Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Kültürlü primer veya kurulan hücre hatları yaygın hayvan modelleri kullanmadan önce bir ilk yaklaşım olarak temel biyolojik ve mekanik soruları ele almak için kullanılır. Bu protokol, çinko (Zn) ve Atom emici spektroskopisi ile diğer iz elemanlarının çalışmaları için tüm hücre özler ve hücre altı fraksiyonları hazırlamak açıklamaktadır.

Abstract

Geçiş metaller organizmalar için temel mikroutrients ancak proteinlerde fizyolojik metaller ile rekabet ve redoks stres üreten yüksek konsantrasyonlarda hücrelere toksik olabilir. Metal tükenmesi veya birikimine yol açabilen patolojik koşullar farklı insan hastalıklarının nedensel ajanlarıdır. Anemi, akrodermatit Enteropathica ve Wilson ve Menkes hastalıklarına örnekler dahildir. Bu nedenle, bu öğelerin normal fizyolojik işlevlere nasıl katkı sağlayacağını araştırmayı kolaylaştırmak için yüksek hassasiyet ve doğruluk ile biyolojik örneklerde geçiş metallerinin düzeylerini ve taşınması ölçmek mümkün olması önemlidir ve Toksisite. Çinko (Zn), örneğin, birçok memelinin proteinleri bir kofaktör, sinyalizasyon olaylara katılır ve hücrelerde ikincil bir haberci olduğunu. Fazlalığında, Zn toksik ve diğer metallerin emilimini inhibe edebilir, açık iken, potansiyel olarak ölümcül koşullara çeşitli yol açabilir.

Grafit fırını atomik emilim spektroskopisi (GF-AAS), çeşitli biyolojik örneklerde Zn ve diğer geçiş metal konsantrasyonlarını belirlemek için son derece hassas ve etkili bir yöntem sağlar. GF-AAS aracılığıyla elektrotermal atomizasyon, ilgi unsurunun uyarılma dalga boyu kullanarak sonraki seçici emme analizi için numunelerin küçük hacimleri parçalamalı ile metaller nicelik. Beer-Lambert Kanunu doğrusallık sınırları içinde, metal tarafından ışık emici doğrudan analit konsantrasyonu ile orantılıdır. Zn içeriğinin belirlenmesi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, GF-AAS hem ücretsiz hem de kompleks Zn proteinlerinde ve muhtemelen küçük numune hacimlerinde yüksek hassasiyetle küçük hücre içi moleküllerde algılanır. Ayrıca GF-AAS, İndüktif olarak bağlı plazma kitle spektrometresi (ıCP-MS) veya Synchrotron tabanlı X-ışını floresans ile daha kolay erişilebilir durumdadır. Bu yöntemle, GF-AAS ' l a analiz için farklı kültürlü hücre hatlarının sistematik numune hazırlanması açıklanmıştır. Bu iz elemanının varyasyonları, hem tam hücre endoglikozidazları hem de Proliferasyona ve farklılaşan hücrelerin alt hücreli fraksiyonları ilkesinin kanıtı olarak karşılaştırıldı.

Introduction

Zn, cu, MN ve Fe gibi geçiş ve ağır metaller, gıda ve kirleticilerin her iki besinindeki ortamda doğal olarak bulunur. Tüm yaşayan organizmalar bu mikroutrients farklı miktarlarda gerektirir; Ancak, yüksek seviyelere maruz organizmalar için zararlı. Metal edinme ağırlıklı olarak diyet yoluyla, ancak metaller de solunabilir veya cilt üzerinden absorbe edilebilir1,2,3,4,5. Atmosferik partiküllerde metaller varlığının arttığını ve sağlık riskleriyle büyük ölçüde ilişkili olduğunu dikkate almak önemlidir. Antropojenik faaliyetler nedeniyle, AG, as, CD, CR, HG, ni, Fe ve PB gibi ağır metaller seviyeleri atmosferik partikül madde, yağmur suyu ve toprak6,7' de tespit edilmiştir. Bu metaller, özellikle Zn ve Fe, temel fizyolojik iz elemanları ile rekabet potansiyeline sahip ve Biyolojik süreçler için temel enzimleri devre dışı bırakarak toksik etkileri teşvik.

İz öğesi Zn redoks Neutral ve biyolojik reaksiyonlar bir Lewis asit olarak davranır, bu da protein katlama ve katalitik aktivite için gerekli olan temel bir kofaktör meme proteinlerinin% 10 ' dan fazla8,9, 10; Sonuç olarak, çeşitli fizyolojik fonksiyonlar için esastır8,11. Ancak, birçok iz elemanları gibi, bu metaller normal fizyolojik fonksiyon kolaylaştırarak ve toksisite neden arasında hassas bir denge vardır. Memelilerde, Zn eksiklikleri anemiye yol açar, büyüme geriliği, hipogonadizm, cilt anomalileri, ishal, alopesi, tat bozuklukları, kronik inflamasyon, ve bağışıklık ve nörolojik fonksiyonları özürlü11,12, 13,14,15,16,17,18. Aşırı olarak, Zn sitotoksisdir ve bakır gibi diğer temel metallerin emilimini bozar19,20,21.

Ayrıca, cu ve Fe gibi bazı metaller zararlı reaksiyonlara katılma potansiyeline sahiptir. Fenton kimya ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi, demir sülfür kümesi proteinlerinin montajına müdahale edebilir ve lipid metabolizmasını değiştirebilir22,23,24. Bu hasarı önlemek için, hücreler toksik etkileri önlemek için metal bağlayıcı şaperonlar ve taşıyıcılar kullanır. Kuşkusuz, metal homeostaz sıkıca belirli hücre türlerinin metaller uygun düzeylerde korumak sağlamak için kontrol edilmelidir. Bu nedenle, biyolojik numunelerde iz metallerin doğru ölçümü için teknikleri ilerletmek için önemli bir ihtiyaç vardır. Gelişmekte olan ve olgun organizmalarda, hücresel düzeyde, farklı gelişimsel aşamalarda ve normal ve patolojik koşullarda iz elemanları için diferansiyel biyolojik ihtiyaç var. Bu nedenle, organizmal metal homeostazisini anlamak için doku ve sistemik metal düzeylerinin kesin belirlenmesi gereklidir.

Grafit fırını atomik emilim spektrometresi (GF-AAS), küçük numune hacimleri için kullanılan, biyolojik ve çevresel örneklerde mevcut geçiş ve ağır metaller ölçmek için ideal hale getirmek için son derece hassas bir tekniktir25,26 , 27 , 28. dahası, tekniğin yüksek hassasiyetinden dolayı, Xenopus kullanarak na+/k+-ATPase ve gastrik H+/y+-ATPase ' i n ince taşıma özelliklerini incelemek için uygun olduğu gösterilmiştir. bir model sistemi olarak oosit29. GF-AAS, bir örnek içinde atomized elemanlar bir ışık kaynağı ile ilgi metal içeren yayılan radyasyon dalga boyu absorbe, elemanın konsantrasyonuna orantılı absorbe radyasyon ile. Elemental elektronik uyarma her kimyasal eleman için benzersiz bir quantized sürecinde ultraviyole veya görünür radyasyon emilimi üzerine gerçekleşir. Tek bir elektron sürecinde, bir foton emilimi atom içinde daha yüksek seviyeye daha düşük bir enerji seviyesinde hareket eden bir elektron içerir ve GF-AAS radyasyon emici sayısı ile orantılı örnek tarafından emilen fotonların miktarını belirler elementleri grafit tüpünde atomize edilir.

Bu tekniğin seçicilik atomların elektronik yapısına dayanır, hangi her eleman belirli bir emilim/emisyon spektral hattı vardır. Zn durumunda, emici dalga boyu 213,9 Nm ve tam olarak diğer metallerden ayırt edilebilir. Genel olarak, GF-AAS, Zn 'ı yeterli tespit sınırı (LOD) ve yüksek hassasiyet ve seçicilik25ile ölçmek için kullanılabilir. Emilen dalga boyu değişiklikler entegre ve belirli ve izole dalga boylarında enerji emme doruklarına olarak sunulmaktadır. Belirli bir örnekteki Zn konsantrasyonu genellikle, emici, numunenin Zn konsantrasyonu ile doğrudan orantılı olduğu Beer-Lambert kanununa göre bilinen konsantrasyonların standart bir eğrisinden hesaplanır. Ancak, GF-AAS analizlerine Beer-Lambert denklemi uygulanması da bazı komplikasyonlar sunar. Örneğin, numunelerin atomizasyon ve/veya homojen olmayan konsantrasyonlarındaki varyasyonlar metal ölçümlerini etkileyebilmektedir.

GF AAS iz Elemental analizi için gerekli metal atomizasyon üç temel adımlardan oluşur. İlk adım, sıvı çözücünün buharlaşma olduğu desolvasyon; Fırından sonra kuru bileşikler bırakarak yaklaşık 100 °C sıcaklığa ulaşır. Sonra, bileşikler 800 den 1.400 °C (analiz edilecek öğeye bağlı olarak) onları ısıtarak buharlaştırılmış ve bir gaz haline gelir. Son olarak, gaz durumundaki bileşikler 1.500 ila 2.500 °C arasında bulunan sıcaklıklarda atomize edilir. Yukarıda da anlatıldığı gibi, bir metal konsantrasyonunun artması GF-AAS tarafından algılanan emilim üzerinde orantılı artışlar oluşturacaktır, ancak fırın, mümkün olan konsantrasyonların çalışma aralığı olan dinamik analiz aralığını azaltır cihaz tarafından belirlenir. Böylece, teknik düşük konsantrasyonları ve LOD ve bira-Lambert Kanununun doğrusallık (LOL) sınırını belirleyerek yöntemin dinamik aralığının dikkatli bir şekilde belirlenmesi gerektirir. LOD, bir maddenin tespit edilmesi için gereken asgari miktardır, matrisin Zn standart sapması üç kez tanımlanır. LOL Beer-Lambert Kanunu kullanılarak tespit edilebilir maksimum konsantrasyon.

Bu çalışmanın içinde, tüm hücre özleri, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar içinde Zn seviyelerini analiz etmek ve kültürlü hücrelerde proliferasyon ve ayrım yapmak için standart bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Numune hazırlama sırasında metal kaybını önlemek için farklı hücresel sistemlere çekirdekler protokolünün hızlı izolasyonu uyarlanmıştır. Kullanılan hücresel modeller, fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, murine Nöroblastom hücreleri (N2A veya Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytes, insan olmayan-tumorigenic meme epitelyal hücre hattı (MCF10A) ve epitelyal madin-Darby köpek böbrek ( MDCK) hücreleri. Bu hücreler farklı sırlardan kurulmuştur ve in vitrometal düzeylerinin erit spesifik varyasyonlarını araştırmak için iyi modellerdir.

Fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, iskelet kası farklılaşmasını araştırmak için iyi uygun bir in vitro modeli oluşturmaktadır. Yüksek serum koşullarında kültürlü olduğunda bu hücrelerin proliferasyonu hızlıdır. Kas Kemine farklılaşma daha sonra düşük serum koşulları tarafından indüklenir30. Murine Nöroblastom (N2A) kurulan hücre hattı fare nöral arması türetilmiştir. Bu hücreler nöronal ve Kökbacaklılar kök hücre morfolojisi mevcut. Farklılaşma uyarıcı üzerine, N2A hücreleri neurons gibi nöronların çeşitli özellikleri mevcut, neurofilaments. N2A hücreler Alzheimer hastalığı araştırmak için kullanılır, nörit büyüme, ve nörotoksisite31,32,33. 3T3-L1 murine ön adipocytes kurulan hücre hattı genellikle Adipogenesis ile ilişkili metabolik ve fizyolojik değişiklikleri araştırmak için kullanılır. Bu hücreler fibroblast benzeri bir morfoloji sunar, ancak bir kez farklılaşma için uyarılır, onlar lipid sentezi ve trigliserid birikimi ile ilişkili enzimatik aktivasyon mevcut. Bu sitoplazmik lipid damlacıkları34,35üretmek için morfolojik değişiklikler olarak gözlemlenebilir. MCF10A, meme fibrokistik hastalığı36olan premenopozal bir kadından elde edilen tümör olmayan bir meme epitelyal hücre çizgisinin. Proliferasyon, hücre göçü ve istilası gibi meme Karsinogenezi ile ilgili biyokimyasal, moleküler ve hücresel çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Madin-Darby köpek böbreği (MDCK) epitelyal hücre hattı, epitelyal fenotipin kurulması ile ilgili özellikleri ve moleküler olayları araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Konfluence ulaştıktan sonra, bu hücreler polarize olur ve hücre-hücre yapışmaları, mammalin epitelyal dokularının özellikleri37.

Memeli hücrelerinde Zn seviyelerini ölçmek için AAS yeteneğini test etmek için, bu beş hücre hatlarının tüm ve hücre altı fraksiyonları (sitersol ve çekirdeği) analiz ettik. AAS ölçümleri bu hücre tiplerinde Zn farklı konsantrasyonları gösterdi. Konsantrasyonlarda primer myoblastlar proliferasyon ve farklılaşıyor (4 ila 7 nmol/mg protein) ve dört kurulan hücre hatları (20 ile 40 nmol/mg protein arasında değişen) daha yüksek. Primer myoblastlar ve nörblastoma hücrelerinde proliferasyon hücreleriyle karşılaştırıldığında, Zn düzeylerinde önemli olmayan küçük bir artış tespit edildi. Farklılaşmış adipanositlerde zıt etki tespit edildi. Ancak, proliferasyon 3T3-L1 hücreleri farklılaşmış hücrelere kıyasla metal yüksek konsantrasyonları sergiledi. Daha da önemlisi, bu üç hücreli çizgide, hücre içi fraksiyonlama, Zn 'ın bu hücrelerin metabolik durumuna göre sitersol ve çekirdeğin farklılaşması olduğunu göstermiştir. Örneğin, proliferasyon myoblastlar, N2A hücreler ve 3T3-L1 öncesi adipocytes, metal çoğunluğu çekirdeğe lokalizedir. Belirli hücre tedavileri kullanılarak farklılaşma indüksiyon üzerine, Zn bu üç hücre türlerinde sitüsol lokalize. İlginçtir ki, her iki epitelyal hücre hatları, bir karakteristik sıkı Tek tabakalı oluşmuş olan konfluence ulaştığında karşılaştırıldığında proliferasyon sırasında Zn daha yüksek düzeylerde gösterdi. Proliferasyon epitelyal hücrelerde, meme hücre hattı MCF10A Siton ve çekirdek arasında eşit Zn dağılımı vardı, böbrek kaynaklı hücre hattında iken, metal çoğu çekirdeğinde yer aldı. Bu iki hücre tipinde, hücreler konfluence ulaşıldığında, Zn ağırlıklı olarak siterona yer verildi. Bu sonuçlar GF-AAS düşük verim örneklerinde Elemental analiz yapmak için son derece hassas ve doğru bir teknik olduğunu göstermektedir. GF-AAS hücre altı fraksiyonlama ile birleştiğinde ve farklı hücre hatları ve dokularda iz metal öğelerin düzeylerini araştırmak için adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mammalin hücre kültürü

  1. Genel hususlar
    1. Daha önce gözden38memelinin hücre kültürü için aseptik teknikleri izleyin.
    2. 37 °C ' de nemlendirici% 5 CO2 kuluçte tüm hücre çizgilerini koruyun. Hücre kültürü koşulları her hücre türü için farklılık gösterir. Kullanılan her hücre çizgisi için uygun kültür koşullarını korumak önemlidir, bu prosedürlerin varyasyonları anormal fenotürleri ve hücre kültürünün başarısızlığa yol açacaktır.
    3. İlgi hücre hattı ile tanıdık emin olun ve belirli deneyler için seçilen her hücre türü için sağlanan protokolleri izleyin (aşağıdaki bazı örnekler bakın).
  2. Tripsinizasyon ve yapışıcı hücrelerin geçişini Genel prosedür
    1. Hücre kültürü ortamını kültür plakadan aspirasyon ile çıkarın.
    2. Hücreleri hafifçe kalsiyum ve magnezyum olmadan PBS kullanarak yıkayın (10 cm2 kültür yüzey alanı başına 5 ml). Hücre monolayer ayırma önlemek için plaka tarafına yıkama çözümü ekleyin; çözüm kapsamını maksimize etmek için plaka girdap. Epitelyal hücreler için, aşağıdaki adımlarla hücrelerin dağılmasını kolaylaştırmak için PBS 'de 37 °C ' de kuluçvörün içinde 10 ila 15 dakika hücreleri inkübe etmek gerekir.
    3. Yıkama çözümünü aspirasyon ile çıkarın.
    4. Plaka (10 cm2başına yaklaşık 0,7 ml) için yeterli ayrışma reaktif (0,25% tripsin) ekleyin. Hafifçe girdap hücre monolayer tam kapsama almak için plaka.
    5. 2 ila 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü inküye. Gerçek kuluçş süresi kullanılan hücre hattına göre değişir, epitelyal hücreler durumunda 37 °C ' de kuluçte 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edilmesi tavsiye edilir. Hücre dekolmanı için mikroskop altındaki hücrelere dikkat edin.
    6. Hücrelerin çoğu ayrılmış olduğunda, ön ısıtılmış kaplama veya büyüme orta 5 mL hücre süspansiyon kurtarmak (bazı örnekler için aşağıya bakın). Hücreleri birkaç kez hücre tek tabakalı üzerinde pipetleme tarafından mekanik olarak ayırmak.
    7. Hücre süspansiyonunu 15 mL Konik Tüpe aktarın ve 2 ila 5 dakika 1.000 x g 'de santrifüjün. Santrifüjleme hızı ve süresi hücre tipine göre değişir. Hassas aspirasyon ile medya çıkarın, hücre Pelet dokunmak için değil dikkatli olmak. Hücre pelemini 5 ila 10 mL 'Lik uygun ön ısıtılmış büyüme ortamını resuspend ve bir hemokytometer veya otomatik hücre sayacı kullanarak sayma için bir örnek çıkarın.
    8. Her belirli hücre hattı için önerilen yoğunluğu tohum için hücre süspansiyon uygun hacminin yararlanın (bazı örnekler için aşağıya bakın). Kültür çanak boyutuna göre Kültür medya yeterli hacim ile ek ve geri kuluçla hücreleri yerleştirin.
  3. Fare uydu hücrelerinden türetilen primer myoblastlar
    1. Başlamadan önce, primer myoblast büyümesi için kollajen kaplı plakalar hazırlayın. Deiyonize suda% 0,02 kollajen ve 0,05 M asetik asit içeren bir çözüm, 0,22 μm steril filtre cihazı ile filtrasyon ile sterilize edilmelidir. 37 °C ' de bir gecede kollajen çözeltisi ile kültür plakalarını kulyın.
    2. Ertesi gün, kollajen çözeltisi Aspire, steril kabine kuru hava plakaları izin ve depolama 4 °c kullanım kadar.
      Not: en az miktarda kollajen şunlardır: 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Tohum primer myoblastlar 1 x 104 hücreli/cm2 ' de 55 cm2 kollajen kaplı kültür plakaları. Proliferasyon medya Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM)/ham 's F12 besin karışımı Kültür medya içeren 20% fetal Sığır serum (FBS), 25 ng/mL rekombinant temel fibroblastik büyüme faktörü (FGF), ve 100 U/mL penisilin/streptomisin.
      Not: proliferating ve stok hücreleri% 50 altında tutarsızlık tutulmalıdır. Hücre teması, hücrelerin miyojenik farklılaşması için taahhüt eder ve kültürün büyüme yeteneklerini bozar.
    4. Primer myoblastlar ayırt etmek için, hücrelerin% 80 ulaşmak için izin 100% konfluency, normal olarak oluşur sonra 48 h kaplama. Sonra, farklılaşma medyasını değiştirin (DMEM,% 2 at serumu, 1% insülin, transferrin, selenyum A Supplement, ve 100 U/mL penisilin/streptomisin). Hasat kadar günlük medya yenileyin.
  4. Murine Nöroblastom (N2A)
    1. Plaka N2A hücreleri 2 x 104 hücreler/cm2 büyüme medyasında, düşük serum orta/dmem yüksek glikoz ve L-glutamin içeren bir karışımı içeren (1:1, v:v), ek 10% FBS ve 100 U/ml penisilin/streptomisin. 50% konfluency altında hisse senedi kültürünü koruyun.
    2. N2A hücrelerin farklılaşması,% 25 ' e% 40 ' a ulaştı. Azalan serum orta/DMEM,% 1 FBS ve 20 μM retinoik asitle 7 ila 10 gün arasında bir karışım içeren farklılaşma medyasını değiştirin. Hücre hasat kadar her gün medya yenileyin.
      Not: N2A hücreleri ayırt gibi, bazı hücreler yuvarlak, kolayca ayırın ve Apoptozis çıkabilir. Ne zaman duman çekiş ve plaka Kültür medya ekleyerek dikkatli olun.
  5. 3T3 L1 murine ön adipocytes
    1. Yüksek glikoz ile DMEM fare 3T3/L1 hücreleri korumak, 10% FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile tamamlayıcı. Adipojenik süreç hücrelerin konfluence bağlıdır; Bu nedenle, stok kültürünün% 50 ' den fazla konfluency üzerinde büyümesine izin vermeyin, daha yüksek konfluence hücrelerin ayırt etmek için yeteneğini zarar verecektir.
    2. Hücreleri 2 x 104 hücreli/cm2' de plaka. Bu yoğunlukta, hücreler 3 gün içinde konfluence ulaşacaktır.
    3. Hücrelerin% 100 konflukans ulaştıktan sonra iki gün Adipojenik farklılaşma neden. İndüksiyon medyası,% 10 FBS, 10 μg/mL insülin, 0,5 mM 3-İzobutil-1-methyxanthine, 1 μM dexametazon ve 10 μM troglitazon içeren DMEM 'den oluşur.
    4. % 10 FBS ve 5 μg/mL insülin içeren DMEM 'den sonra 48 h inkübasyon yaptıktan sonra indüksiyon medyasını değiştirin. Her gün hasat kadar medyayı yenileyin. Tam farklılaşma temsili örnekleri genellikle Adipojenik indüksiyon sonrası 7 ile 10 gün arasında toplanır.
      Not: Adipogenesis ilerledikçe, hücreler yuvarlak hale gelir ve kolayca ayırmak eğilimindedir. Ne zaman duman çekiş ve plaka Kültür medya ekleyerek dikkatli olun.
  6. MCF10A hücreler
    1. Plaka MCF10A hücreler DMEM/F12 (1:1, v:v), ile tamamlayıcı 5% FBS, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 0,5 μg/mL hidrokortizon, 10 μg/mL insülin, ve 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF). Önerilen tohumlama yoğunluğu 1 x 105 hücreli/cm2' dir. Bu koşullar altında, hücreler 4 gün içinde% 100 konflukans ulaşacaktır. Ortam her 2 ile 3 gün hasat kadar yenileyin.
      Not: MCF10A hücreleri ayırmak zordur. 37 °C ' de, tripsinizasyon öncesinde 0,5 mM EDTA ile kalsiyum içermeyen PBS 'de 10 ila 15 dk 'lik hücrelerin inküyasyonu önerilir.
  7. Madin-Darby köpek böbrek hücreleri (mdck)
    1. Plaka MDCK hücreleri DMEM ile tamamlayıcı 10% FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin. Önerilen tohumlama yoğunluğu 1 x 105 hücreler/cm2, hücreler 3 gün içinde% 100 konfluency ulaşacaktır. Hasat kadar her 2 günde bir medya yenileyin.
      Not: MDCK hücreleri ayırmak zordur. Tripsinizasyon öncesi kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS 'de 37 °C ' de 5 ila 10 dk. arasında hücrelerin inküyasyonu önerilir. Hücre ayrışma önlemek için hücreleri ayırmak için beklerken Flask vurmak veya sallayarak plakaları karıştırmayın.

2. aas için mammalian hücre kültürü örnek hazırlama: tüm hücre ve hücre altı fraksiyonlama

  1. Kültür 55 cm2 plaka ilgi hücreleri. Küçük kültür plakaları kullanımı GF-AAS algılama sınırları altında metaller seviyeleri ile numune verebilir.
  2. Tüm hücre ekstresi
    1. Bir vakum tuzağı kullanarak kültür medyasını aspirate. Tüm medya izlerini kaldırtığınızdan emin olun. Hücreleri istenilen zaman noktalarıyla veya kültür koşullarından üç kez, buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir şekilde durulayın.
    2. Hemen 1 mL PBS kalsiyum ve magnezyum ücretsiz yeni bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak plaka hücreleri kazıyın. Numuneyi 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.000 x g 'de 2 dakika santrifüjün ve süpernatant Aspire. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Pelet örneklerini-20 °C ' de saklayın veya 2,4 adıma geçin.
  3. Subcellular fraksiyonlama
    1. Bir vakum tuzağı kullanarak kültür medyasını aspirate. Tüm medya izlerini kaldırtığınızdan emin olun. Hücreleri istenilen zaman noktalarıyla veya kültür koşullarından üç kez, buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir şekilde durulayın. 1 mL buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum ile plaka kapalı hücreleri scrape.
    2. Numuneleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine tutun. 10.000 x g'de 10 s için santrifüjler. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar Metal Analizi istenirse çekirdeklerin hızlı yalıtım devam edin. Bu prosedür, hücre ekstraksiyon39, 40nedeniyle metaller olası kaybını en aza indirir.
    3. Aspirasyon ile süpernatant çıkarın ve 400 μL buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum ücretsiz, 0,1% nonidet P-40 (NP-40), olmayan bir iyonik deterjan içeren hücre Pelet pelletini. Transfer 100 μL yeni bir mikrosantrifüjte tüp ve tüm hücre örneği olarak düşünün. Bu kısım numunenin% 25 'ini temsil eder.
    4. Bir P1000 micropipet ucu ile buz üzerinde 5 ila 10 kez hücre süspansiyonu pipetleme çekirdekleri izole. Epitelyal hücrelerin çekirdekleri yalıtımı% 0,5 NP-40 konsantrasyonu gerektirir. Bir 30 1/2 g iğne ile 10 ila 15 pasajlar takip 10 ila 15 kez, bir 26 3/4 G iğne üzerinden hücre süspansiyonu geçirerek hücre ayrışma elde.
      Not: 40X hedefi kullanarak ışık mikroskobu ile nükleinin bütünlüğünü doğrulayın.
    5. Kalan hücre lysate süspansiyonunu (300 μL) 10.000 x g'de 10 s için santrifüjler. Süpernatant sitosolik fraksiyonu içerecektir. 300 μL 'i yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    6. 500 μL PBS 'de nükleer fraksiyonu içeren pelet kalsiyum ve magnezyum içermeyen,% 0,1 NP-40 içeren, daha sonra 10 s için% 10.000 x gsantrifüjte durulayın. Süpernatant kaldırmak ve aynı çözeltinin 100 μL içinde çekirdekleri içeren pelet pelletini.
      Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. Örnekler-20 °C ' de depolanabilir.
  4. Üç sonication döngüleri (30 s/30 s kapalı, 50 kHz, 200 W) ile hücreleri Lyse 5 dk. Bradford41tarafından örnekteki toplam protein içeriğini ölçmek.
  5. Nükleer (Histonlar, kromatin remodelers, nükleer matris proteinleri) veya sitosolik fraksiyonları (β-tubulin, β-akin) için spesifik antikorları kullanarak Batı leke tarafından fraksiyonları saflığının kalite kontrolünü gerçekleştirin (Şekil 2).
    Not: sonicators metal ucu ile kullanmayın. Bu numuneyi metallerle kirletebilir.

3. atom emici spektroskopisi ile memelinin hücre kültürlerinin tüm hücre ve hücreler fraksiyonları Zn içerik analizi

  1. 80 °C ' de 1 saat, daha sonra 20 °C ' de gece için konsantre HNO3 iz metal notu (dikkat) eşit hacimli kullanarak asit sindirimi ile hücre kültürü örneklerini (tüm hücre veya nükleer fraksiyonları) mineralize.
  2. H2O 2 reaksiyon hacminin% 30 ' unu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Örnek hacmi 18 MΩ arıtılmış suyla 500 μL 'ye getirin.
    Not: HNO3 elleçleme, kimyasal güvenlik gözlükleri, sıçrama koruması için bir yüz kalkanı, eldiven ve yeterli havalandırma (duman başlığı) kullanılmadığı takdirde onaylı bir buhar solunum cihazı giymelidir. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Örnekler oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
  3. Grafit fırını ile donatılmış AAS tarafından Zn ölçümleri için standart çözümler ve deneysel örnekler hazırlayın.
    1. Deiyonize suda% 2 (v/v) HNO3 çözeltisi kullanın, standart eğri için kullanılan aynı toplu işlem boyunca kalibrasyon için boş bir çözüm olarak geliyor. 18 MΩ arıtılmış suda seyreltilmiş analitik sınıf standartlarını kullanın.
    2. % 2 (v/v) HNO3 çözeltisi ile ticari olarak kullanılabilir bir 1.000 ppm Zn stok çözeltisi içinde Zn 1.000 PPB bir standart hazırlayın deiyonize suda çözüm. 100 PPB standardından çalışma standart çözümlerini 5, 8, 10, 15, 20 ve 25 PPB 'ye doğrudan deiyonize suda% 2 (v/v) HNO3 çözeltisi ile seyreltilerek hazırlayın. Zn standartlarını ve boşluğu% 0,1 (1 g/L) mg (NO3)2 matris değiştirici ile hazırlayın.
      Not: Zn LOD 0,01 PPB (μg/L) ' dir. Standartların konsantrasyonunu artırarak Zn 'ın doğrusallık limiti 20 PPB olarak belirlendi (Şekil 3).
    3. Aynı optimum koşullarda standart ve numuneleri ölçün: 250 mL/dak, enjeksiyon sıcaklığı 20 °C ve GF Sıcaklığı 1.800 °C ' nin giriş debisi.
      Not: GF Sıcaklığı, yeni bir numune veya standart enjeksiyonu öncesinde, temizleme adımları için 2450 °C ' ye yükseltilmiştir.
    4. Lamba (C-HCL) ' nin geçerli bir 20 A, dalga boyu 213,9 Nm ve 0,7 Nm yarık optimize edin.
    5. Metal içeriğini belirlemek için Zn standart eğrisini kullanarak mineralize numuneleri ölçün. Küçük hacimler ölçüldüğünde, ölçümler uzun süre alırsa numuneler Buharlık yapabilir. Bu nedenle, örneklere su eklemek için tavsiye edilir. Elde edilen veriler LOD 'in ötesinde ise% 0,01 HNO3 (analitik sınıf) ile tedavi edilen 18 MΩ arıtılmış su ile numuneleri seyreltin.
      Not: genellikle, numuneler 500 μL, standart eğri kurulduktan sonra doğru ölçülecek AAS otomatik otomatik örnekleyici yerleştirilen bir hacmine seyreltilir. Gerekli hacim Kullanıcı tarafından belirlenmeli ve konsantrasyonların son hesaplamaları dikkate almanız gerekir. Bir girişimde tam bir deney AAS tarafından Zn belirlemeler bitirme önerilir. Ölçümleri duraklatma büyük deneysel varyasyonlar ve tutarsızlıkları neden olabilir.
  4. PPB ölçümlerini, AAS ile ölçülen Zn 'den elde edilen molarite dönüştürün. Zn (65,39 amu) kütlesini düşünün. 63.390.000 tarafından AAS tarafından elde edilen PPB miktarını Böl. Hücrelerde, Zn konsantrasyonları pmol birimlerinden μmol 'e kadar değişir.
    1. Bradford tarafından belirlenen örnekteki ilk protein kütlesi ile Zn (pmol veya μmol) konsantrasyonunu bölün (adım 2,4). Bu hesaplama, numunenin mg protein başına yer alan metal miktarını (pmol veya μmol Zn) işleme alacak.
      Not: metal belirlemeler sırasında kullanılan seyreltme faktörlerini dikkate almak önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GF-AAS ' ı ı, memelinin hücrelerinde Zn dakika seviyelerini algılamak için test ettik (Şekil 1). Böylece, fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar ve kurulan hücre hatları N2A (Nöroblastom türetilmiştir), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (meme epiteli) ve MDCK hücreleri (köpek böbrek epiteli) kültürüne sahibiz. İlk olarak, tüm bu hücre türlerinin tüm hücresini, sitosolik ve nükleer fraksiyonları izole ettik ve Batı leke tarafından fraksiyonları saflığını değerlendirdi (Şekil 2). Kromatin Remodeler Brg1 ve tübülin 'in, sırasıyla nükleer ve sitosolik kesirler belirteçleri olarak, temsili immün algılanması, Bölüm 2,3 ' de açıklanan hücre altı fraksiyonlama protokolünün uyguniyetini göstermiştir. Analizi (Şekil 2). GF-AAS analizleri için yukarıda açıklandığı gibi tüm hücre ve hücre altı fraksiyonları hazırlanmıştır ve tipik bir doğrusal standart eğrisi elde etmek için ekipmanların kalibrasyonu yapılmıştır (Şekil 3).

Şekil 4 , her hücre türünün proliferasyon ve farklılaşan veya konfluent monolayerlerinin temsili ışık mikroskopisi görüntülerini ve bunların ilgili Zn düzeylerini gösterir. Daha da önemlisi, bu çalışmada analiz edilen tüm hücre hatları, nM aralığında Zn konsantrasyonlarını göstermiştir. Ancak, metal diferansiyel dağılımı tespit edildi. Farklılaşan primer myotubes, proliferasyon hücrelerinden daha yüksek Zn seviyeleri sergiledi (Şekil 4A). Özellikle, iyon çoğunu Proliferasyona ve farklılaşan myoblastlar nükleer fraksiyonda yer aldı. N2A (Şekil 4b) hücre hattı türeyen Nöroblastom içinde Zn benzer bir hücre altı dağılımı tespit edildi. Ancak, ölçümler N2A hücrelerin Zn seviyeleri primer myoblastlar daha yüksek büyüklükte bir sipariş olduğunu gösterdi. Öte yandan, kurulan 3T3-L1 hücre çizgisi, ön adipanositlerin farklılaştırılması ve lipidler biriken olgun adilositler oluşturmak için indüklenen zaman daha proliferasyon olduğunda Zn yüksek seviyeleri sergiledi (Şekil 4c).

Biz de Zn içeriği iki farklı kurulan epitelyal hücre hatları ölçülür: MCF10A insan meme bezi (Şekil 4d) ve köpek böbrek-türetilen mdck (Şekil 4E) hücreler türetilmiştir. İlginçtir ki, her iki durumda da, daha yüksek düzeylerde Zn içinde konfluent monolayers daha Proliferasyona hücreler tespit edildi. Ancak, meme bezinden türetilen epitelyal hücreler, böbrek hücrelerinden 2 kat daha yüksek metal seviyeleri gösterdi. MCF10A hücreler proliferasyon hücrelerinde sitosolik ve nükleer fraksiyonlar arasında Zn eşit seviyeleri gösterdi. MCF10A hücreler konfluence ulaştığında, tüm hücredeki% 40 azalma Zn seviyeleri tespit edildi ve metal sitosolik fraksiyonda (Şekil 4d) en çok konsantre edilmiş olarak bulunmuştur. Buna karşılık, Proliferasyona mdck hücreleri, sitosolik fraksiyonuna kıyasla nükleer fraksiyonda Zn yüksek seviyeleri sergiledi, ancak mdck hücrelerinin konfluence ulaştığında, tüm hücrelerde Zn bir azalma tespit edildi, bu geçiş metal çoğunluğu ile sitosolik fraksiyonda gözlenen (Şekil 4E).

Figure 1
Resim 1: memelinin kültürlü hücrelerinin Elemental (Zn) analizleri Için temsilci akış çizelgesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: çekirdekler protokolünün hızlı izolasyonu ile elde edilen fraksiyonlar saflığının doğrulanması 39 , 40. temsilci Batı leke primer myoblastlar farklılaşarak hücre altı fraksiyonları saflık gösteren. Kromatin Remodeler enzim Brg1 nükleer fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı, ve tübülin sitosolik fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Zn standartlarının kalibrasyon eğrisi. Zn için temsili standart eğrisi GF-AAS tarafından belirlenir. GF-AAS, aşağıdaki konsantrasyonlarda seyreltilmiş standart Zn çözümleri ile kalibre edilmiştir: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 ve 30 PPB. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: farklı memelinin kültürlü hücrelerinde çinko seviyeleri. Temsilci ışık MİKROGRAFİ ve tüm hücre ekstreleri ve sitosolik ve nükleer kesirler Zn içeriği. Veri üç bağımsız biyolojik çoğaltır ± SEM ortalama temsil eder. (A) murine Primary myoblastlar proliferasyon ve ayrım 2 gün. (B) murine Nöroblastom N2A hücre hattı önce ve sonra indüksiyon retinoik asit tedavisi ile ayırt etmek. (C) Murine 3T3-L1 öncesi adipocytes ve 6 gün farklılaşma sonrası. (D) insan meme epitel hücre hattı MCF10A ön-konfluent ve confluent Tek tabakalı. (E) böbrek epitelyal hücre hattı mdck ön-konfluent ve confluent Tek tabakalı. Veriler, üç bağımsız deneylerin ortalama ± SE değerini temsil eder. öğrencinin t-test önemini gösterir, * p ≤ 0,05. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Atomik emilme spektroskopisi, küçük hacimli/kütle biyolojik örneklerinde Zn ölçümü için son derece hassas bir yöntemdir. Zn ölçümünün tanımlanan optimizasyonu bu yöntemin uygulanması basit hale getirir ve ideal analitik koşulları garanti eder. Burada, GF-AAS ' ı kullanarak, tüm hücrelerde Zn konsantrasyonunu, farklı hücre hatlarından siterik ve nükleer fraksiyonları tespit ettik. Sonuçlar, bu tekniğin floresan problar ve ıCP-MS ile elde edilenlere karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Örneğin, çeşitli floresan problar 0,1 aralığında labil mitokondrial Zn seviyeleri gösterdi 300 PM, Golgi seviyeleri picomolar aralığının altında, ve endoplazmik retikulum tarafından değişmektedir 800 için 5.000 PM42, hangi seviyeleri ile tutarlı sitosolik Kesirlerde algılanır. Dahası, Zn-duyarlı fluorophore fluozin-3, MCF10A ve C2C12 hücreleri43,44, ayrıca sitoplazmada Zn nicelik ile tutarlı olan küçük siterik veziküller içinde labil Zn birikimi gösterdi. Dahası, ıCP-MS tarafından, grubumuz tarafından gerçekleştirilen Zn analizleri, birincil myotubes45 farklılaşarak Zn tüm hücre SEVIYELERININ GF-AAS tarafından bu raporda elde edilenlere benzer olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, C6 sıçan glioma hücrelerinde AAS ve zinquin-E46 kullanarak Zn belirleyici örnekleri de burada kullanılan Nöroblastom N2A hücrelerinde gözlenen benzer aralıkları işlenmiş.

Bugüne kadar, hücrelerde Zn algılamak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Ancak, GF-AAS sadece ücretsiz Zn algılanmasını sağlar değil, doğru ve son derece hassas bir teknik kalır, ama aynı zamanda metal karmaşıklık ve proteinler ve potansiyel olarak küçük moleküllere bağlı ölçer. Grubumuz son zamanlarda hücre geçirgen floresan prob ile yapılan ölçümleri (hangi bind ücretsiz Zn2 +) ile doğrudan Zn seviyeleri ile ilişkilendirerek, GF-AAS Proliferasyona ve ayırt myoblasts tespit 43. ancak, bu problar tarafından elde edilen sonuçlar, tüm hücre veya protein-bağlı Zn konsantrasyonları temsilcisi olmayabilir. Ayrıca, Zn bir redox olmayan aktif türler ve divalent Kif olarak var olduğundan, fizyolojik koşullarda, hücresel sistemlerde tespiti bir meydan okuma olarak kaldı. Roman Zn görüntüleme teknikleri, son teknoloji Synchrotron tabanlı X-ışını floresans mikroskobu, radyoizotoplar ve lazer ablasyon indüktif-bağlı plazma kütle spektrometresi (LA-ıCP-MS) gibi mevcut hale gelmiştir. Ne yazık ki, bu teknikler bazı kaynaklar bilimsel topluluk29,42,47,48,49,50erişilemez gerektirir.

Çalışmalar, ıCP-MS ' i k 'den daha hassas bir teknik olduğunu göstermiştir, çünkü Bağıl standart sapma değerleri Zn gibi metaller için ıCP-MS tespitlerinde daha düşük olarak gösterilmiştir. Bu etkiye ilişkin olası açıklama, ıCP-MS ' i k i 5.000 'den 10.000 °C ' ye kadar olan çalışma argon sıcaklıkları gibi kimyasal müdahaleleri ortadan kaldırabilecek şekilde tasarlanmıştır. Bazı kimyasal bağlar 3.000 °C ' de muhafaza edilebilir, bu da AAS operasyonu için Aralık içindedir. Bu tahvil 6.000 °C ' nin üstünde tamamen bozulacaktır. Bu nedenle, ıCP-MS tarafından plazma durumunda ulaşılan bu yüksek sıcaklıklar kimyasal müdahaleleri ortadan kaldırabilir,51daha iyi algılama limitleri yol açan. Ayrıca, ıCP-MS, GF-AAS ' e kıyasla daha büyük hacim örnekleri gerektirir, ikincisi 100 μL altında hacimler ile çalışma yeteneğine sahip olduğu için, AAS, ıCP-OES veya ıCP-MS gibi diğer spektroskopik yöntemlerden önemli ölçüde daha azdır. Yöntemde yer alan küçük birimler göz önüne alındığında, GF-AAS biyolojik örneklerde Zn konsantrasyonu belirlemek için ideal bir tekniktir, öncelikle analiz hücre altı fraksiyonları içeriyorsa, arıtılmış proteinlerde metal algılama, veya hücresel küçük varyasyonlar taşıyıcılar veya metal bağlama proteinlerinin mutasyonları nedeniyle metal içerik29,52. Buna ek olarak, GF-AAS sisteminin duyarlılık iz ve ultra-iz konsantrasyonları belirlemek için (PG/mL ng/mL) başka bir avantajdır.

GF-AAS verilerinin güvenilirliğini sağlamak için önemli hususlar alınmalıdır. Bunlar yeterli kalibrasyon, grafit tüpünün bütünlüğü ve elektrotermal atomizasyon için uygun matris değiştirici seçimi içerir. Matris değiştirici, atomizer 'de yer alan termal süreçleri etkileyen numuneye eklenen kimyasal öğelerdir. Bu değiştiriciler piroliz sırasında analitin kaybını en aza indirir ve matris bileşenlerinin kaldırılmasına katkıda bulunur. Genel olarak, değiştirici daha düşük sıcaklıklarda matris bileşenlerini buharlaştırmaya örnek matris değiştirebilir ve analit stabilizatörleri olarak çalışabilir. Bu hususlara ek olarak, atomizer sıcaklık programı için adımların yeterli optimizasyonu gerçekleştirmek önemlidir.

1) optimum piroliz sıcaklık, hangi hiçbir analit kaybı ortaya hangi atomizasyon adımda maksimum sıcaklık anlamına gelir ve en az ile analit maksimum emici sağlar, dahil olmak üzere iki ana hususlar alınmalıdır Arka plan. Bir de 2) en düşük sıcaklık hangi analit tamamen buharlaşma ve tekrarlanabilir sinyal veya tepe olarak kaydedilmiş anlamına gelir optimum atomizasyon sıcaklığı, kurulması dikkate almalısınız. GF-AAS analizlerinin dezavantajlarından biri, doğru ölçümler için kapsamlı bir optimizasyon ve standardizasyonun gerekli olduğu eleman müdahalesidir. Ancak, bugüne kadar, GF-AAS çeşitli biyolojik örneklerde metal iyonlarının tespit edilmesi için bilimsel araştırmalarda önemli bir aracı temsil eder. GF-AAS tarafından Zn (ve diğer metaller) algılama yöntemlerinin gelecekteki uygulamaları, hayvan modellerinden veya hasta biopsinden elde edilen organ ve dokularda metaller düzeylerini ölçerek, iz elemanları için spesifik fizyolojik ihtiyaçlarını daha iyi anlamasını içerir. Sonuç olarak, GF-AAS doğru, hassas, uygun maliyetli ve erişilebilirdir ve bu analitik teknik, teknolojik gelişmeler bu algılama sistemleri için ileri hareket ederken geliştirmeye devam edecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Massachusetts Tıp Fakültesi Üniversitesi 'nden öğrenci çeşitliliği akademisyenler Ödülü 'nden tuvalet-B ' d e k i desteklenmektedir. TAN. SEP-CONACYT, Grant 279879 tarafından desteklenmektedir. J. G. N, National Science Foundation Grant DBı 0959476 tarafından desteklenmektedir. Yazarlar onun teknik destek için N2A hücre hattı ve Daniella Cangussu sağlamak için Dr Daryl A. Bosco minnettar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

Biyokimya sayı 147 çinko atom emici spektroskopisi proliferasyon farklılaşma memelinin hücre kültürü hücre altı fraksiyonlama
Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter