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Biochemistry

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Le linee cellulari primarie o consolidate sono comunemente utilizzate per affrontare questioni biologiche e meccanicistiche fondamentali come approccio iniziale prima di utilizzare modelli animali. Questo protocollo descrive come preparare estratti di cellule intere e frazioni subcellulari per studi di zinco (Zn) e altri oligoelementi con spettroscopia di assorbanza atomica.

Abstract

I metalli di transizione sono micronutrienti essenziali per gli organismi, ma possono essere tossici per le cellule ad alte concentrazioni competendo con i metalli fisiologici nelle proteine e generando stress redox. Le condizioni patologiche che portano alla deplezione o all'accumulo di metalli sono agenti causali di diverse malattie umane. Alcuni esempi includono l'anemia, l'enteropatica dell'acrodermatite e le malattie di Wilson e Menkes. È quindi importante essere in grado di misurare i livelli e il trasporto dei metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e accuratezza al fine di facilitare la ricerca esplorando come questi elementi contribuiscano alle normali funzioni fisiologiche e Tossicità. Lo zinco (Zn), ad esempio, è un cofattore in molte proteine dei mammiferi, partecipa a eventi di segnalazione ed è un messaggero secondario nelle cellule. In eccesso, Zn è tossico e può inibire l'assorbimento di altri metalli, mentre in deficit, può portare a una varietà di condizioni potenzialmente letali.

La spettroscopia di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) fornisce un metodo altamente sensibile ed efficace per determinare Zn e altre concentrazioni di metalli di transizione in diversi campioni biologici. L'atomizzazione elettrotermica tramite GF-AAS quantifica i metalli atomizzando piccoli volumi di campioni per la successiva analisi selettiva dell'assorbimento utilizzando la lunghezza d'onda dell'eccitazione dell'elemento di interesse. Entro i limiti della linearità della legge della birra-Lambert, l'assorbanza della luce da parte del metallo è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'analita. Rispetto ad altri metodi per determinare il contenuto di Zn, GF-AAS rileva sia Zn libero e complessato in proteine e possibilmente in piccole molecole intracellulari con alta sensibilità in piccoli volumi di campione. Inoltre, GF-AAS è anche più facilmente accessibile rispetto alla spettrometria di massa plasmatica induttivamente accoppiata (ICP-MS) o alla fluorescenza a raggi X basata su sincrotrone. In questo metodo, viene descritta la preparazione sistematica del campione di diverse linee cellulari coltivate per le analisi in un GF-AAS. Le variazioni di questo oligoelemento sono state confrontate sia nei lisati a cellule intere che nelle frazioni subcellulari di cellule proliferanti e differenziate come prova di principio.

Introduction

La transizione e i metalli pesanti, come Zn, cu, MN e Fe, si trovano naturalmente nell'ambiente in entrambi i nutrienti negli alimenti e negli inquinanti. Tutti gli organismi viventi richiedono quantità diverse di questi micronutrienti; Tuttavia, l'esposizione a livelli elevati è deleteriosa per gli organismi. L'acquisizione di metalli è principalmente attraverso la dieta, ma i metalli possono anche essere inalati o assorbiti attraverso la pelle1,2,3,4,5. È importante notare che la presenza di metalli nelle particelle atmosferiche è in aumento ed è stata in gran parte associata a rischi per la salute. A causa di attività antropogeniche, sono stati rilevati aumenti dei livelli di metalli pesanti come AG, As, CD, CR, Hg, NI, Fe e PB in particolato atmosferico, acqua piovana e suolo6,7. Questi metalli hanno il potenziale per competere con oligoelementi fisiologici essenziali, in particolare Zn e Fe, e inducono effetti tossici inattivando gli enzimi fondamentali per i processi biologici.

L'oligoelemento Zn è redox neutro e si comporta come un acido di Lewis nelle reazioni biologiche, il che lo rende un cofattore fondamentale necessario per la piegatura delle proteine e l'attività catalitica in oltre il 10% delle proteine dei mammiferi8,9, 10; il di conseguenza, è essenziale per diverse funzioni fisiologiche8,11. Tuttavia, come molti oligoelementi, c'è un delicato equilibrio tra questi metalli facilitando la normale funzione fisiologica e causando tossicità. Nei mammiferi, carenze di Zn portano a anemia, ritardo della crescita, ipogonadismo, anomalie della pelle, diarrea, alopecia, disturbi del gusto, infiammazione cronica, e le funzioni immunitarie e neurologiche compromessa11,12, 13,14,15,16,17,18. In eccesso, lo Zn è citotossico e altera l'assorbimento di altri metalli essenziali come il rame19,20,21.

Inoltre, alcuni metalli come Cu e Fe hanno il potenziale per partecipare a reazioni dannose. La produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) tramite la chimica Fenton può interferire con l'assemblaggio delle proteine del cluster di zolfo di ferro e alterare il metabolismo lipidico22,23,24. Per evitare questo danno, le cellule utilizzano chaperoni e trasportatori di legame metallico per prevenire gli effetti tossici. Indubbiamente, l'omeostasi metallica deve essere strettamente controllata per garantire che determinati tipi di cellule mantengano i livelli appropriati di metalli. Per questo motivo, vi è una significativa necessità di avanzare tecniche per la misurazione accurata dei metalli in tracce in campioni biologici. Negli organismi in via di sviluppo e maturi esiste una necessità biologica differenziale per oligoelementi a livello cellulare, in diverse fasi evolutive, e in condizioni normali e patologiche. Pertanto, la determinazione precisa dei livelli di tessuto e di metallo sistemico è necessaria per comprendere l'omeostasi metallica dell'organismo.

La spettrometria di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) è una tecnica altamente sensibile utilizzata per piccoli volumi di campioni, rendendola ideale per misurare la transizione e i metalli pesanti presenti nei campioni biologici e ambientali25,26 , 27 il , 28. Inoltre, a causa dell'elevata sensibilità della tecnica, si è dimostrato appropriato per studiare le proprietà di trasporto fine di na+/K+-ATPase e gastrico H+/K+-ATPase con Xenopus ovociti come sistema modello29. In GF-AAS, gli elementi atomizzati all'interno di un campione assorbono una lunghezza d'onda della radiazione emessa da una fonte di luce contenente il metallo di interesse, con la radiazione assorbita proporzionale alla concentrazione dell'elemento. L'eccitazione elettronica Elementale avviene dopo l'assorbimento di radiazioni ultraviolette o visibili in un processo quantizzato unico per ogni elemento chimico. In un singolo processo di elettroni, l'assorbimento di un fotone coinvolge un elettrone che si muove da un livello di energia inferiore a un livello superiore all'interno dell'atomo e GF-AAS determina la quantità di fotoni assorbita dal campione, che è proporzionale al numero di radiazioni che assorbono elementi atomizzati nel tubo di grafite.

La selettività di questa tecnica si basa sulla struttura elettronica degli atomi, in cui ogni elemento ha una specifica linea spettrale di assorbimento/emissione. Nel caso di Zn, la lunghezza d'onda di assorbanza è 213,9 Nm e può essere precisamente distinta da altri metalli. Complessivamente, GF-AAS può essere utilizzato per quantificare Zn con adeguati limiti di rilevazione (LOD) e alta sensibilità e selettività25. I cambiamenti nella lunghezza d'onda assorbita sono integrati e presentati come picchi di assorbimento di energia a lunghezze di onda specifiche e isolate. La concentrazione di Zn in un dato campione è di solito calcolata da una curva standard di concentrazioni conosciute secondo la legge della birra-Lambert, in cui l'assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di Zn nel campione. Tuttavia, l'applicazione dell'equazione di Beer-Lambert alle analisi di GF-AAS presenta anche alcune complicazioni. Ad esempio, le variazioni nell'atomizzazione e/o nelle concentrazioni non omogenee dei campioni possono influire sulle misurazioni metalliche.

L'atomizzazione del metallo necessaria per l'analisi elementale della traccia GF AAS consiste in tre passaggi fondamentali. Il primo passo è la desolvazione, dove il solvente liquido viene evaporato; lasciando i composti secchi dopo che il forno raggiunge una temperatura di circa 100 ° c. Poi, i composti vengono vaporizzati riscaldandoli da 800 a 1.400 ° c (a seconda dell'elemento da analizzare) e diventare un gas. Infine, i composti allo stato gassoso sono atomizzati con temperature che vanno da 1.500 a 2.500 ° c. Come discusso in precedenza, aumentando le concentrazioni di un metallo di interesse renderà aumenti proporzionali sull'assorbimento rilevato dal GF-AAS, ma il forno riduce la gamma dinamica di analisi, che è il campo di lavoro di concentrazioni che possono essere determinato dallo strumento. Pertanto, la tecnica richiede basse concentrazioni e un'attenta determinazione della gamma dinamica del metodo determinando il LOD e il limite di linearità (LOL) della legge della birra-Lambert. Il LOD è la quantità minima richiesta per una sostanza da rilevare, definita come tre volte la deviazione standard di Zn nella matrice. Il LOL è la massima concentrazione che può essere rilevata utilizzando la legge di birra-Lambert.

In questo lavoro, descriviamo un metodo standard per analizzare i livelli di Zn in estratti di cellule intere, frazioni citoplasmatiche e nucleari, e nel proliferare e differenziare le cellule coltivate (Figura 1). Abbiamo adattato il rapido isolamento del protocollo dei nuclei a diversi sistemi cellulari per prevenire la perdita di metallo durante la preparazione del campione. I modelli cellulari utilizzati erano i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, cellule di neuroblastoma murina (N2A o Neuro2A), murine 3T3 L1 adipociti, una linea cellulare epiteliale del seno non tumorigenico umano (MCF10A), e rene epiteliale Madin-Darby canino ( MDCK). Queste cellule sono state stabilite da diversi lignaggi e sono buoni modelli per indagare le variazioni specifiche di lignaggio dei livelli di metallo in vitro.

I mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo costituiscono un modello in vitro ben adatto per indagare la differenziazione muscolare scheletrica. La proliferazione di queste cellule è veloce quando viene coltivata in condizioni sieriche elevate. La differenziazione nel lignaggio muscolare viene quindi indotta da condizioni sieriche basse30. La linea cellulare stabilita dal neuroblastoma murino (N2A) è derivata dalla cresta neurale del topo. Queste cellule presentano la morfologia delle cellule staminali neuronali e amoeboidi. Dopo lo stimolo di differenziazione, le cellule N2A presentano diverse proprietà dei neuroni, come i neurofilamenti. Le cellule N2a sono usate per indagare la malattia di Alzheimer, la crescita del neurite e la neurotossicità31,32,33. Il 3T3-L1 murino pre-adipociti stabilito linea cellulare è comunemente usato per indagare i cambiamenti metabolici e fisiologici associati con adipogenesi. Queste cellule presentano una morfologia simile a fibroblasti, ma una volta stimolata per la differenziazione, presentano l'attivazione enzimatica associata alla sintesi lipidica e all'accumulo di trigliceridi. Questo può essere osservato come cambiamenti morfologici per produrre goccioline di lipidi citoplasmatici34,35. MCF10A è una linea cellulare epiteliale mammaria non tumorale derivata da una donna premenopausale con malattia fibrocistica mammaria36. È stato ampiamente utilizzato per gli studi biochimici, molecolari e cellulari relativi alla carcinogenesi mammaria, come la proliferazione, la migrazione cellulare e l'invasione. La linea cellulare epiteliale del rene canino Madin-Darby (MDCK) è stata ampiamente utilizzata per indagare le proprietà e gli eventi molecolari associati alla creazione del fenotipo epiteliale. Al raggiungimento della confluenza, queste cellule diventano polarizzate e stabiliscono le adesioni cellulari, caratteristiche dei tessuti epiteliali dei mammiferi37.

Per testare la capacità di AAS di misurare i livelli di Zn nelle cellule di mammiferi, abbiamo analizzato frazioni intere e subcellulari (citosol e nucleo) di queste cinque linee cellulari. Le misurazioni di AAS hanno mostrato diverse concentrazioni di Zn in questi tipi di cellule. Le concentrazioni sono state più basse nel proliferare e differenziare i mioblasti primari (da 4 a 7 nmol/mg di proteina) e più in alto nelle quattro linee cellulari stabilite (che vanno da 20 a 40 nmol/mg di proteina). Un piccolo aumento non significativo dei livelli di Zn è stato rilevato nella differenziazione delle mioblasti primari e delle cellule di neuroblastoma rispetto alle cellule proliferanti. L'effetto opposto è stato rilevato in adipociti differenziati. Tuttavia, le cellule 3T3-L1 proliferanti hanno mostrato concentrazioni più elevate del metallo rispetto alle cellule differenziate. È importante sottolineare che, in queste tre linee cellulari, il frazione subcellulare ha mostrato che Zn è distribuito differenzialmente nel citosol e nel nucleo secondo lo stato metabolico di queste cellule. Per esempio, in proliferare mioblasti, cellule N2A, e 3T3-L1 pre-adipociti, la maggior parte del metallo è localizzato al nucleo. Dopo l'induzione della differenziazione utilizzando trattamenti cellulari specifici, Zn localizzato al citosol in questi tre tipi di cellule. È interessante notare che entrambe le linee cellulari epiteliali hanno mostrato livelli più elevati di Zn durante la proliferazione rispetto a quando raggiungono la confluenza, in cui è stato formato un caratteristico monostrato stretto. Nelle cellule epiteliali proliferanti, la linea cellulare mammaria MCF10A aveva una distribuzione uguale di Zn tra il citosol e il nucleo, mentre nella linea cellulare derivata dal rene, la maggior parte del metallo era situata nel nucleo. In questi due tipi di cellule, quando le cellule raggiunsero la confluenza, Zn era prevalentemente localizzato al citosol. Questi risultati dimostrano che GF-AAS è una tecnica altamente sensibile e accurata per eseguire l'analisi elementare in campioni a basso rendimento. GF-AAS accoppiato con frazione subcellulare e può essere adattato per indagare i livelli di oligoelementi metallici in diverse linee cellulari e tessuti.

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Protocol

1. coltura cellulare dei mammiferi

  1. Considerazioni generali
    1. Seguire le tecniche asettiche per la coltura cellulare dei mammiferi precedentemente recensiti38.
    2. Mantenere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato 5% CO2 a 37 ° c. Le condizioni di coltura delle celle variano per ogni tipo di cella. È importante mantenere condizioni di coltura appropriate per ogni linea cellulare utilizzata, poiché le variazioni di queste procedure porteranno a fenotipi aberranti e al fallimento della coltura cellulare.
    3. Assicurati di conoscere la linea cellulare di interesse e segui i protocolli forniti per ogni tipo di cella selezionato per esperimenti specifici (Vedi alcuni esempi di seguito).
  2. Procedura generale per la tripsinizzazione e il passaggio di cellule aderenti
    1. Rimuovere il supporto di coltura cellulare dalla piastra di coltura per aspirazione.
    2. Lavare le cellule delicatamente utilizzando PBS senza calcio e magnesio (5 mL per 10 cm2 superficie di coltura). Aggiungere la soluzione di lavaggio sul lato della piastra per evitare di distaccare il monostrato delle cellule; ruotare la piastra per massimizzare la copertura della soluzione. Per le cellule epiteliali, è necessario Incubare le cellule per 10-15 min nell'incubatore a 37 ° c in PBS per facilitare la dissociazione delle cellule nei seguenti passaggi.
    3. Rimuovere la soluzione di lavaggio per aspirazione.
    4. Aggiungere abbastanza reagente di dissociazione (0,25% tripsina) alla piastra (circa 0,7 mL per 10 cm2). Ruotare delicatamente la piastra per ottenere una copertura completa del monostrato cellulare.
    5. Incubare la cultura a temperatura ambiente per 2 a 5 min. Il tempo di incubazione effettivo varia con la linea cellulare utilizzata, nel caso di cellule epiteliali si raccomanda di incubare per 10-15 minuti nell'incubatore a 37 ° c. Osservare le cellule sotto il microscopio per il distacco delle cellule.
    6. Quando la maggior parte delle cellule si sono staccate, recuperare la sospensione cellulare in 5 mL della placcatura pre-riscaldato o del mezzo di crescita (Vedi sotto per alcuni esempi). Dissociare meccanicamente i gruppi di cellule pipettando più volte il monostrato cellulare.
    7. Trasferire la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 2 a 5 min. La velocità e il tempo di centrifugazione variano in base al tipo di cellula. Rimuovere il supporto da un'aspirazione delicata, facendo attenzione a non toccare il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare in 5-10 mL del mezzo di crescita pre-riscaldato appropriato e rimuovere un campione per il conteggio utilizzando un emocytometro o un contatore cellulare automatico.
    8. Utilizzare il volume appropriato della sospensione cellulare per seminare la densità raccomandata per ogni linea di cella specifica (vedere di seguito per alcuni esempi). Integrare con il volume adeguato di mezzi di coltura in base alle dimensioni del piatto di coltura e mettere le cellule di nuovo nell'incubatrice.
  3. Mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo
    1. Prima di iniziare, prepara le piastre rivestite di collagene per la crescita primaria del mioblasto. Una soluzione contenente 0,02% di collagene e 0,05 di acido acetico in acqua deionizzata deve essere sterilizzata mediante filtrazione con un dispositivo filtrante sterile da 0,22 μm. Incubare le piastre di coltura con la soluzione di collagene durante la notte a 37 ° c.
    2. Il giorno successivo, aspirare la soluzione di collagene, lasciare asciugare le piastre nell'armadietto sterile e conservare a 4 ° c fino all'uso.
      Nota: i volumi minimi di collagene sono: per 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Mioblasti primari seme a 1 x 104 cellule/cm2 in 55 cm2 piastre di coltura rivestite di collagene. I media di proliferazione sono i media di coltura della miscela nutriente F12 di Dulbecco (DMEM)/Ham, contenenti il 20% di siero bovino fetale (FBS), 25 ng/mL di fattore di crescita fibroblastico di base ricombinante (FGF) e 100 U/mL di penicillina/streptomicina.
      Nota: le cellule proliferative e di scorta devono essere mantenute sotto il 50% della confluenza. Il contatto cellulare induce l'impegno delle cellule alla differenziazione miogenica e compromette le capacità di crescita della cultura.
    4. Per differenziare i mioblasti primari, consentire alle cellule di raggiungere 80% a 100% confluenza, che normalmente si verifica dopo 48 h di placcatura. Quindi, cambiare a media di differenziazione (DMEM, 2% siero di cavallo, 1% di insulina, transferrina, selenio un integratore, e 100 U/mL di penicillina/streptomicina). Aggiornare i media ogni giorno fino al raccolto.
  4. Neuroblastoma murino (N2A)
    1. Piastra N2A celle ad una densità di 2 x 104 cellule/cm2 in media di crescita, contenente una miscela di ridotto-siero medio/DMEM contenente alto glucosio e L-Glutammina (1:1, v:v), supplemento con 10% FBS e 100 U/ml di penicillina/streptomicina. Mantenere la cultura dello stock sotto il 50% di confluenza.
    2. Indurre la differenziazione delle cellule N2A una volta confluenza raggiunto 25% a 40%. Cambiamento di media di differenziazione contenente una miscela di siero ridotto medio/DMEM, 1% FBS e 20 μM di acido retinoico per 7 a 10 giorni. Aggiorna i media ogni altro giorno fino alla raccolta delle cellule.
      Nota: poiché le cellule N2A si differenziano, alcune cellule diventano rotonde, si staccano facilmente e possono subire l'apoptosi. Prestare attenzione quando si aspirano e si aggiungono i supporti di coltura alle piastre.
  5. 3T3 L1 murine pre-adipociti
    1. Mantenere le cellule del mouse 3T3/L1 in DMEM con alto glucosio, integrato con 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina. Il processo adipogenico dipende dalla confluenza delle cellule; Pertanto, non lasciate che la cultura dello stock crescano oltre il 50% di confluenza, poiché una maggiore confluenza compromette la capacità delle cellule di differenziarsi.
    2. Piastra le cellule a 2 x 104 cellule/cm2. A questa densità, le cellule raggiungeranno confluenza in 3 giorni.
    3. Indurre la differenziazione adipogenica due giorni dopo che le cellule raggiungono 100% confluenza. I supporti di induzione sono costituiti da DMEM contenenti 10% FBS, 10 μg/mL di insulina, 0,5 mM 3-isobutilil-1-metilxantina, 1 μM di desametasone e 10 μM di troglitazone.
    4. Sostituire il supporto di induzione dopo 48 h di incubazione ai mezzi di differenziazione (DMEM contenente 10% FBS e 5 μg/mL di insulina). Aggiornare i media ogni altro giorno fino al raccolto. Campioni rappresentativi di differenziazione completa sono normalmente raccolti tra 7 e 10 giorni dopo l'induzione adipogenica.
      Nota: come progredisce l'adipogenesi, le cellule diventano rotonde e tendono a staccarsi facilmente. Prestare attenzione quando si aspirano e si aggiungono i supporti di coltura alle piastre.
  6. Celle MCF10A
    1. Piastre MCF10A celle in DMEM/F12 (1:1, v:v), integrate con 5% FBS, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 0,5 μg/mL di idrocortisone, 10 μg/mL di insulina e 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF). La densità di semina raccomandata è 1 x 105 cellule/cm2. In queste condizioni, le cellule raggiungeranno il 100% di confluenza entro 4 giorni. Aggiornare il supporto ogni 2 o 3 giorni fino al raccolto.
      Nota: le celle MCF10A sono difficili da staccare. Si raccomanda di incubare le cellule per 10-15 min a 37 ° c in PBS senza calcio con 0,5 mM di EDTA prima della tripsinizzazione.
  7. Cellule renali canina Madin-Darby (MDCK)
    1. Cellule di MDCK a piastre in DMEM integrate con 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina. La densità di semina raccomandata è 1 x 105 cellule/cm2, dove le cellule raggiungeranno il 100% di confluenza entro 3 giorni. Aggiornare il supporto ogni 2 giorni fino al raccolto.
      Nota: le celle MDCK sono difficili da staccare. Si raccomanda di incubare le cellule per 5 a 10 min a 37 ° c in PBS senza calcio e magnesio prima della tripsinizzazione. Per prevenire l'aggregazione cellulare non agitare le piastre colpendo o scuotendo il pallone in attesa che le cellule si staccino.

2. preparazione del campione di coltura cellulare dei mammiferi per AAS: frazione di cellule intere e subcellulari

  1. Cultura le cellule di interesse in 55 cm2 piastre. L'uso di piastre di coltura più piccole può produrre campioni con livelli di metalli sotto i limiti di rilevazione del GF-AAS.
  2. Estratto di cellule intere
    1. Aspirare i mezzi di coltura utilizzando una trappola per vuoto. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di supporti. Sciacquare le cellule dai punti temporali o dalle condizioni di coltura desiderati tre volte con PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio.
    2. Raschiare immediatamente le cellule dalla piastra utilizzando un nuovo raschietto in plastica in 1 mL di PBS privo di calcio e magnesio. Trasferire il campione a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 2 min a 2.000 x g e aspirare il surnatante. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni di pellet a-20 ° c o procedere al passo 2,4.
  3. Frazione subcellulare
    1. Aspirare i mezzi di coltura utilizzando una trappola per vuoto. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di supporti. Sciacquare le cellule dai punti temporali o dalle condizioni di coltura desiderati tre volte con PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio. Rasare le cellule dalla piastra con 1 mL di PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio.
    2. Trasferire i campioni in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio. Centrifugare per 10 s a 10.000 x g. Continuare l'isolamento rapido dei nuclei se si desidera l'analisi del metallo delle frazioni citoplasmatiche e nucleari. Questa procedura ridurrà al minimo la potenziale perdita di metalli a causa dell'estrazione delle cellule39, 40.
    3. Rimuovere il supernatante per aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 400 μL di PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio, contenente 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), un detergente non ionico. Trasferire 100 μL in una nuova provetta per microcentrifuga e considerarla come l'intero campione di cellule. Questa aliquota rappresenta il 25% del campione.
    4. Isolare i nuclei pipettando la sospensione cellulare da 5 a 10 volte su ghiaccio con una punta di micropipetta P1000. L'isolamento dei nuclei delle cellule epiteliali richiede una concentrazione di 0,5% NP-40. Raggiungere la dissociazione cellulare passando la sospensione cellulare attraverso un ago 26 3/4 G da 10 a 15 volte, seguita da 10-15 passaggi attraverso un ago 30 1/2 G.
      Nota: verificare l'integrità dei nuclei mediante microscopia leggera utilizzando un obiettivo 40x.
    5. Centrifugare la sospensione di lisato cellulare rimanente (300 μL) per 10 s a 10.000 x g. Il supernatante conterrà la frazione citosolica. Trasferire i 300 μL in una nuova provetta per microcentrifuga.
    6. Sciacquare il pellet contenente la frazione nucleare in 500 μL di PBS privo di calcio e magnesio, contenente 0,1% NP-40, quindi centrifugare per 10 s a 10.000 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet contenente i nuclei in 100 μL della stessa soluzione.
      Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati a-20 ° c.
  4. Lizzare le cellule da tre cicli di sonicazione (30 s on/30 s off, a 50 kHz, 200 W) per 5 min. quantificare il contenuto proteico totale nel campione da Bradford41.
  5. Eseguire il controllo di qualità della purezza delle frazioni da Western blot utilizzando anticorpi specifici per il nucleare (istoni, rimodernatori della cromatina, proteine della matrice nucleare) o frazioni citosoliche (β-tubulina, β-actina) (Figura 2).
    Nota: non utilizzare sonicatori con una punta metallica. Questi possono contaminare il campione con i metalli.

3. analisi del contenuto di Zn di frazioni intere di cellule e subcellulari di colture cellulari di mammiferi mediante spettroscopia di assorbanza atomica

  1. Mineralizzare i campioni di colture cellulari (intere cellule o frazioni nucleari) mediante digestione acida usando un volume uguale di grado di metallo concentrato HNO3 Trace (Caution) per 1 h a 80 ° c, quindi una notte a 20 ° c.
  2. Arrestare la reazione aggiungendo il 30% del volume di reazione di H2O2. Portare il volume del campione a 500 μL con acqua purificata da 18 MΩ.
    Nota: la manipolazione di HNO3 deve essere effettuata indossando occhiali di sicurezza chimici, uno scudo facciale per la protezione da spruzzi, guanti e un respiratore di vapore approvato se la ventilazione adeguata (cappa aspirante) non è disponibile. Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati a temperatura ambiente (RT).
  3. Preparare soluzioni standard e campioni sperimentali per misurazioni Zn da AAS dotati di un forno di grafite.
    1. Utilizzare 2% (v/v) HNO3 soluzione in acqua deionizzata, proveniente dallo stesso lotto utilizzato per la curva standard come la soluzione vuota per la calibrazione in tutto. Utilizzare standard di qualità analitici diluiti in acqua purificata da 18 MΩ.
    2. Preparare uno standard di 1.000 ppb di Zn da una soluzione di stock di Zn 1.000 ppm commercialmente disponibile con 2% (v/v) di soluzione HNO3 in acqua deionizzata. Preparare le soluzioni standard di lavoro dal 100 ppb standard diluendo a 5, 8, 10, 15, 20, e 25 PPB direttamente con 2% (v/v) HNO3 soluzione in acqua deionizzata. Preparare gli standard Zn e lo spazio vuoto con un modificatore di matrice 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 .
      Nota: il LOD di Zn è 0,01 ppb (μg/L). Aumentando la concentrazione degli standard, il limite di linearità di Zn è stato determinato a 20 ppb (Figura 3).
    3. Misurare standard e campioni nelle stesse condizioni ottimizzate: portata di introduzione di 250 mL/min, temperatura di iniezione di 20 ° c e temperatura GF di 1.800 ° c.
      Nota: la temperatura GF è stata aumentata a 2450 ° c per fasi di pulizia, prima dell'iniezione di un nuovo campione o standard.
    4. Ottimizzare la lampada (C-HCL) ad una corrente di 20 A, lunghezza d'onda di 213,9 Nm, e fessura di 0,7 Nm.
    5. Misurare i campioni mineralizzati utilizzando la curva standard Zn per determinare il contenuto metallico. Quando vengono misurati piccoli volumi, i campioni possono evaporare se le misurazioni prendono lunghi periodi di tempo. Pertanto, si consiglia di aggiungere acqua ai campioni. Diluire i campioni con acqua purificata da 18 MΩ trattata con 0,01% HNO3 (grado analitico) se i dati ottenuti superano il LOD.
      Nota: in genere, i campioni vengono diluiti in un volume di 500 μL, collocati nell'autocampione automatico dell'AAS da misurare subito dopo la stabilita della curva standard. Il volume richiesto deve essere determinato dall'utente e dovrebbe prendere in considerazione i calcoli finali delle concentrazioni. Si consiglia di terminare le determinazioni Zn da AAS di un esperimento completo in un tentativo. La sospensione delle misurazioni può comportare notevoli variazioni sperimentali e incongruenze.
  4. Convertire le misurazioni PPB in molarità come ottenuto da Zn misurato tramite AAS. Si consideri la massa di Zn (65,39 AMU). Dividere la quantità di PPB ottenuta da AAS per 63.390.000. Nelle cellule, le concentrazioni di Zn vanno da unità di pmol a μmol.
    1. Dividere la concentrazione di Zn (pmol o μmol) per la massa iniziale di proteine nel campione determinato da Bradford (passaggio 2,4). Questo calcolo renderà la quantità di metallo (pmol o μmol Zn) contenuta per mg di proteina del campione.
      Nota: è importante considerare i fattori di diluizione utilizzati durante le determinazioni metalliche.

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Representative Results

Abbiamo testato la capacità del GF-AAS di rilevare i livelli dei minuti di Zn nelle cellule di mammiferi (Figura 1). Così, abbiamo coltivato i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, e le linee cellulari stabilite N2A (neuroblastoma derivato), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitelio del seno), e cellule MDCK (epitelio del rene del cane). In primo luogo, abbiamo isolato le frazioni intere di cellule, citosoliche e nucleari di tutti questi tipi di cellule e valutato la purezza delle frazioni da Western blot (Figura 2). L'immunorilevazione rappresentativa del Remodeler cromatina Brg1 e della tubulina come marcatori di frazioni nucleari e citosoliche, rispettivamente, ha dimostrato l'idoneità del protocollo di frazionamento subcellulare descritto nel paragrafo 2,3 per eseguire l'Elementale analisi (Figura 2). Le frazioni intere di cellule e subcellulari sono state preparate come descritto sopra per le analisi di GF-AAS e la calibrazione dell'apparecchiatura è stata eseguita per produrre una curva standard lineare tipica (Figura 3).

Figura 4 Mostra immagini di microscopia luce rappresentativa di monostrati proliferanti e differenziati o confluenti di ogni tipo di cellula, e i corrispondenti livelli di Zn per questi. È importante sottolineare che tutte le linee cellulari analizzate in questo studio hanno mostrato concentrazioni di Zn nella gamma nM. Tuttavia, è stata rilevata una distribuzione differenziale del metallo. I miotubi primari differenziati presentavano livelli più elevati di Zn rispetto alle cellule proliferanti (Figura 4a). In particolare, gran parte dello ione era localizzato alla frazione nucleare in entrambi i mioblasti proliferanti e differenzianti. Una simile distribuzione subcellulare di Zn è stata rilevata nella linea cellulare derivata da neuroblastoma N2A (Figura 4B). Tuttavia, le misurazioni hanno mostrato che le cellule N2A avevano livelli di Zn un ordine di grandezza superiore ai mioblasti primari. D'altra parte, la linea di cellule 3T3-L1 stabilita ha mostrato livelli più elevati di Zn quando i pre-adipociti stavano proliferando rispetto a quando sono stati indotti a differenziare e formare adipociti maturi che accumulano lipidi (Figura 4c).

Abbiamo anche misurato il contenuto di Zn in due diverse linee cellulari epiteliali stabilite: la MCF10A derivata dalla ghiandola mammaria umana (Figura 4D) e le cellule MDCK (Figura 4e) derivate dal rene del cane. È interessante notare che, in entrambi i casi, sono stati rilevati livelli elevati di Zn nelle cellule proliferanti rispetto ai monostratori confluenti. Tuttavia, le cellule epiteliali derivate dalla ghiandola mammaria hanno mostrato livelli di metallo che erano 2 volte superiore a quello delle cellule renali. Le cellule MCF10A hanno mostrato livelli uguali di Zn tra le frazioni citosoliche e nucleari nelle cellule proliferanti. Una volta che le cellule MCF10A raggiungono la confluenza, è stata rilevata una diminuzione del 40% nei livelli di Zn della cellula intera, e il metallo è stato trovato per essere più concentrato nella frazione citosolica (Figura 4D). Al contrario, le cellule MDCK proliferanti presentavano livelli più elevati di Zn nella frazione nucleare, rispetto alla frazione citosolica, ma quando le cellule MDCK raggiunsero la confluenza, fu rilevata una diminuzione di Zn in cellule intere, con la maggior parte di questo metallo di transizione osservata nella frazione citosolica (Figura 4E).

Figure 1
Figura 1: diagramma di flusso rappresentativo delle analisi elementali (Zn) delle cellule coltivate di mammiferi. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 2
Figura 2: validazione della purezza delle frazioni ottenute tramite il rapido isolamento del protocollo dei nuclei 39 a , 40. Representative Western blot differenzia i mioblasti primari mostrando la purezza delle frazioni subcellulari. L'enzima rimodernatore della cromatina Brg1 è stato utilizzato per identificare la frazione nucleare e la tubulina è stata utilizzata per identificare la frazione citosolica. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 3
Figura 3: curva di taratura degli standard Zn. Curva standard rappresentativa per Zn determinata da GF-AAS. Il GF-AAS è stato calibrato con le soluzioni standard Zn diluite alle seguenti concentrazioni: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 e 30 PPB. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 4
Figura 4: livelli di zinco in diverse cellule coltivate di mammiferi. Micrografi luminosi rappresentativi e contenuto di Zn in estratti cellulari interi e frazioni citosoliche e nucleari. I dati rappresentano la media di tre replicati biologici indipendenti ± SEM. (A) i mioblasti primari di murine proliferano e differenziano per 2 giorni. B) linea cellulare murina NEUROBLASTOMA N2a prima e dopo l'induzione per differenziare il trattamento con acido retinoico. C) pre-adipociti murine 3T3-L1 e 6 giorni dopo la differenziazione. D) monostrato pre-confluente e confluente della linea cellulare epiteliale mammaria umana MCF10A. E) monostrato pre-confluente e confluente della linea cellulare epiteliale renale MDCK. I dati rappresentano la media di tre esperimenti indipendenti ± SE. lo studente t-test Mostra significato, * p ≤ 0,05. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Discussion

La spettroscopia di assorbanza atomica è un metodo altamente sensibile per la quantificazione di Zn in piccoli campioni biologici di volume/massa. L'ottimizzazione descritta della misura Zn rende semplice l'applicazione di questo metodo e garantisce condizioni analitiche ideali. Qui, utilizzando GF-AAS, abbiamo determinato la concentrazione di Zn in cellule intere, e in frazioni citosoliche e nucleari, da diverse linee cellulari. I risultati dimostrano che questa tecnica rende paragonabile a quelle ottenute da sonde fluorescenti e ICP-MS. Per esempio, diverse sonde fluorescenti hanno mostrato livelli di Zn mitocondriali labili nell'intervallo di 0,1 a 300 pM, i livelli nei Golgi erano al di sotto della gamma picomolare e il reticolo endoplasmatico variava da 800 a 5.000 pM42, che sono coerenti con i livelli rilevati nelle frazioni citosoliche. Inoltre, il fluozin-3 fluoroforo reattivo Zn ha mostrato accumulo di Zn labile in piccole vescicole citosoliche in MCF10A e in C2C12 cellule43,44, che sono anche coerenti con la Zn quantificata nel citoplasma. Inoltre, le analisi Zn di ICP-MS eseguite dal nostro gruppo hanno mostrato che i livelli interi di cellule Zn nella differenziazione dei miotubi primari45 sono simili a quelli ottenuti in questo rapporto da GF-AAS. Inoltre, esempi di determinazioni di Zn in cellule di glioma del ratto C6 utilizzando AAS e Zinquin-E46 hanno anche reso intervalli simili a quelli osservati nelle cellule N2a di neuroblastoma utilizzati qui.

Fino ad oggi, diverse tecniche sono state sviluppate per rilevare Zn nelle cellule. Tuttavia, GF-AAS rimane una tecnica accurata e altamente sensibile che non solo consente il rilevamento di Zn libero, ma misura anche il metallo complessato e legato alle proteine e potenzialmente a piccole molecole. Il nostro gruppo ha recentemente mostrato che le misurazioni effettuate con sonda fluorescente permeabile alle cellule (che ha un'alta affinità per legare libero Zn2 +) direttamente correlata con i livelli di Zn rilevati da GF-AAS in proliferando e differenziando mioblasti 43. Tuttavia, i risultati ottenuti da queste sonde non possono essere rappresentativi delle concentrazioni di Zn di cellule intere o associate a proteine. Inoltre, poiché Zn esiste come una specie non redox attiva e come catione divalente, in condizioni fisiologiche, la sua rilevazione nei sistemi cellulari è rimasta una sfida. Sono diventate disponibili nuove tecniche di imaging Zn, come la microscopia a fluorescenza a raggi X a base di sincrotrone, i radioisotopi e la spettrometria di massa al plasma ad accoppiamento induttivo con ablazione laser (LA-ICP-MS). Sfortunatamente, alcune di queste tecniche richiedono risorse inaccessibili alla comunità scientifica29,42,47,48,49,50.

Studi hanno dimostrato che ICP-MS è una tecnica più precisa di AAS, come valori di deviazione standard relativi hanno dimostrato di essere più basso nelle determinazioni ICP-MS per i metalli come Zn. La spiegazione probabile per questo effetto è che l'ICP-MS è intrinsecamente in grado di eliminare le interferenze chimiche, poiché le temperature di argon operative vanno da 5.000 a 10.000 ° c. Alcuni legami chimici possono essere mantenuti a 3.000 ° c, che è nell'intervallo per l'operazione AAS. Queste obbligazioni saranno completamente perturbate a oltre 6.000 ° c. Pertanto, queste alte temperature raggiunte nello stato plasmatico da ICP-MS possono eliminare le interferenze chimiche, portando a migliori limiti di rilevazione51. Inoltre, ICP-MS richiede campioni di volume più grandi rispetto a GF-AAS, in quanto quest'ultimo è in grado di funzionare con volumi inferiori a 100 μL, che è significativamente inferiore rispetto ad altri metodi spettroscopici come AAS, ICP-OES o ICP-MS. Dati i piccoli volumi coinvolti nel metodo, GF-AAS è la tecnica ideale per determinare la concentrazione di Zn in campioni biologici, principalmente se l'analisi coinvolge frazioni subcellulari, rilevamenti metallici in proteine purificate, o piccole variazioni nel cellulare contenuto metallico dovuto a mutazioni di trasportatori o di proteine leganti il metallo29,52. Inoltre, la sensibilità del sistema GF-AAS per determinare le concentrazioni di tracce e ultra-tracce (pg/mL a ng/mL) è un altro vantaggio.

Devono essere prese importanti considerazioni per garantire l'affidabilità dei dati GF-AAS. Questi includono una calibrazione adeguata, l'integrità del tubo di grafite e la selezione di un modificatore di matrice adatto per l'atomizzazione elettrotermica. I modificatori di matrici sono elementi chimici aggiunti al campione, che influenzano i processi termici che si svolgono nell'atomizzatore. Questi modificatori riducono al minimo la perdita di analita durante la pirolisi e contribuiscono alla rimozione dei componenti della matrice. Nel complesso, i modificatori possono modificare la matrice del campione per evaporare i componenti della matrice a temperature più basse e possono funzionare come stabilizzatori dell'analita. Oltre a queste considerazioni, è importante eseguire un'adeguata ottimizzazione dei passaggi per il programma di temperatura atomizzatore.

Devono essere prese due considerazioni principali, tra cui 1) che stabiliscono la temperatura di pirolisi ottimale, che si riferisce alla temperatura massima alla fase di atomizzazione in cui non si verifica alcuna perdita di analiti, e che consente una massima assorbanza dell'analita con minime origini. Si dovrebbe anche considerare 2) stabilendo la temperatura di atomizzazione ottimale, che si riferisce alla temperatura minima alla quale l'analita è completamente evaporato e registrato come un segnale o picco riproducibile. Uno degli svantaggi delle analisi di GF-AAS è l'interferenza degli elementi, per cui un'accurata ottimizzazione e standardizzazione sono essenziali per misurazioni accurate. Tuttavia, ad oggi, GF-AAS rappresenta uno strumento importante nella ricerca scientifica per rilevare gli ioni metallici in diversi campioni biologici. Le future applicazioni dei metodi di rilevazione di Zn (e di altri metalli) da parte di GF-AAS comprenderanno la misurazione dei livelli di metalli in organi e tessuti ottenuti da modelli animali o biopsie dei pazienti per comprendere meglio le esigenze fisiologiche specifiche degli oligoelementi. In conclusione, GF-AAS è accurato, sensibile, conveniente e accessibile, e questa tecnica analitica continuerà a migliorare come avanzamenti tecnologici si muovono in avanti per questi sistemi di rilevamento.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla facoltà diversità studiosi Award dalla University of Massachusetts Medical School a T.P.-B. N.N.-T. è supportata da SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N è supportato dalla National Science Foundation Grant DBI 0959476. Gli autori sono grati al dottor Daryl A. bosco per aver fornito la linea cellulare N2A e a Daniella Cangussu per il suo supporto tecnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

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