Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Gekweekte primaire of gevestigde cel lijnen worden vaak gebruikt om fundamentele biologische en mechanistische vragen als een eerste aanpak aan te pakken voor het gebruik van dierlijke modellen. Dit protocol beschrijft hoe u hele cel extracten en subcellulaire fracties voor de studies van zink (Zn) en andere sporenelementen met atomaire absorptiespectroscopie voor te bereiden.

Abstract

Overgang metalen zijn essentiële micronutriënten voor organismen, maar kan giftig zijn voor cellen bij hoge concentraties door te concurreren met fysiologische metalen in eiwitten en het genereren van redox stress. Pathologische omstandigheden die leiden tot uitputting van metaal of accumulatie zijn oorzakelijke agentia van verschillende ziekten van de mens. Enkele voorbeelden zijn anemie, acrodermatitis enteropathica, en Wilson en Menkes ' ziekten. Het is daarom belangrijk om de niveaus en het vervoer van overgangsmetalen in biologische monsters met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid te kunnen meten om onderzoek te vergemakkelijken om te onderzoeken hoe deze elementen bijdragen tot normale fysiologische functies en Toxiciteit. Zink (Zn), bijvoorbeeld, is een cofactor in veel zoogdieren eiwitten, participeert in signalering gebeurtenissen, en is een secundaire boodschapper in cellen. In overmaat, is Zn giftig en kan absorptie van andere metalen remmen, terwijl in tekort, het tot een verscheidenheid van potentieel dodelijke voorwaarden kan leiden.

Graphite Furnace atomaire absorptiespectroscopie (GF-AAS) biedt een zeer gevoelige en effectieve methode voor het bepalen van Zn en andere overgang metaal concentraties in diverse biologische monsters. Elektrothermische verneveling via GF-AAS kwantificeert metalen door atomiseren kleine hoeveelheden monsters voor de daaropvolgende selectieve absorptie analyse met behulp van golflengte van excitatie van het element van belang. Binnen de grenzen van de lineariteit van de bier-Lambert wet, de absorptie van licht door het metaal is direct evenredig aan de concentratie van de analyt. Vergeleken met andere methoden om Zn content te bepalen, detecteert GF-AAS zowel vrije als gecomplexeerde Zn in eiwitten en mogelijk in kleine intracellulaire moleculen met een hoge gevoeligheid in kleine sample volumes. Bovendien, GF-AAS is ook gemakkelijker toegankelijk dan inductief gekoppelde plasma massaspectrometrie (ICP-MS) of synchotron-based X-Ray fluorescentie. Bij deze methode wordt de systematische monstervoorbereiding van verschillende gekweekte cel lijnen voor analyses in een GF-AAS beschreven. Variaties in dit spoorelement werden vergeleken in zowel hele cel lysaten en subcellulaire fracties van proliferatie en gedifferentieerde cellen als bewijs van principe.

Introduction

Overgang en zware metalen, zoals Zn, Cu, MN, en Fe, zijn van nature in het milieu gevonden in zowel voedingsstoffen in voedsel en verontreinigende stoffen. Alle levende organismen vereisen verschillende hoeveelheden van deze micronutriënten; echter, blootstelling aan hoge niveaus is schadelijk voor organismen. Metal acquisitie is voornamelijk door het dieet, maar metalen kunnen ook worden ingeademd of geabsorbeerd door de huid1,2,3,4,5. Het is belangrijk op te merken dat de aanwezigheid van metalen in atmosferische deeltjes neemt toe en is grotendeels geassocieerd met gezondheidsrisico's. Wegens antropogene activiteiten, zijn de verhoogde niveaus van zware metalen zoals AG, zoals, cd, CR, Hg, ni, Fe, en PB ontdekt in atmosferische deeltjes kwestie, regenwater, en grond6,7. Deze metalen hebben het potentieel om te concurreren met essentiële fysiologische sporenelementen, met name Zn en Fe, en ze veroorzaken toxische effecten door het inactiveren van fundamentele enzymen voor biologische processen.

Het spoorelement Zn is redox neutraal en gedraagt zich als een Lewis zuur in biologische reacties, waardoor het een fundamentele cofactor die nodig is voor eiwit vouwen en katalytische activiteit in meer dan 10% van zoogdieren eiwitten8,9, 10; Bijgevolg is het essentieel voor diverse fysiologische functies8,11. Echter, net als vele sporenelementen, is er een delicaat evenwicht tussen deze metalen vergemakkelijken van de normale fysiologische functie en het veroorzaken van toxiciteit. Bij zoogdieren, Zn tekortkomingen leiden tot anemie, groeivertraging, hypogonadisme, huidafwijkingen, diarree, alopecia, smaakstoornissen, chronische ontsteking, en verminderde immuun-en neurologische functies11,12, 13,14,15,16,17,18. In overmaat, Zn is chemo en schaadt de absorptie van andere essentiële metalen zoals koper19,20,21.

Bovendien, sommige metalen zoals Cu en FE hebben het potentieel om deel te nemen aan schadelijke reacties. Productie van reactieve zuurstof soorten (Ros) via Fenton chemie kan interfereren met de assemblage van ijzerzwavel cluster eiwitten en Alter lipide metabolisme22,23,24. Om deze schade te voorkomen gebruiken cellen metaal-bindende chaperones en transporteurs om toxische effecten te voorkomen. Ongetwijfeld, metaal homeostase moet strak worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat specifieke soorten cellen te handhaven goede niveaus van metalen. Om deze reden, is er een significante behoefte om technieken voor nauwkeurige meting van spoormetalen in biologische steekproeven vooruit te gaan. Bij het ontwikkelen en rijpen van organismen bestaat er een differentiële biologische behoefte aan sporenelementen op cellulair niveau, in verschillende ontwikkelingsstadia, en in normale en pathologische omstandigheden. Daarom, nauwkeurige bepaling van weefsel en systemische metaal niveaus is noodzakelijk om organisch metaal homeostase te begrijpen.

Graphite Furnace atomaire absorptiespectrometrie (GF-aas) is een zeer gevoelige techniek die wordt gebruikt voor kleine monster volumes, waardoor het ideaal is om de overgang en zware metalen aanwezig zijn in biologische en milieu-monsters te meten25,26 , 27 , 28. Bovendien is het vanwege de hoge gevoeligheid van de techniek aangetoond dat het geschikt is voor het bestuderen van de fijne transport eigenschappen van na+/K+-ATPase en maag H+/K+-ATPase met behulp van Xenopus oöcyten als modelsysteem29. In GF-AAS, absorberen de verstoven elementen binnen een steekproef een golflengte van straling die door een lichtbron wordt uitgezonden die het metaal van belang bevat, met de geabsorbeerde straling evenredig aan de concentratie van het element. Elementaire elektronische excitatie vindt plaats bij absorptie van ultraviolette of zichtbare straling in een gequanteerd proces uniek voor elk chemisch element. In een enkel elektron proces, de absorptie van een foton gaat om een elektron verplaatsen van een lager energieniveau naar een hoger niveau binnen het Atoom en GF-AAS bepaalt de hoeveelheid fotonen geabsorbeerd door het monster, dat evenredig is aan het aantal straling absorberen elementen verstoven in de grafiet buis.

De selectiviteit van deze techniek berust op de elektronische structuur van de atomen, waarin elk element een specifieke absorptie/emissie spectrale lijn heeft. In het geval van Zn, de absorptie golflengte is 213,9 nm en kan precies worden onderscheiden van andere metalen. Globaal, kan GF-AAS worden gebruikt om Zn met adequate grenzen van opsporing (LOD) en hoge gevoeligheid en selectiviteit25te kwantificeren. De veranderingen in de geabsorbeerde golflengte zijn geïntegreerd en gepresenteerd als pieken van energie-absorptie op specifieke en geïsoleerde golflengten. De concentratie van de Zn in een bepaald monster wordt meestal berekend op basis van een standaardkromme van bekende concentraties volgens de wet bier-Lambert, waarbij de absorptie direct evenredig is met de concentratie van Zn in het monster. Echter, de toepassing van de beer-Lambert vergelijking met GF-AAS analyses presenteert ook een aantal complicaties. Bijvoorbeeld, variaties in de verneveling en/of niet-homogene concentraties van de monsters kan invloed hebben op de metalen metingen.

De metalen verneveling vereist voor GF AAS Trace Elemental Analysis bestaat uit drie fundamentele stappen. De eerste stap is desolvatie, waar het vloeibare oplosmiddel wordt verdampt; het verlaten van droge verbindingen na de oven bereikt een temperatuur van rond 100 °C. Vervolgens worden de verbindingen verdampt door ze te verwarmen van 800 tot 1.400 °C (afhankelijk van het te analyseren element) en een gas te worden. Tot slot, de verbindingen in de gasvormige staat zijn verstoven met temperaturen die variëren van 1.500 tot 2.500 ° c. Zoals hierboven besproken, zal het verhogen van de concentraties van een metaal van belang evenredige stijgingen van de absorptie gedetecteerd door de GF-AAS, maar de oven vermindert het dynamisch bereik van de analyse, dat is het werkbereik van concentraties die kunnen worden bepaald door het instrument. Zo, de techniek vereist lage concentraties en een zorgvuldige bepaling van het dynamisch bereik van de methode door het bepalen van de LOD en de grens van lineariteit (LOL) van de beer-Lambert wet. De LOD is de minimumhoeveelheid die nodig is om een stof te kunnen detecteren, gedefinieerd als drie maal de standaarddeviatie van Zn in de matrix. De LOL is de maximale concentratie die kan worden gedetecteerd met behulp van bier-Lambert wet.

In dit werk beschrijven we een standaardmethode om de niveaus van Zn te analyseren in hele cel extracten, cytoplasma en nucleaire fracties, en in het verspreiden en differentiëren van gekweekte cellen (Figuur 1). We hebben de snelle isolatie van kernen protocol aangepast aan verschillende cellulaire systemen om metaal verlies te voorkomen tijdens het monster voorbereiding. De gebruikte cellulaire modellen waren primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, muizen neuroblastoma cellen (N2A of Neuro2A), muizen 3T3 L1 adipocyten, een menselijke niet-tumorigenic borst epitheel cel lijn (MCF10A), en epitheel Madin-Darby de Honds nier ( MDCK) cellen. Deze cellen werden gevestigd van verschillende lineages en zijn goede modellen voor het onderzoeken van Lineage specifieke variaties van metaal niveaus in vitro.

Primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen vormen een goed geschikt in vitro model om skeletspier differentiatie te onderzoeken. De proliferatie van deze cellen is snel wanneer gekweekt onder hoge serum voorwaarden. Differentiatie in de gespierde afstamming wordt vervolgens geïnduceerd door lage serum condities30. De muizen neuroblastoma (N2A) gevestigde cel lijn werd afgeleid van de muis neurale kuif. Deze cellen aanwezig neuronale en amoeboid stamcel morfologie. Bij differentiatie stimulus, de N2A cellen presenteren verschillende eigenschappen van neuronen, zoals neurofilaments. N2a cellen worden gebruikt om de ziekte van Alzheimer te onderzoeken, neuriet uitgroei, en neurotoxiciteit31,32,33. De 3T3-L1 muizen pre-adipocyten gevestigde cel lijn wordt vaak gebruikt om de metabole en fysiologische veranderingen in verband met adipogenesis te onderzoeken. Deze cellen presenteren een fibroblast-achtige morfologie, maar eenmaal gestimuleerd voor differentiatie, ze presenteren enzymatische activering geassocieerd met lipide synthese en triglyceriden accumulatie. Dit kan worden waargenomen als morfologische veranderingen te produceren cytoplasma lipide druppeltjes34,35. MCF10A is een niet-tumor borstklier epitheel cel lijn afgeleid van een premenopauzale vrouw met borstkanker fibrocystische ziekte36. Het is op grote schaal gebruikt voor biochemische, moleculaire, en cellulaire studies met betrekking tot borst carcinogenese zoals proliferatie, cel migratie, en invasie. De Madin-Darby Canine nier (MDCK) epitheel cel lijn is uitvoerig gebruikt om de eigenschappen en moleculaire gebeurtenissen in verband met de oprichting van de epitheel fenotype te onderzoeken. Bij het bereiken van samenvloeiing, deze cellen worden gepolariseerd en vast te stellen cel-cel adhesies, kenmerken van zoogdier epitheelweefsels37.

Om het vermogen van AAS te testen om de niveaus van Zn in zoogdiercellen te meten, analyseerden we hele en subcellulaire fracties (cytosol en Nucleus) van deze vijf cel lijnen. AAS metingen toonden verschillende concentraties van Zn in deze cel types. De concentraties waren lager in het vermenigvuldigen en het onderscheiden van primaire myoblasten (4 tot 7 nmol/mg van proteïne) en hoger in de vier gevestigde cel lijnen (die zich van 20 tot 40 nmol/mg van proteïne uitstrekken). Een kleine niet-significante stijging van Zn niveaus werd ontdekt in het onderscheiden van primaire myoblasten en neuroblastoma cellen in vergelijking met het vermenigvuldigen van cellen. Het tegenovergestelde effect werd ontdekt in onderscheiden adipocyten. Nochtans, vertoonden de vermenigvuldigende 3T3-L1 cellen hogere concentraties van het metaal in vergelijking met onderscheiden cellen. Belangrijk, in deze drie cel lijnen, subcellulaire fractionering toonde aan dat Zn is gedifferentieerd verdeeld in de cytosol en de kern volgens de metabole toestand van deze cellen. Bijvoorbeeld, in het verspreiden zich myoblasten, N2A cellen, en 3T3-L1 pre-adipocyten, is een meerderheid van het metaal gelokaliseerd aan de kern. Bij de inductie van differentiatie met behulp van specifieke cel behandelingen, Zn gelokaliseerd om de cytosol in deze drie soorten cellen. Interessant is dat beide epitheelcellen hogere niveaus van Zn toonden tijdens de proliferatie in vergelijking met bij het bereiken van samenvloeiing, waarin een karakteristieke strakke monolayer werd gevormd. In de proliferatie van Epitheelcellen, de borstklieren cel lijn MCF10A had een gelijke Zn verdeling tussen de cytosol en de kern, terwijl in de nier-afgeleide cel lijn, het grootste deel van het metaal was gelegen in de kern. In deze twee cellen, toen de cellen samenvloeiing bereikten, was Zn voornamelijk gelegen aan de cytosol. Deze resultaten tonen aan dat GF-AAS is een zeer gevoelige en accurate techniek voor het uitvoeren van elementaire analyse in lage opbrengst monsters. GF-AAS in combinatie met subcellulaire fractionering en kan worden aangepast aan de niveaus van sporenmetalen elementen in verschillende cellen en weefsels te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. zoogdiercellen cultuur

  1. Algemene overwegingen
    1. Volg de aseptische technieken voor zoogdiercellen cultuur eerder beoordeeld38.
    2. Handhaaf alle cel lijnen in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 °c. De voorwaarden voor de cultuur van cellen verschillen per type cel. Het is belangrijk om de juiste cultuur voorwaarden te handhaven voor elke gebruikte cel lijn, als variaties van deze procedures zal leiden tot afwijkende fenotypes en falen van de cel cultuur.
    3. Zorg ervoor dat kennis met de cel lijn van belang, en volg de protocollen die voor elk type cel geselecteerd voor specifieke experimenten (zie enkele voorbeelden hieronder).
  2. Algemene procedure voor trypsinization en het doorgeven van aanhangende cellen
    1. Verwijder de cel cultuurmedia van de kweek plaat door aspiratie.
    2. Was de cellen voorzichtig met behulp van PBS zonder calcium en magnesium (5 mL per 10 cm2 cultuur oppervlakte). Voeg de Wash oplossing aan de zijkant van de plaat om te voorkomen dat ontkoppelen cel monolayer; Swirl de plaat om dekking van de oplossing te maximaliseren. Voor Epitheelcellen, is het noodzakelijk om de cellen incuberen voor 10 tot 15 min in de incubator op 37 ° c in PBS om de dissociatie van cellen te vergemakkelijken in de volgende stappen.
    3. Verwijder de wassen oplossing door aspiratie.
    4. Voeg voldoende dissociatie reagens (0,25% trypsine) toe aan de plaat (ongeveer 0,7 mL per 10 cm2). Zachtjes wervelen de plaat om volledige dekking van de cel monolayer te krijgen.
    5. Incubeer de cultuur bij kamertemperatuur voor 2 tot 5 min. De werkelijke incubatietijd varieert met de gebruikte cel lijn, in het geval van epitheelcellen wordt aanbevolen om incuberen voor 10 tot 15 min in de incubator op 37 ° c. Observeer de cellen onder de Microscoop voor cel loslating.
    6. Wanneer de meeste cellen zijn losgemaakt, herstelt u de cel schorsing in 5 mL van de voorverwarmde plating of groeimedium (zie hieronder voor enkele voorbeelden). Mechanisch scheiden cel bosjes door het pipetteren over de cel monolayer meerdere malen.
    7. Breng de schorsing van de cel over op een conische buis van 15 mL en centrifugeer ze bij 1.000 x g voor 2 tot 5 minuten. De snelheid van de centrifuges en de tijd variëren op basis van het type cel. Verwijder de media door zachte aspiratie, die oppassen niet aan de cel pellet touch. Hersuspendeer de cel pellet in 5 tot 10 mL van de juiste voorverwarmde groeimedium en verwijder een monster voor het tellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller.
    8. Gebruik maken van de juiste volume van de cel schorsing om de aanbevolen dichtheid zaad voor elke specifieke cel lijn (zie hieronder voor enkele voorbeelden). Supplement met het voldoende volume van de cultuurmedia volgens de grootte van de cultuur schotel en plaats de cellen terug in de incubator.
  3. Primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen
    1. Voor de aanvang, bereid collageen-gecoate platen voor primaire Myoblast groei. Een oplossing met 0,02% collageen, en 0,05 M azijnzuur in deioniseerde water moet worden gesteriliseerd door filtratie met een 0,22 µm steriel filterapparaat. Incubeer de kweek platen met de collageen oplossing overnachting bij 37 °C.
    2. Op de volgende dag, aspireren de collageen oplossing, laat de platen aan de lucht drogen in de steriele kast en op te slaan bij 4 ° c tot het gebruik.
      Nota: de minimale volumes van collageen zijn: voor 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Zaad primaire myoblasten op 1 x 104 cellen/cm2 in 55 cm2 collageen-gecoate kweek platen. De proliferatie media is Dulbecco modified Eagle medium (DMEM)/Ham F12 nutriënten mengsel cultuurmedia met 20% foetale boviene serum (FBS), 25 ng/mL van recombinant Basic fibroblastic growth factor (FGF), en 100 U/mL van penicilline/streptomycine.
      Opmerking: proliferatie en Stock cellen moeten worden gehandhaafd onder 50% van de confluentie. Het contact van de cel veroorzaakt verplichting van de cellen aan myogene differentiatie en schaadt de de groei capaciteiten van de cultuur.
    4. Voor het differentiëren van de primaire myoblasten, laat de cellen te bereiken 80% tot 100% confluentie, die normaliter optreedt na 48 h van plating. Dan, verandering in differentiatie media (DMEM, 2% het serum van het paard, 1% insuline, transferrin, selenium een supplement, en 100 U/mL van penicilline/streptomycine). Vernieuw de media dagelijks tot de oogst.
  4. Muizen neuroblastoma (N2A)
    1. Plaat N2A cellen met een dichtheid van 2 x 104 cellen/cm2 in de groeimedia, met een mengsel van verminderde serum medium/DMEM met hoge glucose en L-glutamine (1:1, v:v), aan te vullen met 10% FBS en 100 U/ml van penicilline/streptomycine. Behoud van de voorraad cultuur onder 50% confluentie.
    2. Induceren differentiatie van N2A cellen eenmaal confluentie bereikt 25% tot 40%. Verandering in differentiatie media die een mengsel van verminderd-serum middel/DMEM, 1% FBS, en 20 µ M retinol zuur 7 tot 10 dagen bevatten. Vernieuw de media om de andere dag tot cel oogst.
      Nota: aangezien de N2A cellen onderscheiden, worden sommige cellen rond, losmaken gemakkelijk, en kunnen apoptosis ondergaan. Wees voorzichtig bij het opzuigen en het toevoegen van de cultuurmedia aan de platen.
  5. 3T3 L1 muizen pre-adipocyten
    1. Handhaaf muis 3T3/L1 cellen in DMEM met hoge glucose, aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL van penicilline/streptomycine. Het adipogenic proces is afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen; Daarom, laat de voorraad cultuur groeien meer dan 50% confluentie, als een hogere samenvloeiing zal het vermogen van de cellen te differentiëren schaden.
    2. Plaat de cellen op 2 x 104 cellen/cm2. Bij deze dichtheid, zullen de cellen samenloop in 3 dagen bereiken.
    3. Induceren adipogenic differentiatie twee dagen na de cellen te bereiken 100% confluentie. De media van de inductie bestaat uit DMEM bevattend 10% FBS, 10 μg/mL insuline, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyxanthine, 1 μM dexamethason, en 10 μM troglitazone.
    4. Vervang de inductie media na 48 h incubatie naar differentiatie media (DMEM met 10% FBS, en 5 μg/mL insuline). Vernieuw de media om de andere dag tot de oogst. Representatieve monsters van volledige differentiatie worden normaalgesproken verzameld tussen 7 en 10 dagen na adipogenic inductie.
      Nota: aangezien adipogenesis vordert, worden de cellen rond en neigen gemakkelijk los te maken. Wees voorzichtig bij het opzuigen en het toevoegen van de cultuurmedia aan de platen.
  6. MCF10A cellen
    1. Plaat MCF10A cellen in DMEM/F12 (1:1, v:v), aangevuld met 5% FBS, 100 U/mL penicilline/streptomycine, 0,5 µ g/mL hydrocortison, 10 µ g/mL insuline, en 20 ng/mL epidermale groeifactor (EFG). Aanbevolen zaai dichtheid is 1 x 105 cellen/cm2. Onder deze omstandigheden zullen de cellen bereiken 100% confluentie binnen 4 dagen. Vernieuw de media om de 2 tot 3 dagen tot de oogst.
      Opmerking: MCF10A cellen zijn moeilijk los te maken. Het wordt aanbevolen om de cellen incuberen voor 10 tot 15 min bij 37 ° c in PBS vrij van calcium met 0,5 mM EDTA voorafgaand aan trypsinization.
  7. Michielsen-Darby Canine nier cellen (MDCK)
    1. Plaat MDCK cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL van penicilline/streptomycine. Aanbevolen zaaien dichtheid is 1 x 105 cellen/cm2, waar de cellen zal bereiken 100% confluentie binnen 3 dagen. Vernieuw de media om de 2 dagen tot de oogst.
      Opmerking: MDCK cellen zijn moeilijk los te maken. Het wordt aanbevolen om de cellen incuberen voor 5 tot 10 min bij 37 ° c in PBS vrij van calcium en magnesium voorafgaand aan trypsinization. Om te voorkomen dat cel klonteren niet roeren de platen door te raken of schudden van de kolf tijdens het wachten voor de cellen te ontkoppelen.

2. zoogdiercellen cultuur sample voorbereiding voor AAS: hele cel en subcellulaire fractionering

  1. Cultuur de cellen van belang in 55 cm2 platen. Het gebruik van kleinere cultuur platen kan opleveren monsters met een niveau van metalen onder de detectiegrenzen van de GF-AAS.
  2. Hele cel extract
    1. Aspireren de cultuurmedia met behulp van een vacuüm val. Zorg ervoor dat alle sporen van de media te verwijderen. Spoel de cellen van de gewenste tijdpunten of cultuur voorwaarden drie keer met ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium.
    2. Schraap onmiddellijk de cellen van de plaat met behulp van een nieuwe plastic cel schraper in 1 mL PBS vrij van calcium en magnesium. Breng het monster over naar een 1,5 mL micro centrifugebuis en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2.000 x g en aspireren de bovendrijvende. Het protocol kan hier worden onderbroken. Store pellet monsters bij-20 ° c of ga verder met stap 2,4.
  3. Subcellulaire fractionering
    1. Aspireren de cultuurmedia met behulp van een vacuüm val. Zorg ervoor dat alle sporen van de media te verwijderen. Spoel de cellen van de gewenste tijdpunten of cultuur voorwaarden drie keer met ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium. Schraap de cellen van de plaat met 1 mL ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium.
    2. Breng de monsters naar een 1,5 mL micro centrifugebuis en houden op ijs. Centrifugeer voor 10 s bij 10.000 x g. Doorgaan snelle isolatie van kernen als metaalanalyse van cytoplasma en kern fracties gewenst is. Deze procedure zal het potentiële verlies van metalen als gevolg van de extractie van cellen39, 40te minimaliseren.
    3. Verwijder de bovendrijvende door aspiratie en hersuspendeer de cel pellet in 400 l van ijskoude PBS vrij van calcium en magnesium, bevattende 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), een niet-ionische wasmiddel. Breng 100 l naar een nieuwe micro centrifugebuis en beschouw het als de hele cel monster. Deze hoeveelheid vertegenwoordigt 25% van het monster.
    4. Isoleren kernen door het pipetteren van de cel schorsing 5 tot 10 keer op het ijs met een P1000 micropipet tip. Kernen isolatie van epitheelcellen vereist een concentratie van 0,5% NP-40. Bereik cel dissociatie door het passeren van de cel schorsing door middel van een 26 ¾ G naald 10 tot 15 keer, gevolgd door 10 tot 15 passages door middel van een 30 ½ G naald.
      Opmerking: Controleer de kernen integriteit door Lichtmicroscopie met behulp van een 40x doelstelling.
    5. Centrifugeer de resterende cel lysate suspensie (300 l) voor 10 s bij 10.000 x g. De bovendrijvende zal de cytosolische Fractie bevatten. Breng de 300 l over naar een nieuwe micro centrifugebuis.
    6. Spoel de pellet met de kern Fractie in 500 l, zonder calcium en magnesium, met 0,1% NP-40, centrifugeer vervolgens voor 10 s bij 10.000 x g. Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet met de kernen in 100 l van dezelfde oplossing.
      Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° c.
  4. Lyse de cellen door drie sonische cycli (30 s op/30 s weg, bij 50 kHz, 200 W) 5 min. kwantificeren totaal eiwitgehalte in de steekproef door Bradford41.
  5. Voer kwaliteitscontrole van de zuiverheid van de fracties door westelijke vlek uit gebruikend antilichamen specifiek voor of kern (histonen, chromatin remodellerers, kern matrijs proteïnen) of cytosolische fracties (β-tubulin, β-actine) (Figuur 2).
    Opmerking: gebruik geen sonicators met een metalen tip. Deze kunnen de steekproef met metalen vervuilen.

3. Zn content analyse van hele cel en subcellulaire fracties van zoogdiercellen culturen door atomaire absorptiespectroscopie

  1. Mineraliseren de monsters van de cel cultuur (gehele cel of kern fracties) door zure spijsvertering gebruikend een gelijk volume van geconcentreerde HNO3 de rang van het spoor metaal (voorzichtigheid) voor 1 h bij 80 °c, dan overnachten bij 20 °c.
  2. Stop de reactie door 30% van het reactievolume van H2O 2 toe te voegen. Breng het sample volume naar 500 l met 18 MΩ gezuiverd water.
    Opmerking: HNO3 behandeling moet worden gedaan dragen van chemische veiligheidsbril, een gezicht schild voor spatbescherming, handschoenen, en een goedgekeurde damp masker als adequate ventilatie (rook kap) is niet beschikbaar. Het protocol kan hier worden onderbroken. Monsters kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT).
  3. Bereid standaard oplossingen en experimentele monsters voor Zn metingen door AAS uitgerust met een grafietoven.
    1. Gebruik 2% (v/v) HNO3 oplossing in deioniseerde water, afkomstig uit dezelfde partij gebruikt voor de standaard curve als de blanco oplossing voor kalibratie in. Gebruik analytische graad normen verdund in 18 MΩ gezuiverd water.
    2. Maak een standaard van 1.000 ppb van Zn uit een commercieel verkrijgbare 1.000 ppm Zn stockoplossing met 2% (v/v) HNO3 oplossing in deioniseerde water. Bereid werk standaard oplossingen van de 100 ppb standaard door het te verdunnen tot 5, 8, 10, 15, 20, en 25 ppb direct met 2% (v/v) HNO3 oplossing in deioniseerde water. Bereid de Zn normen en de blanco met een 0,1% (1 g/L) mg (nr.3)2 matrix modifier.
      Opmerking: de LOD van Zn is 0,01 ppb (µ g/L). Door de concentratie van de normen te verhogen, werd de grens van de lineariteit van Zn vastgesteld op 20 ppb (Figuur 3).
    3. Meetnorm en steekproeven onder de zelfde geoptimaliseerde voorwaarden: het tarief van de stroom van inleiding van 250 mL/min, injectie temperatuur van 20 °C, en GF temperatuur van 1.800 °C.
      Opmerking: de GF temperatuur werd verhoogd tot 2450 ° c voor cleanout stappen, voorafgaand aan de injectie van een nieuw monster of standaard.
    4. Optimaliseer de lamp (C-HCL) tot een stroom van 20 A, golflengte van 213,9 nm, en spleet van 0,7 nm.
    5. Meet de minerale monsters met behulp van de Zn standaard curve om metalen inhoud te bepalen. Aangezien de kleine volumes worden gemeten, kunnen de steekproeven verdampen als de metingen lange tijdspannes vergen. Daarom is het raadzaam om water toe te voegen aan de monsters. Verdun de monsters met 18 MΩ gezuiverd water behandeld met 0,01% HNO3 (analytische rang) indien de verkregen gegevens buiten de LOD.
      Opmerking: typisch, monsters worden verdund tot een volume van 500 µ L, geplaatst in de geautomatiseerde automatische sampler van de AAS te worden gemeten direct na de standaard curve is vastgesteld. Het vereiste volume moet door de gebruiker worden bepaald en moet rekening houden met de uiteindelijke berekeningen van de concentraties. Het afronden van de Zn-bepalingen door AAS van een compleet experiment in één poging wordt aanbevolen. Het onderbreken van de metingen kan leiden tot grote experimentele variaties en inconsistenties.
  4. Zet de ppb metingen om in de Kies vorm, verkregen uit Zn gemeten via AAS. Beschouw de massa van Zn (65,39 UAM). Verdeel de hoeveelheid ppb verkregen door AAS door 63.390.000. In cellen variëren de Zn-concentraties van eenheden van pmol tot µmol.
    1. Verdeel de concentratie van Zn (pmol of µmol) door de initiële massa van eiwitten in het monster bepaald door Bradford (stap 2,4). Deze berekening maakt de hoeveelheid metaal (pmol of µmol Zn) opgenomen per mg eiwit van het monster.
      Nota: het is belangrijk om de verdunningsfactoren te overwegen die tijdens de metaal bepalingen worden gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We testten het vermogen van de GF-AAS om de minieme niveaus van Zn in zoogdiercellen op te sporen (Figuur 1). Zo hebben we gekweekt primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, en de gevestigde cel lijnen N2A (neuroblastoma afgeleid), 3T3 L1 (adipocyten), MCF10A (borst epitheel), en MDCK cellen (hond nier epitheel). Eerst, isoleerden wij gehele cel, cytosolische, en kern fracties van al deze cel types en evalueerden de zuiverheid van de fracties door westelijke vlek (Figuur 2). Representatieve immunodetection van de Chromatin verbouwer Brg1 en tubulin als markers van kern-en cytosolische fracties, respectievelijk, aangetoond dat de geschiktheid van de subcellular fractionering protocol beschreven in punt 2,3 voor het uitvoeren van de elementaire analyse (Figuur 2). Hele cel en subcellulaire fracties werden voorbereid zoals hierboven beschreven voor GF-AAS-analyses, en de kalibratie van de apparatuur werd uitgevoerd om een typische lineaire standaard curve opleveren (Figuur 3).

Figuur 4 toont representatieve Lichtmicroscopie beelden van proliferatie en gedifferentieerde of Confluent monolayers van elk type cel, en de overeenkomstige Zn niveaus voor deze. Belangrijk is dat alle cel lijnen geanalyseerd in deze studie toonden Zn concentraties in de nM bereik. Nochtans, werd een differentiële distributie van het metaal ontdekt. De gedifferentieerde primaire myotubes stelde hogere niveaus van Zn tentoon dan de proliferatie van cellen (figuur 4a). In het bijzonder, werd veel van het ion gevestigd aan de kern Fractie in zowel het vermenigvuldigen als het onderscheiden myoblasten. Een gelijkaardige subcellulaire distributie van Zn werd ontdekt in de neuroblastoma afgeleide cel lijn N2A (figuur 4b). Metingen toonden echter aan dat N2A cellen Zn niveaus hadden een orde van grootte hoger dan primaire myoblasten. Aan de andere kant, de gevestigde 3T3-L1 cel lijn tentoongesteld hogere niveaus van Zn toen de pre-adipocyten waren proliferatie dan toen ze werden geïnduceerd te differentiëren en te vormen volwassen adipocyten dat lipiden accumuleren (figuur 4c).

We hebben ook Zn content gemeten in twee verschillende gevestigde epitheelcellen: de MCF10A afgeleid van de menselijke borstklier (figuur 4D) en de hond nier-afgeleide MDCK (figuur 4e) cellen. Interessant, in beide gevallen, hogere niveaus van Zn in proliferatie cellen dan in Confluent monolayers werden gedetecteerd. Echter, de epitheelcellen afgeleid van de borstklier toonde metalen niveaus die waren 2-voudige hoger dan die van de nier cellen. MCF10A cellen toonden gelijke niveaus van Zn tussen cytosolische en kern fracties in proliferatie cellen. Zodra MCF10A cellen bereiken samenvloeiing, een 40% daling van de hele cel Zn niveaus werd gedetecteerd, en het metaal bleek het meest geconcentreerd in de cytosolische fractie (figuur 4D). Omgekeerd, vertoonden de proliferatie MDCK cellen hogere niveaus van Zn in de kern Fractie, vergeleken bij de cytosolische Fractie, maar toen de MDCK cellen samenvloeiing bereikten, werd een daling van Zn in gehele cellen ontdekt, met de meerderheid van deze overgangsmetaal waargenomen in de cytosolische fractie (figuur 4e).

Figure 1
Figuur 1: representatief stroomschema voor elementaire (Zn) analyses van zoogdieren gekweekte cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: validatie van de zuiverheid van fracties verkregen via de snelle isolatie van kernen protocol 39 , 40. representatieve westelijke vlek van het onderscheiden van primaire myoblasten tonend de zuiverheid van subcellulaire fracties. De Chromatin remodelleerder enzym Brg1 werd gebruikt om de nucleaire fractie te identificeren, en tubulin werd gebruikt om de cytosolische fractie te identificeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: kalibratiekromme van Zn-normen. Representatieve standaardkromme voor Zn bepaald door GF-AAS. De GF-AAS werd gekalibreerd met de standaard Zn oplossingen verdund op de volgende concentraties: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 en 30 ppb. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: zinkniveaus in verschillende zoogdieren gekweekte cellen. Representatieve licht-en Zn-inhoud in hele cel extracten en cytosolische en kern fracties. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie onafhankelijke biologische repliceert ± SEM. (a) muizen primaire myoblasten vermenigvuldigen en differentiëren voor 2 dagen. (B) muizen neuroblastoma n2a cel lijn voor en na inductie te differentiëren door retinoic zure behandeling. (C) muizen 3T3-L1 pre-adipocyten en 6 dagen na differentiatie. (D) pre-Confluent en Confluent monolayer van de menselijke borstklier epitheel cel lijn MCF10A. (E) pre-Confluent en Confluent monolayer van de nier epitheel cel lijn MDCK. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten ± SE. de t-test van de student toont betekenis, * p ≤ 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Atomaire absorptiespectroscopie is een zeer gevoelige methode voor Zn kwantificering in kleine volume/massa biologische monsters. De beschreven optimalisatie van Zn meting maakt toepassing van deze methode eenvoudig en garandeert ideale analytische condities. Hier, met behulp van GF-AAS, hebben we bepaald de concentratie van Zn in hele cellen, en in cytosolische en nucleaire fracties, uit verschillende cellen lijnen. De resultaten tonen aan dat deze techniek vergelijkbaar is met die verkregen door tl-sondes en ICP-MS. Bijvoorbeeld, toonden verscheidene fluorescente sondes labiele mitochondrial Zn niveaus in de waaier van 0,1 tot 300 P.m., waren de niveaus in Golgi onder het picomolar waaier, en endoplasmatisch reticulum varieerden van 800 tot 5.000 pM42, die met niveaus in overeenstemming zijn aangetroffen in de cytosolische fracties. Bovendien toonde de Zn-responsieve fluorophore FluoZin-3 de accumulatie van labiele Zn in kleine cytosolische blaasjes in MCF10A en in C2C12 cellen43,44, die ook consistent zijn met de Zn gekwantificeerd in het cytoplasma. Bovendien, Zn analyses door ICP-MS uitgevoerd door onze groep toonde aan dat hele cel niveaus Zn in het differentiëren van primaire myotubes45 zijn vergelijkbaar met die verkregen in dit rapport door GF-aas. Bovendien, voorbeelden van Zn bepalingen in C6 rat glioom cellen met behulp van AAS en Zinquin-E46 hebben ook gerenderd soortgelijke reeksen aan die waargenomen in neuroblastoma n2a cellen die hier worden gebruikt.

Tot op heden zijn diverse technieken ontwikkeld om Zn in cellen op te sporen. Echter, GF-AAS blijft een nauwkeurige en zeer gevoelige techniek die niet alleen maakt de opsporing van vrije Zn, maar het meet ook de metalen gecomplexeerd en gebonden aan eiwitten en mogelijk aan kleine moleculen. Onze groep heeft onlangs aangetoond dat metingen uitgevoerd met cel-doorlaatbaar fluorescerende sonde (die een hoge affiniteit om te binden vrije Zn2 +) direct gecorreleerd met de niveaus van Zn gedetecteerd door GF-aas in het verspreiden en differentiëren myoblasten 43. de door deze sondes verkregen resultaten mogen echter niet representatief zijn voor hele cel-of eiwit afhankelijke Zn-concentraties. Bovendien, aangezien Zn bestaat als een niet-redox actieve soorten en als divalent catie, onder fysiologische omstandigheden, de detectie in cellulaire systemen bleef een uitdaging. Nieuwe Zn Imaging technieken zijn beschikbaar gekomen, zoals de State-of-the-art synchotron-gebaseerde X-Ray fluorescentie microscopie, isotopen, en laser ablatie inductief-gekoppelde plasma massaspectrometrie (LA-ICP-MS). Helaas, sommige van deze technieken vereisen middelen ontoegankelijk voor de wetenschappelijke gemeenschap29,42,47,48,49,50.

Studies hebben aangetoond dat ICP-MS een meer precieze techniek is dan AAS, aangezien relatieve standaarddeviatie waarden lager zijn gebleken in ICP-MS-bepalingen voor metalen zoals Zn. De waarschijnlijke verklaring voor dit effect is dat ICP-MS intrinsiek in staat is om chemische interferenties te elimineren, omdat de werkende argon-temperaturen variëren van 5.000 tot 10.000 °C. Sommige chemische obligaties kunnen worden gehandhaafd op 3.000 ° c, die in het bereik voor AAS operatie. Deze obligaties zullen volledig worden verstoord op meer dan 6.000 °C. Daarom, deze hoge temperaturen bereikt in de plasma-toestand door ICP-MS kan elimineren chemische interferenties, wat leidt tot een betere detectiegrenzen51. Bovendien vereist ICP-MS grotere volume monsters ten opzichte van GF-AAS, aangezien deze laatste in staat is met volumes te werken onder 100 l, wat beduidend minder is dan andere spectroscopie methoden zoals AAS, ICP-OES, of ICP-MS. Gezien de kleine volumes die betrokken zijn bij de methode, GF-AAS is de ideale techniek om Zn concentratie te bepalen in biologische monsters, vooral als de analyse omvat subcellulaire fracties, metaal detecties in gezuiverde eiwitten, of kleine variaties in cellulaire metalen inhoud als gevolg van mutaties in vervoerders of metalen bindende eiwitten29,52. Bovendien is de gevoeligheid van de GF-AAS-systeem om te traceren en ultra-Trace concentraties (PG/mL te bepalen ng/mL) is een ander voordeel.

Belangrijke overwegingen moeten worden genomen om de betrouwbaarheid van de GF-AAS gegevens te waarborgen. Deze omvatten adequate kalibratie, integriteit van de grafiet buis, en de selectie van geschikte matrix modifier voor elektrothermische verneveling. Matrix modifiers zijn chemische elementen toegevoegd aan het monster, die de thermische processen die plaatsvinden in de verstuiver beïnvloeden. Deze modifiers minimaliseren het verlies van analyt tijdens pyrolyse en dragen bij tot het verwijderen van matrix componenten. Globaal, kunnen de modifiers de steekproef matrijs veranderen om de matrijs componenten bij lagere temperaturen te verdampen en kan als analyten stabilisatoren werken. In aanvulling op deze overwegingen, is het belangrijk om voldoende optimalisatie van de stappen voor de verstuiver temperatuur programma uit te voeren.

Twee belangrijke overwegingen moeten worden genomen, waaronder 1) tot vaststelling van de optimale pyrolyse temperatuur, die verwijst naar de maximale temperatuur bij de verneveling stap waarbij geen analyt verlies optreedt, en die het mogelijk maakt een maximale absorptie van de analyt met een minimale Achtergrond. Men moet ook overwegen 2) tot vaststelling van de optimale verneveling temperatuur, die verwijst naar de minimale temperatuur waarbij de analyt volledig is verdampt en geregistreerd als een reproduceerbaar signaal of piek. Een van de nadelen van GF-AAS analyses is element interferentie, waarvoor een grondige optimalisering en standaardisatie essentieel zijn voor nauwkeurige metingen. Echter, tot op heden, GF-AAS is een belangrijk instrument in wetenschappelijk onderzoek naar de metaal-ionen te detecteren in diverse biologische monsters. Toekomstige toepassingen van Zn (en andere metalen) detectiemethoden door GF-AAS zullen onder meer het meten van de niveaus van metalen in organen en weefsels verkregen van dierlijke modellen of patiënt biopten om beter te begrijpen specifieke fysiologische behoeften voor spoorelementen. Tot slot, GF-AAS is nauwkeurig, gevoelig, kosteneffectieve en toegankelijke, en deze analytische techniek zal blijven verbeteren naarmate de technologische vooruitgang vooruit voor deze detectie systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Faculty Diversity Scholars Award van de Universiteit van Massachusetts Medical School aan T.P.-B. N.N.-T. wordt ondersteund door SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N wordt ondersteund door de National Science Foundation Grant DBI 0959476. De auteurs zijn dankbaar Dr Daryl A. Bosco voor het verstrekken van de N2A Cell line en aan Daniella Cangussu voor haar technische ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

Biochemie zink atomaire absorptiespectroscopie proliferatie differentiatie zoogdiercellen cultuur subcellulaire fractionering
Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter