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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Linhas celulares primárias ou estabelecidas cultivadas são comumente usadas para abordar questões biológicas e mecanísticas fundamentais como uma abordagem inicial antes de usar modelos animais. Este protocolo descreve como preparar extratos de células inteiras e frações subcelulares para estudos de zinco (Zn) e outros oligoelementos com espectroscopia de absorvância atômica.

Abstract

Os metais de transição são micronutrientes essenciais para os organismos, mas podem ser tóxicos para as células em altas concentrações, competindo com metais fisiológicos em proteínas e gerando estresse redox. As condições patológicas que levam à depleção ou acúmulo de metal são agentes causais de diferentes doenças humanas. Alguns exemplos incluem anemia, Acrodermatite enteropática, e as doenças de Wilson e Menkes. Portanto, é importante poder medir os níveis e o transporte de metais de transição em amostras biológicas com alta sensibilidade e precisão, a fim de facilitar a pesquisa explorando como esses elementos contribuem para as funções fisiológicas normais e Toxicidade. O zinco (Zn), por exemplo, é um cofator em muitas proteínas de mamíferos, participa em eventos de sinalização, e é um mensageiro secundário nas pilhas. Em excesso, Zn é tóxico e pode inibir a absorção de outros metais, enquanto no déficit, pode levar a uma variedade de condições potencialmente letais.

A espectroscopia de absorção atômica do forno de grafite (GF-AAS) fornece um método altamente sensível e efetivo para a determinação de Zn e outras concentrações metálicas de transição em diversas amostras biológicas. A atomização Eletrotérmica via GF-AAS quantifica metais por atomização de pequenos volumes de amostras para posterior análise seletiva de absorção usando o comprimento de onda da excitação do elemento de interesse. Dentro dos limites da linearidade da lei Beer-Lambert, a absorvância da luz pelo metal é diretamente proporcional à concentração do analito. Comparado a outros métodos de determinação do teor de Zn, o GF-AAS detecta Zn livre e complexado em proteínas e possivelmente em pequenas moléculas intracelulares com alta sensibilidade em pequenos volumes amostrais. Além disso, GF-AAS também é mais prontamente acessível do que a espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS) ou fluorescência de raios-X à base de síncrotron. Neste método, descreve-se a preparação sistemática de amostras de diferentes linhagens de células cultivadas para análises em GF-AAS. As variações neste elemento de traço foram comparadas em lysates inteiros da pilha e em frações subcellular de pilhas proliferating e diferenciadas como a prova do princípio.

Introduction

A transição e os metais pesados, como Zn, UC, MN e Fe, são encontrados naturalmente no ambiente em ambos os nutrientes em alimentos e poluentes. Todos os organismos vivos necessitam de diferentes quantidades destes micronutrientes; no entanto, a exposição a níveis elevados é deletério para os organismos. A aquisição de metais é principalmente através da dieta, mas os metais também podem ser inalados ou absorvidos pela pele1,2,3,4,5. É importante notar que a presença de metais em partículas atmosféricas está aumentando e tem sido largamente associada a riscos para a saúde. Devido às atividades antropogênicas, o aumento dos níveis de metais pesados como o AG, as, CD, CR, Hg, Ni, Fe e PB foram detectados em material particulado atmosférico, água da chuva e solo6,7. Estes metais têm o potencial de competir com oligoelementos fisiológicos essenciais, particularmente Zn e Fe, e induzem efeitos tóxicos pela inativação de enzimas fundamentais para processos biológicos.

O elemento traço Zn é redox neutro e se comporta como um ácido de Lewis em reações biológicas, o que o torna um cofator fundamental necessário para a dobradura de proteínas e atividade catalítica em mais de 10% das proteínas de mamíferos8,9, de 10; Conseqüentemente, é essencial para diversas funções fisiológicas8,11. No entanto, como muitos oligoelementos, há um equilíbrio delicado entre estes metais facilitando a função fisiológica normal e causando toxicidade. Em mamíferos, as deficiências de Zn levam à anemia, retardo de crescimento, hipogonadismo, anormalidades cutâneas, diarréia, alopecia, distúrbios do paladar, inflamação crônica e funções imunes e neurológicas comprometidas11,12, 13,14,15,16,17,18. Em excesso, o Zn é citotóxico e prejudica a absorção de outros metais essenciais como o cobre19,20,21.

Adicionalmente, alguns metais como o UC e o FE têm o potencial para participar em reações prejudiciais. A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) via química de Fenton pode interferir com a montagem de proteínas cluster de enxofre de ferro e alterar o metabolismo lipídico22,23,24. Para evitar este dano, as células utilizam chaperonas de ligação metálica e transportadores para evitar efeitos tóxicos. Indubitàvelmente, a homeostase do metal deve ser controlada firmemente para assegurar-se de que os tipos específicos da pilha mantenham níveis apropriados de metais. Por este motivo, há uma necessidade significativa de avançar técnicas para a medida exata de metais de traço em amostras biológicas. Em desenvolver e em organismos maduros existe uma necessidade biológica diferencial para oligoelementos no nível celular, em estágios desenvolventes diferentes, e em circunstâncias normais e patológicas. Conseqüentemente, a determinação precisa de níveis do tecido e do metal sistemático é necessária para compreender a homeostase do metal do organismo.

A espectrometria de absorção atômica da fornalha da grafita (GF-AAS) é uma técnica altamente sensível usada para volumes pequenos da amostra, fazendo o ideal medir a transição e os metais pesados atuais em amostras biológicas e ambientais25,26 , 27 anos de , 28. Além disso, devido à alta sensibilidade da técnica, demonstrou-se apropriado para o estudo das propriedades de transporte fino de na+/K+-ATPase e H+/k+-ATPase gástrica usando Xenopus Os oócitos como um sistema modelo29. Em GF-AAS, os elementos atomizados dentro de uma amostra absorvem um comprimento de onda de radiação emitida por uma fonte luminosa contendo o metal de interesse, com a radiação absorvida proporcional à concentração do elemento. A excitação eletrônica elementar ocorre em cima da absorção da radiação ultravioleta ou visível em um processo quantized original para cada elemento químico. Em um único processo de elétron, a absorção de um fóton envolve um elétron movendo-se de um nível de energia mais baixo para um nível mais alto dentro do átomo e GF-AAS determina a quantidade de fótons absorvidos pela amostra, que é proporcional ao número de radiação absorvendo elementos atomizados no tubo de grafite.

A seletividade desta técnica depende da estrutura eletrônica dos átomos, em que cada elemento tem uma linha espectral específica de absorção/emissão. No caso do Zn, o comprimento de onda da absorvência é 213,9 nm e pode ser distinguido precisamente de outros metais. No geral, o GF-AAS pode ser utilizado para quantificar o Zn com limites adequados de detecção (LOD) e alta sensibilidade e seletividade25. As mudanças no comprimento de onda absorvido são integradas e apresentadas como picos de absorção de energia em comprimentos de onda específicos e isolados. A concentração do Zn em uma determinada amostra é geralmente calculada a partir de uma curva padrão de concentrações conhecidas de acordo com a lei Beer-Lambert, na qual a absorvência é diretamente proporcional à concentração de Zn na amostra. No entanto, a aplicação da equação de Beer-Lambert às análises de GF-AAS também apresenta algumas complicações. Por exemplo, variações na atomização e/ou concentrações não homogêneas das amostras podem afetar as medições metálicas.

A atomização do metal exigida para a análise elementar do traço do GF AAS consiste em três etapas fundamentais. O primeiro passo é a desolvação, onde o solvente líquido é evaporado; deixando compostos secos após o forno atinge uma temperatura de cerca de 100 ° c. Em seguida, os compostos são vaporizado por aquecendo-os de 800 a 1.400 ° c (dependendo do elemento a ser analisado) e tornar-se um gás. Finalmente, os compostos no estado gasoso são atomizados com temperaturas que variam de 1.500 a 2.500 ° c. Como discutido acima, o aumento das concentrações de um metal de interesse irá render aumentos proporcionais na absorção detectada pelo GF-AAS, mas o forno reduz a gama dinâmica de análise, que é a gama de trabalho de concentrações que podem ser determinado pelo instrumento. Assim, a técnica requer baixas concentrações e uma cuidadosa determinação da amplitude dinâmica do método, determinando o LOD e o limite de linearidade (LOL) da lei Beer-Lambert. O LOD é a quantidade mínima necessária para que uma substância seja detectada, definida como três vezes o desvio padrão de Zn na matriz. O LOL é a concentração máxima que pode ser detectada usando a lei de Beer-Lambert.

Neste trabalho, descrevemos um método padrão para analisar os teores de Zn em extratos celulares inteiros, frações citoplasmáticas e nucleares, e em proliferar e diferenciar células cultivadas (Figura 1). Adaptamos o rápido isolamento do protocolo de núcleos a diferentes sistemas celulares para evitar a perda de metal durante a preparação da amostra. Os modelos celulares utilizados foram mioblasts primários derivados de células de satélite de camundongo, células de neuroblastoma murino (N2A ou Neuro2A), adipócitos murino 3T3 L1, uma linha celular epitelial de mama não tumorigênica humana (MCF10A) e rim canino Madin-Darby epitelial ( MDCK). Estas pilhas foram estabelecidas das linhagens diferentes e são bons modelos para investigar variações específicas da linhagem de níveis do metal in vitro.

Os mioblastos preliminares derivados das pilhas satélites do rato constituem um modelo in vitro well-adequado para investigar a diferenciação do músculo esqueletal. A proliferação destas pilhas é rápida quando cultivada condições elevadas do soro. A diferenciação na linhagem muscular é então induzida por baixas condições do soro30. O neuroblastoma murino (N2A) estabeleceu a linha celular foi derivado da crista neural do rato. Estas pilhas apresentam a morfologia neuronal e amebóide da pilha de haste. Em cima do estímulo da diferenciação, as pilhas N2A apresentam diversas propriedades dos neurônios, tais como neurofilamentos. N2A células são usadas para investigar a doença de Alzheimer, o crescimento do neurite e a neurotoxicidade31,32,33. Os pré-adipócitos murinos de 3T3-L1 estabelecidos na linhagem celular são comumente utilizados para investigar as alterações metabólicas e fisiológicas associadas à adipogênese. Essas células apresentam uma morfologia fibroblástica, mas uma vez estimuladas para diferenciação, apresentam ativação enzimática associada à síntese lipídica e acúmulo de triglicerídeos. Isso pode ser observado como alterações morfológicas para produzir gotas lipídicas citoplasmáticas34,35. MCF10A é uma linha celular epithelial mamária do não-tumor derivada de uma mulher na pré-menopausa com doença fibrocística mamária36. Tem sido amplamente utilizado para estudos bioquímicos, moleculares e celulares relacionados à carcinogênese mamária, como proliferação, migração celular e invasão. O rim canino de Madin-Darby (MDCK) linha de pilha epithelial foi usado extensivamente para investigar as propriedades e os eventos moleculars associados com o estabelecimento do phenotype epithelial. Ao chegar à confluência, estas células tornam-se polarizadas e estabelecem aderências de células celulares, características dos tecidos epiteliais de mamíferos37.

Para testar a capacidade de AAS para medir os níveis de Zn em células de mamíferos, analisamos frações inteiras e subcelulares (citosol e núcleo) dessas cinco linhagens celulares. As medidas do AAS mostraram concentrações diferentes de Zn nestes tipos da pilha. As concentrações foram menores em proliferating e diferenciando-se os mioblastos preliminares (4 a 7 nmol/mg da proteína) e mais altamente nas quatro linhas de pilha estabelecidas (que variam de 20 a 40 nmol/magnésio da proteína). Um aumento não-significativo pequeno em níveis de Zn foi detectado em diferenciar mioblastos preliminares e pilhas do neuroblastoma quando comparado às pilhas proliferating. O efeito oposto foi detectado em adipocytes diferenciados. Entretanto, as pilhas 3T3-L1 proliferating exibiram umas concentrações mais elevadas do metal comparadas às pilhas diferenciadas. É importante ressaltar que, nessas três linhagens celulares, o fracionamento subcelular mostrou que o Zn é distribuído diferencialmente no citosol e no núcleo de acordo com o estado metabólico dessas células. Por exemplo, em proliferating mioblasts, células N2A, e 3T3-L1 pré-adipócitos, a maioria do metal é localizada ao núcleo. Em cima da indução da diferenciação usando tratamentos de pilha específicos, Zn localizado ao citosol nestes três tipos da pilha. Curiosamente, ambas as linhagens epiteliais mostraram níveis mais elevados de Zn durante a proliferação quando comparados ao alcance da confluência, em que uma monocamada apertada característica foi formada. Na proliferação de células epiteliais, a linhagem celular mamária MCF10A apresentou igual distribuição de Zn entre o citosol e o núcleo, enquanto na linhagem celular derivada do rim, a maior parte do metal foi localizada no núcleo. Nestes dois tipos da pilha, quando as pilhas alcangaram a confluência, Zn foi ficada situada predominantly ao cytosol. Esses resultados demonstram que a GF-AAS é uma técnica altamente sensível e precisa para a realização de análises elementares em amostras de baixo rendimento. GF-AAS acoplado com fracionamento subcelular e pode ser adaptado para investigar os níveis de oligoelementos metálicos em diferentes linhagens celulares e tecidos.

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Protocol

1. cultura de células de mamíferos

  1. Considerações gerais
    1. Siga as técnicas assépticas para a cultura de células de mamíferos previamente revisadas38.
    2. Manter todas as linhas celulares em uma incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c. As condições de cultura de célula variam para cada tipo de célula. É importante manter as condições de cultura apropriadas para cada linha celular usada, como variações desses procedimentos levará a fenótipos aberrantes e falha da cultura celular.
    3. Assegure familiaridade com a linha de interesse da célula e siga os protocolos fornecidos para cada tipo de célula selecionado para experimentos específicos (Veja alguns exemplos abaixo).
  2. Procedimento geral para tripsinização e passagem de pilhas aderentes
    1. Remova a mídia de cultura da célula da placa de cultura por aspiração.
    2. Lave as células suavemente usando PBS sem cálcio e magnésio (5 mL por 10 cm2 área de superfície da cultura). Adicione a solução de lavagem ao lado da placa para evitar a desanexação da monocamada celular; Gire a placa para maximizar a cobertura da solução. Para células epiteliais, é necessário incubar as células por 10 a 15 min na incubadora a 37 ° c em PBS para facilitar a dissociação das células nas etapas a seguir.
    3. Retire a solução de lavagem por aspiração.
    4. Acrescente reagente de dissociação suficiente (0,25% de tripsina) à placa (aproximadamente 0,7 mL por 10 cm2). Gire delicadamente a placa para começ a cobertura completa da monocamada da pilha.
    5. Incubar a cultura à temperatura ambiente durante 2 a 5 min. O tempo real da incubação varia com a linha de pilha usada, no caso das pilhas epithelial é recomendado incubar por 10 a 15 minutos na incubadora em 37 ° c. Observe as células o microscópio para o descolamento celular.
    6. Quando a maioria das células se destacaram, recupere a suspensão celular em 5 mL do chapeamento pré-aquecido ou meio de crescimento (veja abaixo alguns exemplos). Dissociar mecanicamente aglomerados de células por pipetagem sobre a monocamada celular várias vezes.
    7. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e Centrifugue-as a 1.000 x g durante 2 a 5 min. A velocidade e o tempo de centrifugação variam com base no tipo de célula. Retire a mídia por aspiração suave, sendo cuidadoso para não tocar o pellet celular. Resuspend a pelota da pilha em 5 a 10 ml do meio pre-aquecido apropriado do crescimento e remova uma amostra para contar usando um hemocitômetro ou um contador de pilha automático.
    8. Utilize o volume adequado da suspensão da célula para propagar a densidade recomendada para cada linha celular específica (veja abaixo alguns exemplos). Suplemento com o volume adequado de meios de cultura de acordo com o tamanho do prato de cultura e colocar as células de volta para a incubadora.
  3. Mioblasts primários derivados de células de satélite do rato
    1. Antes de começar, prepare placas revestidas de colágeno para o crescimento de mioblastos primários. Uma solução contendo 0, 2% de colágeno e 0, 5 M de ácido acético em água deionizada deve ser esterilizada por filtração com um dispositivo de filtro estéril de 0,22 μm. Incubar as placas da cultura com a solução do colagénio durante a noite em 37 ° c.
    2. No dia seguinte, aspirar a solução de colágeno, permitir que as placas para secar ao ar no armário estéril e armazenar a 4 ° c até o uso.
      Nota: os volumes mínimos de colágeno são: para 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Mioblastos preliminares da semente em 1 x 104 Cells/cm2 em 55 cm2 placas colagénio-revestidas da cultura. A mídia de proliferação é o meio de cultura de mistura de nutrientes de Dulbecco Modified Eagle ' s Medium (DMEM)/Ham, contendo 20% de soro bovino fetal (FBS), 25 ng/mL de fator de crescimento fibroblástico básico recombinante (FGF) e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
      Nota: as células proliferating e conservada em estoque devem ser mantidas 50% da confluência. O contato celular induz comprometimento das células à diferenciação miogênica e prejudica as capacidades de crescimento da cultura.
    4. Para diferenciar os Myoblasts preliminares, permita que as pilhas alcancem 80% a confluency de 100%, que ocorre normalmente após 48 h do chapeamento. Em seguida, mude para meios de diferenciação (DMEM, 2% de soro de cavalo, 1% de insulina, transferrina, selênio um suplemento, e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina). Atualize a mídia diariamente até a colheita.
  4. Neuroblastoma murino (N2A)
    1. Placa N2A células em uma densidade de 2 x 104 células/cm2 em meios de crescimento, contendo uma mistura de médio-soro reduzido/DMEM contendo alta glicose e L-glutamina (1:1, v:v), suplemento com 10% FBS e 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Manter a cultura de ações 50% de confluência.
    2. Induzir a diferenciação de células N2A uma vez que a confluência atingiu 25% a 40%. Mudança para meios de diferenciação contendo uma mistura de soro reduzido médio/DMEM, 1% FBS e 20 μM de ácido retinóico por 7 a 10 dias. Atualize a mídia todos os dias até a colheita da célula.
      Nota: como células N2A diferenciar, algumas células tornam-se redondas, desanexar facilmente, e pode sofrer apoptose. Tenha cuidado ao aspirar e adicionar a mídia de cultura para as placas.
  5. 3T3 L1 pré-adipócitos murinos
    1. Manter o mouse 3T3/L1 células em DMEM com alta glicose, suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. O processo adipogênico é dependente da confluência das células; Portanto, não deixe que a cultura de ações cresça mais de 50% confluência, como maior afluência irá prejudicar a capacidade das células para diferenciar.
    2. Placa as pilhas em 2 x 104 Cells/cm2. Nesta densidade, as células chegarão à confluência em 3 dias.
    3. Induzir a diferenciação adipogênica dois dias após as células atingirem 100% de confluência. Os meios de indução consistem em DMEM contendo 10% de FBS, 10 μg/mL de insulina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metixantina, 1 μM de dexametasona e 10 μM de troglitazona.
    4. Substitua a mídia de indução após 48 h de incubação a meios de diferenciação (DMEM contendo 10% de FBS e 5 μg/mL de insulina). Atualize a mídia todos os dias até a colheita. Amostras representativas de total diferenciação são normalmente coletadas entre 7 e 10 dias após a indução adipogênica.
      Nota: à medida que a adipogênese progride, as células tornam-se redondas e tendem a se separar facilmente. Tenha cuidado ao aspirar e adicionar a mídia de cultura para as placas.
  6. MCF10A células
    1. Placa MCF10A células em DMEM/F12 (1:1, v:v), suplementada com 5% FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 10 μg/mL de insulina e 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF). A densidade recomendada de semeadura é de 1 x 105 células/cm2. Nestas condições, as células chegarão a 100% de confluência no prazo de 4 dias. Atualize a mídia a cada 2 a 3 dias até a colheita.
      Nota: MCF10A células são difíceis de desanexar. Recomenda-se incubar as células por 10 a 15 min a 37 ° c em PBS livre de cálcio com EDTA de 0,5 mM antes da trypsinization.
  7. Células renais caninas Madin-Darby (MDCK)
    1. Células MDCK de placa em DMEM suplementados com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. A densidade recomendada da semeadura é 1 x 105 Cells/cm2, onde as pilhas alcançam a confluência de 100% dentro de 3 dias. Atualize a mídia a cada 2 dias até a colheita.
      Nota: as células MDCK são difíceis de separar. Recomenda-se incubar as células por 5 a 10 min a 37 ° c em PBS livre de cálcio e magnésio antes da trypsinization. Para impedir a aglomeração da pilha não agitam as placas batendo ou agitando o balão ao esperar que as pilhas desanexem.

2. preparação da amostra de cultura de células de mamíferos para AAS: fraccionamento de células inteiras e subcelulares

  1. Cultura as células de interesse em 55 cm2 placas. O uso de placas de cultura menores pode produzir amostras com níveis de metais os limites de detecção do GF-AAS.
  2. Extrato de células inteiras
    1. Aspirar a mídia de cultura usando uma armadilha de vácuo. Certifique-se de remover todos os traços de mídia. Enxágüe as células dos pontos de tempo desejados ou condições de cultura três vezes com PBS gelada livre de cálcio e magnésio.
    2. Raspe imediatamente as células da placa usando um novo raspador de células plásticas em 1 mL de PBS livre de cálcio e magnésio. Transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue por 2 min a 2.000 x g e aspire o sobrenadante. O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene amostras de pellets a-20 ° c ou avance para o passo 2,4.
  3. Fraccionamento subcelular
    1. Aspirar a mídia de cultura usando uma armadilha de vácuo. Certifique-se de remover todos os traços de mídia. Enxágüe as células dos pontos de tempo desejados ou condições de cultura três vezes com PBS gelada livre de cálcio e magnésio. Raspe as células fora da placa com 1 mL de PBS gelada livre de cálcio e magnésio.
    2. Transfira as amostras para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha-se no gelo. Centrifugador para 10 s em 10.000 x g. Continue a isolação rápida dos núcleos se a análise do metal de frações cytoplasmic e nucleares é desejada. Este procedimento minimizará a potencial perda de metais devido à extração celular39, 40.
    3. Retire o sobrenadante por aspiração e ressuscite o pellet celular em 400 μL de PBS frio-gelado livre de cálcio e magnésio, contendo 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), um detergente não-iônico. Transfira 100 μL para um novo tubo de microcentrífuga e considere-o como a amostra de célula inteira. Esta alíquota representa 25% da amostra.
    4. Isolar núcleos introduzindo a suspensão da célula 5 a 10 vezes no gelo com uma ponta de micropipeta P1000. O isolamento de núcleos de células epiteliais requer uma concentração de 0,5% NP-40. Alcançar a dissociação celular, passando a suspensão celular através de uma agulha de 26 3/4 G 10 a 15 vezes, seguido por 10 a 15 passagens através de uma agulha de 30 1/2 G.
      Nota: verificar a integridade dos núcleos por microscopia de luz usando um objetivo de 40x.
    5. Centrifugue a suspensão de lisado de células restantes (300 μL) por 10 s a 10.000 x g. O sobrenadante conterá a fração citosólica. Transfira o 300 μL para um novo tubo de microcentrífuga.
    6. Enxague a pelota contendo a fração nuclear em 500 μL de PBS livre de cálcio e magnésio, contendo 0,1% NP-40, depois Centrifugue por 10 s a 10.000 x g. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet contendo os núcleos em 100 μL da mesma solução.
      Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas a-20 ° c.
  4. Lyse as células por três ciclos sonication (30 s on/30 s off, em 50 kHz, 200 W) por 5 min. quantificar o teor de proteína total na amostra por Bradford41.
  5. Executar o controle de qualidade da pureza das frações por Western blot usando anticorpos específicos tanto para o nuclear (histonas, remodeladores de cromatina, proteínas de matriz nuclear) ou frações citosónicas (β-tubulina, β-actina) (Figura 2).
    Nota: não use compactos com uma ponta de metal. Estes podem contaminar a amostra com metais.

3. análise de conteúdo de Zn de células inteiras e frações subcelulares de culturas de células de mamíferos por espectroscopia de absorvência atômica

  1. Mineralize as amostras da cultura de pilha (pilha inteira ou frações nucleares) pela digestão ácida usando um volume igual da classe concentrada do metal do traço de HNO3 (cuidado) para 1 h em 80 ° c, então durante a noite em 20 ° c.
  2. Pare a reacção adicionando 30% do volume de reacção de H2o2. Traga o volume amostral para 500 μL com água purificada de 18 MΩ.
    Nota: a manipulação de HNO3 deve ser feita usando vidros de segurança químicos, um protetor de cara para a proteção do respingo, luvas, e um respirador aprovado do vapor se a ventilação adequada (capa das emanações) não está disponível. O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente (RT).
  3. Prepare soluções padrão e amostras experimentais para medições de Zn por AAS equipadas com um forno de grafite.
    1. Use 2% (v/v) HNO3 solução em água deionizada, proveniente do mesmo lote usado para a curva padrão como a solução em branco para a calibração em todo. Use padrões de grau analítico diluídos em 18 MΩ água purificada.
    2. Prepare um padrão de 1.000 ppb de Zn de uma solução de estoque de Zn 1.000 ppm comercialmente disponível com solução de HNO3 de 2% (v/v) em água desionizada. Prepare as soluções padrão de trabalho do padrão 100 ppb diluindo-a para 5, 8, 10, 15, 20 e 25 ppb diretamente com 2% (v/v) HNO3 solução em água desionizada. Prepare os padrões de Zn e o espaço em branco com um modificador de matriz de 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 .
      Nota: o LOD de Zn é 0, 1 ppb (μg/L). Ao aumentar a concentração das normas, determinou-se o limite de linearidade do Zn a 20 ppb (Figura 3).
    3. Medida padrão e amostras as mesmas condições otimizadas: vazão de introdução de 250 mL/min, temperatura de injeção de 20 ° c e temperatura GF de 1.800 ° c.
      Nota: a temperatura GF foi aumentada para 2450 ° c para as etapas de limpeza, antes da injeção de uma nova amostra ou padrão.
    4. Otimize a lâmpada (C-HCL) para uma corrente de 20 A, comprimento de onda de 213,9 nm e fenda de 0,7 nm.
    5. Meça as amostras mineralizadas usando a curva padrão de Zn para determinar o conteúdo metálico. Como pequenos volumes são medidos, as amostras podem evaficar se as medições demoram longos períodos de tempo. Conseqüentemente, recomenda-se adicionar a água às amostras. Diluir as amostras com água purificada de 18 MΩ tratada com 0, 1% de HNO3 (grau analítico) se os dados obtidos estiverem além do LOD.
      Nota: normalmente, as amostras são diluídas para um volume de 500 μL, colocadas no amostrador automático automatizado do AAS a ser medido logo após a curva padrão ser estabelecida. O volume necessário deve ser determinado pelo usuário e deve considerar os cálculos finais das concentrações. O acabamento das determinações de Zn por AAS de um experimento completo em uma tentativa é recomendado. Pausar as medições pode levar a grandes variações experimentais e inconsistências.
  4. Converta as medições de PPB em molaridade como obtido a partir de Zn medido via AAS. Considere a massa de Zn (65,39 Amu). Divida a quantidade de PPB obtida pelo AAS em 63.390.000. Nas células, as concentrações de Zn variam de unidades de pmol a μmol.
    1. Divida a concentração de Zn (pmol ou μmol) pela massa inicial de proteína na amostra determinada por Bradford (etapa 2,4). Este cálculo irá processar a quantidade de metal (pmol ou μmol Zn) contido por mg de proteína da amostra.
      Nota: é importante considerar os fatores de diluição utilizados durante as determinações metálicas.

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Representative Results

Testou-se a capacidade do GF-AAS em detectar níveis de Zn em células mamíferas (Figura 1). Assim, nós cultivou os mioblastos preliminares derivados das pilhas satélites do rato, e as linhas de pilha estabelecidas N2A (neuroblastoma derivado), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitélio da mama), e pilhas de MDCK (epitélio do rim do cão). Primeiramente, foram isoladas frações de células inteiras, citosónicas e nucleares de todos esses tipos de células e avaliaram a pureza das frações por Western blot (Figura 2). A imunodetecção representativa do remodelador de cromatina Brg1 e tubulina como marcadores de frações nucleares e citosónicas, respectivamente, demonstrou a adequação do protocolo de fraccionamento subcelular descrito na seção 2,3 para executar o Elemental análise (Figura 2). As frações células inteiras e subcelulares foram preparadas como descrito acima para as análises de GF-AAS, e a calibração do equipamento foi realizada para produzir uma curva padrão linear típica (Figura 3).

A Figura 4 mostra imagens representativas de microscopia de luz de monocamadas proliferating e diferenciados ou confluentes de cada tipo de célula, e os níveis correspondentes de Zn para estes. É importante ressaltar que todas as linhagens celulares analisadas neste estudo mostraram concentrações de Zn na faixa de nM. Entretanto, uma distribuição diferencial do metal foi detectada. Miotubos primários diferenciados exibiram níveis mais elevados de Zn do que as células proliferantes (figura 4a). Notavelmente, muito do íon foi localizado à fração nuclear em ambos proliferating e diferenciando Myoblasts. Uma distribuição subcelular similar de Zn foi detectada na linha celular derivada do neuroblastoma N2A (Figura 4B). Entretanto, as medidas mostraram que as pilhas de N2A tiveram níveis do Zn uma ordem da magnitude mais altamente do que Myoblasts preliminar. Por outro lado, a linha celular 3T3-L1 estabelecida apresentou níveis mais elevados de Zn quando os pré-adipócitos estavam proliferando do que quando foram induzidos a diferenciar e formar adipócitos maduros que acumulam lipídios (Figura 4C).

Nós igualmente medimos o índice do Zn em duas linhas de pilha epithelial estabelecidas diferentes: o MCF10A derivado da glândula mamária humana (Figura 4D) e do cão rim-derivado MDCK (Figura 4e) pilhas. Curiosamente, em ambos os casos, níveis mais elevados de Zn em células proliferantes do que em monocamadas confluentes foram detectados. Entretanto, as pilhas epithelial derivadas da glândula mamária mostraram os níveis do metal que eram 2 vezes mais altamente do que aquele das pilhas de rim. As pilhas de MCF10A mostraram níveis iguais de Zn entre frações citosólico e nucleares em pilhas proliferating. Uma vez que MCF10A células atingem a confluência, uma diminuição de 40% nos níveis de Zn de células inteiras foi detectada, e o metal foi mais concentrado na fração citosólica (Figura 4D). Inversamente, as células de MDCK proliferating exibiram níveis mais elevados de Zn na fração nuclear, comparado à fração citosólico, mas quando as pilhas de MDCK alcangaram a confluência, uma diminuição de Zn em pilhas inteiras foi detectada, com a maioria deste metal da transição observada na fração citosólica (Figura 4E).

Figure 1
Figura 1: fluxograma representativo para análise elementar (Zn) de células cultivadas em mamíferos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: validação da pureza das frações obtidas através da rápida isolação do protocolo dos núcleos 39 , 40. Representative Western blot diferenciando os mioblastos primários que mostram a pureza das frações subcelulares. A enzima remodeladora cromatina Brg1 foi utilizada para identificar a fração nuclear, e a tubulina foi utilizada para identificar a fração citosólica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: curva de calibração dos padrões de Zn. Curva padrão representativa para Zn determinada pela GF-AAS. O GF-AAS foi calibrado com as soluções padrão de Zn diluídas nas seguintes concentrações: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 e 30 ppb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: níveis de zinco em diferentes células cultivadas em mamíferos. Micrografias de luz representativas e teor de Zn em extratos celulares inteiros e frações citosónicas e nucleares. Os dados representam a média de três repetições biológicas independentes ± SEM. (a) mioblasts primários murinos proliferando e diferenciando por 2 dias. (B) linha celular murine NEUROBLASTOMA N2A antes e após a indução para diferenciar pelo tratamento com ácido retinóico. (C) pré-adipócitos murino 3T3-L1 e 6 dias pós-diferenciação. (D) monocamada pré-confluente e confluente da linhagem celular epitelial mamária humana MCF10A. (E) monocamada pré-confluente e confluente da linha celular epitelial renal MDCK. Os dados representam a média de três experimentos independentes ± SE. o teste tde Student mostra significância, * p ≤ 0, 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A espectroscopia de absorvância atômica é um método altamente sensível para quantificação de Zn em amostras biológicas de pequeno volume/massa. A otimização descrita da medição de Zn faz com que a aplicação deste método seja simples e garante condições analíticas ideais. Aqui, utilizando-se GF-AAS, determinou-se a concentração de Zn em células inteiras, e em frações citosónicas e nucleares, de diferentes linhagens celulares. Os resultados mostram que essa técnica se torna comparável àquelas obtidas por sondas fluorescentes e ICP-MS. Por exemplo, várias sondas fluorescentes mostraram níveis de Zn mitocondrial lábil na faixa de 0,1 a 300 PM, os níveis no Golgi estavam abaixo da faixa uma, e o retículo endoplasmático variou de 800 a 5.000 PM42, que são consistentes com níveis detectadas nas frações citosónicas. Além disso, o fluoróforo Zn-responsivo fluozin-3 mostrou acúmulo de Zn lábil em pequenas vesículas citosómicas em MCF10A e em C2C12 células43,44, que também são consistentes com o Zn quantificado no citoplasma. Além disso, as análises de Zn por ICP-MS realizadas pelo nosso grupo mostraram que os níveis de células inteiras de Zn na diferenciação dos miotubos primários45 são semelhantes àqueles obtidos neste relato por GF-AAS. Além disso, exemplos de determinações de Zn em células de glioma de ratos C6 por meio de AAS e Zinquin-E46 também têm apresentado faixas semelhantes àquelas observadas em NEUROBLASTOMA N2A células utilizadas aqui.

Até o momento, diversas técnicas foram desenvolvidas para detectar Zn nas células. No entanto, GF-AAS continua a ser uma técnica precisa e altamente sensível que não só permite a detecção de Zn livre, mas também mede o metal complexado e ligado a proteínas e potencialmente a pequenas moléculas. Nosso grupo mostrou recentemente que as medidas executadas com a sonda fluorescente permeável por células (que tem uma alta afinidade para ligar Zn livre2 +) diretamente correlacionadas com os níveis de Zn detectados por GF-AAS em proliferating e diferenciando mioblasts 43. no entanto, os resultados obtidos por estas sondas podem não ser representativos de concentrações de Zn de células inteiras ou ligadas à proteína. Além disso, uma vez que o Zn existe como uma espécie ativa não redox e como cátion divalente, em condições fisiológicas, sua detecção em sistemas celulares permaneceu um desafio. As técnicas novas da imagem latente do Zn tornaram-se disponíveis, tais como o estado---a-arte Synchrotron-baseou a microscopia de fluorescência do raio X, os radioisótopos, e a espectrometria maciça indutivamente acoplada do plasma da ablação do laser (LA-ICP-MS). Infelizmente, algumas dessas técnicas necessitam de recursos inacessíveis à comunidade científica29,42,47,48,49,50.

Estudos mostraram que ICP-MS é uma técnica mais precisa do que AAS, pois os valores relativos de desvio padrão mostraram-se inferiores nas determinações ICP-MS para metais como Zn. A explicação provável para este efeito é que ICP-MS é intrinsecamente capaz de eliminar interferências químicas, como as temperaturas de funcionamento do argônio variam de 5.000 a 10.000 ° c. Algumas ligações químicas podem ser mantidas em 3.000 ° c, que está na escala para a operação de AAS. Estas ligações serão completamente interrompidas acima de 6.000 ° c. Portanto, essas altas temperaturas alcançadas no estado plasmático por ICP-MS podem eliminar interferências químicas, levando a melhores limites de detecção51. Além disso, ICP-MS requer amostras de volume maiores em comparação com GF-AAS, pois esta última é capaz de operar com volumes inferiores a 100 μL, o que é significativamente menor que outros métodos espectroscópicos como AAS, ICP-OES ou ICP-MS. Considerando os pequenos volumes envolvidos no método, GF-AAS é a técnica ideal para determinar a concentração de Zn em amostras biológicas, principalmente se a análise envolver frações subcelulares, detecções metálicas em proteínas purificadas ou pequenas variações na conteúdo metálico devido a mutações em transportadores ou proteínas de ligação metálica29,52. Além disso, a sensibilidade do sistema GF-AAS para determinar as concentrações de traço e ultra traço (pg/mL para ng/mL) é outra vantagem.

Devem ser tomadas considerações importantes para garantir a fiabilidade dos dados GF-AAS. Estes incluem a calibração adequada, a integridade do tubo da grafite, e a seleção do modificador apropriado da matriz para a atomização Electrothermal. Modificadores de matriz são elementos químicos adicionados à amostra, que afetam os processos térmicos que acontecem no atomizador. Estes modificadores minimizam a perda de analito durante a pirólise e contribuem para a remoção dos componentes da matriz. No geral, os modificadores podem alterar a matriz de amostra para evaular os componentes da matriz em temperaturas mais baixas e podem funcionar como estabilizadores de analito. Além destas considerações, é importante executar a optimização adequada das etapas para o programa da temperatura do atomizador.

Duas considerações principais devem ser tomadas, incluindo 1) que estabelecem a temperatura a melhor da pirólise, que se refere à temperatura máxima na etapa da atomização em que nenhuma perda do analito ocorre, e que permite uma absorvência máxima do analito com mínimo Fundo. Deve-se também considerar 2) estabelecendo a temperatura ideal de atomização, que se refere à temperatura mínima na qual o analito é totalmente evaporado e gravado como um sinal ou pico reprodutível. Uma das desvantagens das análises de GF-AAS é a interferência de elementos, para a qual uma otimização e padronização minuciosas são essenciais para medições precisas. No entanto, até o momento, a GF-AAS representa uma importante ferramenta na pesquisa científica para detectar os íons metálicos em diversas amostras biológicas. Futuras aplicações de Zn (e outros metais) métodos de detecção por GF-AAS incluirá a medição dos níveis de metais em órgãos e tecidos obtidos a partir de modelos animais ou biópsias de pacientes para entender melhor as necessidades fisiológicas específicas para oligoelementos. Em conclusão, GF-AAS é preciso, sensível, rentável e acessível, e esta técnica analítica continuará a melhorar à medida que os avanços tecnológicos avançam para esses sistemas de detecção.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo prêmio professores de diversidade acadêmicos da faculdade de medicina da Universidade de Massachusetts para o higiênico-B. N.N.-T. é apoiado por SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N é apoiado pelo National Science Foundation Grant DBI 0959476. Os autores são gratos ao Dr. Daryl a. Bosco por fornecer a linha celular N2A e a Daniella Cangussu pelo seu apoio técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

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