Summary
Aqui nós descrevemos um ensaio hidropônico do crescimento de planta para quantificar a presença da espécie e para visualizar a distribuição espacial das bactérias durante a colonização inicial de raizes de planta e após sua transferência em ambientes diferentes do crescimento.
Abstract
As bactérias formam microbiomas complexos de rizosfera em forma de micróbios interagindo, organismos maiores e o ambiente abiótico. Em condições laboratoriais, a colonização por rizosfera por bactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPB) pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em relação às plantas não colonizadas. No entanto, em configurações de campo, os tratamentos bacterianos com PGPB muitas vezes não fornecem benefícios substanciais para as culturas. Uma explanação é que esta pode ser devido à perda do PGPB durante interações com os micróbios endógenos do solo sobre o tempo da planta. Essa possibilidade tem sido difícil de confirmar, uma vez que a maioria dos estudos se concentra na colonização inicial e não na manutenção do PGPB dentro das comunidades de rizosfera. É a hipótese de que a montagem, a coexistência e a manutenção de comunidades bacterianas são moldadas por características determinísticas do microambiente da rizosfera, e que essas interações podem impactar a sobrevida do PGPB em ambientes nativos. Para estudar esses comportamentos, um ensaio hidropônico de crescimento vegetal é otimizado usando Arabidopsis Arabidopsis thaliana para quantificar e visualizar a distribuição espacial de bactérias durante a colonização inicial das raízes das plantas e após a transferência para o crescimento diferente Ambientes. A reprodutibilidade e utilidade deste sistema são então validadas com o bem estudado PGPB Pseudomonas Simiae. Para investigar como a presença de múltiplas espécies bacterianas pode afetar a colonização e a dinâmica de manutenção na raiz da planta, uma comunidade modelo de três cepas bacterianas (um Arthrobacter, Curtobacteriume microbacterium espécies) originalmente isoladas da rhizofera a . Arabidopsis thaliana é construída. Mostra-se que a presença destas espécies bacterianas diversas pode ser medida usando este ensaio hidropônico da planta-maintanence, que fornece uma alternativa aos estudos de comunidade bacterianos de sequenciamento-baseados. Estudos futuros que utilizam este sistema podem melhorar a compreensão do comportamento bacteriano em microbiomas de plantas multiespécies ao longo do tempo e em mudanças nas condições ambientais.
Introduction
A destruição das culturas por doenças bacterianas e fúngicas resulta na diminuição da produção de alimentos e pode perturbar severamente a estabilidade global1. Com base na descoberta de que os micróbios em solos supressores são responsáveis pelo aumento da saúde vegetal2, os cientistas perguntaram se o microbioma vegetal pode ser aproveitado para apoiar o crescimento das plantas, modificando a presença e abundância de particular espécies bacterianas3. As bactérias encontradas para ajudar no crescimento ou no desenvolvimento de planta são denominadas coletivamente bactérias promotoras do crescimento de planta (PGPB). Mais recentemente, os estudos mudaram de simplesmente identificar potencial PGPB para compreender como interkingdom interações no solo, em torno de raízes, ou na rizosfera (a área diretamente circundante e incluindo a superfície radicular) pode estar impactando PGPB atividade4.
A colonização por rizosfera pelo PGPB pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em resposta a diversos estressores em relação às plantas não colonizadas5. Entretanto, os resultados são frequentemente mais variáveis em condições nativas do solo comparadas àquelas observadas nas configurações de estufa e de laboratório de perto controladas6. Uma hipótese para essa diferença é que o crescimento ou o comportamento do pgpb pode ser inibido por bactérias ou fungos nativos do solo nos campos7,8. Efeitos benéficos por bactérias rizosfera geralmente dependem da capacidade das bactérias para 1) localizar e mover-se para a raiz, 2) colonizar a raiz através da formação de biofilme, e 3) interagir com a planta hospedeira ou patógenos através da produção de pequenas moléculas metabolitos7,9. Qualquer um desses comportamentos de colonização pode ser afetado pela presença e atividade de micróbios vizinhos10.
Foi elaborado um sistema para quantificar e visualizar esses distintos estágios bacterianos de colonização da rizosfera (Figura 1). Essa abordagem facilitará estudos investigando por que a manutenção de PGPB a longo prazo não é, por vezes, observada após a transferência de plantas para novos ambientes, como durante o plantio de mudas pré-inoculadas. A Arabidopsis Arabidopsis thaliana foi escolhida como modelo vegetal devido ao seu uso extensivo em estudos laboratoriais, bem como aos amplos dados disponíveis sobre suas interações microbianas11. Há três estágios no sistema: 1) crescimento de A. Arabidopsis thaliana , 2) colonização bacteriana e 3) manutenção bacteriana (ver Figura 1). Porque a. Arabidopsis thaliana é uma planta terrestre, era importante assegurar-se de que não sofresse o esforço de água indevido no sistema hidropônico12. Inspirados nos métodos utilizados por Haney et al.13, as mudas são cultivadas em malha plástica para separar a parte aérea do meio de crescimento líquido. Este sistema não parece comprometer a saúde eo desenvolvimento do hospedeiro da planta, e melhora a. Arabidopsis thaliana crescimento em líquido11. À medida que a planta atira flutua acima da superfície, as raízes são totalmente expostas à colonização por bactérias inoculadas no meio de crescimento bacteriano líquido. Isto permite que as bactérias do interesse sejam examinadas para a colonização nos nutrientes que são as mais favoráveis ao crescimento, ao então desloc condições para permitir que a planta continue crescendo em um meio nutriente projetado suportar seu crescimento. Ambos os estágios incluem agitação constante para prevenir a anóxia da raiz13. As bactérias podem ser visualizadas ou quantificadas a partir das raízes da planta após a transferência do meio de colonização ou do meio de manutenção. Este sistema hidropônico é muito flexível, permitindo que as condições experimentais e as tensões aplicadas sejam facilmente alteradas, dependendo dos interesses dos pesquisadores.
Este método descrito é importante no contexto do corpo maior da literatura sobre interações planta-micróbe porque fornece um sistema robusto para estudar estas interações na superfície da raiz ao igualmente ser customizável às preferências do crescimento de bactérias diferentes. Laboratórios de biologia vegetal muitas vezes executam experimentos de colonização de planta-micróbe em ágar sólido, permitindo apenas movimento planar (se isso) de bactérias, exigindo também a manipulação potencialmente destrutiva de plantas durante a transferência subsequente. Em contrapartida, os laboratórios de microbiologia têm freqüentemente priorizado a saúde das bactérias dentro de seus experimentos, em detrimento das plantas14,15. Essas diferentes prioridades de laboratórios centrados em plantas e Microbiologia têm historicamente dificultado a comparação de resultados entre esses grupos, uma vez que cada um tipicamente otimiza as condições experimentais para otimizar seu organismo de interesse15. O sistema de flutuação-malha-planta-crescimento descrito aqui impede a submersão completa da planta, uma vantagem notável aos estudos microbiologia-orientados precedentes, ao igualmente otimizar temporariamente o crescimento e a sobrevivência das bactérias para facilitar a colonização. Assim, o ensaio que apresentamos aqui pode abordar as preocupações de ambos os biólogos de plantas (sobre a hidratação e manipulação tátil da planta), satisfazendo os critérios dos microbiologistas (permitindo diferentes condições de crescimento bacteriano e múltiplas interações de espécies)7. Este protocolo é projetado ser adaptável para o uso com várias bactérias, plantas, e condições ambientais.
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Protocol
Nota: a configuração experimental é descrita para maior clareza e usada para gerar os resultados representativos incluídos neste relatório, mas as condições podem ser modificadas conforme desejado. Todos os passos devem ser realizados usando EPI e após reccomendations institucionais e federais para a segurança, de acordo com o status BSL das bactérias utilizadas.
1. caracterização de bactérias
- Determine a morfologia das bactérias na placa de agar de médio crescimento. Reressuscitem as células em um OD aproximado600 = 0,5 e a placa de um volume de 1 μl no meio de agar de escolha. Adicione X-GAL às placas de agar para uma concentração final de 20 mg/mL para diferenciar melhor os membros individuais da comunidade bacteriana específica. Cresça em 24 ° c ou 30 ° c até a forma das colônias, a seguir tome retratos e notas na morfologia da colônia.
- Definir a correlação entre a densidade óptica de cada cepa bacteriana e o número de CFU (unidades formadoras de colônias) por mL16. Ressuscitem as bactérias em 1 mL de água em uma placa de 24 poços para um OD aproximado600 = 5, executam duas vezes diluições seriais, monitoram o OD600 de todas as diluições, e a placa cada para determinar o CFU/ml viável em cada amostra em densidades ópticas múltiplas.
- Determine a tolerância máxima de sonication para cada cepa bacteriana. Para fazer isso, as células alíquotas em uma placa de 24 poços contendo meio líquido, reservando algumas células como uma amostra de controle unsonicated. Usando um ultrasonicator com um acessório do chifre de 24 pontas, aplique três círculos de 12 s do sonication em 40 ampères com pulsos de 2 s.
Nota: o uso de um ultrasonicator de 24 poços é aconselhado a facilitar a multiplexação a jusante de amostras de plantas de processamento, mas se não estiver disponível, use um ultrasonicator equipado com uma microtip e realize cada amostra sonication independentemente. Sempre use Earmuffs nominal de pelo menos 25 NRR proteção. - Realize 10 vezes diluições seriadas das amostras sonicated e unsonicated e mancha em placas de agar. Determine se há uma redução em células viáveis após a sonicação. Em caso afirmativo, use uma amostra fresca e repita a etapa do sonication usando um tempo total reduzido da sonication ou uma amplitude até que o tratamento não tenha nenhum efeito no CFU/mL final17.
2. preparação de mudas de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em malha plástica
- Crie discos da malha plástica usando um perfurador de furo padrão.
- Colete os discos em um recipiente de vidro com uma tampa frouxa da folha de alumínio, e esterilize usando uma autoclave ajustada a um ciclo seco de 20 minutos13.
- Usando tweezers Flame-sterilized, distribua aproximadamente 40 discos sterilized da malha em uma única camada através da superfície de uma placa do ágar da planta-crescimento-média. Use sais de 0,5 x Murashige e Skoog (MS), contendo 500 mg/L de tampão MES [2-(N-morpholino) ácido etanólico] e 1,5% de agar Bacto, como meio de crescimento vegetal, com 50 μg/mL de benomilo adicionado ao limite de contaminação fúngica das mudas.
- Prepare sementes axênicas de A. Arabidopsis thaliana como descrito anteriormente17.
- Coloc aproximadamente 100 – 300 sementes cada em uns tubos de centrifugação individuais em uma cremalheira e coloc em um vidro resealable ou em um recipiente plástico pesado ("frasco") em uma capa das emanações.
- Usando o cuidado, coloc uma taça de 100 mL do alvejante no frasco, adicione 3 mL do HCl concentrado ao alvejante, e sele imediatamente o frasco e permita que os fumos esterilize sementes por pelo menos 4 h.
- Retire cuidadosamente os tubos de sementes esterilizadas debaixo do jarro e vedação.
- Coloque duas sementes no centro de cada malha. Placas de vedação com fita cirúrgica e incubar por 2 – 6 dias a 4 ° c na escuridão para vernalizar sementes.
- Para germinar e cultivar mudas, coloque o lado do agar de placa para baixo em uma câmara de crescimento de plantas por 8 – 10 dias em configurações de dia curto: 9 h de luz a 21 ° c e 15 h de escuro a 18 ° c (Figura 1, etapa 2).
3. colonização de plantas em meio de crescimento bacteriano líquido
- Adicione 1 mL de meio de crescimento bacteriano a cada poço de uma placa esterilizada de 24 poços, exceto para as cavidades de controle somente de mídia. Use o caldo Lennox Luria (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl) como o meio de crescimento bacteriano.
- Transferir as mudas germinadas incorporadas em malha de placas de agar para o líquido (Figura 1, etapa 3a).
- Descasque delicadamente a malha que contem duas plântulas germinadas acima e fora da placa do ágar usando o fórceps flama-sterilized. Escolha a malha com mudas igualmente dimensionadas e não danificadas.
- Se a remoção do agar não for Lisa, descarte a malha e a planta. Transfira um flutuador a cada poço do líquido do crescimento bacteriano, lado da raiz para baixo.
- Inocular bactérias em poços contendo mudas flutuantes.
- Ressuscitem as bactérias cultivadas durante a noite em placas de agar para um OD600 equivalente a 108 CFU/ml no líquido de médio crescimento bacteriano. Adicionar 10 μL de suspensão bacteriana a cada poço para uma concentração final de 106 CFU bactérias por poço.
- Se preparar uma mistura de bactérias, ressuscitem cada um para o OD600 equivalente a 108 CFU/ml, misture em proporções iguais, e adicione 10 μL da mistura final por poço de líquido.
- Selar a placa para o crescimento estéril. Sem tocar no lado pegajoso, pressione cuidadosamente o filme permeável a gás através da placa. Assegure-se de que cada poço esteja selado individualmente aplicando a pressão em torno de cada um dos anéis feitos pelos poços. Recoloque a tampa plástica da placa confortavelmente sobre a placa e o filme permeável a gás (Figura 1, passo 3B).
- Incubar as placas por 18 h em uma câmara de crescimento vegetal, as mesmas condições que as mudas foram originalmente germinadas, exceto em um agitador de placa orbital definido para 220 rpm.
4. manutenção da colonização bacteriana
- Para enxaguar todos os flutuadores (plantas no engranzamento), adicione 1 mL da água estéril aos poços de uma placa 24-well nova. Remova o filme permeável a gás. Usando fórceps estéril, transfira flutuadores aos poços com água (Figura 1, etapa 4a). Enxágüe descansando por 10 min à temperatura ambiente (RT) sem agitação.
Nota: para determinar a eficiência da colonização bacteriana das raízes, em vez de sua capacidade de manter a colonização ao longo do tempo, as plantas podem ser sacrificadas nesta etapa, levando-os diretamente para o passo 5,1. - Encha os poços de uma placa nova de 24 poços com 1 mL de meio de crescimento vegetal. Transfira uma malha para cada poço. Cubra com um selo permeável a gás e incubar por 72 h no agitador da placa orbital a 220 rpm na câmara de crescimento vegetal (Figura 1, etapa 4b).
- Repita a enxaguadela como realizada na etapa 4,1 com flutuadores após o período de incubação de 72 h.
5. coleção das bactérias para contagens viáveis da pilha
Nota: o número de bactérias por raiz de plântulas pode ser determinado em qualquer ponto temporal de incubação. A colonização pode ser monitorada entre 0 h e 18 h, enquanto a manutenção pode ser monitorada a partir de 18 h em diante. As plantas destinadas à imagem latente podem prosseguir diretamente à seção 6.
- Retire as mudas da malha (Figura 1, etapa 5). Coloc delicadamente o fórceps flama-sterilized abaixo das folhas (mas no lado da folha da malha), e comprima levemente a haste. Mexa as mudas para cima e para longe da malha para desalojar a raiz sem quebrá-la. Se a raiz quebrar, raspe delicadamente a parte inferior da malha para recolher o comprimento cheio.
- Remova as bactérias das raízes das plantas. Transfira as bactérias para poços de uma placa 24-bem contendo 1 mL de ddH20. SONICATE as amostras conforme descrito na etapa 1,3.
Nota: usando um microscópio, procure todas as bactérias restantes na superfície da raiz em uma amostra sonicated. Se as bactérias permanecem, aumente o tempo ou a intensidade total do sonication até que nenhuma bactéria permaneça ligada, até o nível o mais elevado de sonication que não afeta contagens viáveis da pilha como determinado na seção 1. - Quantificar as bactérias nas raízes.
- Realize diluições seriais de 10 vezes das amostras sonicadas até uma diluição de 10-6 em meio de crescimento bacteriano. Adicione 50 μL de cada diluição a placas de agar individuais e espalhe com grânulos de vidro estéreis (ou espalhador bacteriano). Incubar as placas com a temperatura ideal para as bactérias até que as colônias individuais são Countable.
- Uma vez distinguível, contar o número de cada morfologia da colônia (conforme determinado na seção 1), e calcular CFU de cada espécie bacteriana por plântula. Descarte todas as amostras que mostrem contaminação, pois a contaminação durante a colonização ou manutenção pode afetar a presença bacteriana.
6. coleção de raízes de plantas intactas para microscopia
- Usando fórceps, retire as mudas de malha como na seção 5.
- Transfira cada planta para lâminas de microscópio.
- Coloque a ponta da raiz no slide e arraste para longe da ponta para definir o disparo para baixo Flush com o slide, assegurando uma raiz endireitada para melhor imagem. Adicione uma gota de água ou meio de crescimento vegetal estéril às amostras para hidratar as interfaces entre as lamelas e os slides.
- Coloc um lamela de vidro apenas acima da coroa da raiz (a região encaixotado mais superior em Figura 1) e abaixo das folhas do tiro para evitar inclinar da lamínula (para permitir a imagem latente da coroa da raiz), e pressione para baixo delicadamente17.
- Se usando bactérias fluorescentes, a imagem usando filtros apropriados da excitação/emissão para diferenciar as bactérias de se e a raiz18da planta.
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Representative Results
O bem caracterizado PGPB P. Simiae WCS417r é conhecido por colonizar as raízes de a. Arabidopsis thaliana na cultura hidropônica. Esta bactéria naturalmente fluorescente pode ser facilmente visualizada usando microscopia nas raízes das mudas após a colonização (Figura 2). Embora seja possível a imagem do comprimento total dessas mudas de a. Arabidopsis thaliana ' (4 – 6 mm de comprimento) raízes, fazê-lo para muitas plantas levaria uma quantidade proibitiva de tempo. Como a maioria das variações entre os temporais e as espécies de bactérias pode ser capturada pela imagem da coroa, do meio e da ponta da raiz14 (indicada por caixas vermelhas na Figura 1), essas regiões foram priorizadas para imagens em vez de imagens de raiz completa Comprimentos. Nas imagens de campo brilhante das raízes de a. Arabidopsis thaliana colonizadas por P. Simiae(Figura 2), é possível visualizar o contorno das raízes e dos cabelos radiculares; no entanto, aos 18 h de colonização, não é possível diferenciar claramente as raízes colonizadas versus não colonizadas usando imagens de campo brilhante. Quando P. Simiae indica o autofluorescence, nós usamos uma tensão projetada igualmente para expressar uma proteína fluorescente amarela (YFP)19 com comprimentos de onda da excitação/emissão de 490-510/520-550 nanômetro18. A ampliação de 100x foi suficiente para identificar claramente agregados individuais e pequenos de células de P. Simiae em raízes de a. Arabidopsis thaliana . Como mostrado na Figura 2, os laboratórios com acesso a microscópios confocais de alta resolução ou microscópios de bancada menos dispendiosos podem visualizar a presença e a distribuição de bactérias ao longo da raiz.
Embora informativo em termos de distribuição espacial, as imagens de microscopia não são adequadas para a quantificação de células bacterianas. Nós coletamos assim bactérias da superfície das raizes usando o ultrasonication como descrito previamente e validado9,20. Três rodadas de 12 s de ultrasonication21 em uma amplitude de 40 foram suficientes para interromper a superfície externa das mudas de raiz (suplementar Figura 1) e remover todas as bactérias, enquanto não impactando a viabilidade bacteriana. Sonication foi usado em vez de grânulo-batendo métodos9 para melhor promover a dispersão de agregados bacterianos/biofilmes. Quantificando CFU/root após 18 h de colonização e um adicional de 72 h de manutenção mostrou que P. Simiae ambos coloniza e se mantém nas raízes de a. Arabidopsis thaliana em nosso sistema hidropônico de plântulas flutuantes (Figura 3). O número de CFU/plântula em qualquer ponto temporal mostrou boa reprodutibilidade em repetições biológicas realizadas em dias diferentes (Figura 3). A variação observada é comum entre os ensaios de colonização radicular22 e provavelmente devido a variações menores de tempo, condições ambientais ou tamanho da raiz da planta, mesmo entre mudas germinadas ao mesmo tempo e selecionadas para serem semelhantes em tamanho. Observamos um aumento no número de UFC/plântula após 72 h em meio de manutenção em relação aos números observados no ponto de tempo pós-colonização 18 h (Figura 3). Isso indica que o crescimento ativo das bactérias colonizadas na raiz da planta ocorreu durante a fase de manutenção.
Além do que a utilidade deste ensaio hidropônico para quantificar a colonização e a manutenção bacterianas individuais, é igualmente aplicável a monitorar a associação de espécies múltiplas em raizes de planta. Para demonstrar isso, foram escolhidas três espécies de bactérias isoladas de a. Arabidopsis thaliana cultivadas em solo natural condições laboratoriais20. Os isolados foram cepas de Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans e Curtobacterium oceanosedimentum23. Esta comunidade simplificada foi escolhida devido à capacidade dessas espécies de coexistir em meios de crescimento bacteriano líquido na agitação da cultura (dados não publicados). Além disso, essas três espécies podem ser claramente diferenciadas em meios contendo X-GAL devido a diferenças na morfologia e cor da colônia (figura 4a). O X-GAL não afeta o crescimento relativo de qualquer uma dessas espécies bacterianas (dados não publicados). Estas diferenças na morfologia e na aparência da colônia em X-GAL permitiram-nos contar o CFU/seedling de cada espécie sem seleção antibiótica, mesmo na cocultura da multi-espécie.
A. nicotinovorans, M. oleivorans, e C. oceanosedimentum foram todos colonizados e mantidos na raiz, seja isoladamente ou em Cocultura bacteriana (Figura 4B). Cada espécie apresentou tendências semelhantes em diferentes repetições biológicas e técnicas, mesmo dentro de comunidades mistas. Isto demonstra que o protocolo do ensaio pode ser usado para medir o CFU/raiz relativo ou total de cada espécie. Curiosamente, quando cultivadas isoladamente, nenhuma espécie individual mostrou um aumento apreciável na abundância durante a fase de manutenção, mas o CFU global/raiz da Comunidade combinada aumentou em coculturas, indicando que essas bactérias não proíbem a colonização das outras cepas.
Para todos os experimentos, plantas cultivadas em meios líquidos sem a adição de bactérias como controles negativos foram sempre incluídas. Nenhuma bactéria foi visível nessas raízes de controle durante a microscopia (Figura 2), nem foram detectadas bactérias por meio de plaqueamento para CFU (dados não publicados). Isto indica que a esterilização das sementes e usando as técnicas estéreis durante este ensaio era suficiente manter plantas axênicos a menos que colonized propositadamente.
Figura 1: ensaio para colonização bacteriana e manutenção em raízes de a. Arabidopsis thaliana . Mudas de a. Arabidopsis thaliana cultivadas em malha plástica esterilizada foram transferidas para um meio de crescimento otimizado para bactérias [aqui, 0,1 x lb (caldo Luria) Lennox]. As bactérias colonizaram então a raiz sobre 18 h quando a planta flutuou em agitar o líquido. Após um enxágüe, o flutuador colonizado foi transferido para um meio de crescimento otimizado para plantas (0,5 x MS + MES) para 72 h para testar a manutenção de bactérias nas raízes. O flutuador foi enxaguado então, e a planta com todos os micróbios Unidos foi removida para a análise (quantificação de CFU/seedling ou imagem latente pela microscopia). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: visualizando a colonização por P. Simiae de raízes com microscopia fluorescente. P. Simiae (verde de cor falsa) colonizou raízes de a. Arabidopsis thaliana e foi mantida na raiz após transferência para meio de crescimento vegetal. Coroa de raiz (esquerda), comprimento médio (centro) e ponta (direita) na ampliação de 40x são mostradas a partir de áreas indicadas na Figura 1. As duas fileiras superiores mostram as imagens do brilhante-campo e as fluorescentes das raizes colonizadas por P. Simiae (imaged pela microscopia epifluorescente). As mesmas raízes também foram imaged por um microscópio confocal (centro de duas fileiras). O controle negativo sem bactérias nas duas linhas inferiores não demonstrou colonização. As barras de escala representam 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: quantificação de P. Simiae em raízes de a. Arabidopsis thaliana . Número total de células viáveis de P. Simiae recuperadas por plântulas de A. Arabidopsis thaliana após 18 h de colonização ou 72 h de manutenção. Três repetições biológicas individuais são mostradas, cada uma contendo três repetições técnicas de duas mudas por flutuador. Os números mostrados são os meios das repetições técnicas, enquanto as barras representam erros padrão dos meios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: quantificação da colonização e manutenção de uma comunidade bacteriana mista em raízes de a. Arabidopsis thaliana . (A) colônias de a. nicotinovorans, M. oleivorans e C. oceanosedimentum podem ser diferenciadas em meio de agar contendo X-GAL por morfologia e cor da colônia. (B) raízes de 10 mudas diurnas foram inoculadas com aproximadamente 3x105 CFU/ml de cada uma das três cepas. São mostrados CFU/seedling total recuperados de cada espécie após 18 h de colonização ou 72 h de manutenção quando colonizados isoladamente ou em uma comunidade bacteriana de três membros. Duas repetições biológicas, cada uma compreendendo duas repetições técnicas de duas mudas por flutuador, são mostradas. Os números mostrados são os meios das duas repetições técnicas, enquanto as barras representam erros padrão dos meios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: Ultrasonication interrompe a superfície da raiz. Para desalojar as bactérias da superfície da raiz, as plantas inteiras foram sonicated, e as bactérias foram liberadas no líquido, que foi diluído serialmente e chapeado para a quantificação de CFU/seedling. (A) uma muda intacta é (B) estruturalmente interrompida após o ultrasonication. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Plantas em todos os ambientes interagem com milhares a milhões de diferentes bactérias e fungos5,7. Essas interações podem impactar negativamente e positivamente a saúde das plantas, com potenciais efeitos na produção de culturas e no rendimento alimentar. Trabalhos recentes também sugerem que a colonização variável de culturas por PGPBs pode ser responsável por tamanho de planta imprevisível e produtividade de culturas em ensaios de campo22. Compreender os mecanismos por trás dessas interações pode nos permitir manipular diretamente as comunidades microbianas associadas à planta para auxiliar no desenvolvimento de plantas saudáveis, mesmo estresse24.
Como a colonização bacteriana das raízes e sua manutenção na rizosfera é fundamental para as interações entre plantas e Microbe9, queríamos construir um sistema para visualizar e quantificar de forma revisível esses comportamentos bacterianos. Este sistema hidropônico, flutuante do crescimento das plântulas permite a imagem latente microscópica e a quantificação de populações bacterianas nas raizes de a. Arabidopsis thaliana.
O ensaio de interação planta-micróbe descrito integra elementos benéficos de protocolos experimentais existentes. O método de malha flutuante baseou-se na de Haney et al.13, que mensurou a colonização inicial de P. Simiae WCS417r em mudas estáticas, flutuantes a. Arabidopsis thaliana . Na avaliação deste sistema, foi validada a forte colonização de raízes de a. Arabidopsis thaliana por P. Simiae , apesar de um meio de crescimento diferente de Haney et al. ser utilizado e incluir agitação orbital durante a colonização. A inclusão de agitação orbital durante a colonização e manutenção facilita interações bacterianas que podem não ocorrer na cultura estática, bem como reduzir as condições anóxicas que podem inibir o crescimento bacteriano e a saúde da raiz vegetal13. Também integramos os aspectos dos protocolos focados em microbiologia projetados para apoiar a colonização radicular das plantas por várias espécies bacterianas8,15,25. Isso incluiu um passo de transferência crucial para fora do meio otimizado para a colonização bacteriana e em um meio otimizado para o crescimento das plantas. Esta transferência para o meio fresco também permitirá que os mecanismos subjacentes à manutenção bacteriana nas raízes comecem a ser abordados, uma abordagem que pode fornecer insights sobre a manutenção errática do PGPB em ensaios de campo6.
Este ensaio foi otimizado para o processamento rápido de várias amostras para permitir que as variáveis ambientais e as comunidades bacterianas mistas sejam ensaiadas dentro de uma réplica biológica de vários poços. Enquanto ultrasonication tem sido mostrado anteriormente para ser suficiente para a ruptura e coleta de bactérias rizosfera, a placa de 24 poços e multi-prong chifre acessório acelera processamento de amostra. Esta abordagem de cálculo de viabilidade celular para quantificar a presença bacteriana poderia ser complementada por, ou expandida para incluir, qPCR ou MiSeq 16S rRNA gene comunidade perfilamento para determinar a abundância relativa de comunidades mais diversas de bactérias colonizantes 20. Além, durante a imagem latente, a utilidade de centrar-se sobre apenas três regiões de cada raiz da planta para apressar a visualização da presença bacteriana e a localização nas raizes é destacada. A colonização dessas diferentes regiões radiculares mostrou-se diferente entre as espécies bacterianas14. A imagem latente pode ser executada com as bactérias naturalmente autofluorescent ou as bactérias geneticamente tratável projetadas para expressar uma proteína fluorescente.
A metodologia descrita aqui permite uma avaliação rápida e reprodutível da colonização radicular por bactérias PGPB, mas há limitações às conclusões que podem ser extraídas desses experimentos. Por exemplo, a capacidade de bactérias para a quimiotributação para a raiz é conhecida por ser importante para a colonização de muitas espécies bacterianas de raízes vegetais, mas este processo pode não ser exigido dentro deste sistema de inoculação de agitação. Dito isto, para estudos especificamente interessados em quimiotaxia, a etapa de colonização poderia ser realizada em cultura líquida estática ou na superfície de um meio de agar mole, onde as bactérias poderiam ser chapeadas distantes da planta, exigindo que eles se movam ativamente para o Raiz. Além, um meio de crescimento relativamente rico durante a colonização foi usado para promover o crescimento bacteriano e o acessório da planta; Entretanto, estas concentrações de nutrientes comparativamente elevadas podem proibir a examinação da utilização bacteriana ou da competição para o carbono planta-derivado durante a colonização. Mais uma vez, dependendo dos requisitos de crescimento das bactérias que estão sendo estudadas, o meio de colonização pode ser variado para melhor atender às questões específicas de pesquisa de pesquisadores específicos.
Este sistema foi projetado para ser facilmente capaz de diferentes condições de crescimento bacteriano e vegetal e para a adição de diferentes estressores ambientais e timepoints. No entanto, os métodos descritos aqui são os mais adequados para medir interações bacterianas com as raízes de mudas de a. Arabidopsis thaliana . A coleção foi aperfeiçoada para esta planta, e as plantas maiores ou mais sensíveis podem ser intratáveis no sistema de flutuação do multi-poço-placa. Finalmente, enquanto as bactérias de interesse utilizadas aqui colonizam a raiz da planta na cultura líquida, para outras bactérias pode ser necessário inocular as raízes da planta por imersão-inoculação ou chapeamento em um meio de agar sólido em vez19.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos de pesquisa fornecidos pelo departamento de pesquisa de energia biológica e ambiental (DOE-BER 0000217519 a E.A.S.), a National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 para E. A. S). O SLH também foi apoiado pelo programa de bolsas de pós-graduação da National Science Foundation. Agradecemos ao Dr. Jeffery Dangl por fornecer cepas bacterianas e uma visão inestimável. Agradecemos ao Dr. Andrew Klein e Matthew J. Powers por sugestões experimentais. Finalmente, a SLH gostaria de agradecer as ligações nas redes sociais por nos lembrares que a difusão da ciência é um privilégio e uma responsabilidade, especialmente através de meios criativos e acessíveis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
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