Summary
Aquí describimos un ensayo de crecimiento de plantas hidropónicas para cuantificar la presencia de especies y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de su transferencia a diferentes ambientes de crecimiento.
Abstract
Las bacterias forman microbiomas complejos de rizoesfera según los microbios que interactúan, los organismos más grandes y el entorno abiótico. En condiciones de laboratorio, la colonización de la rizosfera por bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPB) puede aumentar la salud o el desarrollo de plantas anfitrionas en relación con las plantas no colonizadas. Sin embargo, en entornos de campo, los tratamientos bacterianos con PGPB a menudo no proporcionan beneficios sustanciales a los cultivos. Una explicación es que esto puede deberse a la pérdida del PGPB durante las interacciones con microbios del suelo endógenos durante la vida útil de la planta. Esta posibilidad ha sido difícil de confirmar, ya que la mayoría de los estudios se centran en la colonización inicial en lugar del mantenimiento de pgPB dentro de las comunidades rizosferas. Se presume aquí que el montaje, la coexistencia y el mantenimiento de las comunidades bacterianas están moldeados por características deterministas del microambiente de la rizoesfera, y que estas interacciones pueden afectar la supervivencia de PGPB en entornos nativos. Para estudiar estos comportamientos, se optimiza un ensayo hidropónico de crecimiento vegetal utilizando Arabidopsis thaliana para cuantificar y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de la transferencia a un crecimiento diferente Entornos. La reproducibilidad y utilidad de este sistema se validan con el bien estudiado PGPB Pseudomonas simiae. Para investigar cómo la presencia de múltiples especies bacterianas puede afectar a la dinámica de colonización y mantenimiento en la raíz de la planta, una comunidad modelo a partir de tres cepas bacterianas (una Arthrobacter, Curtobacteriumy Microbacterium especies) originalmente aisladas de la rizoesfera A. thaliana. Se ha demostrado que la presencia de estas diversas especies bacterianas se puede medir utilizando este ensayo hidropónico de mantenimiento de plantas, que proporciona una alternativa a los estudios comunitarios bacterianos basados en la secuenciación. Estudios futuros utilizando este sistema pueden mejorar la comprensión del comportamiento bacteriano en microbiomas de plantas multiespecie con el tiempo y en condiciones ambientales cambiantes.
Introduction
La destrucción de cultivos por enfermedades bacterianas y fúngicas da lugar a una menor producción de alimentos y puede perturbar gravemente la estabilidad mundial1. Sobre la base del descubrimiento de que los microbios en suelos supresores son responsables de aumentar la salud vegetal2, los científicos han preguntado si el microbioma vegetal puede ser aprovechado para apoyar el crecimiento de las plantas modificando la presencia y abundancia de particulares especies bacterianas3. Las bacterias que se encuentran para ayudar en el crecimiento o desarrollo de las plantas se denominan colectivamente bacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPB). Más recientemente, los estudios han pasado de identificar simplemente el PGPB potencial a entender cómo las interacciones interkingdom en el suelo, alrededor de las raíces o en la rizosfera (el área que rodea directamente e incluye la superficie de la raíz) pueden estar afectando a PGPB actividad4.
La colonización rizosfera por PGPB puede aumentar la salud o el desarrollo de las plantas anfitrionas en respuesta a diversos factores estresantes en relación con las plantas no colonizadas5. Sin embargo, los resultados son a menudo más variables en las condiciones del suelo nativo en comparación con los observados en los invernaderos y entornos de laboratorio estrechamente controlados6. Una hipótesis para esta diferencia es que el crecimiento o comportamiento de PGPB puede ser inhibido por bacterias o hongos de suelo nativo en los campos7,8. Los efectos beneficiosos de las bacterias rizosfera generalmente dependen de la capacidad de las bacterias a 1) localizar y moverse hacia la raíz, 2) colonizar la raíz a través de la formación de biopelículas, y 3) interactuar con la planta huésped o patógenos a través de la producción de moléculas pequeñas metabolitos7,9. Cualquiera de estos comportamientos de colonización puede verse afectado por la presencia y actividad de los microbios vecinos10.
Diseñamos un sistema para cuantificar y visualizar estas distintasetapas de colonización bacteriana de la rizoesfera (Figura 1). Este enfoque facilitará los estudios que investigan por qué a veces no se observa el mantenimiento a largo plazo de la PGPB después de la transferencia de plantas a nuevos ambientes, como durante la plantación de plántulas preinoculadas. Arabidopsis thaliana como fueron elegidos como modelo de planta debido a su amplio uso en estudios de laboratorio, así como a los amplios datos disponibles sobre sus interacciones microbianas11. Hay tres etapas en el sistema: 1) A. crecimiento thaliana, 2) colonización bacteriana, y 3) mantenimiento bacteriano (ver Figura 1). Debido a que A. thaliana es una planta terrestre, era importante asegurarse de que no estaba sufriendo estrés hídrico indebido en el sistema hidropónico12. Inspirados en los métodos utilizados por Haney et al.13, las plántulas se cultivan en malla de plástico para separar el brote del medio de crecimiento líquido. Este sistema no parece comprometer la salud y el desarrollo del huésped de la planta, y mejora el crecimiento de A. thaliana en líquido11. A medida que el brote de la planta flota sobre la superficie, las raíces están completamente expuestas a la colonización por bacterias inoculadas en el medio de crecimiento bacteriano líquido. Esto permite que las bacterias de interés sean examinadas para la colonización de nutrientes que son más propicios para el crecimiento, mientras que luego cambia las condiciones para permitir que la planta continúe creciendo en un medio nutritivo diseñado para apoyar su crecimiento. Ambas etapas incluyen temblores constantes para prevenir la anoxia de la raíz13. Las bacterias se pueden visualizar o cuantificar desde las raíces de la planta después de la transferencia desde el medio de colonización o el medio de mantenimiento. Este sistema hidropónico es muy flexible, permitiendo que las condiciones experimentales y las tensiones aplicadas se alteren fácilmente dependiendo de los intereses de los investigadores.
Este método descrito es importante en el contexto del cuerpo más amplio de literatura sobre las interacciones entre la planta y los microbios, ya que proporciona un sistema robusto para estudiar estas interacciones en la superficie de la raíz, al mismo tiempo que es personalizable a las preferencias de crecimiento de diferentes bacterias. Los laboratorios de biología vegetal a menudo realizan experimentos de colonización de microbios vegetales en agar sólido, lo que permite sólo el movimiento plano (si eso) de bacterias, al tiempo que requiere la manipulación potencialmente destructiva de las plantas durante la transferencia posterior. Por el contrario, los laboratorios de microbiología han priorizado con frecuencia la salud de las bacterias dentro de sus experimentos, en detrimento de las plantas14,15. Estas diferentes prioridades de los laboratorios centrados en plantas y microbiología han hecho históricamente difícil comparar resultados entre estos grupos, ya que cada uno suele optimizar las condiciones experimentales para optimizar su organismo de interés15. El sistema de crecimiento de plantas de malla flotante descrito aquí previene la inmersión completa de la planta, una ventaja notable para estudios anteriores orientados a la microbiología, al tiempo que optimiza temporalmente el crecimiento y la supervivencia de las bacterias para facilitar la colonización. Por lo tanto, el ensayo que presentamos aquí puede abordar las preocupaciones de ambos biólogos de plantas (sobre la sobrehidratación y la manipulación táctil de la planta) al tiempo que satisface los criterios de los microbiólogos (permitiendo diferentes condiciones de crecimiento bacteriano y múltiples interacciones de especies)7. Este protocolo está diseñado para ser adaptable para su uso con diversas bacterias, plantas y condiciones ambientales.
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Protocol
NOTA: La configuración experimental se describe para mayor claridad y se utiliza para generar los resultados representativos incluidos en este informe, pero las condiciones se pueden modificar según se desee. Todos los pasos deben realizarse utilizando EPI y siguiendo las recomendaciones institucionales y federales para la seguridad, de acuerdo con el estado BSL de las bacterias utilizadas.
1. Caracterización de bacterias
- Determinar la morfología de las bacterias en la placa de agar medio de crecimiento. Resuspenda las células a una OD aproximada de600 o 0,5 y placa un volumen de 1 l en el medio de agar de elección. Añadir X-gal a las placas de agar a una concentración final de 20 mg/ml para diferenciar mejor a los miembros individuales de la comunidad bacteriana específica. Crecer a 24oC o 30oC hasta que se formen colonias, luego toma fotos y notas sobre la morfología de la colonia.
- Definir la correlación entre la densidad óptica de cada cepa bacteriana y el número de Ufc (unidades formadoras de colonias) por ml16. Resuspender las bacterias en 1 ml de agua en una placa de 24 pocillos a una OD aproximadade 600 x 5, realizar dos diluciones seriales, monitorizar600 OD de todas las diluciones y placa cada una para determinar la CFU/ml viable en cada muestra a múltiples densidades ópticas.
- Determinar la tolerancia máxima de sonicación para cada cepa bacteriana. Para ello, las células alícuotas en una placa de 24 pocillos que contienen medio líquido, reservando algunas células como una muestra de control sin sonicar. Usando un ultrasonicador con un accesorio de cuerno de 24 puntas, aplique tres rondas de 12 s de sonicación a 40 amperios con pulsos de 2 s.
NOTA: Se recomienda el uso de un ultrasonicador de 24 pozos para facilitar la multiplexación aguas abajo de las muestras de la planta de procesamiento, pero si uno no está disponible, utilice un ultrasonicador equipado con un microtip y realice cada sonicación de muestra de forma independiente. Use siempre orejeras nominales con al menos 25 NRR de protección. - Realice diluciones seriales de 10 veces de las muestras sonicadas y sin sonicar y atraviese en placas de agar. Determine si hay una reducción en las células viables después de la sonicación. Si es así, utilice una muestra fresca y repita el paso de sonicación utilizando un tiempo de sonicación total reducido o amplitud hasta que el tratamiento no tenga ningún efecto sobre la UFC/ml17final.
2. Preparación de plántulas Arabidopsis thaliana sobre una malla de plástico
- Cree discos de la malla de plástico utilizando un perforador de orificio estándar.
- Recoger los discos en un recipiente de vidrio con una cubierta suelta de papel de aluminio, y esterilizar utilizando un autoclave establecido en un ciclo seco de 20 minutos13.
- Usando pinzas esterilizadas por llama, distribuya aproximadamente 40 discos de malla esterilizada en una sola capa a través de la superficie de una placa de agar medio de crecimiento vegetal. Utilice sales de Murashige y Skoog (MS) de 0,5x, que contengan 500 mg/L de tampón MES [2-(N-morpholino)ácido etanosulfónico] y 1,5% de agar Bacto, como medio de crecimiento vegetal, con 50 g/ml de benomyl añadido al límite de contaminación fúngica de las plántulas.
- Preparar semillas axenicas de A. thaliana como se describió anteriormente17.
- Coloque aproximadamente entre 100 y 300 semillas cada una en tubos de centrífuga individuales en un estante y colóquelas en un recipiente de vidrio o plástico pesado o resellable ("jar") en una campana de humos.
- Con precaución, coloque un vaso de 100 ml de lejía en el frasco, agregue 3 ml de HCl concentrado a la lejía, e inmediatamente sellar el frasco y dejar que los humos esterilizan las semillas durante al menos 4 h.
- Retire cuidadosamente los tubos de las semillas esterilizadas de debajo del frasco y selle.
- Coloque dos semillas en el centro de cada malla. Sellar las placas con cinta quirúrgica e incubar durante 2-6 días a 4 oC en la oscuridad para vernalizar las semillas.
- Para germinar y cultivar plántulas, coloque el lado del agar de la placa hacia abajo en una cámara de crecimiento de la planta durante 8-10 días en entornos de día corto: 9 h de luz a 21 oC y 15 h de oscuridad a 18 oC (Figura1, paso 2).
3. Colonización de plantas en medio de crecimiento bacteriano líquido
- Añadir 1 ml de medio de crecimiento bacteriano a cada pocal de una placa estéril de 24 pocillos, excepto para los pozos de control solo multimedia. Utilizar caldo de lennox luria (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl) como medio de crecimiento bacteriano.
- Transfiera las plántulas germinadas incrustadas en malla de las placas de agar al líquido (Figura1, paso 3a).
- Pele suavemente la malla que contiene dos plántulas germinadas hacia arriba y hacia fuera de la placa de agar usando fórceps esterilizados por llama. Elija malla con plántulas de igual tamaño y sin daños.
- Si la eliminación del agar no es lisa, deseche esa malla y la planta. Transfiera un flotador a cada pozo de líquido de crecimiento bacteriano, lado de la raíz hacia abajo.
- Inocular bacterias en pozos que contienen plántulas flotantes.
- Resuspender las bacterias cultivadas durante la noche en placas de agar a una OD600 equivalente a 108 CFU/ml en el líquido medio de crecimiento bacteriano. Añadir 10 l de suspensión bacteriana a cada pocal para una concentración final de 106 bacterias cFU por poca.
- Si prepara una mezcla de bacterias, resuspenda cada una a la OD600 equivalente a 108 CFU/ml, mezcle en proporciones iguales y agregue 10 ml de la mezcla final por pozo de líquido.
- Selle la placa para un crecimiento estéril. Sin tocar el lado pegajoso, presione cuidadosamente la película permeable al gas a través de la placa. Asegúrese de que cada pozo ha sido sellado individualmente mediante la aplicación de presión alrededor de cada uno de los anillos hechos por los pozos. Vuelva a colocar la tapa de plástico de la placa acurrucada sobre la placa y la película permeable al gas (Figura1, paso 3b).
- Incubar las placas durante 18 h en una cámara de crecimiento vegetal, en las mismas condiciones en que las plántulas fueron germinadas originalmente, excepto en un agitador de placa orbital ajustado a 220 rpm.
4. Mantenimiento de la colonización bacteriana
- Para enjuagar todos los flotadores (plantas en malla), agregue 1 ml de agua estéril a los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos. Retire la película permeable al gas. Usando fórceps estériles, transfiera flotadores a pozos con agua (Figura1, paso 4a). Enjuagar descansando durante 10 min a temperatura ambiente (RT) sin agitación.
NOTA: Para determinar la eficiencia de colonización bacteriana de las raíces en lugar de su capacidad para mantener la colonización con el tiempo, las plantas se pueden sacrificar en este paso llevándolas directamente al paso 5.1. - Llenar los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos con 1 ml de medio de crecimiento vegetal. Transfiera una malla a cada poca. Cubra con un sello permeable al gas e incubar durante 72 h en el agitador de placaorbital a 220 rpm en la cámara de crecimiento de la planta (Figura1, paso 4b).
- Repita el ensaquejo tal como se realiza en el paso 4.1 con flotadores después del período de incubación de 72 h.
5. Recolección de bacterias para recuentos celulares viables
NOTA: El número de bacterias por raíz de plántula se puede determinar en cualquier punto de tiempo de incubación. La colonización se puede controlar entre 0 h y 18 h, mientras que el mantenimiento se puede supervisar a partir de las 18 h. Las plantas destinadas a la toma de imágenes pueden pasar directamente a la sección 6.
- Retire las plántulas de la malla (Figura1, paso 5). Coloque suavemente fórceps esterilizados por llama debajo de las hojas (pero en el lado de la hoja de la malla), y pellizque ligeramente el tallo. Mueve las plántulas hacia arriba y lejos de la malla para desalojar la raíz sin romperla. Si la raíz se rompe, raspe suavemente la parte inferior de malla para recoger toda la longitud.
- Eliminar las bacterias de las raíces de las plantas. Transfiera las bacterias a los pozos de una placa de 24 pocillos que contiene 1 ml de ddH20. Sonicar las muestras como se describe en el paso 1.3.
NOTA: Con un microscopio, busque las bacterias restantes en la superficie de la raíz en una muestra sonicada. Si las bacterias permanecen, aumente el tiempo total de sonicación o intensidad hasta que no queden bacterias unidas, hasta el nivel más alto de sonicación que no afecte el recuento celular viable según lo determinado en la sección 1. - Cuantificar las bacterias en las raíces.
- Realizar diluciones seriales de 10 veces de las muestras sonicadas hasta una dilución de 10-6 en medio de crecimiento bacteriano. Añadir 50 l de cada dilución a placas de agar individuales y esparcir con cuentas de vidrio estériles (o esparcidor bacteriano). Incubar placas a la temperatura óptima para las bacterias hasta que las colonias individuales sean contables.
- Una vez distinguible, contar el número de morfología de cada colonia (según se determina en la sección 1), y calcular la CFU de cada especie bacteriana por plántula. Deseche las muestras que muestren contaminación, ya que la contaminación durante la colonización o el mantenimiento puede afectar la presencia bacteriana.
6. Colección de raíces vegetales intactas para microscopía
- Con fórceps, retire las plántulas de la malla como en la sección 5.
- Transfiera cada planta a portaobjetos de microscopio.
- Coloque la punta de la raíz en la diapositiva y arrastre lejos de la punta para establecer el tiro al ras con la diapositiva, asegurando una raíz enderezada para la mejor imagen. Agregue una gota de agua o un medio de crecimiento de la planta estéril a las muestras para hidratar las interfaces entre los cubreobjetos y los portaobjetos.
- Coloque un cubrecristales justo encima de la corona de la raíz (región en caja superior en la Figura1) y debajo de las hojas de brote para evitar la colocación del cubreobjetos (para permitir la imagen de la corona de raíz), y presione suavemente17.
- Si utiliza bacterias fluorescentes, imagen utilizando filtros de excitación/emisión apropiados para diferenciar las bacterias entre sí y la raíz de la planta18.
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Representative Results
El bien caracterizado PGPB P. simiae WCS417r es conocido por colonizar las raíces de A. thaliana en el cultivo hidropónico. Esta bacteria naturalmente fluorescente se puede visualizar fácilmente mediante microscopía en las raíces de las plántulas después de la colonización (Figura2). Aunque es posible imaginar toda la longitud de estas semilleras A. thaliana' (4-6 mm de longitud) raíces, hacerlo para muchas plantas tomaría una cantidad prohibitiva de tiempo. Debido a que la mayoría de las variaciones entre los puntos de tiempo y las especies de bacterias se pueden capturar mediante imágenes de la corona, el medio y la punta de la raíz14 (indicado por cuadros rojos en la Figura1), estas regiones fueron priorizadas para la toma de imágenes en lugar de la imagen de raíz completa Longitudes. En las imágenes de campo brillante de P. simiae-colonized A. raíces thaliana (Figura2), es posible visualizar el contorno de las raíces y los pelos de raíz; sin embargo, a 18 h de colonización, no es posible diferenciar claramente las raíces colonizadas frente a las no colonizadas utilizando imágenes de campo brillante. Mientras que P. simiae muestra autofluorescencia, utilizamos una cepa también diseñada para expresar una proteína fluorescente amarilla (YFP)19 con longitudes de onda de excitación/emisión de 490-510/520-550 nm18. Un aumento de 100x fue suficiente para identificar claramente agregados individuales y pequeños de células de P. simiae en raíces A. thaliana. Como se muestra en la Figura2, los laboratorios con acceso a microscopios confocales de alta resolución o microscopios de sobremesa menos costosos pueden visualizar la presencia y distribución de bacterias a lo largo de la raíz.
Aunque son informativas en términos de distribución espacial, las imágenes de microscopía no son adecuadas para la cuantificación de células bacterianas. Así recopilamos bacterias de la superficie de lasraíces utilizando ultrasonidos como se describió y validó anteriormente 9,20. Tres rondas de 12 s de ultrasonidos21 a una amplitud de 40 fueron suficientes para interrumpir la superficie exterior de las plántulas de raíz (Figurasuplementaria 1) y eliminar todas las bacterias sin afectar a la viabilidad bacteriana. Se utilizó sonicación en lugar de métodos de latido de cuentas9 para promover mejor la dispersión de agregados bacterianos/biopelículas. La cuantificación de la CFU/raíz después de 18 h de colonización y 72 h adicionales de mantenimiento demostró que P. simiae ambos coloniza y se mantiene en las raíces de A. thaliana en nuestro sistema hidropónico, de plántula flotante (Figura 3). El número de UFC/separación en cualquier punto de tiempo mostró una buena reproducibilidad en todas las réplicas biológicas realizadas en días diferentes (Figura3). La variación observada es común entre los ensayos de colonización de raíces22 y es probable que se deba a pequeñas variaciones de tiempo, condiciones ambientales o tamaño de la raíz de la planta, incluso entre las plántulas germinadas al mismo tiempo y seleccionadas para ser similares en tamaño. Observamos un aumento en el número de UFC/plántulas después de 72 h en medio de mantenimiento en comparación con los números observados en el punto de tiempo posterior a la colonización 18 h (Figura3). Esto indica el crecimiento activo de las bacterias colonizadas en la raíz de la planta ocurrió durante la etapa de mantenimiento.
Además de la utilidad de este ensayo hidropónico para cuantificar la colonización y el mantenimiento bacteriano individual, también es aplicable al seguimiento de la asociación de múltiples especies en las raíces de las plantas. Para demostrarlo, se eligieron tres especies de bacterias aisladas de A. thaliana cultivadas en suelo natural en condiciones de laboratorioencondiciones de laboratorio. Los aislados fueron cepas de Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans y Curtobacterium oceanosedimentum23. Esta comunidad simplificada fue elegida debido a la capacidad de estas especies para coexistir en medios de crecimiento bacteriano líquido en el cultivo de agitación (datos inéditos). Además, estas tres especies se pueden diferenciar claramente en los medios que contienen X-gal debido a las diferencias en la morfología y el color de las colonias (Figura4A). El X-gal no afecta el crecimiento relativo de ninguna de estas especies bacterianas (datos no publicados). Estas diferencias en morfología y apariencia de colonia en X-gal nos permitieron contar la CFU/separación de cada especie sin selección de antibióticos, incluso en el cocultivo multiespecie.
A. nicotinovorans, M. oleivorans, y C. oceanosedimentum fueron todos colonizados y mantenidos en la raíz, ya sea solo sin o en cocultivo bacteriano (Figura 4B). Cada especie mostraba tendencias similares en diferentes réplicas biológicas y técnicas, incluso dentro de comunidades mixtas. Esto demuestra que el protocolo de ensayo se puede utilizar para medir la CFU/raíz relativa o total de cada especie. Curiosamente, cuando se cultiva solo, ninguna especie individual mostró un aumento apreciable en abundancia durante la etapa de mantenimiento, pero la CFU/raíz general de la comunidad combinada aumentó en cocultivos, lo que indica que estas bacterias no prohíben la colonización de las otras cepas.
Para todos los experimentos, siempre se incluyeron plantas cultivadas en medios líquidos sin la adición de bacterias, ya que siempre se incluyeron controles negativos. No se vieron bacterias visibles en estas raíces de control durante la microscopía (Figura2), ni se detectó ninguna bacteria a través del revestimiento de la CFU (datos no publicados). Esto indica que la esterilización de semillas y el uso de las técnicas estériles durante este ensayo fueron suficientes para mantener las plantas axenicas a menos que colonizadas intencionalmente.
Figura 1: Ensayo para la colonización bacteriana y el mantenimiento de las raíces A. thaliana. Las plántulas A. thaliana cultivadas en malla de plástico esterilizado se transfirieron a un medio de crecimiento optimizado para bacterias [aquí, 0,1 x LB (caldo de luria) Lennox]. Las bacterias luego colonizaron la raíz durante 18 h mientras la planta flotaba en el líquido tembloroso. Después de un enjuague, el flotador colonizado se transfirió a un medio de crecimiento optimizado para plantas (0,5x MS + MES) durante 72 h para comprobar el mantenimiento de bacterias en las raíces. El flotador se enjuagó entonces, y la planta con cualquier microbios conectados fue removida para su análisis (cuantificación de la CFU /separación o imagen por microscopía). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización de la colonización de P. simiae de raíces con microscopía fluorescente. P. simiae (verde de color falso) colonizó las raíces de A. thaliana y se mantuvo en la raíz después de la transferencia al medio de crecimiento vegetal. La corona de raíz (izquierda), la longitud media (centro) y la punta (derecha) con un aumento de 40x se muestran en las áreas indicadas en la Figura1. Las dos filas superiores muestran las imágenes fluorescentes y de campo brillante de las raíces colonizadas por P. simiae (imagen de microscopía epigense). Las mismas raíces también fueron imágenes de un microscopio confocal (centro de dos filas). El control negativo de las no bacterias en las dos filas inferiores no mostró colonización. Las barras de escala representan 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de P. simiae en raíces A. thaliana. Número total de células viables de P. simiae recuperadas por plántulas A. thaliana después de 18 h de colonización o 72 h de mantenimiento. Se muestran tres réplicas biológicas individuales, cada una con tres réplicas técnicas de dos plántulas por flotador. Los números mostrados son los medios de las réplicas técnicas, mientras que las barras representan errores estándar de los medios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de la colonización y mantenimiento de una comunidad bacteriana mixta sobre las raíces A. thaliana. (A) Las colonias de A. nicotinovorans, M. oleivorans y C. oceanosedimentum se pueden diferenciar en medio de agar que contiene X-gal por morfología y color de la colonia. (B) Las raíces de las plántulas de 10 días de edad fueron inoculadas con aproximadamente 3x105 CFU/ml de cada una de las tres cepas. Se muestran la UFC total/separación recuperada de cada especie después de 18 h de colonización o 72 h de mantenimiento cuando se coloniza solo o en una comunidad bacteriana de tres miembros. Se muestran dos réplicas biológicas, cada una de las cuales comprende dos réplicas técnicas de dos plántulas por flotador. Los números mostrados son los medios de las dos réplicas técnicas, mientras que las barras representan errores estándar de los medios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Ultrasonidos perturba la superficie de la raíz. Para desalojar las bacterias de la superficie de la raíz, plantas enteras fueron sonicadas, y la bacteria fue liberada en el líquido, que fue diluido en serie y chapado para la cuantificación de CFU / plántulas. (A) Una plántula intacta se interrumpe estructuralmente (B) después de la ultrasonicación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Las plantas en todos los ambientes interactúan con miles a millones de diferentes bacterias y hongos5,7. Estas interacciones pueden afectar negativa y positivamente a la salud de las plantas, con efectos potenciales sobre el rendimiento de los cultivos y la producción de alimentos. Los trabajos recientes también sugieren que la colonización variable de cultivos por PGPB puede explicar el tamaño impredecible de la planta y el rendimiento de los cultivos en los ensayos de campo22. Comprender los mecanismos detrás de estas interacciones podría permitirnos manipular directamente las comunidades microbianas asociadas a las plantas para ayudar en el desarrollo de plantas saludables, incluso bajo estrés24.
Debido a que la colonización bacteriana de las raíces y sumantenimiento en la rizoesfera es fundamental para las interacciones entre la planta y los microbios 9, queríamos construir un sistema para visualizar y cuantificar reproduciblemente estos comportamientos bacterianos. Este sistema hidropónico de crecimiento de plántulas flotantes permite la toma de imágenes microscópicas y la cuantificación de poblaciones bacterianas en las raíces de A. thaliana.
El ensayo de interacción entre la planta y los microbios descrito integra elementos beneficiosos de los protocolos experimentales existentes. El método de malla flotante se basó en el de Haney et al.13, que midió la colonización inicial de P. simiae WCS417r en plántulas estáticas y flotantes A. thaliana. En la evaluación de este sistema, se validó una fuerte colonización de las raíces de A. thaliana por P. simiae, a pesar de que se utilizó un medio de crecimiento diferente de Haney et al. e incluyó el temblor orbital durante la colonización. La inclusión del temblor orbital durante tanto la colonización como durante el mantenimiento facilita interacciones bacterianas que podrían no ocurrir en el cultivo estático, así como reducir las condiciones anóxicas que pueden inhibir tanto el crecimiento bacteriano como la salud de las raíces de las plantas13. También integramos aspectos de protocolos centrados en la microbiologíadiseñados para apoyar la colonización de la raíz vegetal por varias especies bacterianas 8,15,25. Esto incluyó un paso de transferencia crucial fuera del medio optimizado para la colonización bacteriana y en un medio optimizado para el crecimiento de la planta. Esta transferencia al medio fresco también permitirá que los mecanismos subyacentes al mantenimiento bacteriano en las raíces comiencen a ser abordados, un enfoque que puede proporcionar información sobre el mantenimiento errático de PGPB en los ensayos de campo6.
Este ensayo fue optimizado para el procesamiento rápido de múltiples muestras para permitir que las variables ambientales y las comunidades bacterianas mixtas se ensayen dentro de una réplica biológica multipozo. Mientras que la ultrasonicación se ha demostrado previamente para ser suficiente para la interrupción y la recolección de bacterias rizosfera, la placa de 24 pocillos y el accesorio de cuerno multi-prong acelera el procesamiento de muestras. Este enfoque de cálculo de viabilidad celular para cuantificar la presencia bacteriana podría complementarse con, o ampliado para incluir, qPCR o MiSeq 16S rRNA perfilado de la comunidad para determinar la abundancia relativa de comunidades más diversas de bacterias colonizadoras 20. Además, durante la toma de imágenes, se destaca la utilidad de centrarse en sólo tres regiones de cada raíz vegetal para acelerar la visualización de la presencia bacteriana y la localización en las raíces. Se ha demostrado que la colonización de estas diferentes regiones radiculares difiere entre las especies bacterianas14. Las imágenes se pueden realizar con bacterias autofluorescentes naturalmente o bacterias genéticamente tracbles diseñadas para expresar una proteína fluorescente.
La metodología descrita aquí permite una evaluación rápida y reproducible de la colonización de raíces por la bacteria PGPB, pero hay limitaciones a las conclusiones que se pueden extraer de estos experimentos. Por ejemplo, la capacidad de las bacterias para chemotax hacia la raíz es conocida por ser importante para la colonización de muchas especies bacterianas de raíces vegetales, pero este proceso puede no ser necesario dentro de este sistema de inoculación temblorosa. Dicho esto, para estudios específicamente interesados en la quimiotaxis, el paso de colonización podría realizarse en cultivo líquido estático o en la superficie de un medio de agar blando, donde las bacterias podrían ser chapadas distantes de la planta, requiriendo que se muevan activamente hacia el Raíz. Además, un medio de crecimiento relativamente rico durante la colonización se utilizó para promover el crecimiento bacteriano y la unión de las plantas; sin embargo, estas concentraciones comparativamente altas de nutrientes pueden prohibir el examen de la utilización bacteriana o la competencia por el carbono derivado de las plantas durante la colonización. Una vez más, dependiendo de los requisitos de crecimiento de las bacterias que se están estudiando, el medio de colonización se puede variar para adaptarse mejor a las preguntas de investigación particulares de investigadores específicos.
Este sistema fue diseñado para ser fácilmente susceptible a diferentes condiciones de crecimiento bacteriano y vegetal y a la adición de diferentes factores de estrés ambientalyes y puntos de tiempo. Sin embargo, los métodos descritos aquí son los más adecuados para medir las interacciones bacterianas con las raíces de las plántulas A. thaliana. La recolección se ha optimizado para esta planta, y las plantas más grandes o más sensibles pueden ser intratables en el sistema flotante multi-pozo-placa. Por último, mientras que las bacterias de interés utilizadas aquí colonizan la raíz de la planta en cultivo líquido, para otras bacterias puede ser necesario inocular las raíces de la planta por inmersión-inoculación o chapado en un medio de agar sólido en su lugar19.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación proporcionados por el Departamento de Investigación Biológica y Ambiental Energética (DOE-BER 0000217519 a E.A.S.), la Fundación Nacional de Ciencias (INSPIRE IOS-1343020 a E.A.S).. SLH también fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Dr. Jeffery Dangl por proporcionar cepas bacterianas y una visión invaluable. Agradecemos al Dr. Andrew Klein y Matthew J. Powers por sus sugerencias experimentales. Por último, SLH desea agradecer a las conexiones en las redes sociales por recordarnos que la difusión de la ciencia es un privilegio y una responsabilidad, especialmente a través de medios creativos y accesibles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
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