersom det ger ett robust system för att studera dessa interaktioner på roten ytan samtidigt som den är anpassningsbar till tillväxt preferenser olika bakterier. Växtbiologi Labs utför ofta växt-Microbe kolonisering experiment på fast agar, vilket möjliggör endast planar rörelse (om det) av bakterier samtidigt som kräver potentiellt destruktiva manipulation av växter under efterföljande överföring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofta prioriterat hälsan hos bakterierna i sina experiment, till nackdel för växterna14,15. Dessa olika prioriteringar av växt-och mikrobiologi fokuserade laboratorier har historiskt gjort det svårt att jämföra resultat mellan dessa grupper, eftersom varje typiskt optimerar experimentella förhållanden för att optimera deras organism av intresse15. Den flytande-mesh-växt-tillväxtsystem som beskrivs här förhindrar full Plant nedsänkning, en anmärkningsvärd fördel för tidigare mikrobiologi orienterade studier, samtidigt också tillfälligt optimera tillväxten och överlevnaden av bakterier för att underlätta kolonisering. Sålunda, det test som vi presenterar här kan ta upp farhågor från både växt biologer (om över-hydrering och taktil manipulation av anläggningen) samtidigt som uppfyller kriterierna för mikrobiologer (möjliggör olika bakterietillväxt villkor och flera Artens interaktioner)7. Detta protokoll är utformat för att vara anpassningsbar för användning med olika bakterier, växter och miljöförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: den experimentella installationen beskrivs för tydlighetens skull och används för att generera representativa resultat som ingår i denna rapport, men villkoren kan ändras efter behov. Alla steg bör utföras med hjälp av PPE och efter institutionella och federala reccomendations för säkerhet, enligt BSL status av de bakterier som används.
1. karakterisering av bakterier
- Bestäm morfologin av bakterier på odlingssubstrat agar plattan. Omsuspendera cellerna vid en ungefärlig OD600 = 0,5 och platta en 1 μl volym till agar medium val. Tillsätt X-gal till agar plattor till en slutlig koncentration av 20 mg/mL för att bättre skilja enskilda medlemmar av den specifika bakteriella samhället. Växa vid 24 ° c eller 30 ° c tills kolonier bildas, ta sedan bilder av och anteckningar om kolonin morfologi.
- Definiera sambandet mellan varje bakterie stammens optiska densitet och antalet CFU (kolonibildande enheter) per mL16. Omsuspendera bakterier i 1 mL vatten i en 24-brunn platta till en ungefärlig OD600 = 5, utföra tvåfaldigt seriella utspädningar, övervaka OD600 av alla utspädningar, och plattan vardera för att bestämma den livskraftiga CFU/ml i varje prov på flera optiska densiteter.
- Bestäm maximal ultraljudsbehandling tolerans för varje bakteriestam. För att göra detta, alikvot celler till en 24-brunn tallrik som innehåller flytande medium, reservera vissa celler som en unsonicated kontrollprov. Använda en ultrasonicator med en 24-Tip horn fastsättning, tillämpa tre omgångar av 12 s av ultraljudsbehandling på 40 amp med 2 s pulser.
Obs: användningen av en 24-Tja ultrasonicator rekommenderas att underlätta nedströms multiplexering av bearbetningsanläggningen prover, men om man inte är tillgänglig, använda en ultrasonicator försedd med en mikrotip och utföra varje prov ultraljudsbehandling självständigt. Använd alltid öronsnäckor som är klassade till minst 25 NRR-skydd. - Utför 10-faldig seriell spädningar av sonicated och unsonicated prover och spot på agar plattor. Avgöra om det finns en minskning av livskraftiga celler efter ultraljudsbehandling. Om så är det, använda en ny prov och upprepa ultraljudsbehandling steg med en reducerad total ultraljudsbehandling tid eller amplitud tills behandlingen har ingen effekt på den slutliga CFU/mL17.
2. beredning av Arabidopsis thaliana plantor på ett plast nät
- Skapa skivor av plast mesh med hjälp av en vanlig hålslag.
- Samla diskarna i en glasbehållare med en lös cover av aluminiumfolie, och sterilisera med en autoklav inställd på en 20 min torr cykel13.
- Med hjälp av flamsteriliserade pincetter, fördela cirka 40 steriliserade mesh-diskar i ett enda skikt över ytan av en växt-tillväxt-medium agar plattan. Använd 0.5 x Murashige och Skoog (MS) salter, innehållande 500 mg/L av MES buffert [2-(N-morpholino) etansulfonsyra] och 1,5% Bacto agar, som växt odlingssubstrat, med 50 μg/mL benomyl tillsätts till gränsen svamp förorening av plantorna.
- Förbered axeniska frön av A. thaliana som tidigare beskrivits17.
- Placera cirka 100 – 300 frön vardera i enskilda centrifugrör i ett rack och placera dem i ett återförslutbart glas eller en tung plastbehållare ("burk") i ett dragskåp.
- Med försiktighet, placera en bägare på 100 mL av blekmedel i burken, tillsätt 3 mL koncentrerad HCl till blekmedel, och omedelbart täta burken och låt ångorna sterilisera frön i minst 4 h.
- Ta försiktigt bort rören av steriliserade frön underifrån burken och tätning.
- Placera två frön i mitten av varje mesh. Tätnings plattor med kirurgisk tejp och inkubera i 2 – 6 dagar vid 4 ° c i mörker för att vernalize frön.
- För att gro och odla plantor, placera plattagar sidan ner i en växttillväxt kammare för 8 – 10 dagar under korta dag inställningar: 9 h ljus vid 21 ° c och 15 h mörkt vid 18 ° c (figur 1, steg 2).
3. kolonisering av växter i flytande bakterietillväxt medium
- Tillsätt 1 mL bakterie odlingssubstrat till varje brunn på en steril 24-borrplatta, med undantag för endast Media-kontrollbrunnar. Använd Lennox Luria buljong (10 g Tryptone, 5 g jästextrakt, 5 g NaCl) som bakterietillväxt medium.
- Överför de groda plantor som är inbäddade i mesh från agarplattor till vätskan (figur 1, Steg 3a).
- Skala försiktigt maska som innehåller två gror plantor upp och bort agarplattan med hjälp av flamsteriliserade tång. Välj mesh med lika stora och oskadade plantor.
- Om avlägsnande från agar inte är slät, kassera detta nät och växter. Överför en flöte till varje brunn av bakterie-tillväxt flytande, Rota sidan besegrar.
- Inokulera bakterier i brunnar som innehåller flytande plantor.
- Omsuspendera bakterier som odlas över natten på agarplattor till en OD600 motsvarande 108 CFU/ml i den bakterietillväxt medel vätskan. Tillsätt 10 μL bakteriesuspension till varje brunn för en slutlig koncentration av 106 CFU-bakterier per brunn.
- Om beredning av en blandning av bakterier, Omsuspendera varje till OD600 motsvarande 108 CFU/ml, blanda i lika proportioner, och tillsätt 10 μl av den slutliga blandningen per brunn av vätska.
- Försegla plattan för steril tillväxt. Utan att röra den klibbiga sidan, försiktigt trycka på gas-permeable filmen över plattan. Se till att varje brunn har varit individuellt förseglad genom att tillämpa tryck runt var och en av ringarna som gjorts av brunnarna. Sätt tillbaka plåtens plastlock tätt över plattan och den gas genomträngliga filmen (figur 1, steg 3b).
- Inkubera plattorna för 18 h i en växttillväxt kammare, under samma förhållanden som plantorna ursprungligen grott, utom på en orbital tallrik shaker inställd på 220 RPM.
4. upprätthållande av bakteriell kolonisering
- För att skölja alla flöten (växter på mesh), tillsätt 1 mL sterilt vatten till brunnar i en ny 24-brunn tallrik. Ta bort gas-permeable film. Med hjälp av sterila tång, överför flöten till brunnar med vatten (figur 1, steg 4a). Skölj genom att vila i 10 min vid rumstemperatur (RT) utan agitation.
Anmärkning: för att avgöra bakteriell kolonisering effektivitet rötter snarare än deras förmåga att bibehålla kolonisering över tiden, växter kan offras i detta steg genom att ta dem direkt till steg 5,1. - Fyll brunnarna i en ny 24-borrplatta med 1 mL växt odlingssubstrat. Överför ett nät till varje brunn. Täck med en gas-permeable tätning och inkubera för 72 h på orbitalplattan shaker vid 220 rpm i växternas tillväxt kammare (figur 1, steg 4b).
- Upprepa sköljningen som utförd i steg 4,1 med flöten efter inkubationstiden 72 h.
5. insamling av bakterier för livskraftiga cell räkningar
Anmärkning: antalet bakterier per plantor rot kan bestämmas vid någon inkubering timepoint. Kolonisering kan övervakas mellan 0 h och 18 h, medan underhåll kan övervakas från 18 h och framåt. Växter som är avsedda för avbildning kan fortsätta direkt till avsnitt 6.
- Ta bort plantorna från nätet (figur 1, steg 5). Försiktigt placera flamsteriliserade tång under bladen (men på bladsidan av mesh), och lätt nypa stammen. Vicka plantorna upp och bort från mesh för att få bort roten utan att bryta den. Om roten bryts, skrapa försiktigt nät botten för att samla in hela längden.
- Ta bort bakterier från växternas rötter. Överför bakterierna till brunnar i en 24-brunnsplatta som innehåller 1 mL ddH20. Sonikera proverna enligt beskrivningen i steg 1,3.
Anmärkning: med hjälp av ett mikroskop, leta efter eventuella kvarvarande bakterier på roten ytan på en sonicated prov. Om bakterier kvar, öka den totala ultraljudsbehandling tid eller intensitet tills inga bakterier förblir bunden, upp till den högsta nivån av ultraljudsbehandling som inte påverkar livskraftiga celler räknas som bestäms i avsnitt 1. - Kvantifiera bakterierna på rötterna.
- Utför seriella 10-faldig utspädningar av sonicated prover upp till en 10-6 utspädning i bakterietillväxt medium. Tillsätt 50 μL av varje spädning till individuella agar plattor och sprid med sterila glaspärlor (eller bakteriell spridare). Inkubera plattorna vid optimal temperatur för bakterier tills enskilda kolonier är uppräknebara.
- När distinguishable, räkna antalet varje koloni morfologi (som bestäms i avsnitt 1), och beräkna CFU av varje bakteriearter per fröplanta. Kassera prover som visar kontaminering, eftersom kontaminering under kolonisering eller underhåll kan påverka bakteriell närvaro.
6. insamling av intakt växtrötter för mikroskopi
- Med hjälp av pinps, ta bort plantor från mesh som i avsnitt 5.
- Överför varje planta till Mikroskop rutschbanor.
- Placera spetsen på roten på bilden och dra bort från spetsen för att ställa in skjuta ner spola med bilden, vilket garanterar en rätade rot för bästa avbildning. Tillsätt en droppe vatten eller steril växt odlingssubstrat till proverna för att återfukta gränssnitten mellan täckglas och diabilder.
- Placera ett glas täckblad strax ovanför roten kronan (översta boxed regionen i figur 1) och under fotograferingen bladen för att undvika snedställda täckglaset (för att möjliggöra root Crown Imaging), och tryck ner försiktigt17.
- Om du använder fluorescerande bakterier, bild med hjälp av lämpliga excitation/utsläpp filter för att skilja bakterier från varandra och växten roten18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den väl karaktäriserade PGPB P. simiae WCS417r är känd för att kolonisera rötterna av A. thaliana i hydroponiska kulturen. Denna naturligt fluorescerande bakterie kan enkelt visualiseras med hjälp av mikroskopi på rötterna av plantor efter kolonisation (figur 2). Även om det är möjligt att avbilda hela längden av dessa A. thaliana plantor "(4-6 mm längd) rötter, gör så för många växter skulle ta en prohibitiv tid. Eftersom de flesta variationer över tidspunkter och arter av bakterier kan fångas upp genom avbildning kronan, mitten och spetsen av roten14 (indikeras av röda rutor i figur 1), dessa regioner prioriterades för Imaging snarare än Imaging full root Längder. I Bright-fältet bilder av P. simiae-koloniserade A. thaliana rötter (figur 2), är det möjligt att visualisera konturerna av rötter och rot hårstrån; men vid 18 h kolonisering, är det inte möjligt att tydligt skilja koloniserade kontra icke-koloniserade rötter med hjälp av ljusa fält bilder. Medan P. simiae visar autofluorescence, använde vi en stam också konstruerad för att uttrycka en gul fluorescerande protein (yfp)19 med excitation/emission våglängder av 490-510/520-550 Nm18. En förstoring på 100x var tillräcklig för att tydligt identifiera enskilda och små aggregat av P. simiae celler på a. thaliana rötter. Som visas i figur 2, laboratorier med tillgång till antingen högupplöst konfokala Mikroskop eller billigare bänk Mikroskop kan både visualisera närvaron och distributionen av bakterier längs roten.
Även informativ när det gäller rumslig distribution, mikroskopi bilder är inte väl lämpade för kvantifiering av bakterieceller. Vi insamlade således bakterier från ytan av rötter med hjälp av ultraljud som tidigare beskrivits och validerade9,20. Tre omgångar av 12 s av ultraljud21 vid en amplitud på 40 var tillräckliga för att störa den yttre ytan av rot plantor (kompletterande figur 1) och ta bort alla bakterier samtidigt inte påverkar bakteriell lönsamhet. Ultraljudsbehandling användes snarare än Bead-slog metoder9 för att bättre främja spridning av bakterie aggregat/biofilmer. Kvantifiera CFU/root efter 18 h kolonisering och ytterligare 72 h underhåll visade att P. simiae både koloniserar och upprätthålls på rötterna av A. thaliana i vår hydroponiska, flytande fröplanta system (figur 3). Antalet CFU/plantor vid antingen tidpunkten visade god reproducerbarhet över biologiska replikat som utfördes på olika dagar (figur 3). Den observerade variationen är vanlig bland rot koloniseringstester22 och är sannolikt på grund av mindre variationer av timing, miljöförhållanden, eller växt rot storlek, även bland plantor grorade samtidigt och valt att vara liknande i storlek. Vi observerar en ökning av antalet CFU/Groddplanta efter 72 h i underhålls medium jämfört med siffrorna observerade vid postkoloniseringen 18 h tidpunkten (figur 3). Detta indikerar aktiv tillväxt av de koloniserade bakterierna på växten Rota uppstod under underhållet arrangerar.
Förutom nyttan av denna hydroponiska analys för att kvantifiera enskilda bakteriella kolonisering och underhåll, det är också tillämplig för att övervaka föreningen av flera arter på växternas rötter. För att demonstrera detta, tre arter av bakterier isolerade från A. thaliana odlas i naturlig jord under laboratorieförhållanden valdes20. Isolaterna var stammar av Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans, och Curtobacterium oceanosedimentum23. Denna förenklade gemenskap valdes på grund av dessa arter förmåga att samexistera i flytande bakteriella tillväxt medier i skakar kultur (opublicerade data). Dessutom kan dessa tre arter tydligt differentieras på medier som innehåller X-gal på grund av skillnader i kolonimorfologi och färg (figur 4a). X-gal påverkar inte den relativa tillväxten av någon av dessa bakteriearter (opublicerade data). Dessa skillnader i morfologi och koloni utseende på X-gal tillät oss att räkna CFU/plantor av varje art utan antibiotikum urval, även i flera arter samodling.
A. nicotinovorans, M. oleivorans, och C. oceanosedimentum var alla koloniserade och underhållas på roten, antingen ensam eller i bakteriell Coculture (figur 4b). Varje art visade trender som var likartade över olika biologiska och tekniska replikat, även inom blandade samhällen. Detta visar att analys protokollet kan användas för att mäta både relativ eller total CFU/root för varje art. Intressant, när odlas ensam, inga enskilda arter visade en märkbar ökning av överflöd under underhålls skedet, men den totala CFU/roten av den kombinerade gemenskapen ökade i cocultures, vilket tyder på att dessa bakterier inte förbjuder koloniseringen av de andra stammarna.
För alla experiment, växter som odlas i flytande medier utan tillsats av bakterier som negativa kontroller ingick alltid. Inga bakterier syntes på dessa kontroll rötter under mikroskopi (figur 2), och inga bakterier upptäcktes via plätering för CFU (opublicerade data). Detta indikerar att sterilisering av frön och använda steril teknik under denna analys var tillräckliga för att hålla växter axenic om avsiktligt koloniserade.
Figur 1: analys för bakteriell kolonisering och underhåll på A. thaliana rötter. A. thaliana plantor som odlas på steriliserad plast mesh överfördes till ett tillväxtmedium optimerad för bakterier [här, 0,1 x lb (Luria buljong) Lennox]. Bakterierna koloniserade sedan roten över 18 h medan växten flöt i skakande vätska. Efter en sköljning, den koloniserade float överfördes till ett tillväxtmedium optimerad för växter (0.5 x MS + MES) för 72 h för att testa för underhåll av bakterier på rötterna. Flottören sköljdes sedan och anläggningen med eventuella bifogade mikrober togs bort för analys (kvantifiering av CFU/Groddplanta eller avbildning genom mikroskopi). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: visualisera P. simiae kolonisering av rötter med fluorescerande mikroskopi. P. simiae (falsk-färgad grön) koloniserade A. thaliana rötter och upprätthölls på roten efter överföring till växt-tillväxtmedium. Root Crown (vänster), Mid-Length (mitten) och spets (höger) vid 40x förstoring visas från de områden som anges i figur 1. De två översta raderna visar den ljusa fält och fluorescerande bilder av rötter koloniserade av P. simiae (avbildas med epilys mikroskopi). Samma rötter var också avbildade med ett konfokala Mikroskop (mitten två rader). No-bacteria negativ kontroll i de två nedersta raderna visade ingen kolonisering. Skalstreck representerar 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvantifiering av P. simiae på A. thalianas rötter. Totalt antal P. simiae livskraftiga celler återvinns per A. thaliana fröplanta efter 18 h kolonisering eller 72 h underhåll. Tre enskilda biologiska replikat visas, var och en innehåller tre tekniska replikat av två plantor per float. Siffrorna som visas är medel från tekniska replikat, medan staplar representerar standardfel på medlen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvantifiering av koloniseringen och underhållet av en blandad bakterie gemenskap på a. thalianas rötter. (A) kolonier av a. nicotinovorans, M. oleivorans, och C. oceanosedimentum kan göras åtskillnad mellan på X-gal-innehållande agarmedel vid kolonin morfologi och färga. (B) rötterna till 10 dagsgamla plantor inokulerades med cirka 3x105 CFU/ml av var och en av de tre stammarna. Visat är totalt CFU/plantor återvinnas av varje art efter 18 h av kolonisering eller 72 h underhåll när koloniserade antingen ensam eller i en tre-medlem bakterie gemenskap. Två biologiska replikat, vardera bestående av två tekniska replikat av två plantor per Float, visas. Siffrorna som visas är medel från två tekniska replikat, medan staplar representerar standardfel på medlen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: ultraljud stör roten ytan. För att få bort bakterier från ytan av roten, var hela växter sonicated, och bakterierna släpptes i vätskan, som var seriellt utspädd och pläterad för kvantifiering av CFU/Groddplanta. (A) en intakt fröplanta är (B) strukturellt störd efter ultraljud. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Växter i alla miljöer samverkar med tusentals till miljontals olika bakterier och svampar5,7. Dessa interaktioner kan antingen negativt och positivt påverka växthälsan, med potentiella effekter på skördeavkastning och livsmedelsproduktion. Nyligen arbete tyder också på att varierande kolonisering av grödor av PGPBs kan redogöra för oförutsägbar växt storlek och skördeavkastning i fältförsök22. Förstå mekanismerna bakom dessa interaktioner kan tillåta oss att direkt manipulera växt-associerade mikrobiella samhällen till stöd i friska växt utveckling, även under stress24.
Eftersom bakteriell kolonisering av rötter och deras underhåll i rhizosfären är avgörande för växt-Microbe interaktioner9, vi ville bygga ett system för att reproducerbart visualisera och kvantifiera dessa bakteriella beteenden. Denna hydroponiska, flytande plantor tillväxt system möjliggör mikroskopisk avbildning och kvantifiering av bakterie populationer på rötterna av A. thaliana.
Den beskrivna Plant-Microbe interaktions analysen integrerar nyttiga delar av befintliga experimentella protokoll. Den flytande mesh-metoden baserades på det från Haney et al.13, som mätt initial kolonisering av P. simiae WCS417r på statisk, flytande A. thaliana plantor. Vid utvärderingen av detta system, stark kolonisering av A. thaliana rötter av P. simiae validerats, även om ett annat odlingssubstrat från Haney et al. utnyttjades och inkluderade orbital skakar under koloniseringen. Införandet av orbital skakningar under både kolonisering och underhåll underlättar bakteriella interaktioner som inte kan förekomma i statisk kultur, samt minska anoxiska villkor som kan hämma både bakterietillväxt och växt rot hälsa13. Vi integrerade också aspekter av mikrobiologi fokuserade protokoll för att stödja växtrot kolonisering av olika bakteriearter8,15,25. Detta inkluderade en avgörande överföring steg ur mediet optimerad för bakteriell kolonisering och till ett medium optimerad för växternas tillväxt. Denna överföring till färskt medium kommer också att göra det möjligt för mekanismerna bakom bakterie underhåll på rötter att börja åtgärdas, en metod som kan ge insikter i det oberäkneliga underhållet av PGPB i fältförsök6.
Denna analys var optimerad för snabb bearbetning av flera prover för att möjliggöra miljövariabler och blandade bakteriella samhällen att analyseras inom en multi-well biologisk replikat. Även ultraljud har tidigare visat sig vara tillräckligt för störningar och insamling av rhizosfären bakterier, den 24-väl plattan och multi-stift horn fastsättning quickens provbearbetning. Denna cell genomförbarhet beräkning metod för att kvantifiera bakteriell närvaro kan kompletteras med, eller utvidgas till att omfatta, qPCR eller MiSeq 16S rRNA Gene community profilering för att avgöra det relativa överflöd av mer skiftande samhällen av kolonisera bakterier 20. Dessutom, under Imaging, är nyttan av att fokusera på bara tre regioner i varje växt rot för att påskynda visualisering av bakteriell närvaro och lokalisering på rötterna markeras. Koloniseringen av dessa olika rot regioner har visats skilja sig mellan bakteriearter14. Avbildning kan utföras med antingen naturligt autofluorescent bakterier eller genetiskt tractable bakterier konstruerade för att uttrycka ett fluorescerande protein.
Den metod som beskrivs här möjliggör snabb och reproducerbar utvärdering av root kolonisering av PGPB bakterier, men det finns begränsningar av de slutsatser som kan dras från dessa experiment. Till exempel, möjligheten för bakterier att chemotax mot roten är kända för att vara viktigt för många bakteriearter kolonisering av växtrötter, men denna process kan inte krävas inom detta skakning inympning system. Som sagt, för studier som är särskilt intresserade av chemotaxis, koloniseringen steg kan utföras i statisk flytande kultur eller på ytan av en mjuk agar medium, där bakterier kan pläteras långt från anläggningen, vilket kräver att de aktivt gå mot Root. Dessutom, en relativt rik odlingssubstrat under koloniseringen användes för att främja bakterietillväxt och växt kvarstad; men dessa jämförelsevis höga näringsämnes koncentrationer kan förbjuda undersökning av bakteriell användning av eller konkurrens om vegetabiliskt ursprung kol under koloniseringen. Återigen, beroende på tillväxt kraven för de bakterier som studeras, kan koloniseringen mediet varieras för att bäst passa de särskilda forskningsfrågor av specifika forskare.
Detta system utformades för att vara lätt mottagliga för olika bakteriella och växttillväxt villkor och till tillägg av olika miljömässiga stressorer och timepoints. De metoder som beskrivs här är dock bäst lämpade för att mäta bakteriella interaktioner med rötterna av A. thaliana plantor. Insamling har optimerats för denna anläggning, och större eller mer känsliga växter kan vara svåranpassade i flytande multi-well-plattan systemet. Slutligen, medan de bakterier som används här kolonisera växten roten i flytande kultur, för andra bakterier kan det vara nödvändigt att Inokulera växternas rötter genom DIP-inympning eller plätering på ett fast agar medium istället19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsmedel från Institutionen för energi biologisk och miljö forskning (DOE-BER 0000217519 till E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 till E. A. S). SLH stöddes också av National Science Foundation Graduate Research Fellowship program. Vi tackar Dr Jeffery Dangl för att ge bakteriestammar och ovärderlig insikt. Vi tackar Dr Andrew Klein och Matthew J. Powers för experimentella förslag. Slutligen vill SLH tacka anslutningar på sociala medier för att påminna oss om att spridning av vetenskap är ett privilegium och ett ansvar, särskilt genom kreativa och tillgängliga medel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
