Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein In-vitro-Batchkultur-Fermentationssystem menschlicher Fäkalienmikrobiota unter Verwendung von Inulin (einem bekannten Präbiotikum und einem der am häufigsten untersuchten Mikrobiotamodulatoren), um die Verwendung dieses Systems bei der Abschätzung der Interventionen auf fäkale Mikrobiota Zusammensetzung und metabolische Aktivitäten.
Abstract
Die sich abzeichnende Rolle des Darmmikrobioms bei mehreren menschlichen Krankheiten erfordert einen Durchbruch neuer Werkzeuge, Techniken und Technologien. Solche Verbesserungen sind notwendig, um die Verwendung von Mikrobiom-Modulatoren für den Nutzen der menschlichen Gesundheit zu entschlüsseln. Das groß angelegte Screening und die Optimierung von Modulatoren zur Validierung der Mikrobiommodulation und zur Vorhersage der damit verbundenen gesundheitlichen Vorteile kann jedoch aufgrund der Notwendigkeit einer großen Anzahl von Tieren und/oder menschlichen Probanden praktisch schwierig sein. Zu diesem Zweck können In-vitro- oder Ex-vivo-Modelle das vorläufige Screening von Mikrobiommodulatoren erleichtern. Hierin, Es ist optimiert und demonstriert ein ex vivo fäkale Mikrobiota Kultursystem, das für die Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Interventionen von Darm-Mikrobiom-Modulatoren einschließlich Probiotika, Präbiotika und andere Lebensmittelzutaten verwendet werden kann, abgesehen von Nutraceuticals und Medikamente, über die Vielfalt und Zusammensetzung der menschlichen Darmmikrobiota. Inulin, eine der am häufigsten untersuchten präbiotischen Verbindungen und Mikrobiommodulatoren, wird hier als Beispiel verwendet, um seine Wirkung auf die gesunde fäkale Mikrobiotazusammensetzung und ihre metabolischen Aktivitäten, wie z. B. den pH-Wert von Fäkalien und den Fäkaliengehalte organischer Säuren, zu untersuchen. einschließlich Laktat und kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Das Protokoll kann für Studien nützlich sein, die darauf abzielen, die Auswirkungen verschiedener Interventionen von Modulatoren auf fäkale Mikrobiotaprofile abzuschätzen und ihre gesundheitlichen Auswirkungen vorherzusagen.
Introduction
Die menschliche Mikrobiota ist eine komplexe Gemeinschaft, die aus Bakterien, Archaeen, Viren und eukaryotischen Mikroben1besteht, die den menschlichen Körper innerlich und äußerlich bewohnen. Jüngste Erkenntnisse haben die grundlegende Rolle der Darmmikrobiota und des Darmmikrobioms (die gesamte Sammlung von Mikroben und deren Gene im menschlichen Magen-Darm-Trakt) bei verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs1,2,3. Darüber hinaus produzieren die in unserem Darm lebenden Mikroorganismen ein breites Spektrum an Metaboliten, die unsere Gesundheit erheblich beeinträchtigen und auch zur Pathophysiologie mehrerer Krankheiten sowie einer Vielzahl von Stoffwechselfunktionen beitragen können4, 5. Abnorme Veränderungen (Störungen) in der Zusammensetzung und Funktion dieser darm mikrobiellen Population werden im Allgemeinen als "gut dysbiose" bezeichnet. Dysbiose ist in der Regel mit einem ungesunden Zustand des Hosts verbunden und kann daher von der normalen (patostatischen) mikrobiellen Gemeinschaft unterschieden werden, die mit einem gesunden Kontrollzustand des Hosts verbunden ist. Spezifische Muster der Darmmikrobiom Dysbiose sind oft in verschiedenen Krankheiten gefunden1,2,3,6,7.
Die Fermentation von unverdauten Lebensmitteln, insbesondere der fermentierbaren Kohlenhydrate/Fasern, durch die Darmmikrobiota liefert nicht nur Energie, sondern produziert auch divergierende Metaboliten wie kurzkettige Fettsäuren (SCFAs), Laktat, Formate, Kohlendioxid, Methan, Wasserstoff und Ethanol6. Darüber hinaus produziert die Darmmikrobiota auch eine Reihe anderer bioaktiver Substanzen wie Folat,Biotin, Trimethylamin-N-Oxid, Serotonin, Tryptophan, Gamma-Aminobuttersäure, Dopamin, Noradrenalin, Acetylcholin, Histamin, Desoxycholsäure und 4-Ethylphenylsulfat. Dies geschieht in erster Linie durch die Nutzung intrinsischer Stoffwechselflüsse innerhalb der Host-Mikroben-Nische, die zu mehreren Körperprozessen, Stoffwechselfunktionen und epigenetischen Veränderungenbeiträgt 1,8,9, 10. Die Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf solche mikrobiellen Produkte bleiben jedoch aufgrund des Fehlens einfacher, effizienter und reproduzierbarer Protokolle unentdeckt oder unklar. Die Zusammensetzung der menschlichen Darmmikrobiota ist ein äußerst komplexes und vielfältiges Ökosystem, und daher bleiben viele Fragen über seine Rolle in der menschlichen Gesundheit und Krankheitspathologie unbeantwortet. Die Auswirkungen vieler gängiger Darmmikrobiommodulatoren (z.B. Probiotika, Präbiotika, Antibiotika, Fäkalientransplantationen und Infektionen) auf die Zusammensetzung und metabolische Funktionen der Darmmikrobiota bleiben weitgehend schwer fassbar. Darüber hinaus ist die Untersuchung und Validierung dieser Effekte in vivo schwierig, insbesondere weil die meisten Nährstoffe und Metaboliten, die von der Darmmikrobiota produziert werden, gleichzeitig und schnell im Darm absorbiert oder entsorgt werden; Daher bleibt die Messung der Produktion, Menge und Verarbeitung dieser Metaboliten (z. B. SCFAs) in vivo nach wie vor eine praktische Herausforderung. Tatsächlich sind physiologische Modelle wie Tiere und menschliche Probanden entscheidend für die Bestimmung der Rolle des Darmmikrobioms und seiner Modulation auf die Gesundheit des Wirts, aber diese sind möglicherweise nicht für großangelegte Screenings verschiedener Arten von Mikrobiommodulatoren aufgrund ethischen, monetären oder zeitlichen Zwängen. Zu diesem Zweck können In-vitro- und/oder Ex-vivo-Modelle, wie die Kultivierung von Darmmikrobiota in vitro und dann das Eingreifen mit verschiedenen Mikrobiota-Modulatoren, zeit- und kostensparende Möglichkeiten bieten und somit ein vorläufiges oder großangelegtes Screening von verschiedene Komponenten (wie Probiotika, Präbiotika, und andere interventionelle Verbindungen) zu untersuchen / ihre Auswirkungen auf die fäkale Mikrobiota Vielfalt zu untersuchen/ vorherzusagen. Studien, die solche In-vitro- und Ex-vivo-Systeme des Darmmikrobioms verwenden, können ein besseres Verständnis der Wirts-Mikrobiom-Wechselwirkungen erleichtern, die zur Gesundheit und Krankheit des Wirts beitragen, und könnten auch dazu führen, dass neuartige Therapien gefunden werden, die auf das Mikrobiom abzielen, um Gesundheit des Wirts zu verbessern und verschiedene Krankheiten zu verhindern und zu behandeln1.
Obwohl die In-vitro-Darm-Mikrobiota-Kultursysteme die tatsächlichen Darmerkrankungen nicht wirklich replizieren können, haben sich mehrere Laboratorien bemüht, solche Modelle zu entwickeln, von denen einige bis zu einem gewissen Grad praktikabel wurden und erfolgreich für verschiedenen Zwecken. Eines der jüngsten Darmmodelle ist der Simulator des Human Intestinal Microbial Ecosystem, das den gesamten menschlichen Magen-Darm-Trakt imitiert, einschließlich des Magens, dünndarm, und verschiedene Regionen des Dickdarms. Solche technisch komplexen Modelle sind jedoch möglicherweise nicht für andere Forschungseinrichtungen weltweit zugänglich. Daher besteht nach wie vor ein kritischer Bedarf an der Entwicklung neuer alternativer Modelle, die relativ einfach, erschwinglich und praktisch für Laboratorien sind, die die Mikrobiommodulatoren und ihre Auswirkungen auf Darmmikrobiota und wirtsgesundheit untersuchen. Daher wäre die Verwendung eines in vitro (oder ex vivo) fäkalen Mikrobiota-Kultursystems nützlich, um die Auswirkungen solcher Interventionen zu untersuchen11,12. Insbesondere kann die Wirkung verschiedener Präbiotika auf die Mikrobiota-Fermentationskapazität in Bezug auf periodische Veränderungen in der Darmmikrobiota-Vielfalt und -Zusammensetzung, dem pH-Wert von Fäkalien und dem Gehalt an mikrobiellen Metaboliten, einschließlich SCFAs und Laktat, untersucht werden. 13. Hierin wird unter Verwendung von Inulin (einer der am häufigsten untersuchten präbiotischen Komponenten) als Beispiel für den Mikrobiommodulator ein Schritt-für-Schritt-Protokoll dieses einfachen ex vivo Mikrobiota-Batchkultursystems beschrieben, um seine Verwendung zur Schätzung der Veränderungen der fäkalen Mikrobiota und mikrobiellen Metaboliten nach Intervention mit den Mikrobiommodulatoren.
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Protocol
VORSICHT: Konsultieren Sie die entsprechenden Materialsicherheitsdatenblätter und befolgen Sie die Anweisungen und Richtlinien für ein entsprechendes Training der Biosafety Level 2 (BSL-2). Befolgen Sie alle Kultivierungsschritte gemäß den Standard-Biosicherheitsregeln und verwenden Sie einen BSL-2-Schrank unter aseptischen Bedingungen. Darüber hinaus können Fäkalienproben aus verschiedenen Modellen und menschliche Probanden ein potenzielles Risiko für die Verbreitung mikrobiellen übertragener Krankheiten haben. Suchen Sie sofort medizinische Hilfe bei der Auftreten von Verletzungen und Infektionen. Darüber hinaus sollte die Verwendung von Stuhlproben für Menschen und Tiere von institutionellen Ethikausschüssen genehmigt werden und den Protokollen zur Verwendung von Proben und Gegenstandsinformationen entsprechen.
1. Vorbereitung von Kulturmedien
-
Vorbereitung der Kulturmedien, Vorbereitung von neun Arten von Bestandslösungen
- Lösung A (1.000 ml): 5,4 g Natriumchlorid (NaCl), 2,7 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 0,16 g Calciumchloriddihydrat (CaCl22H2O), 0,12 g Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl 2) auflösen 6H2O), 0,06 g Manganchlorid-Tetrahydrat (MnCl2x 4H2O), 0,06 g Cobaltouschlorid-Hexahydrat (CoCl 2-6H2O) und 5,4 g Ammoniumsulfat (NH4)2SO4, in entionisiertem Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu machen.
- Lösung B (1.000 ml): 2,7 g Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) in entionisiertem Wasser auflösen, um ein Gesamtvolumen von 1000 ml zu machen.
- Spurenminerallösung (1.000 ml): 500 mg Dinatriumethylendiamin-Tetraacetat-Dihydrat (Na2EDTA), 200 mg Eisensulfat-Heptahydrat (FeSO47H2O), 10 mg Zinksulfat-Heptahydrat (ZnSO4) auflösen 7H2O), 3 mg Mangan(II) Chloridtetrahydrat (MnCl2x 4H2O), 30 mg Phosphorsäure (H3PO4), 20 mg CoCl2,6H2O, 1 mg Cupricchloriddihydrat (CuCl2 2H2O), 2 mg Nickel(II)-Chlorid-Hexahydrat (NiCl26H2O) und 3 mg Natriummolybdatdihydrat (Na2MoO42H2O) in entionisiertem Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu machen.
HINWEIS: Diese Lösung ist lichtempfindlich und stellt daher sicher, dass sie in dunkel/schwarzen oder Aluminium-umwickelten Rohren/Flaschen gelagert wird. - Wasserlösliche Vitaminlösung (1.000 ml): 100 mg Thiaminhydrochlorid (Thiamin-HCl), 100 mg D-Pantothensäure, 100 mg Niacin, 100 mg Pyridoxin, 5 mg P-Aminobenzoesäure und 0,25 mg Vitamin B12 in deionisiertem Wasser auflösen, um das Gesamtvolumen auf 1.000 ml.
- Folat: Biotinlösung (1.000 ml): 10 mg Folsäure, 2 mg D-Biotin und 100 mg Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) in entionisiertem Wasser auflösen, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu machen.
- Riboflavin-Lösung (1.000 ml): Lösen Sie 10 mg Riboflavin in 5 mM HEPES (1,19 g/l) Lösung auf, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu machen.
- Heminlösung (10 ml): 5.000 mg Hemin in 10 mM Natriumhydroxid (NaOH) (0,4 g/l) Lösung auflösen, um ein Gesamtvolumen von bis zu 10 ml zu machen.
- Kurzkettige Fettsäuremischung (10 ml): 2,5 ml N-Valerat, 2,5 ml Isovalerat, 2,5 ml Isobutyrat und 2,5 ml: DL-Methylbutyrat kombinieren.
HINWEIS: Diese Lösung wird empfohlen, in Rauchhaube zu verwenden, um Geruch und Dämpfe zu vermeiden. - Resazurin (1.000 ml): 1 g Resazurin in entionisiertem Wasser auflösen und Gesamtvolumen auf 1.000 ml erhöhen.
-
Medium für die anaerobe In-vitro-Fermentation
- Um dieses Medium vorzubereiten, mischen Sie 330 ml Lösung A, 330 ml Lösung B, 10 ml Trace Minerallösung, 20 ml wasserlösliche Vitaminlösung, 5 ml Folat:Biotinlösung, 5 ml Riboflavin-Lösung; 2,5 ml Heminlösung, 0,4 ml Kurzkettige Fettsäuremischung, 1 ml Resazurin, 0,5 g Hefeextrakt, 4 g Natriumcarbonat (Na2CO3), 0,5 g Cystein HCl-H2O und 0,5 g Trypticase und 296,1 ml destilliertes Wasser hinzufügen.
- Überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie sicher, dass er bei 7,0 liegt, wenn nicht, stellen Sie den pH-Wert mit 1 N HCl oder 1 N NaOH ein. Sterilisieren Sie durch Vakuumfilterung der Medien mit einem Flaschenfilter unter der aseptischen Arbeitsstation.
- Alternativ können Sie alle Komponenten (außer Vitamin- und Heminlösungen) und Autoklaven bei 121 °C 20 min mischen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Gleichzeitig filtern Sie Vitamin- und Heminlösungen mit 0,22 m Membranfiltern und fügen Diese vor dem Dosieren den autoklavierten und gekühlten Medien hinzu.
2. Vorbereitung von anaerobem Kammer und benötigtem Material
- Bewahren Sie alle Materialien, Lösungen und Werkzeuge, die für das Fermentationsexperiment benötigt werden, mindestens 48 h vor Beginn des Experiments in der anaeroben Kammer auf, um sicherzustellen, dass Restsauerstoff, der mit Werkzeugen und löslichem Sauerstoff in Puffern/Lösungen verbunden ist, entfernt und alle Materialien an die eingestellten anaeroben Bedingungen akklimatisiert werden.
HINWEIS: Materialien, die in der anaeroben Kammer benötigt werden (48 h früher nach dem Versuch): (i) Fermentationsmedien; ii) anaerobe Lösung (zubereitet nach Abschnitt 4.1), iii) Wirbel, (iv) Waage, (v) Musselin-Käsetücher, (vi) Schere, (vii) Trichter, (viii) 1,5, 2,0, 15, 50 ml Rohre, (ix) Pipettor (2, 20, 200 und 1.000 l) und kompatible Pfeifenspitzen, (x) Geschütz Pipetten und Pipetten (5 und 10 ml), (xi) Papiergewebe, (xii) Marker, (xiii) Rohrständer für verschiedene Rohre, (xiv) Abfallbox, (xv) O 2-Anzeige und (xvi) 70% Ethanol-Sprühflasche (Desinfektionsmittel).
3. Herstellung von Rohren und Fasern
- Gewicht 300 mg Inulin und Übertragung in ein 50 ml Rohr gefolgt von der aseptischen Zugabe von 26 ml Fermentationsmedien bereits vorbereitet und in der anaeroben Kammer gelagert. Bereiten Sie ein leeres Rohr für jeden Fäkalprobentyp und Versuchsröhre (entsprechend der Anzahl der getesteten Verbindungen) in Dreifachform vor.
- Lassen Sie diese Rohre in der anaeroben Kammer für etwa 24 h, um die Hydratation von Proben zu ermöglichen, bevor Sie mit dem Fermentationsexperiment beginnen. Stellen Sie sicher, dass die Rohrtemperatur zum Zeitpunkt der Impfung 37 °C beträgt, bringen Sie daher die Rohre in den Inkubator, der in der anaeroben Kammer eingeschlossen ist.
4. Zubereitung von Inokulum
- Anaerobe Verdünnungslösung (mindestens 48 h vor Fermentationsexperiment): 5 g NaCl, 2 g Glukose und 0,3 g Cystein-HCl in entionisiertem Wasser auflösen und Gesamtvolumen auf 1.000 ml erhöhen. Autoklav und lagern Sie es in der anaeroben Kammer mindestens 48 h vor Gebrauch.
- Fäkale Inokulumzubereitung (am Tag des Fermentationsexperiments): 5 g frischer Fäkalienprobe in einem 50 ml konischen Rohr wiegen, anaerobe Verdünnungslösung für ein Endvolumen von 50 ml (1:10 w/v) und Wirbel 15 min oder bis vollständig homogenisieren. Filtern Sie die homogenisierte Mischung durch 4 Schichten sterilen Käsetuchs (autoklaviert) und verwenden Sie es sofort zur Impfung in den Medienenthalten.
HINWEIS: Die Fäkalienproben einer Gruppe von Probanden können gepoolt werden, wenn das experimentelle Ziel darin besteht, die Wirkung einer bestimmten Verbindung/Zutat auf die insgesamt gesunde und kranke Fäkalmikrobiota im Allgemeinen zu vergleichen.
5. Fermentation und Probenahme
- Rohre nach Abschnitt 4.2 vorbereiten und Blind-/Kontroll- und Versuchsrohre mit 4 ml verdünntem und gefiltertem Fäkalieninokulum impfen. Inkubieren Sie die geimpften Schläuche bei 37 °C in der anaeroben Kammer. Schütteln Sie die Rohre einmal pro Stunde, indem Sie sanft umkehren, um die Fasern und inoculum wieder aufzuhängen.
- Sammeln Sie Proben so häufig wie nötig, z. B. stündlich bis 0, 3, 6, 9 und 24 h während der Fermentation, indem Sie eine 2 ml Aliquot-Probe aus den jeweiligen Fermentationsrohren in ein 2 ml-Rohr aufnehmen.
- Messen Sie den pH-Wert der Aliquots mit einem pH-Messgerät im Labor (durch direktes Einsetzen der pH-Elektrode in die Probe); Zentrifuge die verbleibende Probe bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C. Einfrieren Sie den Überstand und das Pellet sofort in flüssigem Stickstoff und lagern Sie nach dem Einfrieren den Überstand für die SCFAs-Analyse und pellet für die Mikrobiomanalyse bei -80 °C.
6. Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) und Laktatquantifizierung
HINWEIS: Die SCFAs und Laktat im Überstand der Mikrobiomkultur können genau nach den an anderer Stelle beschriebenen Methoden13,14,15,16gemessen werden.
- Kurz gesagt, tauen Sie die in Abschnitt 5 erhaltenen gefrorenen Überräube aus Kontroll- und Behandlungsproben auf Eis auf und führen Sie alle weiteren Verarbeitungsschritte auf Eis durch. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45 m Membranfilter und verwenden Sie die zellfreien Proben, um die Konzentrationen von SCFAs und Laktat mit dem HPLC-System mit DAD-Detektor bei 210 nm, ausgestattet mit einer HPX-87H-Säule, zu messen. Verwenden Sie für jede Probe ein Injektionsvolumen von 10 l und verwenden Sie H2SO4 (0,005 N), um die Säule mit einer Durchflussrate von 0,6 ml/min bei 35 °C zu beleben.
7. Fäkale Mikrobiom-Analyse
HINWEIS: Führen Sie Mikrobiom-Analyse nach den Methoden und Pipeline an anderer Stelle 7,13,14,17.
- Kurz gesagt, extrahieren Sie genomische DNA aus etwa 200 mg Fäkalien-Güllepellets mit einem fäkalen DNA-Extraktionskit13.
- Verstärken Sie die hypervariable Region des bakteriellen 16S rRNA-Gens, indem Sie die Barcode-Primer gemäß der an anderer Stelle beschriebenen Methode13verwenden, indem Sie die Primersequenzen verwenden, wie im Earth Microbiome Project Protocol18beschrieben.
- Reinigen Sie die resultierenden Amplicons mit magnetischen Reinigungsperlen und quantifizieren Sie sie mit Picogreen oder einer gleichwertigen Methode. Die gereinigten PCR-Produkte in gleicher Molkonzentration und Sequenz auf einem Sequenzer13bündeln.
- Verarbeiten Sie die resultierenden Sequenzen für Entmultiplexing, Qualitätsfilterung und Clustering, taxonomische Zuordnung und Seltenheit sowie nachgelagerte Analysen unter Verwendung der Software Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) gemäß den von Caporaso et al.19.
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Representative Results
Das Protokoll wird verwendet, um die Wirkung eines bestimmten Präbiotikums (d. h. Inulin auf die Mikrobiotazusammensetzung und metabolische Aktivitäten in Bezug auf Veränderungen des pH-Werts und die Konzentration von Laktat und SCFAs im Kot gesunder verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung mit Inulin). Der pH-Wert von Fäkalien, die Fäkalienspiegel von Laktat und SCFAs (Abbildung 1) und die Mikrobiotazusammensetzung (Abbildung 2 und Abbildung 3) werden bei 0 (Baseline), 9 und 24 h inkubationsweise mit oder ohne Inulin gemessen. Die Ergebnisse zeigen, wie die Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota und ihre metabolischen Aktivitäten während der In-vitro-Fermentation mit oder ohne Inulin-Behandlung moduliert werden.
Abbildung 1: Veränderungen des pH-Wertes (a), des Laktats (b) und der kurzkettigen Fettsäuren viz. Acetat (c), Propionat (d) und Butyrat (e) im menschlichen Kot bei 0 (Basislinie), 9 und 24 h anaerobe Fermentation mit oder ohne Inulin. Die hier dargestellten Werte sind Mittelwert von dreifachen Proben. * P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, vs. Ausgangswert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Veränderungen der Mikrobiota-Vielfalt und -Zusammensetzung im menschlichen Kot bei 0 (Basis), 9 und 24 h anaerobe Fermentation mit oder ohne Inulin. (a) Gewichtete und (b) ungewichtete Unifrac-Maßnahmen der Beta-Diversität, die mithilfe der Principle Coordinate Analysis (PCoA) visualisiert werden. (c-f) Indizes der Alpha-Vielfalt, d. h. phylogenetische Vielfalt (PD-Ganzesbaum (c); Artenreichtum (Chao1; d); beobachtete Anzahl der operativen taxonomischen Einheiten (OTUs, e); und Artengleichmäßigkeit (Shannon-Index, f)). Relative Häufigkeit von Hauptphyla (g) und Gattungen (h). Die hier dargestellten Werte sind Mittelwert von dreifachen Proben. * P < 0,05, **P < 0,01, vs. Ausgangswert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Lineare Diskriminante Analyse (LDA) Effektgröße (LEfSe) Analyse von Darm-Mikrobiota-Änderungen nach 9 h und 24 h Inkubation mit (INU) oder ohne (CTL) Inulin. Taxonomisches Cladogramm aus LEfSe-Analyse von 16S-Sequenzen (relative Häufigkeit bei 0,5%) die unterschiedlich reichliche Taxa zwischen verschiedenen Stichprobengruppen darstellen. Die Helligkeit jedes Punktes ist proportional zu seiner Effektgröße (d. h. der Taxon-Fülle). Hier werden nur Taxa angezeigt, die den LDA-Schwellenwert von >2,4 überschreiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgestellte In-vitro-Fäkalien-Gärungsmodell ist ein einfaches Einzel-Batch-Modell, um die Auswirkungen verschiedener Substrate und mikrobiellen Stämme (z. B. Präbiotika und Probiotika) auf die Zusammensetzung der menschlichen Fäkalmikrobiota sowie deren Metabolische Aktivitäten in Bezug auf den pH-Wert und die SCFAs-Spiegel. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Inokulation von Inulin den pH-Wert des Fäkalien verringert und die SCFAs und laktatiniert in inulin behandelten Fäkalien im Vergleich zur nicht behandelten fäkalen Mikrobiotakultur signifikant erhöht (Abbildung 1). Darüber hinaus scheint sich die Darmmikrobiota-Signatur auch zwischen inulinbehandelten und unbehandelten Proben zu unterscheiden (Abbildung 2 und Abbildung 3). Diese Daten veranschaulichen, wie dieses System die Auswirkungen von Inulin auf die Fecal-Mikrobiom-Vielfalt und -Zusammensetzung sowie seine metabolischen Aktivitäten widerspiegeln kann. Darüber hinaus können mit diesem System je nach spezifischen experimentellen Zielen und Hypothesen auch eine Vielzahl anderer Faktoren gemessen werden. Darüber hinaus werden neben der 16S rRNA-Gensequenzierung auch andere Analysen wie die gesamte mikrobielle Metagenomsequenzierung (mit Deminemator des ganzen Genoms) oder qPCR- und Kulturmethoden, die auf bestimmte einzelne oder mehrere Gattungen, Arten und Stämme (z. B. Bifidobakterien, Lactobacilli, Akkermansia, Enterobacteriacaea, Clostridia, etc.) kann auch ausgeführt werden. Darüber hinaus können verschiedene chromatographische Verfahren für die Analyse von SCFAs, wie LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID und HPLC, basierend auf experimentellen Anforderungen und Verfügbarkeiten genutzt werden. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die Probenvorbereitung für diese Verfahren je nach den Instrumenten und Bedingungen für den Betrieb20variieren kann.
Obwohl die Verwendung von frischen Fäkalienproben am besten reproduzierbare Ergebnisse liefern würde; jedoch kann die snap gefrorene Fäkalienprobe (wie sie in dem hier vorgestellten Experiment verwendet wird) auch wirksam verwendet werden, da die meisten Bakterien von ihr wiederbelebt werden können, sobald sie auf Körpertemperatur reanimiert wurden und nach dem EinfrierenkeineZersetzung mehr stattfindet. Die Verwendung von Tiefkühlproben kann besonders vorteilhaft sein, wenn es unmöglich ist, am geplanten Tag des Experiments frische Fäkalienproben von bestimmten Spendern oder von demselben Spender zu erhalten, wenn ein Experiment repliziert werden muss. Es ist jedoch zu beachten, dass die Fäkalienproben mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung sofort bei -80 °C gelagert werden sollten. Um die Exposition der gefrorenen Fäkalienproben gegenüber Luft (Sauerstoff) zu vermeiden, sollten die Proben so bald wie möglich/unmittelbar nach dem Herausnehmen aus dem Gefrierschrank in die anaerobe Kammer überführt und sofort verwendet werden (wiederholtes Auftauen sollte vermieden werden). Alle nachfolgenden Experimente einschließlich Probenauftauen, Inokulumvorbereitung und -verarbeitung sollten in der anaeroben Kammer durchgeführt werden.
Die Darm-Bio-Umgebung und der pH-Wert während der Nährstofffermentation im Großdarm sind besonders deshalb sehr wichtig, wenn man bedenkt, dass ein ungewöhnlich reduzierter pH-Wert auf einen erhöhten Säuregehalt aufgrund der Substratnutzung hindeutet. Daher kann eine schnellere pH-Reduktion einerschnelleren Substratnutzung 22 entsprechen. Obwohl in diesem Modell der pH-Wert nicht kontrolliert wurde, wird die Einbeziehung identischer nicht behandelter Kontrollen dringend empfohlen, um direkte Vergleiche anzustellen. Die SCFAs, die im Dickdarm als Folge der Fermentation von unverdaulichen Polysacchariden durch die Darmmikrobiota hergestellt werden, können verschiedene Mechanismen im Zusammenhang mit der Erhaltung der Wirtsgesundheit weiter beeinflussen. Diese Metaboliten tragen zur Glukoneogenese und Lipidbiosynthese bei, wirken als Energiequelle für Kolonozyten und können auch gesundheitliche Vorteile haben, einschließlich Immunmodulation, kontrollierte/verbesserte Darmbarrierefunktionen und Neuromodulation23, 24,25,26. Darüber hinaus sind SCFAs auch dafür bekannt, mehrere biologische Wege zu beeinflussen, einschließlich Hormone, Endocannabinoid-System, Zellproliferation und Tod, Knochengesundheit, Mineralabsorption, Darmmotilität, Darm-pH-Wert und Invert-Effekte auf das Darmmikrobiom und mikrobielle Metabolische Funktion. Daher kann die Kenntnis des Profils und der Konzentrationen von Darm-/Fäkalien-SCFAs eine wichtige Komponente bei der Bewertung der Wirksamkeit spezifischer Mikrobiotamodulatoren6sein. Natürlich produziert das Darmmikrobiom neben SCFAs auch viele andere wichtige Metaboliten (z.B. Ammonium, Vitamine, Histamin). Daher können die überstäuglichen Proben, die während solcher In-vitro-Fermentationsexperimente gesammelt wurden, auch für globale Metabolomik-Analysen ausgewertet werden, um neuartige Darmmikrobiom-abgeleitete Metaboliten zu entdecken, die von spezifischen Mikrobiommodulatoren beeinflusst werden können.
Das hier beschriebene System hat viele Vorteile, wie die Einfachheit, Einfachheit, Kosteneffizienz und die allgemeine Akzeptanz des Versuchsaufbaus. Es gibt jedoch auch wenige Einschränkungen. Zum Beispiel bezieht sich das System nicht auf die Wechselwirkung von Präbiotika (oder anderen verwendeten Eingriffen) im oberen Verdauungssystem (z. B. Speichel, Magen, Dünndarm), bevor es der Mikrobiota des Dickdarms ausgesetzt wird. Solche Schritte können jedoch entsprechend den spezifischen versuchsspezifischen Anforderungen angenommen und aufgenommen werden. Außerdem kann ein saurer und/oder enzymatischer Hydrolyseprozess vor der Fermentation durchgeführt werden müssen, wenn bestimmte Substrate, einschließlich Vollwertkost oder verdauliche Lebensmittel, verwendet werden, da nur der unverdauliche Teil solcher Lebensmittel bis zum Dickdarm reicht, der von den unteren Darmmikrobiota. Darüber hinaus kann sich die Zusammensetzung der Darmmikrobiota aufgrund spezifischer Kulturbedingungen während der Fermentation verschieben. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass bis zu 9 h Inkubation, Mikrobiota-Änderungen sind viel näher an normal als bei 24 h. Jedoch, nach 24 h der Inkubation, Obwohl pH- und SCFAs-Spiegel erheblich erhöht, Darm-Mikrobiota Zusammensetzung zeigte, dass Proteobacteria Zählt erhöht, während die mikrobielle Vielfalt reduziert. Es bleibt jedoch unbekannt, wie genau und genau die erhöhte Anhäufung von mikrobiellen Metaboliten, die mit dem gesenkten pH-Wert von Fäkalien einhergehen, mit spezifischen Mikrobiota-Signaturen verbunden ist.
Zusammenfassend wird hier in diesem Protokoll ein einfaches Protokoll zur Simulation des Ex-vivo-Mikrobiota-Ökosystems beschrieben. Das System ermöglicht es Forschern, verschiedene Interventionen auf Modulation der Mikrobiota-Vielfalt, Zusammensetzung und metabolische Funktion zu testen, die verschiedene Merkmale des Wirts Darm und allgemeine Gesundheit beeinflussen können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Förderung durch das Center for Diabetes, Adipositas and Metabolism und das Clinical and Translational Science Center, die Wake Forest School of Medicine, die Finanzierung des Department of Defense (Grant-Nummer: W81XWH-18-1-0118), kermit Glenn Phillips II Lehrstuhl für Herz-Kreislauf-Medizin; die National Institutes of Health finanziert Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziert von P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 und das Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziert von UL1TR001420) werden ebenfalls dankend anerkannt. Wir danken auch den Freiwilligen für die Bereitstellung von Fäkalienproben und unseren anderen Labormitgliedern für ihre technische Hilfe während dieses Experiments.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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